ES2298457T3 - Medio para detectar microbios objetivo en una muestra. - Google Patents
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Abstract
Medio específico para coliformes no gelificado, líquido que permite la detección de la presencia o ausencia de microbios objetivo en una muestra medioambiental o biológica licuada que comprende: vitaminas, una fuente de iones amonio, un tampón, un agente antifúngico, un indicador de nutriente, un antibiótico que evita o inhibe el crecimiento y la reproducción de una o más especies o grupos de microbios que no son objetivo, un inductor de una enzima que cataliza el metabolismo del indicador de nutriente, un precursor de ADN, ácido D-glucónico 0, 13 - 0, 16 g/l, una fuente de sulfito, aminoácidos en una concentración de al menos: alanina 0, 025 g/l, arginina 0, 030 g/l, ácido aspártico 0, 056 g/l, ácido glutámico 0, 1 g/l, glicina 0, 015 g/l, prolina 0, 09 g/l, cistina 0, 002 g/l, histidina 0, 006 g/l, isoleucina 0, 01 g/l, leucina 0, 030 g/l, lisina 0, 03 g/l, metionina 0, 01 g/l, fenilalanina 0, 018 g/l, serina 0, 029 g/l, treonina 0, 018 g/l, triptófano 0, 003 g/l, tirosina 0, 0064 g/l y valina 0, 023 g/l, hierro, calcio, fosfato, potasio, sodio, cobalto, cobre, plomo, magnesio, manganeso, cloruro, estaño y/o zinc y piruvato de sodio, que puede actuar para permitir la viabilidad y reproducción de los microbios objetivo a una tasa tal que puede observarse cualquier cambio detectable en dicha muestra en 18 horas para una muestra con menos de 10 microbios objetivo por 100 ml.
Description
Medio para detectar microbios objetivo en una
muestra.
Esta invención se encuentra en el campo de la
química, la biología y la microbiología y se refiere a medios
novedosos para detectar la presencia de microbios objetivo en una
muestra de un material posiblemente contaminado.
Los microorganismos están presentes de manera
ubicua en especímenes biológicos y medios ambientales adecuados
para su crecimiento. Sin embargo, algunos demuestran ser nocivos
para los organismos superiores y los medios para detectar su
presencia son importantes para preservar la salud pública. Están
disponibles muchos medios para detectar diversos tipos de
microorganismos, que ofrecen diversas ventajas con respecto a su
velocidad y especificidad.
Todos los microorganismos tienen ciertas
necesidades para su crecimiento y reproducción. En general, los
microorganismos requieren la presencia de lo siguiente para su
crecimiento: una fuente de energía tal como la luz o compuestos de
carbono; y una fuente de materias primas incluyendo carbono,
nitrógeno, azufre y fósforo así como cantidades traza de otros
minerales. Además, los microorganismos deben estar en un entorno
adecuado en el que se mantengan una temperatura, un pH, una
salinidad y una concentración de oxígeno apropiados.
Un procedimiento común usado para detectar la
presencia de microorganismos supone añadir un espécimen a un medio
de cultivo que contiene todos los elementos necesarios para mantener
el crecimiento. La muestra puede ser natural o pretratarse, tal
como mediante filtración de membrana, antes de añadirse al medio de
cultivo. El medio puede contener o no productos químicos tales como
agentes antimicrobianos o antibióticos que suprimen el crecimiento
de microorganismos distintos al microorganismo objetivo.
Normalmente, se esterilizan estos medios de cultivo para garantizar
que no hay interferencia de microbios contaminantes y normalmente se
requiere un periodo de incubación bastante largo de desde
veinticuatro hasta cuarenta y ocho horas para que crezcan los
microbios hasta concentraciones detectables. Adicionalmente, una vez
que se detecta el crecimiento en estos procedimientos, debe
identificarse el microorganismo objetivo usando una o más pruebas
específicas para una variedad de características físicas o
bioquímicas únicas
de los microbios objetivo. Por tanto, estos procedimientos requieren mucha mano de obra y llevan mucho tiempo.
de los microbios objetivo. Por tanto, estos procedimientos requieren mucha mano de obra y llevan mucho tiempo.
Se han realizado esfuerzos para simplificar y
acelerar el procedimiento de detección. Entre estos esfuerzos, se
han hecho intentos para medir subproductos metabólicos específicos
de microorganismos individuales. Estos métodos incluyen: ensayos de
impedancia eléctrica, ensayos de ATP, ensayos basados en anticuerpos
y ensayos de sustratos marcados con carbono 14. También se han
usado indicadores del crecimiento microbiano para monitorizar el
crecimiento de microbios objetivo que cambian de color sólo después
de detectarse el crecimiento del microbio objetivo. Estos
indicadores normalmente reaccionan químicamente con un subproducto
metabólico producido por los microbios objetivo dando como
resultado un cambio de color en el medio. Los ejemplos de productos
químicos que cambian de color en presencia de cambios de pH
asociados con el crecimiento incluyen rojo de fenol, azul de
bromocresol y rojo neutro. Por ejemplo, Golber, patente
estadounidense número 3.206.317 usa rojo de fenol, un producto
químico que cambia de color en presencia de productos de desecho
ácidos producidos por el microbio objetivo. Berger et al.
patente estadounidense número 3.496.066 describe el uso de
compuestos que las bacterias convierten en colorantes, por ejemplo,
tropinonas y dioxanos, Bochner, patente estadounidense número
4.129.483 describe el uso de una sustancia no biodegradable
(tetrazolio) que se reduce químicamente para producir un cambio de
color. En todos estos ejemplos, el indicador es un compuesto que no
sirve como fuente de un nutriente requerido.
Edberg, patente estadounidense número 4.925.789
describe el uso de un indicador de nutriente que no sólo sirve como
fuente de nutrientes, sino que también cambia de color al
metabolizarse. La patente proporciona un medio que contiene un
indicador de nutriente que, cuando lo metaboliza una bacteria
objetivo, libera un resto que confiere un color u otro cambio
detectable al medio. El procedimiento se aprovecha de una
especificidad enzimática única para una especie o grupos de
bacterias particulares. Sugiere el uso de antibióticos para
seleccionar el crecimiento de los microorganismos seleccionados
como objetivo y proporciona ejemplos específicos de ensayos basados
en líquidos. Otros métodos usados previamente tales como Kilian
et al., Acta. Path. Microbiol. Scand. Secc. B \NAK7
271-276 (1979) y Damare et al., J. Food
Science 50:1736 (1985) informan sobre el uso de medios basados en
agar sin antibióticos.
El documento WO 94/20638 se refiere a un sistema
rápido de detección de coliformes, el documento EP 574 977 se
refiere a un método directo para detectar niveles muy bajos de
contaminación por coliformes y el documento EP 591 554 se refiere a
un método rápido para la detección de microorganismos.
La presente invención se caracteriza por un
medio que permite la detección de la presencia o ausencia de un
microbio objetivo en una muestra biológica o medioambiental licuada
en el plazo de tan sólo 18 a 24 horas. Por ejemplo, pueden
detectarse Escherichia coli y otros coliformes en el plazo de
aproximadamente 18 horas desde el inicio del periodo de incubación
con gran especificidad. Por tanto, el presente medio se diferencia
de los medios anteriores en que se requieren aproximadamente 24
horas para obtener un resultado de la prueba para E. coli.
Puede prepararse un medio de este tipo usando cantidades variables
tanto de los nutrientes como de los indicadores de crecimiento. Sin
embargo, la invención proporciona componentes de aminoácidos,
vitaminas y elementos en cantidades superiores a las usadas
previamente. Otras características de los medios de esta invención
incluyen el uso de piruvato de sodio para ayudar en la recuperación
de bacterias dañadas metabólicamente, el uso de un periodo de
equilibración térmica, el uso de menos cloruro de sodio y la
provisión de otros metabolitos en cantidades adecuadas.
