CN107849572A - 用于可诱导共表达系统中的载体 - Google Patents

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CN107849572A CN201680035423.4A CN201680035423A CN107849572A CN 107849572 A CN107849572 A CN 107849572A CN 201680035423 A CN201680035423 A CN 201680035423A CN 107849572 A CN107849572 A CN 107849572A
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Abstract

本发明提供了用于能够受控地诱导各基因产物的表达的可诱导共表达系统中的表达载体。

Description

用于可诱导共表达系统中的载体
相关申请的交叉引用
本申请是美国申请No.14/740,475的部分继续申请，该美国申请是美国申请No.14/419,653的部分继续申请，后者是2013年8月5日提交的国际申请PCT/US2013/053562按照35U.S.C.§371的国家阶段进入，该国际申请依据35U.S.C.§119(e)要求2012年8月5日提交的美国临时申请No.61/679,751和2012年12月29日提交的美国临时申请No.61/747,246的利益，该所有申请的全部公开内容通过引用引入本文。
美国申请No.14/740,475也是2014年2月5日提交的国际申请PCT/US2014/014968的部分继续申请，该国际申请要求2013年8月5日提交的国际申请PCT/US2013/053562的优先权，该后一国际申请依据35U.S.C.§119(e)要求2012年8月5日提交的美国临时申请No.61/679,751和2012年12月29日提交的美国临时申请No.61/747,246的利益，该所有申请的全部公开内容通过引用引入本文。
序列表的引用
本申请包括电子提交的序列表，其通过引用引入本文。
技术领域
本发明总体属于分子生物学和生物技术生产的技术领域。更特别地，本发明属于重组蛋白质表达的技术领域。
背景技术
生物技术物质的产生是复杂的过程，在所需的产物是不同基因编码的分子的组合(如由两个或更多个不同多肽形成的多聚蛋白质)时更是如此。多个基因产物的成功共表达需要克服多种挑战，而这由于多于一个基因产物的同时表达而复杂化。必须克服的问题包括当使用多于一个类型的载体时产生相容的表达载体；获得正确化学计量比的产物；产生正确折叠的和对于结合伴体的处于正确构象的基因产物；从细胞和不希望的蛋白质如未正确折叠的和/或处于不正确构象中的蛋白质纯化出所需的产物；和最小化包涵体的形成，其作为最大化所需产物的产率的一个方面。已经采取了许多不同的途径来解决这些挑战，但仍有对于更好的共表达方法的需要。
几种可诱导的细菌蛋白质表达系统(包括含有lac和ara启动子的质粒)已设计用于表达单个蛋白质。这些系统在难以表达的蛋白质的共表达中具有有限的用途，因为它们不能在野生型大肠杆菌(E.coli)的整个生长培养物群体内同质地(homogenously)诱导蛋白质(Khlebnikov和Keasling,“Effect of lacY expression on homogeneity ofinduction from the Ptac and Ptrc promoter by natural and synthetic inducers”,Biotechnol Prog 2002May-Jun；18(3):672-674)。当诱导剂的转运蛋白的表达依赖于诱导剂的存在时，如在野生型大肠杆菌lac和ara系统的情况中，诱导剂的细胞浓度必须达到阈值水平以启动转运蛋白的产生，但一旦达到该阈值，非受控的正反馈环可以出现，其结果是细胞中诱导剂的高水平和相应地来自诱导型启动子的高水平表达：“全或无”现象。提高生长培养基中诱导剂的浓度增加了群体中处于高表达模式的细胞的比例。虽然这种类型的系统导致在群体规模下蛋白质表达的浓度依赖性诱导，但其对于需要对表达的紧密控制的蛋白质(包括为毒性的、具有不良溶解性或因为其它原因要求特定浓度的那些)的表达和产生不是最佳的。
已经进行了一些尝试以通过消除诱导剂依赖性的诱导剂转运而在单一启动子表达系统中解决“全或无”诱导的现象。一个实例是在乳糖渗透酶基因(lac Yam)中产生无效突变和使用lac启动子的可选诱导剂如IPTG(异丙基-硫代-D-半乳糖苷)，其可以在不存在转运蛋白的情况下在一定程度上穿过细胞膜(Jensen等,“The use of lizc-typepromoter in control analysis”,Eur J Biochem 1993Jan 15；211(1-2):181-191)。另一途径是在阿拉伯糖转运蛋白基因缺陷但具有乳糖渗透酶基因中的突变lacY(A117C)(这允许其转运阿拉伯糖到细胞中)的菌株中使用阿拉伯糖诱导启动子(Morgan-Kiss等,“Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coli araBAD promoter byuse of a lactose transporter of relaxed specificity”,Proc Natl Acad Sci U S A2002May 28；99(11):7373-7377)。
单个蛋白质表达系统的成分通常是不相容的，排除了其在共表达系统中的使用，因为它们可能受到不同诱导剂-启动子系统之间“交互”效应的不利影响，或需要相互排斥的基因组修饰，或经历一般的代谢调节。解决lac和ara诱导型启动子系统之间的“交互”问题的尝试包括AraC转录激活剂的定向进化以改善其在IPTG(lac启动子的诱导剂)存在下诱导araBAD启动子的能力(Lee等,“Directed evolution of AraC for improvedcompatibility of arabinose-and lactose-inducible promoters”,Appl EnvironMicrobiol 2007Sep；73(18):5711-5715；Epub 2007Jul 20)。但是，基于ara和lac诱导型启动子的表达载体之间的相容性仍然由于对于相互排斥的基因组修饰的需要而受到限制：对于通过阿拉伯糖对araBAD启动子的同质诱导需要lacY点突变(lacY(A117C))和对于通过IPTG对lac启动子的同质诱导需要无效lacY基因。一般代谢调节—例如，碳分解代谢产物阻遏(CCR)—也可以影响诱导型启动子的相容性。CCR特征在于当存在更优选的化合物时含碳化合物利用所需的基因的阻遏，如在葡萄糖先于其它糖优先利用中看到的。在ara和prp诱导型启动子系统的情况中，阿拉伯糖的存在降低了丙酸盐诱导来自prpBCDE启动子的表达的能力，一种据信涉及CCR的效应(Park等,“The mechanism of sugar-mediatedcatabolite repression of the propionate catabolic genes in Escherichia coli”,Gene 2012Aug 1；504(1):116-121,Epub 2012May 3)。显然存在着对于克服这些问题的可诱导共表达系统的需要。
发明内容
本发明提供了用于能够受控地诱导各基因产物组分的可诱导共表达系统中的表达载体。本发明的一个实施方式是一种包含两个或更多个诱导型启动子的表达构建体，其中至少一个所述诱导型启动子响应于不同于另一个所述诱导型启动子的诱导剂的诱导剂，且其中没有诱导型启动子是选自以下的诱导型启动子：四环素诱导启动子、铜诱导启动子和甲硫氨酸诱导启动子。在一些实施方式中，上述表达构建体不包含乳糖诱导启动子，且在某些实施方式中，上述表达构建体不包含通过磷酸盐耗竭诱导的启动子。在另外的实施方式中，表达构建体是染色体外的。本发明的另外的实施方式提供包含两个或更多个诱导型启动子的表达构建体，其中至少一个所述诱导型启动子响应于不同于另一个所述诱导型启动子的诱导剂的诱导剂，且(A)其中各诱导型启动子选自L-阿拉伯糖诱导启动子、丙酸盐诱导启动子、鼠李糖诱导启动子、木糖诱导启动子、乳糖诱导启动子和通过磷酸盐耗竭诱导的启动子；或(B)其中至少一个诱导型启动子选自araBAD启动子、prpBCDE启动子、rhaSR启动子、xlyA启动子、lacZYA启动子和phoA启动子；或(C)其中表达构建体包含至少一个丙酸盐诱导启动子(其在一些实施方式中是prpBCDE启动子)，及选自L-阿拉伯糖诱导启动子、鼠李糖诱导启动子、木糖诱导启动子、乳糖诱导启动子和通过磷酸盐耗竭诱导的启动子的至少一个诱导型启动子；或(D)其中表达构建体包含至少一个L-阿拉伯糖诱导启动子(其在一些实施方式中是araBAD启动子)，及选自丙酸盐诱导启动子、鼠李糖诱导启动子、木糖诱导启动子、乳糖诱导启动子和通过磷酸盐耗竭诱导的启动子的至少一个诱导型启动子；或(E)其中至少一个诱导型启动子是丙酸盐诱导启动子且至少一个另外的诱导型启动子是L-阿拉伯糖诱导启动子；或(F)其中表达构建体包含与SEQ ID NO:15的核苷酸4937-5185的至少50个(或至少75个，或至少100个)连续碱基具有至少80％(或至少90％，或至少95％)序列同一性的核苷酸序列；或(G)其中表达构建体包含与SEQ ID NO:15的核苷酸2818-3151的至少50个(或至少75个，或至少100个)连续碱基具有至少80％(或至少90％，或至少95％)序列同一性的核苷酸序列；或(H)其中表达构建体包含与SEQ ID NO:15的核苷酸2818-3151的至少50个(或至少75个，或至少100个)连续碱基具有至少80％(或至少90％，或至少95％)序列同一性和与SEQ ID NO:15的核苷酸4937-5185的至少50个(或至少75个，或至少100个)连续碱基具有至少80％(或至少90％，或至少95％)序列同一性的核苷酸序列；或(I)其中表达构建体包含与SEQ ID NO:15的核苷酸1833-5304的至少3000个(或至少3250个)连续碱基具有至少80％(或至少90％，或至少95％)序列同一性的核苷酸序列；或(J)其中表达构建体包含与SEQ ID NO:15的至少3000个(或至少3250个，或至少3500个，或至少4000个，或至少5000个)连续碱基具有至少80％(或至少90％，或至少95％)序列同一性的核苷酸序列；或(K)其中表达构建体包含SEQ ID NO:15的核苷酸1833-5304；或(L)其中表达构建体包含SEQ ID NO:15；或(M)其中表达构建体还包含编码与诱导型启动子结合的转录调节子的多核苷酸序列，其中在一些实施方式中，转录调节子选自AraC、PrpR、RhaR和XylR；或(N)其中表达构建体还包含编码从诱导型启动子转录的至少一个基因产物的至少一个多核苷酸序列。