El medio contiene una cantidad eficaz de
vitaminas, aminoácidos, oligoelementos y sales que pueden mantener
la viabilidad y la reproducción del microbio objetivo en presencia
de un indicador de nutriente. Los medios que han demostrado ser
óptimos en esta invención para la detección de E. coli y
coliformes totales en una muestra incluyen una fuente de iones
amonio (por ejemplo, a una concentración final de la muestra de
sulfato de amonio de aproximadamente 4,5 a 5,5 g/litro), un tampón
(por ejemplo, ácido libre de HEPES de aproximadamente 6,0 a 7,5
g/litro y sal sódica de HEPES de 4,7 a 5,8 g/litro), ácido
D-glucónico de aproximadamente 0,13 a 0,16 g/litro,
una fuente de sulfito (por ejemplo, sulfito de sodio de
aproximadamente 0,036 a 0,044 g/litro), un agente antifúngico (por
ejemplo, anfotericina B de aproximadamente 0,0009 a 0,0011 g/litro),
una fuente de iones magnesio (por ejemplo, sulfato de magnesio de
aproximadamente 0,09 a 0,11 g/litro), un indicador de nutriente
(por ejemplo,
orto-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido
(ONPG) de aproximadamente 0,450 a 0,550 g/litro y
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucurónido
(MUG) de aproximadamente 0,067 a 0,085 g/litro), una fuente de
iones zinc (por ejemplo, sulfato de zinc de aproximadamente 0,00045
a 0,00055 g/litro) y una fuente de iones manganeso (por ejemplo,
sulfato de manganeso de aproximadamente 0,00045 a 0,00055
g/litro).
Además, se proporcionan los siguientes
componentes en las siguientes cantidades mínimas. Las cantidades
máximas u óptimas de cada componente pueden ser varias veces (por
ejemplo, 3-10 o incluso 20 veces) superiores a las
proporcionadas a continuación. Específicamente, un medio de este
tipo tendrá un contenido de nitrógeno total de al menos
aproximadamente 1,1 a 1,7 g/litro. Se proporcionan los aminoácidos
requeridos para el crecimiento del microbio objetivo. No deben
proporcionarse todos los aminoácidos y puede variar la cantidad
relativa de cada uno. Los expertos en la técnica reconocerán que
pueden usarse fuentes naturales de tales aminoácidos en vez de
fuentes puras. Los aminoácidos pueden proporcionarse a partir de una
variedad de fuentes. Normalmente, sólo deben proporcionarse los
aminoácidos esenciales que no pueden sintetizarse de forma endógena
por los microbios objetivo. Éstos pueden proporcionarse a partir de
fuentes naturales (por ejemplo, extractos de microorganismos
completos) como mezclas o en forma purificada. Las mezclas naturales
pueden contener cantidades variables de tales aminoácidos y
vitaminas (véase a continuación). Se indican a continuación
cantidades específicas de tales aminoácidos y vitaminas. Los
expertos en la técnica reconocerán que pueden usarse muchas
combinaciones diferentes de aminoácidos y vitaminas en los medios
de esta invención. Las listas proporcionadas a continuación ponen
como ejemplo sólo un ejemplo de este tipo. Los contenidos en
aminoácidos incluyen al menos lo siguiente en cantidades de al
menos aproximadamente las cantidades indicadas: alanina (0,025
g/litro), arginina (0,03 g/litro), ácido aspártico (0,056 g/litro),
ácido glutámico (0,1 g/litro), glicina (0,015 g/litro), prolina
(0,09 g/litro), cistina (0,002 g/litro), histidina (0,006 g/litro),
isoleucina (0,01 g/litro), leucina (0,03 g/litro), lisina (0,03
g/litro), metionina (0,01 g/litro), fenilalanina (0,018 g/litro),
serina (0,029 g/litro), treonina (0,018 g/litro), triptófano (0,003
g/litro), tirosina (0,0064 g/litro) y valina (0,023 g/litro).
Se incluyen otros compuestos inorgánicos para
ayudar en el crecimiento del microbio objetivo. Estos incluyen los
siguientes (hasta el grado aún no proporcionado en las fuentes
anteriores de diversas entidades químicas): hierro (por ejemplo, al
menos aproximadamente 0,00165 \mug/l), calcio (por ejemplo, al
menos aproximadamente
0,0003 g/litro), fosfato (por ejemplo, al menos aproximadamente 0,1 g/litro), potasio (por ejemplo, al menos aproximadamente 0,007 g/litro, de manera preferible aproximadamente 0,05 g/litro), sodio (por ejemplo, al menos aproximadamente 0,03 g/litro) y cantidades traza de cobalto, cobre, plomo, magnesio, manganeso, cloruro, estaño y zinc. También se proporcionan las vitaminas requeridas por el microbio objetivo para el crecimiento. Éstas pueden proporcionarse en una forma pura o como parte de un medio más complejo. Tales vitaminas pueden estar presentes en al menos las siguientes cantidades: biotina (0,00005 mg/l), cianocobalamina (trazas), colina (0,05 mg/l), inositol
(0,060 mg/l), ácido nicotínico (0,014 mg/l), niacina (0,00385 mg/l), PABA (0,02 mg/l), ácido fólico (0,000075 mg/l), ácido pantoténico (0,01095 mg/l), piridoxina (0,0015 mg/l), riboflavina (0,0028 mg/l), tiamina (0,0037 mg/l) y timidina (0,010 mg/l).
0,0003 g/litro), fosfato (por ejemplo, al menos aproximadamente 0,1 g/litro), potasio (por ejemplo, al menos aproximadamente 0,007 g/litro, de manera preferible aproximadamente 0,05 g/litro), sodio (por ejemplo, al menos aproximadamente 0,03 g/litro) y cantidades traza de cobalto, cobre, plomo, magnesio, manganeso, cloruro, estaño y zinc. También se proporcionan las vitaminas requeridas por el microbio objetivo para el crecimiento. Éstas pueden proporcionarse en una forma pura o como parte de un medio más complejo. Tales vitaminas pueden estar presentes en al menos las siguientes cantidades: biotina (0,00005 mg/l), cianocobalamina (trazas), colina (0,05 mg/l), inositol
(0,060 mg/l), ácido nicotínico (0,014 mg/l), niacina (0,00385 mg/l), PABA (0,02 mg/l), ácido fólico (0,000075 mg/l), ácido pantoténico (0,01095 mg/l), piridoxina (0,0015 mg/l), riboflavina (0,0028 mg/l), tiamina (0,0037 mg/l) y timidina (0,010 mg/l).
Los expertos en la técnica reconocerán que
pueden proporcionarse carbono orgánico, nitrógeno, oligoelementos,
vitaminas y aminoácidos en muchas formas. Generalmente, se prefiere
tener una cantidad de vitaminas y aminoácidos al menos tan grande
como las cantidades específicas proporcionadas anteriormente, pero
los expertos en la técnica reconocerán que puede variarse la
concentración real de cada componente de modo que pueda compensarse
la reducción en la cantidad de un componente mediante un aumento en
la cantidad de otro. Esto es particularmente relevante cuando se
conocen las necesidades para el crecimiento de un microbio objetivo
particular. Pueden proporcionarse algunos componentes en cantidades
reducidas o eliminarse si se sintetizan de forma endógena por el
microorganismo objetivo. Lo más preferiblemente, la cantidad total
de tales componentes es muy superior a la cantidad total
proporcionada en el ejemplo anterior. Las cantidades del orden de
cinco a diez veces las descritas anteriormente son particularmente
eficaces para permitir la detección de microorganismos en un plazo
de un corto periodo de tiempo (18 horas) mientras se mantiene la
especificidad de detección.
Otros componentes de un medio de este tipo
incluyen antibióticos activos frente a microbios
gram-positivos que no son objetivo, antibióticos
activos frente a microbios gram-negativos que no son
objetivo, inductores de la(s) enzima(s) que
cataliza(n) el metabolismo del/de los indicador(es) de
nutriente, precursores de ADN, precursores de aminoácidos y fuentes
complementarias de potasio y fósforo.
El indicador de nutriente está presente en el
medio en una cantidad que es suficiente para mantener el crecimiento
del microbio objetivo hasta que se produce una señal característica
detectable en el medio durante el crecimiento. Juntos, los
componentes de vitamina, aminoácido, oligoelemento, sal e indicador
de nutriente permiten un crecimiento suficiente del microbio
objetivo de modo que puede observarse un cambio detectable en la
muestra en menos de aproximadamente 24 horas. El indicador de
nutriente altera una característica detectable de la muestra sólo
cuando se metaboliza por el microbio objetivo. Por lo tanto, puede
usarse para confirmar la presencia o ausencia de un microbio en la
muestra. El indicador de nutriente sólo debe metabolizarse por el
microbio objetivo en el medio. Si están presentes otros microbios
en la muestra que podrían metabolizar el indicador de nutriente,
entonces debe suprimirse su crecimiento mediante el uso de
antibióticos específicos. Además, aunque se prefiere que el
indicador de nutriente sea la única fuente del tipo específico de
nutriente para el microbio objetivo, el medio puede contener otras
fuentes de este tipo, pero en cantidades que no reducirán la
especificidad del medio. Por ejemplo, el indicador de nutriente
puede ser la única fuente de carbono para el microbio objetivo.
Alternativamente, pueden estar presentes otras fuentes de carbono
(por ejemplo, aminoácidos) que no se usan de manera preferente por
el microbio objetivo. Si se desea, puede estar presente cierta
pequeña cantidad de otra fuente de carbono que podría usarse de
manera preferente por el microbio objetivo, pero la cantidad
proporcionada es tal que no se reduce la especificidad del medio con
respecto a uno sin tal fuente de carbono.
La expresión "microbio objetivo" significa
uno o más microbios cuya presencia o ausencia va a determinarse. La
expresión puede referirse a un solo microbio (por ejemplo,
Escherichia coli, Enterococcus faecalis,
Staphylococcus aureus, Mycobacterium fortuitum y
Klebsiella pneumonia), un género de microbios, varias
especies relacionadas de microbios (por ejemplo, coliformes), o un
grupo de microbios incluso mayor que tienen una característica
común (por ejemplo, todas las bacterias
gram-negativas). La invención contempla diseñar el
medio y método aprovechándose de especificidades enzimáticas únicas
u otras características únicas para diferentes grupos, familias o
especies de microbios. Por tanto, el indicador de nutriente puede
variar dependiendo de qué microbio se selecciona como objetivo. Sin
embargo, no se pretende que la expresión "microbio objetivo"
incluya todos los microbios.
La expresión "18 horas" significa el tiempo
requerido para que aproximadamente el 95% de las muestras líquidas
que contienen sólo de aproximadamente una a diez coliformes por 100
ml presenten un cambio característico detectable. La temperatura,
la cantidad y el tipo de inductor enzimático presente, la cantidad
de nutrientes proporcionados en el medio y la salud relativa de las
bacterias afectan todos al tiempo de detección. La cantidad de
nutrientes tales como aminoácidos, vitaminas y oligoelementos
proporcionados puede afectar a la tasa de crecimiento del microbio
objetivo, y por tanto, al tiempo de detección. La equilibración
térmica de la muestra hasta una temperatura de incubación de
aproximadamente 35ºC tras añadir el medio puede disminuir el tiempo
requerido para la detección. La cantidad de inductor enzimático
puede disminuir también el tiempo para la detección. Los inductores
enzimáticos que se encuentran en el medio son agentes que actúan
para inducir la actividad o expresión de la enzima que metaboliza
el indicador de nutriente. Tales inductores incluyen
isopropil-\beta-D-tiogalactósido
(IPTG) que induce actividad
\beta-D-galactosidasa y
etil-\beta-D-tioglucósido
que induce actividad \beta-glucosidasa. La salud
relativa del microbio también afecta al tiempo requerido para la
detección. Por lo tanto, la adición de agentes tales como piruvato
que pueden ayudar en la recuperación de microorganismos dañados,
puede acelerar la detección. Si están presentes un gran número de
microbios objetivo en la muestra (es decir, más de 10 microbios/100
ml de muestra), también es posible una detección más rápida. En esta
invención, los medios proporcionados permiten la detección de
cantidades bajas de microbios objetivo (es decir menos de 10/100 ml)
en el periodo de tiempo de 18 a 24 horas, al menos con el 95% del
tiempo. Pueden usarse métodos convencionales para determinar tal
capacidad.
El término "medio" significa una mezcla
sólida, en polvo o líquida que contiene todos o sustancialmente
todos los nutrientes necesarios para mantener el crecimiento y la
reproducción de los microbios objetivo. Esta invención incluye
tanto medios que están esterilizados (es decir, en los que no
resulta crecimiento con la incubación del medio solo, o con un
diluyente estéril) así como medios que no son estériles.
El término "licuado" significa
sustancialmente en forma líquida, aunque también pretende incluir
muestras pulverizadas u homogeneizadas de sustancias sólidas que
tienen al menos un contenido líquido del 10%. La frase pretende
excluir un medio gelificado, tal como se forma con agar.
Los términos "medioambiental" y
"biológico" significan que se toman de o provienen de una
sustancia que puede mantener una o más formas de vida, incluyendo
algas, hongos y bacterias. Los ejemplos incluyen pero no se limitan
a aguas de recreo, aguas de mar, aguas potables, efluentes cloacales
y sustancias alimenticias.
El término "inoculación" significa en o
cerca del momento en que se mezcla la muestra medioambiental o
biológica licuada con el medio de esta invención. Pretende ser el
momento en que se mezclan juntas sustancialmente las dos
sustancias.
La expresión "cantidad eficaz" es una
cantidad dentro del intervalo que permite o fomenta el crecimiento y
la reproducción de un microorganismo objetivo en el plazo de tiempo
especificado. Es decir, una cantidad que permite que los microbios
se adapten al medio, sinteticen los constituyentes necesarios para
la reproducción y posteriormente se reproduzcan. No pretende ser
específica y puede variar dependiendo de factores tales como el
tamaño de la muestra y la concentración de los microbios objetivo.
Generalmente, la expresión indica la cantidad requerida para
detectar menos de 100 microbios objetivo por 1 ml de muestra, lo más
preferible menos de 100 microbios por 100 ml de muestra, o incluso
1 microbio por 100 ml de muestra.
Los términos "vitaminas",
"aminoácidos", "oligoelementos" y "sales" pretenden
incluir todas las moléculas, compuestos y sustancias clasificados
en cada categoría por los expertos en la técnica, ya sean orgánicos
o inorgánicos, y las categorías no pretenden excluir ninguna
sustancia que pueda ser necesaria o propicia para mantener la
vida.
El término "antibiótico" significa una
molécula o péptido que evita o inhibe el crecimiento y la
reproducción de una o más especies o grupos de microbios que no son
objetivo. Los ejemplos se conocen bien en la técnica, sin embargo,
el término no pretende excluir detergentes que pueden inhibir o
evitar de manera específica o de manera no específica el
crecimiento bacteriano. Los ejemplos de antibióticos específicos que
pueden ser útiles en la invención incluyen colistina, ácido
nalidíxico y ansiomicina.
La expresión "indicador de nutriente"
significa una molécula o sustancia que contiene un resto que es una
fuente de un nutriente esencial para el microbio objetivo y un resto
que provoca o produce un cambio característico observable en el
medio o muestra. Un indicador de nutriente incluye fuentes de
nutrientes unidas a o conjugadas con cromógenos. Las fuentes de
nutrientes pueden proporcionar vitaminas, minerales (por ejemplo,
fosfato), oligoelementos, aminoácidos esenciales, o una fuente de
energía de hidratos de carbono (por ejemplo, lactosa). Las
necesidades nutricionales de un microorganismo aumentan a medida que
el microorganismo avanza desde la fase en la que los nutrientes se
acumulan para la reproducción (fase de latencia) hacia la fase
durante la cual se produce realmente la reproducción a una
velocidad relativamente rápida (fase logarítmica). En consecuencia,
los indicadores de nutriente se metabolizan de forma óptima durante
sus periodos de crecimiento, en los que producen un cambio
característico y detectable en la muestra. Preferiblemente, el
indicador de nutriente incluye un resto de nutriente y un
cromógeno. Los cromógenos incluyen cualquier resto que produce un
cambio de color observable en la región del visible o fluorescencia
cuando se excita apropiadamente mediante la fuente de energía
apropiada. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, restos
ortonitrofenilo, fenolftaleína y
4-metilumbeliferona. Aunque el indicador de
nutriente puede proporcionar la única fuente de un nutriente
esencial, pueden proporcionarse otras fuentes de tales nutrientes,
siempre que se mantenga una selectividad y sensibilidad adecuadas
del medio.
La expresión "señal característica
detectable" incluye cualquier cambio en una muestra que puede
detectarse mediante uno o más de los sentidos humanos. La expresión
incluye ejemplos tales como un cambio de color en las regiones de
longitudes de onda del visible o fuera del visible, un cambio en el
estado tal como entre sólido, líquido y gas, una emisión de gas o
un cambio de olor.
El medio incluye suficiente piruvato de sodio
para ayudar en el crecimiento de células dañadas metabólicamente.
La expresión "dañado metabólicamente" incluye casos en los que
se altera el metabolismo celular con respecto al estado
homeostático u óptimo por una agresión externa. Los ejemplos de
"daño metabólico" incluyen casos de exposición celular a
condiciones de calor, frío, cloración o secado excesivos.