本发明还提供包含选自以下的核苷酸序列的表达构建体：(a)与SEQ ID NO:15的核苷酸4937-5185的至少225个(或至少240个)连续碱基具有至少97％序列同一性的核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO:15的核苷酸4937-5304的至少300个(或至少350个)连续碱基具有至少80％(或至少90％，或至少95％)序列同一性的核苷酸序列；(c)与SEQ ID NO:15的核苷酸2818-3259的至少350个(或至少375个，或至少400个，或至少425个)连续碱基具有至少87％(或至少90％，或至少95％)序列同一性的核苷酸序列；(d)与SEQ ID NO:2的核苷酸10-1822的至少400个(或至少450个，或至少500个)连续碱基具有至少90％(或至少95％)序列同一性的核苷酸序列；(e)SEQ ID NO:15的核苷酸2818-3259；(f)SEQ ID NO:15的核苷酸4937-5185；(g)SEQ ID NO:15的核苷酸4937-5304；(h)SEQ ID NO:15的核苷酸2818-3259和SEQID NO:15的核苷酸4937-5185；(i)SEQ ID NO:15的核苷酸2818-3259和SEQ ID NO:15的核苷酸4937-5304；(j)SEQ ID NO:2的核苷酸10-1822；和(k)选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:15的核苷酸序列。在本发明的某些实施方式中，以上表达构建体包含选自L-阿拉伯糖诱导启动子(其在一些实施方式中是araBAD启动子)、丙酸盐诱导启动子(其在一些实施方式中是prpBCDE启动子)、鼠李糖诱导启动子(其在一些实施方式中是rhaSR启动子)、木糖诱导启动子(其在一些实施方式中是xlyA启动子)、乳糖诱导启动子(其在一些实施方式中是lacZYA启动子)和通过磷酸盐耗竭诱导的启动子(其在一些实施方式中是phoA启动子)的诱导型启动子，且在一些实施方式中，以上表达构建体还包含编码从诱导型启动子转录的至少一个基因产物的至少一个多核苷酸序列。
在本发明的另外的实施方式中，表达构建体通过包括将多核苷酸序列插入到选自pBAD240、pPRO43、pPRO44、pPRO45、pPRO430、pPRO430CloDF和pSOL的质粒中的步骤的方法产生。
本发明还提供了包含如以上段落中所述的本发明的至少一种表达构建体的宿主细胞，该表达构建体包含至少一个诱导型启动子。在本发明的一些实施方式中，这一宿主细胞是原核细胞，且在一些情况中，其是大肠杆菌细胞，在某些实施方式中，该大肠杆菌细胞是大肠杆菌ASE(DGH)细胞。在本发明的其它实施方式中，宿主细胞是真核细胞，且在一些情况中，其是酵母细胞，和在一些另外的情况中，其是酿酒酵母细胞。本发明还提供了进一步包含以下的一种或多种的宿主细胞：(a)araBAD基因的删除；(b)araE和/或araFGH基因的改变的基因功能；(c)lacY(A177C)基因；(d)prpB和/或prpD基因的降低的基因功能；(e)sbm/scpA-ygfD/argK-ygfGH/scpBC基因的降低的基因功能；(f)gor和trxB基因的降低的基因功能；(g)AscG基因的降低的基因功能；(h)编码缺乏信号肽的DsbC形式的多核苷酸；(i)编码Erv1p的多核苷酸；和(j)编码伴侣蛋白如蛋白质二硫键异构酶的多核苷酸。在某些另外的实施方式中，(A)宿主细胞具有编码用于至少一个诱导型启动子的诱导剂的转运蛋白的至少一个基因的基因功能的改变，且作为另一实例，其中编码转运蛋白的基因选自araE、araF、araG、araH、rhaT、xylF、xylG和xylH，或特别地是araE，或其中基因功能的改变更特别地是araE从组成型启动子的表达；(B)宿主细胞具有编码代谢至少一个诱导型启动子的诱导剂的蛋白质的至少一个基因的降低的基因功能水平，且作为进一步的实例，其中编码代谢至少一个所述诱导型启动子的诱导剂的蛋白质的基因选自araA、araB、araD、prpB、prpD、rhaA、rhaB、rhaD、xylA和xylB；(C)宿主细胞具有编码参与至少一个诱导型启动子的诱导剂的生物合成的蛋白质的至少一个基因的降低的基因功能水平，该基因在进一步的实施方式中选自scpA/sbm、argK/ygfD、scpB/ygfG、scpC/ygfH、rmlA、rmlB、rmlC和rmlD；(D)宿主细胞具有硫氧还蛋白还原酶基因，特别地trxB的降低的基因功能水平；(E)宿主细胞具有谷胱甘肽还原酶基因和/或谷胱甘肽合成酶基因的降低的基因功能水平，该基因在某些实施方式中是谷胱甘肽还原酶基因gor和/或一个或多个谷胱甘肽合成酶基因gshA和gshB；(F)宿主细胞表达AhpC的至少一个突变体形式；(G)宿主细胞包含含有至少一个L-阿拉伯糖诱导启动子和编码AraC的多核苷酸序列的表达构建体，其中宿主细胞具有编码代谢至少一个所述L-阿拉伯糖诱导启动子的诱导剂的蛋白质的至少一个基因的降低的基因功能，其中该基因选自araA和araB；和/或(H)宿主细胞包含含有至少一个丙酸盐诱导启动子和编码PrpR的多核苷酸序列的表达构建体，其中宿主细胞具有编码代谢至少一个所述丙酸盐诱导启动子的诱导剂的蛋白质的至少一个基因的降低的基因功能，其中该基因选自prpB和prpD。