En otra realización preferida, el indicador de
nutriente altera el color del medio específico para el microbio. El
cambio de color puede ser evidente en la región de longitudes de
onda del visible, o puede ser fluorescencia que es evidente en la
región de longitudes de onda del visible tras la exposición a una
fuente externa de UV. El color generalmente resulta de la
liberación enzimática de un resto cromogénico del indicador de
nutriente. Este resto está coloreado cuando está conjugado con la
parte de nutriente del indicador de nutriente y es incoloro cuando
está en forma no conjugada (es decir, cuando ya no está conjugado
con, o unido a, el resto de nutriente). Los ejemplos de restos
cromogénicos que pueden conjugarse con un resto de nutriente
incluyen, pero no se limitan a restos de ortonitrofenilo que
producen un color amarillo cuando se liberan del indicador de
nutriente, restos de fenolftaleína que producen un color rojo cuando
se liberan del indicador de nutriente, restos de
4-metilumbeliferona que se vuelven fluorescentes
cuando se excitan a aproximadamente 366 nm cuando se liberan del
indicador de nutriente y restos de
bromo-cloro-indol que se vuelven
azules cuando se liberan del indicador de nutriente.
La expresión "medio específico para el
microbio" significa un medio que permite el crecimiento
sustancial sólo del microbio objetivo. Esto incluye medios que
contienen uno o más antibióticos específicos para inhibir el
crecimiento de microorganismos distintos al microbio objetivo e
incluye medios que contienen alternativa o adicionalmente uno o más
indicadores de nutriente que preferiblemente no los metabolizan los
microorganismos distintos al microbio objetivo en ningún grado
sustancial. El término "sustancial" tal como se usa en este
contexto, significa que el medio todavía permite la detección
específica (es decir, precisa en al menos un 95% o incluso un 98%)
y sensible (es decir, niveles de detección de al menos el 95% o
incluso el 98%) del microbio objetivo, tal como se mide mediante
procedimientos convencionales.
Aún en otra realización preferida, el microbio
es una bacteria coliforme o más específicamente el microbio
objetivo es Escherichia coli. Otras realizaciones preferidas
suponen la elección del indicador de nutriente. En una realización
preferida, el indicador de nutriente es un sustrato de
\beta-D-glucuronidasa, cuyos
ejemplos incluyen
ortonitrofenil-\beta-D-glucurónido,
\beta-naftalamida-\beta-D-glucurónido,
\alpha-naftol-\beta-D-glucurónido
y
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucurónido.
Alternativamente, el indicador de nutriente es un sustrato de
\beta-D-galactosidasa, cuyos
ejemplos incluyen
ortonitrofenil-\beta-D-galactopiranósido
y
4-metilumbeliferil-\beta-D-galactopiranósido.
El indicador de nutriente puede ser un sustrato de
\beta-D-glucosidasa, cuyos
ejemplos incluyen
ortonitrofenil-\beta-D-glucosa.
Aún en otra realización, el indicador de nutriente puede ser un
sustrato de L-pironidonil aminopeptidasa, tal como
ortonitrofenil-\beta-L-pironidonilo,
\beta-naftalamida-\beta-L-pironidonilo,
\alpha-naftol-\beta-L-pironidonilo
y
metilumbeliferil-3-L-pironidonilo,
o el indicador de nutriente puede ser un sustrato de
L-alanina aminopeptidasa, tal como
L-alanina-\beta-L-ortonitrofenilo,
\beta-naftalamida-\beta-L-alanina,
\alpha-naftol-\beta-L-alanina
y
4-metilumbeliferil-\beta-L-alanina.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La expresión "coliforme" significa
cualquiera de un grupo de bacterias con forma de bacilo,
oxidasa-negativas, gram-negativas
no formadoras de esporas que presentan actividad
\beta-galactosidasa y normalmente habitan en el
tracto gastrointestinal de los seres humanos. El grupo incluye
Klebsiella pneumonia y Escherichia coli, cuya
presencia en el agua la entienden los expertos en la técnica como
una presunta prueba de contaminación fecal, así como
Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii y
Serratia plymuthica.
El medio también contiene uno o más antibióticos
que evitan que microbios distintos al microbio objetivo metabolicen
el indicador de nutriente. Es decir, el medio contiene antibióticos
que son inhibidores específicos del crecimiento de microbios
distintos al microbio objetivo y evitan eficazmente el crecimiento
de al menos algunos de esos microbios. Lo más preferiblemente,
estos antibióticos actúan frente a una o más bacterias no coliformes
gram-positivas y gram-negativas.
Los ejemplos de tales agentes antimicrobianos que pueden ser útiles
frente a otras bacterias y levaduras incluyen colistina, ácido
nalidíxico, ansiomicina y anfotericina B.
Otra característica de la invención es un método
para detectar la presencia o ausencia de un microbio objetivo en
una muestra líquida medioambiental o biológica, preferiblemente que
incluye la etapa de calentar la muestra hasta la temperatura de
incubación en un incubador de líquido tras añadir el medio
específico para el microbio. Lo más preferiblemente, la temperatura
de incubación es de aproximadamente 35ºC. La expresión "incubador
de líquido" significa un líquido calentado hasta una temperatura
o intervalo de temperatura especificados. Esto puede incluir
cualquier forma de baño de agua, por ejemplo. Un incubador de este
tipo es ventajoso con respecto a los incubadores de aire usados
previamente, puesto que el medio puede alcanzar una temperatura de
incubación óptima más rápido en un incubador de líquido que en un
incubador de aire.
La invención también se caracteriza por un
método para detectar la presencia o ausencia de un microbio objetivo
en una muestra líquida medioambiental o biológica en un plazo de 24
horas. Pueden detectarse Escherichia coli y otros coliformes
usando este método en un plazo de sólo aproximadamente 18 horas.
Este método se caracteriza en primer lugar por mezclar la muestra
con el medio de la invención, calentar la mezcla de muestra y medio
hasta una temperatura de incubación, preferiblemente de 35ºC,
durante aproximadamente 20 minutos. La muestra se transfiere
entonces a un incubador de aire, preferiblemente a 35ºC, durante
aproximadamente 18 horas. El medio incluye una cantidad eficaz de
vitaminas, aminoácidos, elementos y sales de modo que pueden crecer
y reproducirse los microbios coliformes. Además, el medio incluye
una cantidad eficaz de un indicador de nutriente para mantener el
crecimiento de las bacterias coliformes y que produce una señal
característica detectable si lo metaboliza el microbio objetivo. A
continuación, se monitoriza la muestra para determinar si se ha
alterado la característica detectable. Preferiblemente, el medio
también contiene uno o más antibióticos en una cantidad suficiente
para inhibir o evitar el crecimiento de
no-coliformes que están presentes potencialmente en
la muestra de prueba.
La etapa de cuantificación supone proporcionar
una muestra medioambiental o biológica en forma líquida. La muestra
se sitúa o dispensa a la bolsa que contiene la muestra descrita por
Naqui et al., y se mezcla con un medio para permitir y
fomentar el crecimiento de bacterias objetivo. Se incuba la mezcla y
se detecta la cantidad y calidad del cambio de color. Se comparan
la cantidad y calidad obtenidas con una serie de muestras para las
que se conocía la concentración de bacterias.
La invención proporciona un medio optimizado
para determinar la presencia de microbios objetivo. Los microbios,
por ejemplo, bacterias, crecen mucho más rápido en este medio que en
los disponibles actualmente como resultado del aumento de las
cantidades de vitaminas y aminoácidos proporcionadas. Por lo tanto,
se dispone más rápidamente de los resultados de las pruebas. Los
rápidos resultados ahorran tiempo y dinero en el laboratorio. La
velocidad también disminuye la amenaza para la salud pública
permitiendo alertas y medidas de saneamiento tempranas para tratar
la presencia de algunos microorganismos en lugares como suministros
de agua potable y aguas de recreo. Además, el método de esta
invención generalmente no requiere pruebas de conformación puesto
que pueden usarse indicadores de nutriente específicos para el
microorganismo. Adicionalmente, la invención no requiere el uso de
un medio estéril.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes a partir de la siguiente descripción de las
realizaciones preferidas de la misma y a partir de las
reivindicaciones.
En la siguiente descripción, se hará referencia
a diversas metodologías conocidas por los expertos en las técnicas
química, biológica y microbiológica. Las composiciones, métodos y
productos de esta invención son aplicables a especímenes biológicos
y medioambientales y son útiles en las técnicas química, biológica y
microbiológica para la detección de microorganismos.