在本发明的其它方面中，提供了包含两个或更多个类型的表达构建体的宿主细胞，其中各类型的所述表达构建体包含诱导型启动子，其中各类型的表达构建体包含的诱导型启动子不是各其它类型的表达构建体的诱导型启动子，或者其中各类型的表达构建体包含的复制起点与各其它类型的表达构建体的复制起点不同。
在本发明的另外的实施方式中，宿主细胞包含的至少一种表达构建体进一步包含编码与诱导型启动子结合的转录调节子的多核苷酸序列，在一些实施方式中，编码转录调节子的多核苷酸序列和所述转录调节子与其结合的诱导型启动子在相同的表达构建体中，且在进一步的情况中，转录调节子选自AraC、PrpR、RhaR和XylR，或特别地是AraC，或者是PrpR。
本发明还提供了宿主细胞，其包含如以上段落中所述的至少一种表达构建体，该表达构建体包含至少一个诱导型启动子，其中该至少一种表达构建体还包含编码从诱导型启动子转录的至少一个基因产物的至少一个多核苷酸序列。本发明的其它实例包括包含至少一种表达构建体的宿主细胞，该表达构建体包含至少一个诱导型启动子和编码从诱导型启动子转录的基因产物的至少一个多核苷酸序列，其中在某些实施方式中，至少一个基因产物是多肽，或是缺乏信号序列的多肽，或是形成至少一个和少于二十个二硫键、或至少两个和少于十七个二硫键、或至少十八个和少于一百个二硫键、或至少三个和少于十个二硫键、或至少三个和少于八个二硫键的多肽，或是形成选自一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个和九个的多个二硫键的多肽，或是免疫球蛋白重链或轻链或其片段，或是英夫利昔单抗重链或轻链或其片段。
本发明还提供了产生基因产物的方法，如通过使如上所述的本发明的宿主细胞的培养物生长；且在一些实施方式中通过添加至少一个诱导型启动子的诱导剂到培养物中；且在进一步的实施方式中通过从培养物纯化基因产物。在本发明的特定方面中，通过上述方法产生的基因产物是形成至少一个二硫键、或形成至少两个和少于十七个二硫键、或形成至少两个和少于十个二硫键、或形成选自一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个和九个的多个二硫键的多肽，或是免疫球蛋白重链或轻链或其片段。本发明还提供通过上述方法产生的基因产物，其中该基因产物是缺乏信号肽，且在某些实施方式中，形成至少一个二硫键、或至少两个和少于十七个二硫键、或至少十八个和少于一百个二硫键、或至少三个和少于十个二硫键、或至少三个和少于八个二硫键，或形成选自一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个和九个的多个二硫键的多肽，或是免疫球蛋白重链或轻链或其片段。本发明还提供通过这一方法产生的基因产物，且在一些实施方式中，该基因产物是多聚产物的部分，在某些实施方式中该多聚产物是抗体，或在更特别的情况中，是非糖基化抗体、嵌合抗体或人抗体。
本发明的系统和方法还提供包含如以上段落中所述的表达构建体的试剂盒；包含含有如以上段落中所述的本发明的至少一种表达构建体的宿主细胞的试剂盒；和包含通过使本发明的宿主细胞生长而产生的基因产物或多聚产物的试剂盒，其在一些实施方式中包括添加至少一种诱导剂到培养物中，其中在一些实施方式中多聚产物是抗体，或在更特别的情况中，是非糖基化抗体、嵌合抗体或人抗体。
附图说明
图1是可诱导共表达系统的示意性图解，其包括宿主细胞(1)，该宿主细胞包含两种不同的可诱导表达载体(3)和(4)，其在施用诱导剂(5)时表达不同的基因产物，因而形成多聚产物(6)。
图2是可诱导共表达系统的特定用途的示意性图解，其中大肠杆菌宿主细胞基因组(2)编码二硫键异构酶DsbC的胞质形式(其缺乏信号肽)；表达载体pBAD24(或包含L-阿拉伯糖诱导启动子的另一表达载体，如pBAD240)(3)提供免疫球蛋白重链的L-阿拉伯糖诱导的表达，和表达载体pPRO33(或包含丙酸盐诱导启动子的另一表达载体，如pPRO43、pPRO430、pPRO430(CloDF13)、pPRO44或pPRO45)(4)提供免疫球蛋白轻链的丙酸盐诱导的表达；从而在诱导(5)时形成多聚的抗体产物(6)。
图3是可诱导共表达系统的示意性图解，其包括包含可诱导表达载体的宿主细胞(1)，该可诱导表达载体包含两种不同的诱导型启动子(3)和(4)，其施用诱导剂(5)时表达不同的基因产物，因而形成多聚产物(6)。
图4是可诱导共表达系统的特定用途的示意性图解，其中大肠杆菌宿主细胞基因组(2)包括遗传改变，如缺乏信号肽的二硫键异构酶DsbC的胞质形式；多启动子表达载体如pSOL提供(3)免疫球蛋白重链的L-阿拉伯糖诱导的表达和(4)免疫球蛋白轻链的丙酸盐诱导的表达；从而在诱导(5)时形成多聚的抗体产物(6)。
图5是用于可诱导共表达系统中的载体(“双重载体”，也称为“pSOL”)的示意性图示。
图6显示细菌细胞中荧光蛋白的共表达的时间过程，在该图中，显示了来自从丙酸盐诱导prpBCDE启动子表达的红色荧光蛋白(RedFP)的荧光。'pSOL'：大肠杆菌ASE(DGH)细胞中的pSOL-YellowFP-RedFP。'pPRO,pBAD'：大肠杆菌ASE(DGH)细胞中的pBAD24-YellowFP/pPRO33-RedFP。图例中显示了各平均化样品组的诱导剂浓度，其中首先列出丙酸盐浓度(0mM、5mM或20mM)，接着是L-阿拉伯糖浓度(0微摩尔、6.66微摩尔或66.61微摩尔)。
图7显示细菌细胞中荧光蛋白的共表达的时间过程，在该图中，显示了来自从L-阿拉伯糖诱导araBAD启动子表达的黄色荧光蛋白(YellowFP)的荧光。'pSOL'：大肠杆菌ASE(DGH)细胞中的pSOL-YellowFP-RedFP。'pBAD,pPRO'：大肠杆菌ASE(DGH)细胞中的pBAD24-YellowFP/pPRO33-RedFP。图例中显示了各平均化样品组的诱导剂浓度，其中首先列出L-阿拉伯糖浓度(0微摩尔、6.66微摩尔或66.61微摩尔)，接着是丙酸盐浓度(0mM、5mM或20mM)。
具体实施方式
不相容的共表达系统组分的问题通过开发利用位于独立的表达构建体上且在一些实施方式中通过不同诱导剂激活的相容性的可同质诱导的启动子系统的协同细菌共表达系统组分来解决。本发明的优势包括，但不限于：1)可诱导共表达系统内组分的改善的相容性；2)在一起形成多聚体的基因产物或基因产物的其它组合的可诱导表达(两个或更多个基因产物的共表达)；3)通过可独立滴定的诱导对基因产物共表达的改进的控制；4)难以表达的基因产物复合物和其它产物(如多聚体产物和形成二硫键的产物)的改进的表达；5)基因产物共表达的顺利优化。
共表达的基因产物。本发明的可诱导共表达系统设计为共表达两个或更多个不同的基因产物，其构成所需的产物。所需的产物可以是由共表达的基因产物形成的多聚体，或者共表达可以用于产生所需的产物加有助于所需产物的表达的一种或多种另外的产物的组合。
“多聚产物”是指共组装以完成多聚产物的功能的一组基因产物，且不是指基因产物和其它分子如修饰酶(激酶、肽酶等等)、伴侣蛋白、转运蛋白等的暂时缔合。在本发明的某些实施方式中，多聚产物是杂多聚体。在许多实施方式中，共表达基因产物是作为多聚蛋白质的亚基的多肽。但是，也可能使用本发明的可诱导共表达系统以共表达多种不同的非编码RNA分子或多肽和非编码RNA基因产物的组合。非编码RNA分子(也称为非蛋白质编码RNA(npcRNA)、非信使RNA(nmRNA)和功能性RNA(fRNA))包括许多不同类型的RNA分子如微RNA，其不是信使RNA且因此不是用于通过翻译形成多肽的模板。
许多生物学重要的产物由不同多肽链的组合形成。除了抗体和抗体片段外，可以通过本发明的可诱导共表达方法产生的其它多聚产物包括G-偶联的蛋白质受体和配体-门控离子通道如烟碱型乙酰胆碱受体、GABAA受体、甘氨酸受体、5-羟色胺受体、谷氨酸受体和ATP-门控受体如P2X受体。肉毒杆菌神经毒素(通常称为BoTN、BTX，或其商业可得形式之一，(onabotulinumtoxinA))由通过二硫键连接的重链和轻链形成(Simpson等,“The role of the interchain disulfide bond in governing the pharmacologicalactions of botulinum toxin”,J Pharmacol Exp Ther 2004Mar；308(3):857-864,Epub2003Nov 14)。由不同多肽链形成的产物的另一实例是胰岛素，其在真核生物中首先翻译为单一多肽链，折叠并然后切割以最终形成通过二硫键保持在一起的两条多肽链。肉毒杆菌神经毒素或成熟胰岛素在单一宿主细胞中的有效产生是本发明的可诱导共表达方法的用途的实例。
本发明的方法设计为产生正确折叠和/或组装成功能性产物且在这种功能性产物内的所需位置中具有所需数目的二硫键(其可以通过如实施例11中的方法确定)的基因产物。基因产物如多肽的二硫键的数目是在该基因产物以所需功能性产物存在时由该基因产物形成的分子内和分子间键的总数。例如，人IgG抗体的轻链通常具有三个二硫键(两个分子内键和一个分子间键)，且人IgG抗体的重链通常具有七个二硫键(四个分子内键和三个分子间键)。在一些实施方式中，所需基因产物与有益于所需基因产物产生的其它基因产物如伴侣蛋白共表达。伴侣蛋白是帮助其它基因产物的非共价折叠或解折叠和/或组装或分解的蛋白质，但不存在于单体或多聚体基因产物结构执行其正常生物学功能时(已经完成折叠和/或组装的过程)的最终单体或多聚体基因产物结构中。伴侣蛋白可以由表达构建体内的诱导型启动子或组成型启动子表达，或可以由宿主细胞染色体表达；优选地，伴侣蛋白在宿主细胞中的表达以足够高的水平产生正确折叠和/或组装成所需产物的共表达的基因产物。大肠杆菌宿主细胞中存在的伴侣蛋白的实例是折叠因子DnaK/DnaJ/GrpE、DsbC/DsbG、GroEL/GroES、IbpA/IbpB、Skp、Tig(触发因子)和FkpA，其已经用于防止胞质或周质蛋白质的蛋白质聚集。DnaK/DnaJ/GrpE、GroEL/GroES和ClpB可以协同地发挥帮助蛋白质折叠的功能且因此这些伴侣蛋白组合的表达已显示有益于蛋白质表达(Makino等,“Strainengineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria”,Microbcell Fact 2011May 14；10:32)。当在原核宿主细胞中表达真核细胞蛋白质时，真核细胞伴侣蛋白如来自相同或相关真核生物物种的蛋白质二硫键异构酶(PDI)在本发明的某些实施方式中与所需基因产物共表达或可诱导地共表达。