Los microorganismos específicos obtienen sus
nutrientes de una serie de fuentes. Sin embargo, la capacidad para
metabolizar ciertas fuentes puede ser única para un microorganismo o
grupo de microorganismos particular. Las familias, grupos o
especies de microorganismos pueden compartir la especificidad
enzimática para ciertos nutrientes que están ausentes en otros
microorganismos. Aprovechando las características metabólicas de
microorganismos específicos, es posible someter a prueba la
presencia de estos sistemas enzimáticos, y por tanto, de los
microorganismos que presentan ellos mismos estos sistemas
enzimáticos. Véase Edberg, citado anteriormente. Se han identificado
muchas enzimas
que son específicas para grupos particulares de microorganismos y probablemente se identificarán otras en el futuro.
que son específicas para grupos particulares de microorganismos y probablemente se identificarán otras en el futuro.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Las bacterias gram-negativas
contienen una endotoxina como parte de su membrana celular externa.
Pueden contaminar muestras medioambientales o biológicas así como
productos farmacéuticos y otras preparaciones médicas. Por tanto,
es importante tener disponibles métodos de detección eficaces para
determinar si están presentes bacterias
gram-negativas.
Algunas bacterias gram-negativas
como grupo tienen actividad de la enzima L-alanina
aminopeptidasa. Pueden usarse indicadores de nutriente tales como
L-alanina-\beta-ortonitrofenilo,
\beta-naftalamida-\beta-L-alanina,
\alpha-naftol-\beta-L-alanina
y
4-metilumbeliferil-\beta-L-alanina
en el medio como indicadores de nutriente para someter a prueba la
presencia o ausencia de bacterias gram-negativas. Se
conocen bien en la técnica antibióticos útiles para eliminar todas
las bacterias gram-positivas del medio. Por tanto,
es posible detectar la presencia de cualquier bacteria
gram-negativa usando indicadores de nutriente de
actividad L-alanina aminopeptidasa en un medio que
contiene un antibiótico que elimina bacterias
gram-positivas.
La enzima
\beta-D-glucosidasa se encuentra
en el grupo de bacterias Enterococcus. La enzima puede
catalizar la hidrólisis de indicadores de nutriente apropiados que
contienen restos cromogénicos o fluorogénicos unidos a un
\beta-glucósido. Puede usarse esta propiedad para indicar la presencia o ausencia de enterococos en una muestra. Pueden usarse indicadores de nutriente tales como 4-metilumbeliferil-\beta-D-glucopiranósido para indicar la presencia de enterococos. Puede inhibirse el crecimiento de otros microorganismos que expresan actividad \beta-D-glucosidasa proporcionando un medio que contiene antibióticos que mantienen el crecimiento de aquellos microorganismos que no son objetivo pero que no inhiben sustancialmente el crecimiento de Enterococcus. El sulfato de amicacina, bacitracina y anfotericina B son ejemplos de tales antibióticos. Adicionalmente, puede inhibirse el crecimiento de otros microorganismos proporcionando un entorno de crecimiento que tenga un pH alto de aproximadamente 9,6 o una temperatura elevada de aproximadamente 45ºC. Los enterococos pueden crecer a estos pH alto y temperatura elevada permitiendo la detección específica de enterococos en esas condiciones.
\beta-glucósido. Puede usarse esta propiedad para indicar la presencia o ausencia de enterococos en una muestra. Pueden usarse indicadores de nutriente tales como 4-metilumbeliferil-\beta-D-glucopiranósido para indicar la presencia de enterococos. Puede inhibirse el crecimiento de otros microorganismos que expresan actividad \beta-D-glucosidasa proporcionando un medio que contiene antibióticos que mantienen el crecimiento de aquellos microorganismos que no son objetivo pero que no inhiben sustancialmente el crecimiento de Enterococcus. El sulfato de amicacina, bacitracina y anfotericina B son ejemplos de tales antibióticos. Adicionalmente, puede inhibirse el crecimiento de otros microorganismos proporcionando un entorno de crecimiento que tenga un pH alto de aproximadamente 9,6 o una temperatura elevada de aproximadamente 45ºC. Los enterococos pueden crecer a estos pH alto y temperatura elevada permitiendo la detección específica de enterococos en esas condiciones.
Esta especie puede metabolizar el fosfato de
ortonitro-fenilo. Por tanto, si el medio de
crecimiento contiene este indicador de nutriente como la única
fuente de fosfato, Staphylococcus aureus crecerá mientras que
no lo harán otros microorganismos que no pueden metabolizar el
fosfato de ortonitrofenilo. Se producirá un cambio de color por la
liberación del resto ortonitrofenilo.
Esta especie requiere SO_{4} como su fuente de
azufre y esta especie puede metabolizar el sulfato de fenolftaleína.
Por tanto, en un medio selectivo cuya única fuente de azufre es
sulfato de fenolftaleína, esta especie crecerá y producirá un
cambio de color característico por la liberación del resto
coloreado.
La enzima
\beta-D-glucuronidasa está
presente en E. coli. Los indicadores de nutriente tales como
ortonitrofenil-\beta-D-glucurónido,
\beta-naftalamida-\beta-D-glucurónido,
\alpha-naftol-\beta-D-glucurónido
o
metilumbeliferil-\beta-D-glucurónido
son los ejemplos de indicadores de nutriente que puede usarse en un
medio para la detección de E. coli. Pueden añadirse los
antibióticos vancomicina y ansiomicina para seleccionar E.
coli de las bacterias gram-positivas y
levaduras en cantidades en peso de aproximadamente el 0,0001% al
0,01%.
Edberg, patente estadounidense número 4.925.789
informa sobre un medio de crecimiento bacteriano de base líquida
que permite la detección específica de E. coli en una muestra
tras aproximadamente 24 horas de incubación. Tiene una
especificidad notificada para detectar la presencia de una UFC
(unidad formadora de colonias) en 100 ml de volumen. Sin embargo, a
diferencia de los ejemplos específicos de Edberg, la detección de
coliformes totales incluyendo bacterias tales como E. coli
puede obtenerse en aproximadamente 18 horas si se usan otros medios
o métodos descritos en esta invención y sorprendentemente todavía
puede obtenerse una especificidad para detectar una UFC por 100 ml
de volumen. Específicamente, esta invención se caracteriza por
medios que aumentan la cantidad de vitaminas y aminoácidos
presentes para facilitar el crecimiento celular. Por ejemplo, se
obtienen tiempos de detección más cortos si se aumenta la cantidad
de vitaminas y aminoácidos con respecto a las cantidades mostradas
en el medio descrito por Edberg. Un medio que incluye los siguientes
compuestos es especialmente útil para detectar Escherichia
coli permitiendo la detección en un plazo de 24 horas debido a
la tasa de crecimiento más rápida y una especificidad excelente.
Proporcionar cantidades de componente I a niveles de 5 a 10 veces
los indicados permite la detección de Escherichia coli en un
plazo de 18 horas.
Aunque se indican aminoácidos y vitaminas, así
como algunos elementos, específicos, los expertos en la técnica
reconocerán, tal como se describió anteriormente, que pueden variar
significativamente las cantidades relativas de cada componente, sin
pérdida de especificidad.
En un ejemplo más específico de un medio de esta
invención, se proporciona el componente I a diez veces la cantidad
indicada en la tabla I (+/- 10%) con el componente II. Esto se
denomina en el presente documento medio 2.
Un sistema de detección con indicador de
nutriente basado en enzimas tiene la especificidad para detectar
una bacteria coliforme en un volumen de 100 ml en 18 horas. Pueden
detectarse las bacterias coliformes totales monitorizando el medio
para determinar la aparición de un intenso color amarillo en el
medio de prueba tras 18 horas cuando se usa
ortonitrofenil-\beta-D-galactopiranósido
(ONPG) en el medio como fuente primaria de hidratos de carbono. La
enzima \beta-D-galactosidasa se
encuentra en todas las bacterias coliformes y actúa para catalizar
la hidrólisis de
ortonitrofenil-\beta-D-galactopiranósido.
Esta reacción es tanto irreversible como extremadamente sensible a
la presencia de bacterias coliformes. Si está presente E.
coli entre los coliformes totales, el medio se vuelve azul
fluorescente cuando se coloca una lámpara ultravioleta en la región
de 366 nm cerca de la muestra de prueba. Esta fluorescencia se debe
a la hidrólisis de
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucurónido
(MUG) para producir el compuesto fluorescente
4-metilumbeliferona (MU) y la reacción está
catalizada por la enzima
\beta-D-glucuronidasa que se
encuentra en más del 97% de cepas de E. coli.