诱导型启动子。以下是可用于表达构建体中以表达或共表达基因产物的诱导型启动子以及可对包含这类表达构建体的宿主细胞进行的一些遗传修饰的描述。除非另外指定，这些诱导型启动子和相关基因的实例来自大肠杆菌菌株MG1655(美国典型培养物保藏中心保藏号ATCC 700926)，其是大肠杆菌K-12的亚株(美国典型培养物保藏中心保藏号ATCC 10798)。表1列出了诱导型启动子和相关基因的这些实例的核苷酸序列在大肠杆菌MG1655中的基因组位置。如表1中基因组位置所指的核苷酸和其它遗传序列明确地通过引用引入本文。关于本文描述的大肠杆菌启动子、基因和菌株的另外的信息可以在许多公开来源中发现，包括位于ecoliwiki.net的在线EcoliWiki资源。
阿拉伯糖启动子。(如本文中使用的，“阿拉伯糖”意思是L-阿拉伯糖。)参与阿拉伯糖利用的几种大肠杆菌操纵子可通过阿拉伯糖诱导—araBAD、araC、araE和araFGH—但术语“阿拉伯糖启动子”和“ara启动子”通常用于指araBAD启动子。几个另外的术语已用于指大肠杆菌araBAD启动子，如Para、ParaB、ParaBAD和PBAD。本文中“ara启动子”或以上给出的任何可选术语的使用意思是大肠杆菌araBAD启动子。如可从另一术语“araC-araBAD启动子”的使用看到的，araBAD启动子被认为是双向启动子的部分，具有沿一个方向控制araBAD操纵子的表达的araBAD启动子，和与araBAD启动子紧密靠近且在araBAD启动子的相反链上沿另一方向控制araC编码序列的表达的araC启动子。AraC蛋白是araBAD启动子的正向和负向转录调节子。在不存在阿拉伯糖的情况下，AraC蛋白质阻遏由PBAD的转录，但在阿拉伯糖存在下，在结合阿拉伯糖时改变其构象的AraC蛋白质变成允许由PBAD的转录的正向调控元件。araBAD操纵子编码通过将L-阿拉伯糖经中间体L-核酮糖和L-核酮糖-磷酸转化成D-木酮糖-5-磷酸而代谢L-阿拉伯糖的蛋白质。为使由阿拉伯糖诱导启动子的表达的诱导最大化的目的，有利的是消除或降低催化L-阿拉伯糖至L-核酮糖的转化的AraA的功能和也任选地消除或降低AraB和AraD中至少一种的功能。消除或降低宿主细胞降低细胞中阿拉伯糖的有效浓度的能力(通过消除或降低细胞转化阿拉伯糖为其它糖的能力)允许更多的阿拉伯糖可用于阿拉伯糖诱导启动子的诱导。编码将阿拉伯糖移动到宿主细胞中的转录蛋白的基因是araE(其编码低亲和性L-阿拉伯糖质子共输送体)和araFGH操纵子(其编码ABC超家族高亲和性L-阿拉伯糖转录蛋白的亚基)。可以将L-阿拉伯糖转运到细胞中的其它蛋白质是LacY乳糖渗透酶的某些突变体：LacY(A177C)和LacY(A177V)蛋白，其分别具有177位的半胱氨酸或缬氨酸而不是丙氨酸(Morgan-Kiss等,“Long-term and homogeneous regulationof the Escherichia coli araBAD promoter by use of a lactose transporter ofrelaxed specificity”,Proc Natl Acad Sci USA 2002May 28；99(11):7373-7377)。为了获得阿拉伯糖诱导启动子的同质诱导，有利的是使得独立于阿拉伯糖的调节而将阿拉伯糖转运到细胞中。这可以通过消除或降低AraFGH转录蛋白的活性和改变araE的表达以使得其仅由组成型启动子转录来完成。araE的组成型表达可以通过消除或降低原始araE基因的功能并将包括由组成型启动子表达的AraE蛋白质的编码序列的表达构建体引入细胞中来完成。或者，在缺乏AraFGH功能的细胞中，控制宿主细胞的染色体araE基因表达的启动子可以从阿拉伯糖诱导启动子改变为组成型启动子。以类似的方式，作为阿拉伯糖诱导启动子的同质诱导的另外的替代方式，缺乏AraE功能的宿主细胞可以具有由组成型启动子表达的细胞存在的任何功能性AraFGH编码序列。作为另一替代方式，有可能通过用宿主染色体中的组成型启动子取代原始araE和araFGH启动子而由组成型启动子表达araE基因和araFGH操纵子两者。也可能消除或降低AraE和AraFGH阿拉伯糖转运蛋白两者的活性，且在该情况中使用LacY乳糖渗透酶中的突变(其允许这一蛋白质转运阿拉伯糖)。由于lacY基因的表达通常不是由阿拉伯糖调节的，LacY突变体如LacY(A177C)或LacY(A177V)的使用在阿拉伯糖诱导启动子通过阿拉伯糖的存在诱导时不导致“全或无”的诱导现象。因为LacY(A177C)蛋白表现为在转运阿拉伯糖到细胞中更有效，因此编码LacY(A177C)蛋白的多核苷酸的使用相对于编码LacY(A177V)蛋白的多核苷酸的使用是优选的。
丙酸盐启动子。“丙酸盐启动子”或“prp启动子”是大肠杆菌prpBCDE操纵子的启动子，且也称为PprpB。像ara启动子一样，prp启动子是双向启动子的部分，该双向启动子沿一个方向控制prpBCDE操纵子的表达，并具有沿另一方向控制prpR编码序列的表达的prpR启动子。PrpR蛋白是prp启动子的转录调节子，并在PrpR蛋白结合2-甲基柠檬酸(“2-MC”)时激活prp启动子的转录。丙酸盐(也称为丙酸根)是丙酸(或“丙酸”)的离子CH3CH2COO-，并是共有具有通式H(CH2)nCOOH的“脂肪”酸类分子的特定性质的最小脂肪酸：在从水中盐析时产生油层并具有皂性钾盐。商业可得的丙酸盐一般作为丙酸的单价阳离子盐如丙酸钠(CH3CH2COONa)或作为二价阳离子盐如丙酸钙(Ca(CH3CH2COO)2)出售。丙酸盐是膜渗透的并通过由PrpE(丙酰-CoA合成酶)将丙酸盐转化成丙酰-CoA，并然后由PrpC(2-甲基柠檬酸合成酶)将丙酰-CoA转化成2-MC而代谢为2-MC。由prpBCDE操纵子编码的其它蛋白质，PrpD(2-甲基柠檬酸脱水酶)和PrpB(2-甲基异柠檬酸裂合酶)，参与2-MC转化为更小的产物如丙酮酸和琥珀酸的进一步分解代谢。为了最大化通过添加到细胞生长培养基中的丙酸盐对丙酸盐诱导启动子的诱导，因此希望的是具有PrpC和PrpE活性(以将丙酸盐转化成2-MC)但也有消除或降低的PrpD活性及任选地消除或降低的PrpB活性(以防止2-MC被代谢)的宿主细胞。编码参与2-MC生物合成的蛋白质另一操纵子是scpA-argK-scpBC操纵子，也称为sbm-ygfDGH操纵子。这些基因编码琥珀酸转化为丙酰-CoA需要的蛋白质，丙酰-CoA然后可以通过PrpC转化为2-MC。这些蛋白质的功能的消除或降低将除去用于产生2-MC诱导剂的平行途径，并因此可能降低丙酸盐诱导启动子的背景表达水平并提高丙酸盐诱导启动子对外源供应的丙酸盐的敏感性。已发现引入到大肠杆菌BL21(DE3)中以产生菌株JSB的sbm-ygfD-ygfG-ygfH-ygfI的删除(Lee和Keasling,“A propionate-inducible expression systemfor enteric bacteria”,Appl Environ Microbiol 2005Nov；71(11):6856-6862))有助于降低不存在外源供应的诱导剂的情况下的背景表达，但这一删除也降低JSB菌株中由prp启动子的总体表达。但是，应当注意sbm-ygfD-ygfG-ygfH-ygfI删除也明显影响ygfI，其编码具有未知功能的推定LysR-家族转录调节子。基因sbm-ygfDGH作为一个操纵子转录，而ygfI从相反链转录。ygfH和ygfI编码序列的3'末端少量碱基对重叠，因而除去全部sbm-ygfDGH操纵子的删除也明显除去ygfI编码功能。消除或降低sbm-ygfDGH基因产物的子集如YgfG(也称为ScpB，甲基丙二酰-CoA脱羧酶)的功能或删除大部分sbm-ygfDGH(或scpA-argK-scpBC)操纵子的大部分而同时留下足够的ygfH(或scpC)基因的3'末端以使得ygfI的表达不受影响可能足以降低从丙酸盐诱导启动子的背景表达而不降低诱导表达的最高水平。
鼠李糖启动子。(如本文中使用的，“鼠李糖”意思是L-鼠李糖。)“鼠李糖启动子”或“rha启动子”或PrhaSR是大肠杆菌rhaSR操纵子的启动子。像ara和prp启动子一样，rha启动子是双向启动子的部分，该双向启动子沿一个方向控制rhaSR操纵子的表达，且具有沿另一方向控制rhaBAD操纵子的表达的rhaBAD启动子。但是，rha启动子具有参与调节表达的两个转录调节子：RhaR和RhaS。RhaR蛋白质在鼠李糖存在下激活rhaSR操纵子的表达，而RhaS蛋白质分别激活L-鼠李糖分解代谢和转运操纵子(rhaBAD和rhaT)的表达(Wickstrum等,“TheAraC/XylS family activator RhaS negatively autoregulates rhaSR expression bypreventing cyclic AMP receptor protein activation”,J Bacteriol 2010Jan；192(1):225-232)。虽然RhaS蛋白质也可以激活rhaSR操纵子的表达，但实际上RhaS通过干扰环AMP受体蛋白质(CRP)与RhaR共激活表达到高得多的水平的能力而负向地自动调节这种表达。rhaBAD操纵子编码鼠李糖分解代谢蛋白RhaA(L-鼠李糖异构酶)，其转化L-鼠李糖为L-鼠李树胶糖(rhamnulose)；RhaB(鼠李树胶糖激酶)，其磷酸化L-鼠李树胶糖以形成L-鼠李树胶糖-1-P；和RhaD(鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶)，其转化L-鼠李树胶糖-1-P为L-乳醛(lactaldehyde)和DHAP(二羟基丙酮磷酸)。为使细胞中可供诱导鼠李糖诱导启动子的表达的鼠李糖量最大化，希望的是通过消除或降低RhaA或任选地RhaA及RhaB和RhaD中至少一种的功能来降低通过分解代谢降解的鼠李糖的量。大肠杆菌细胞也可以通过由rmlBDACX(或rfbBDACX)操纵子编码的蛋白质RmlA、RmlB、RmlC和RmlD(也分别称为RfbA、RfbB、RfbC和RfbD)的活性从α-D-葡萄糖-1-P合成L-鼠李糖。为降低从鼠李糖诱导启动子的背景表达和增强外源供应的鼠李糖对鼠李糖诱导启动子诱导的敏感性，可能有利的是消除或降低RmlA、RmlB、RmlC和RmlD蛋白质中一种或多种的功能。L-鼠李糖通过RhaT，鼠李糖渗透酶或L-鼠李糖:质子共输送体，转运到细胞中。如上所述，RhaT的表达通过转录调节子RhaS激活。为使RhaT的表达独立于鼠李糖(其诱导RhaS的表达)的诱导，宿主细胞可以改变以使得细胞中所有功能性RhaT编码序列由组成型启动子表达。另外，RhaS的编码序列可以删除或灭活，以使得不产生功能性RhaS。通过消除或降低细胞中RhaS的功能，来自rhaSR启动子的表达水平由于不存在RhaS的负向自动调节而提高，且鼠李糖分解代谢操纵子rhaBAD的表达水平降低，从而进一步提高鼠李糖诱导来自rha启动子的表达的能力。