Puede lograrse la detección con la mayor
velocidad y el menor coste cuando se optimiza el medio para producir
la tasa de crecimiento bacteriano y la actividad enzimática más
rápidas. Adicionalmente, puede añadirse piruvato de sodio al medio
para ayudar en la recuperación y el crecimiento de bacterias dañadas
metabólicamente. Normalmente es suficiente una cantidad de
aproximadamente el 0,0005% en peso. También, la equilibración
térmica de la mezcla de muestra y medio hasta aproximadamente 35ºC
poniendo la muestra en un baño de agua a aproximadamente 35ºC
durante 20 minutos antes de colocarla en un incubador seco disminuye
significativamente el tiempo requerido para la detección.
Es importante detectar la presencia de bacterias
coliformes en el agua potable y en aguas de recreo. Si están
presentes agentes antibacterianos en el agua, puede ser útil añadir
agentes neutralizantes, tales como tiosulfato de sodio o EDTA
sódico. De otro modo, puede detectarse la presencia de coliformes
preparando la muestra según técnicas convencionales. Se recoge una
muestra de agua de 100 ml, se añade el medio de crecimiento a la
muestra, se incuba la muestra a una temperatura propicia para el
crecimiento bacteriano (que normalmente se produce a 35ºC) y la
presencia de coliformes está indicada por un cambio en el color de
la muestra tras aproximadamente 18 horas. Puede producirse un
resultado positivo en cualquier momento hasta 22 horas tras la
mezcla de la muestra y el medio. Puede producirse mucho más
rápidamente en presencia de una concentración relativamente elevada
de coliformes. Puede determinarse la presencia de un coliforme en un
volumen de 100 ml usando el medio y el procedimiento descritos en
esta invención.
Se ha demostrado que numerosos sustratos que
incluyen un resto cromogénico presentan un cambio de color
característico en muestras que contienen microorganismos objetivo
que muestran actividad enzimática específica. Por ejemplo, en
presencia de
\beta-D-glucuronidasa,
ortonitrofenil-\beta-D-glucurónido
produce un cambio de color a amarillo,
4-metilumbeliferil-glucurónido
produce fluorescencia tras excitación a 366 nm y
bromo-cloro-indol-\beta-D-glucurónido
produce un cambio de color a azul cuando está presente E.
coli. En presencia de
\beta-D-galactosidasa,
ortonitrofenil-\beta-D-galactopiranósido
produce un cambio de color a amarillo y
4-metilumbeliferil-\beta-D-galactopiranósido
produce fluorescencia tras excitación a 366 nm.
Algunas combinaciones han demostrado ser
eficaces para detectar la presencia de E. coli así como
bacterias coliformes totales. Puede usarse
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucurónido
junto con
ortonitrofenil-\beta-D-galactopiranósido.
Si está presente cualquier coliforme, la disolución cambia de color
a amarillo en la región de longitudes de onda del visible. Si están
presentes tanto E. coli así como otros coliformes, la
disolución de muestra tanto cambia de color a amarillo y como
fluoresce tras excitación a 366 nm.
Pueden producirse indicadores de nutriente
mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Los
métodos generalmente se caracterizan por el acoplamiento o la
conjugación de un resto de nutriente a un resto cromogénico,
produciendo de ese modo un indicador de nutriente. Se describen
ejemplos de métodos de este tipo por Edberg en la patente
estadounidense número 4.925.789.
Los dos procedimientos convencionales y
aceptados ampliamente para evaluar la presencia de microorganismos
en el agua potable incluyen la prueba de la fermentación en tubos
múltiples acoplada con el análisis del número más probable (NMP) y
la prueba de filtración con membrana (FM). El protocolo para estos
métodos para detectar bacterias coliformes supone pruebas de
presunción acopladas con pruebas de confirmación que suelen llevar
unas 48 a 96 horas para completarse. Además, los resultados de estas
pruebas se complican por la presencia de bacterias no coliformes
que pueden producir, si están presentes en más de 500
microorganismos por mililitro, lecturas de falso positivo o falso
negativo.
La invención de la prueba COLILERT®, descrita en
Edberg, patente estadounidense número 4.925.789, constituyó un
tremendo avance con respecto a los métodos disponibles previamente.
Usando ese método, es posible detectar coliformes en muestras en
concentraciones de tan sólo un microorganismo por 100 mililitros de
muestra. Se caracteriza por una combinación de la etapa de
presunción y la etapa de confirmación para la identificación
microbiana. Por lo tanto, la velocidad de detección es mucho más
rápida y se reducen mucho las posibilidades de obtener lecturas de
falso negativo o falso positivo puesto que están presentes diversos
agentes selectivos en el medio que limitan enormemente el
crecimiento de bacterias no coliformes. Sin embargo, los medios de
la presente invención contemplan el uso de al menos un aumento de
dos veces en la concentración de aminoácidos, vitaminas,
oligoelementos y sales con respecto a los medios usados previamente.
Sorprendentemente, este cambio en el medio produce una detección
mucho más rápida sin pérdida de especificidad.
La presente invención se comparó con los métodos
existentes para detectar coliformes y E. coli en
muestras.
Puede cuantificarse el número de microbios
objetivo presentes en una muestra líquida mezclando una muestra
líquida con el medio descrito anteriormente, poniendo la muestra
líquida que incluye el medio en recipientes adecuados para la
incubación, incubando la mezcla de muestra líquida y medio,
observando la cantidad y calidad de una señal característica
detectable y comparando la cantidad y calidad de una señal
característica detectable con los valores numéricos más probables.
Este procedimiento de cuantificación se caracteriza por comparar la
cantidad y calidad de la característica que se ha alterado,
preferiblemente un cambio de color, con los valores numéricos más
probables obtenidos a partir de muestras en las que se ha
correlacionado la concentración y el cambio característico con
muestras para las que se conoce la concentración bacteriana. Véase
por ejemplo, Compendium of Methods for the Microbiologic
Examination of Foods 3ª ed., editado por Vanderzant y
Splittstoesser, 1992. La técnica del número más probable permite
obtener estimaciones de concentraciones bacterianas que son
inferiores a los límites detectables de otros métodos. Se estima el
número más probable a partir de respuestas en las que se notifican
los resultados como positivos o negativos en una o más diluciones de
la muestra. El método requiere que no todas las muestras
proporcionen un resultado positivo y normalmente se requieren al
menos tres muestras de cada dilución. Se dispone de muchas tablas
del número más probable. Una serie de este tipo es la proporcionada
por de Man, Eur. J. Appl. Microbiol. 1:67 (1975). Pueden realizarse
estimaciones del número más probable usando la fórmula general
notificada por Thomas, J. Am. Water Works Assoc. 34:572 (1942) tal
como sigue:
NMP/g = P/
(NT)
en la que P es el número de tubos
positivos, N es la cantidad total de muestra en todos los tubos
negativos y T es la cantidad total de muestra en todos los tubos.
Las cantidades se notifican en cuanto a
gramos.
La invención emplea un aparato novedoso para
contener una muestra líquida. El aparato se caracteriza por una
bolsa que está diseñada para alojar una muestra líquida y
posteriormente distribuye la muestra líquida en compartimentos
separados dentro de la bolsa, de modo que pueden someterse a prueba
diferentes alícuotas de uno o más tamaños. La invención descrita en
esa solicitud permite además cuantificar los microorganismos
presentes en la muestra añadiendo un medio para fomentar el
crecimiento de microorganismos, termosellar la bolsa de la
invención durante aproximadamente cinco segundos a una temperatura
de aproximadamente 121,1ºC a 176,7ºC (250ºF a 350ºF), incubar la
muestra a una temperatura apropiada durante un periodo de tiempo
apropiado para permitir el crecimiento de microorganismos y
registrar y analizar los resultados. La etapa de cuantificación
supone detectar la cantidad y calidad del cambio de color y comparar
esa cantidad y calidad con los resultados obtenidos para una serie
de muestras para las que se conocía la concentración de bacterias
viables totales.
Experimento
1
El siguiente protocolo sigue los procedimientos
de la EPA de los EE.UU. Se siguió el procedimiento para la recogida
de muestras de microorganismos dañados. Se proporciona como medio
para garantizar que se usan la toma de muestras y el cuidado de las
muestras apropiados en comparaciones de la especificidad y el tiempo
requerido para obtener un resultado para los medios de esta
invención y los medios de la técnica anterior.
1. Se obtienen 2 litros de efluente cloacal
primario fresco de una fuente externa (por ejemplo, una planta de
tratamiento de aguas residuales).
2. Se hace pasar el efluente a través de un
filtro Whatman-40 (diámetro de 150 mm).
3. Se deja que el filtrado alcance la
temperatura ambiente antes del daño con cloro.
4. Se comprueban el pH y la temperatura del
efluente, luego se dispensan alícuotas de 49,5 ml a 21 vasos de
poliestireno que no contienen tiosulfato de sodio.
5. Se agitan las muestras sobre una plataforma
Roto-Mix 50800 (posición 2) a temperatura
ambiente.
6. Se añaden alícuotas de una disolución (a del
5 al 6%) de NaOCl (hipoclorito de sodio) a cada muestra a una
concentración final de 5 ppm. Se comprueban inmediatamente los
niveles de cloro libre y total de una muestra.
7. Se añaden 25 \mul de una disolución al 10%
de tiosulfato de sodio a la primera muestra tras 2 minutos. Se
añade la misma cantidad de tiosulfato de sodio a las muestras
restantes a intervalos de 2 minutos tras la primera adición.
8. Se mide la concentración de cloro libre y
total en el punto medio del daño y en la última muestra, justo
antes de la adición de tiosulfato de sodio.
9. Se determina el número de coliformes
supervivientes en cada muestra mediante filtración con membrana
sobre placas mEndo y se determina la concentración original de
coliformes en el efluente sin tratar mediante filtración con
membrana (diluciones requeridas) sobre placas mEndo.
10. Se cuenta el número de coliformes sobre cada
placa mEndo (un medio selectivo para E. coli) después de 22
a 24 horas de incubación. Se elige la muestra apropiada que ha
experimentado una reducción de 2 Log 10 a 4 Log 10 en la
concentración de coliformes totales y se prepara una serie de
diluciones de dos veces de esta muestra. El número de diluciones
realizadas depende del número de coliformes supervivientes presentes
y debe permitir que haya al menos dos diluciones que contengan
no-coliformes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñó este experimento para comparar el
rendimiento relativo del medio 2 y el medio de Colilert® en la
detección de la presencia de coliformes y E. coli dañadas a
partir de un efluente cloacal primario clorado. El procedimiento
seguido para comparar los dos medios incluyó inocular en primer
lugar cada muestra de efluente clorado diluido en el medio de
prueba con 1 ml de cada dilución en 3 pruebas Colilert® y 1 ml de
cada dilución en 3 pruebas con
medio 2.
medio 2.
A continuación, se equilibraron térmicamente las
pruebas con medio 2 durante 20 minutos en un baño de agua a 35ºC
+/- 0,5ºC y se pusieron las otras pruebas en un incubador seco a
35ºC +/- 0,5ºC. Tras 20 minutos, se pusieron las pruebas con medio
2 en el incubador seco a 35ºC. Entonces se monitorizaron el color y
la fluorescencia y se registraron los resultados a las 18 horas
para el medio 2 y a las 24 horas para el medio de Colilert®. Se
cultivaron en línea muestras con medio 2 positivas aleatorias sobre
agar EMB para el aislamiento y la identificación adicional
usando
API 20E.
API 20E.
\vskip1.000000\baselineskip
En estos estudios se usaron siete efluentes
procedentes de cuatro sitios diferentes geográficamente, separados
en Georgia, Maine, Connecticut y California. Se inocularon un total
de 201 vasos de medio 2 y 201 de Colilert® con las diluciones del
efluente tratado. Se obtuvieron los siguientes resultados:
Un análisis mediante la prueba de
Chi-cuadrado indicó que estos valores no eran
significativamente diferentes con un índice de confianza del 95%.
Se realizó un análisis de especiación de un total de 43 muestras con
medio 2 positivas usando el kit API 20E y las 43 muestras contenían
bacterias coliformes. Estos datos muestran que el medio 2, tras 18
horas de incubación, detectó un número similar de coliformes y E.
coli dañadas que el medio de Colilert® tras 24 horas de
incubación. Por lo tanto, el medio de esta invención es tan
específico como el medio de Colilert® y permite la detección de
microorganismos en 18 horas mientras que el medio de Colilert®
permite la detección en
24 horas.
24 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento
2
Se diseñó este experimento para comparar el
rendimiento del medio 2 con respecto al método del caldo de
lauril-triptosa (CLT) (referencia de la EPA) en la
detección de la presencia de coliformes y E. coli dañadas a
partir de un efluente cloacal primario clorado. Se obtuvieron los
resultados de las pruebas mediante la inoculación en primer lugar
de cada muestra diluida en el medio de prueba añadiendo 100 \mul
de cada dilución en 10 tubos de medio 2 (de 10 ml cada uno) y 100
\mul de cada dilución en 10 tubos de CLT (concentración 1x). A
continuación, se equilibraron térmicamente las pruebas con medio 2
durante 20 minutos en un baño de agua a 35ºC. Se pusieron
directamente los tubos con CLT en un incubador seco a 35ºC. Tras 20
minutos, se pusieron las pruebas con medio 2 en el incubador seco a
35ºC. Entonces se monitorizaron el color y la fluorescencia y se
registraron los resultados a las 18 horas para el medio 2. Se
cultivaron en línea muestras con medio 2 positivas aleatorias sobre
agar EMB para el aislamiento y la identificación adicional usando
API 20E. Entonces se comprobaron las muestras con CLT para
determinar la presencia de gas tras 24 y 48 horas de incubación. Si
había gas presente, se inocularon las muestras en 10 ml de CLVB
(caldo lactosado verde brillante) y 10 ml de caldo de E.
coli y
4-metilumbeliferona-glucurónido
(EC-MUG). Se incubaron los tubos con CLVB en un
incubador seco a 35ºC durante entre 24 y 48 horas. Se incubaron los
tubos con EC-MUG en un baño de agua a 44,5ºC
durante 24 horas. La presencia de gas en los tubos con CLVB indica
la presencia de coliformes. La presencia de gas y fluorescencia en
los tubos con EC-MUG indica la presencia de E.
coli. El experimento se completa tras haber finalizado la
incubación de los tubos con CLVB y EC-MUG.
\vskip1.000000\baselineskip
En este estudio se usaron dos efluentes
procedentes de dos sitios con efluentes cloacales primarios en Maine
y California. Se compararon un total de 240 tubos de NMP con medio
2 frente a 240 tubos con CLT. Los resultados son tal como
sigue:
Un análisis mediante la prueba de
Chi-cuadrado indicó que estos valores eran
significativamente diferentes con un índice de confianza del 95%.
Se realizó un análisis de especiación de un total de 46 muestras con
medio 2 positivas usando el kit API 20E y las 46 muestras contenían
bacterias coliformes. Por lo tanto, el medio 2 es mejor que el
método de CLT en la recuperación de coliformes y E. coli
dañadas a partir de un efluente cloacal primario.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento
3
Se diseñó este experimento para someter a prueba
el rendimiento del medio 2 y el medio de Colilert® en la detección
de coliformes y E. coli no dañadas en presencia de una alta
concentración de bacterias heterótrofas. Se siguió el siguiente
procedimiento. En primer lugar, se inocularon cada vaso de prueba de
100 ml con medio 2 y Colilert® con de 1 a 10 UFC de las siguientes
bacterias: Escherichia coli ATCC 25922, Citrobacter
freundii ATCC 8090,
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 y Enterobacter cloacae ATCC 33457. Entonces se repitió esta etapa con un segundo conjunto de muestras. Se inoculó Aeromonas hydrophilia ATCC 35654, Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145) o Pseudomonas putrefaciens (un aislado natural) en el segundo conjunto de vasos a un intervalo de concentración de 16.000 a 10.000 UFC/ml. Se inocularon los vasos de prueba con medio 2 y Colilert® con A. hydrophilia, Pseudomonas aeruginosa o P. putrefaciens solos para someter a prueba los resultados falsos positivos. Las pruebas con medio 2 se equilibraron térmicamente durante 20 minutos en un baño de agua a 35ºC y las pruebas con Colilert® se pusieron en un incubador seco a 35ºC. Tras 20 minutos, se pusieron las pruebas con medio 2 en el incubador seco a 35ºC. Entonces se monitorizaron el color y la fluorescencia y se registraron los resultados a las 18 horas para el medio 2 y a las 24 horas para Colilert®.
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 y Enterobacter cloacae ATCC 33457. Entonces se repitió esta etapa con un segundo conjunto de muestras. Se inoculó Aeromonas hydrophilia ATCC 35654, Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145) o Pseudomonas putrefaciens (un aislado natural) en el segundo conjunto de vasos a un intervalo de concentración de 16.000 a 10.000 UFC/ml. Se inocularon los vasos de prueba con medio 2 y Colilert® con A. hydrophilia, Pseudomonas aeruginosa o P. putrefaciens solos para someter a prueba los resultados falsos positivos. Las pruebas con medio 2 se equilibraron térmicamente durante 20 minutos en un baño de agua a 35ºC y las pruebas con Colilert® se pusieron en un incubador seco a 35ºC. Tras 20 minutos, se pusieron las pruebas con medio 2 en el incubador seco a 35ºC. Entonces se monitorizaron el color y la fluorescencia y se registraron los resultados a las 18 horas para el medio 2 y a las 24 horas para Colilert®.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron los siguientes resultados:
En este estudio se realizaron un total de 36
pruebas con medio 2 y 36 de Colilert. Nueve de cada conjunto de 36
pruebas contenían E. coli.
En este estudio se realizaron un total de 24
pruebas con medio 2 y 24 de Colilert.
Otras realizaciones se encuentran dentro de las
siguientes reivindicaciones.
Claims (15)
1. Medio específico para coliformes no
gelificado, líquido que permite la detección de la presencia o
ausencia de microbios objetivo en una muestra medioambiental o
biológica licuada que comprende:
vitaminas, una fuente de iones amonio, un
tampón, un agente antifúngico, un indicador de nutriente, un
antibiótico que evita o inhibe el crecimiento y la reproducción de
una o más especies o grupos de microbios que no son objetivo, un
inductor de una enzima que cataliza el metabolismo del indicador de
nutriente, un precursor de ADN,
ácido D-glucónico 0,13 - 0,16 g/l, una fuente de sulfito, aminoácidos en una concentración de al menos: alanina
0,025 g/l, arginina 0,030 g/l, ácido aspártico 0,056 g/l, ácido glutámico 0,1 g/l, glicina 0,015 g/l, prolina 0,09 g/l, cistina 0,002 g/l, histidina 0,006 g/l, isoleucina 0,01 g/l, leucina 0,030 g/l, lisina 0,03 g/l, metionina 0,01 g/l, fenilalanina 0,018 g/l, serina 0,029 g/l, treonina 0,018 g/l, triptófano 0,003 g/l, tirosina 0,0064 g/l y valina 0,023 g/l, hierro, calcio, fosfato, potasio, sodio, cobalto, cobre, plomo, magnesio, manganeso, cloruro, estaño y/o zinc y piruvato de
sodio,
ácido D-glucónico 0,13 - 0,16 g/l, una fuente de sulfito, aminoácidos en una concentración de al menos: alanina
0,025 g/l, arginina 0,030 g/l, ácido aspártico 0,056 g/l, ácido glutámico 0,1 g/l, glicina 0,015 g/l, prolina 0,09 g/l, cistina 0,002 g/l, histidina 0,006 g/l, isoleucina 0,01 g/l, leucina 0,030 g/l, lisina 0,03 g/l, metionina 0,01 g/l, fenilalanina 0,018 g/l, serina 0,029 g/l, treonina 0,018 g/l, triptófano 0,003 g/l, tirosina 0,0064 g/l y valina 0,023 g/l, hierro, calcio, fosfato, potasio, sodio, cobalto, cobre, plomo, magnesio, manganeso, cloruro, estaño y/o zinc y piruvato de
sodio,
que puede actuar para permitir la viabilidad y
reproducción de los microbios objetivo a una tasa tal que puede
observarse cualquier cambio detectable en dicha muestra en 18 horas
para una muestra con menos de 10 microbios objetivo por 100 ml.
2. Medio según la reivindicación 1, en el que la
fuente de iones amonio es sulfato de amonio, el tampón es ácido
libre de HEPES o la sal sódica de HEPES, el agente antifúngico es
anfotericina B y el inductor es
isopropil-\beta-D-tiogalactósido
o
etil-\beta-D-tioglucósido.
3. Medio según la reivindicación 1 ó 2, en el
que el indicador de nutriente es sustrato de
\beta-D-glucuronidasa o sustrato
de \beta-D-galactosidasa
seleccionado del grupo que consiste en
ortonitrofenil-\beta-D-glucurónido,
\beta-naftalamida-\beta-D-glucurónido,
\alpha-naftol-\beta-D-glucurónido,
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucurónido
(MUG),
ortonitrofenil-\beta-D-galactopiranósido
(ONPG) y
4-metilumbeliferil-\beta-D-galactopiranósido.
4. Medio según la reivindicación 1 ó 2, en el
que el indicador de nutriente es un sustrato de \beta glucosidasa
o un sustrato de L-pironidonil aminopeptidasa o un
sustrato de L-alanina aminopeptidasa.
5. Medio según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la concentración de sulfato de
amonio es de 4,5 a 5,5 g/l, de ácido libre de HEPES es de 6,0 a 7,5
g/l, de sal sódica de HEPES es de 4,7 a 5,8 g/l, de anfotericina B
es de 0,0009 a 0,0011 g/l, de ONPG es de 0,450 a 0,550 y de MUG es
de 0,067 a 0,085 g/l.
6. Medio según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el contenido de nitrógeno total es
de al menos 1,1 a 1,7 g/l.
7. Medio según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la concentración de los
aminoácidos es de 5x a 10x.
8. Medio según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la concentración de hierro es de
al menos
0,00165 \mug/l, de calcio es de al menos 0,0003 g/l, de fosfato es de al menos 0,1 g/l, de potasio es de al menos
0,007 g/l, de sodio es de al menos 0,03 g/l y/o trazas de cobalto, cobre, plomo, magnesio, manganeso, cloruro, estaño y zinc.
0,00165 \mug/l, de calcio es de al menos 0,0003 g/l, de fosfato es de al menos 0,1 g/l, de potasio es de al menos
0,007 g/l, de sodio es de al menos 0,03 g/l y/o trazas de cobalto, cobre, plomo, magnesio, manganeso, cloruro, estaño y zinc.
9. Medio según la reivindicación 8, en el que la
concentración de los aminoácidos, del hierro, calcio, fosfato,
potasio, sodio, cobalto, cobre, plomo, magnesio, manganeso, cloruro,
estaño y/o zinc es de 5x a 10x.
10. Medio según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho indicador de nutriente
altera el color de dicho medio específico para coliformes.
11. Medio según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho indicador de nutriente
altera el color de dicho medio específico para coliformes en la
región de longitudes de onda del visible.
12. Medio según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho indicador de nutriente
comprende un resto que puede fluorescer y detectable en la región de
longitudes de onda del visible tras la exposición a una fuente
luminosa de excitación.
13. Medio según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho medio es un polvo soluble
en agua, no estéril.
14. Medio según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que dichos microbios objetivo son o
bien E. coli o bien coliformes totales.
\newpage
15. Método para detectar la presencia o
ausencia de bacterias coliformes, preferiblemente E. coli, en
una muestra líquida medioambiental o biológica que comprende las
etapas de:
- a)
- mezclar dicha muestra líquida con el medio según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14,
- b)
- calentar dicha mezcla de muestra líquida y medio hasta una temperatura de incubación de 30 a 41ºC y se mantiene dicha muestra líquida a dicha temperatura de incubación durante 10 minutos o más; y
- c)
- monitorizar la muestra para determinar si se ha alterado dicha característica detectable.
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Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4088746A (en) * | 1976-11-11 | 1978-05-09 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Radioimmunoassay for thyroid-stimulating hormone (TSH) |
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| US4925789A (en) * | 1986-06-30 | 1990-05-15 | Edberg Stephen C | Method and medium for use in detecting target microbes in situ in a specimen sample of a possibly contaminated material |
| US4888287A (en) * | 1986-09-24 | 1989-12-19 | Eastman Kodak Company | Rapid differentiation of fungi from bacteria using polyene antibiotics |
| EP0347435A4 (en) * | 1987-09-04 | 1991-11-21 | Biogen, Inc. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing soluble t4 proteins |
| US5518894A (en) * | 1987-11-05 | 1996-05-21 | Berg; James D. | Rapid coliform detection system |
| DE3852825T2 (de) * | 1987-11-05 | 1995-05-18 | James D Berg | Schnellverfahren zum nachweis von coliformen mikroorganismen. |
| US5354663A (en) * | 1988-05-04 | 1994-10-11 | Charm Sciences, Inc. | Microbial inhibition test kit and method |
| IE65282B1 (en) * | 1990-04-12 | 1995-10-18 | Becton Dickinson Co | Identifying microorganisms by measuring enzymatic activity in the presence of enzyme activity affecting agents |
| CA2027536C (en) * | 1990-05-14 | 1993-02-16 | George Chang | Method for determination of e.coli in water |
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