木糖启动子。(如本文中使用的，“木糖”意思是D-木糖。)木糖启动子或“xyl启动子”或PxylA意思是大肠杆菌xylAB操纵子的启动子。木糖启动子区域在组织上与其它诱导型启动子类似，其中xylAB操纵子和xylFGHR操纵子在大肠杆菌染色体上沿相反的方向由邻近木糖诱导启动子表达(Song和Park,“Organization and regulation of the D-xyloseoperons in Escherichia coli K-12:XylR acts as a transcriptional activator”,JBacteriol.1997Nov；179(22):7025-7032)。PxylA和PxylF启动子两者的转录调节子是XylR，其在木糖的存在下激活这些启动子的表达。xylR基因作为xylFGHR操纵子的部分表达或由位于xylH和xylR蛋白质编码序列之间的其自身的弱启动子(其不是由木糖诱导)表达。D-木糖通过XylA(D-木糖异构酶)分解代谢，其将D-木糖转化为D-木酮糖，D-木酮糖然后通过XylB(木酮糖激酶)磷酸化以形成D-木酮糖-5-P。为使细胞中可供诱导从木糖诱导启动子的表达的木糖量最大化，希望的是通过消除和降低至少XylA或任选地XylA和XylB两者的功能来降低通过分解代谢降解的木糖的量。xylFGHR操纵子编码XylF、XylG和XylH，ABC超家族高亲和性D-木糖转运蛋白的亚基。编码大肠杆菌低亲和性木糖-质子共输送体的xylE基因代表单独的操纵子，其表达也可通过木糖诱导。为使木糖转运体的表达独立于木糖的诱导，宿主细胞可以改变以使得所有功能性木糖转运蛋白由组成型启动子表达。例如，xylFGHR操纵子可以改变以使得xylFGH编码序列被删除，留下XylR为由木糖诱导PxylF启动子表达的唯一活性蛋白质，并使xylE编码序列由组成型启动子而不是其原始启动子表达。作为另一实例，xylR编码序列由表达构建体中的PxylA或PxylF启动子表达，而xylFGHR操纵子被删除和xylE组成型地表达，或者可选地xylFGH操纵子(缺乏xylR编码序列，因为其存在于表达构建体中)由组成型启动子表达和xylE编码序列被删除或改变以使得它不产生活性蛋白质。
乳糖启动子。术语“乳糖启动子”指的是lacZYA操纵子的乳糖诱导启动子，也称为lacZp1的启动子；这一乳糖启动子位于大肠杆菌K-12亚株MG1655的基因组序列(NCBIReference Sequence NC 000913.2,l l-JAN-2012)中的ca.365603-365568(负链，具有ca.365603-365598处的RNA聚合酶结合('-35')位点、365579-365573处的Pribnow盒('-10')和365567处的转录起始位点)。在一些实施方式中，本发明的可诱导共表达系统可以包含乳糖诱导启动子如lacZYA启动子。在其它实施方式中，本发明的可诱导共表达系统包含非乳糖诱导启动子的一个或多个诱导型启动子。
碱性磷酸酶启动子。术语“碱性磷酸酶启动子”和“phoA启动子”指的是phoApsiF操纵子的启动子，其是在磷酸盐饥饿的条件下诱导的启动子。phoA启动子区域位于大肠杆菌K-12亚株MG1655的基因组序列(NCBI参考序列NC_000913.3,16-DEC-2014)中的ca.401647-401746处(正链，Pribnow盒('-10')在401695-401701处(Kikuchi等,"The nucleotidesequence of the promoter and the amino-terminal region of alkalinephosphatase structural gene(phoA)of Escherichia coli",Nucleic Acids Res1981Nov 11；9(21):5671-5678))。phoA启动子的转录激活剂是PhoB，其是在大肠杆菌中与传感蛋白PhoR一起形成两组分信号转导系统的转录调节剂。PhoB和PhoR从位于大肠杆菌K-12亚株MG1655的基因组序列(NCBI参考序列NC_000913.3,16-DEC-2014)中的ca.417050-419300处(正链，PhoB编码序列在417,142-417,831处且PhoR编码序列在417,889-419,184处)的phoBR操纵子转录。phoA启动子与上述诱导型启动子不同在于其通过物质(细胞内磷酸盐)的缺乏诱导，而不是通过添加诱导剂诱导。由于这一原因，phoA启动子一般用于直接转录在宿主细胞耗竭磷酸盐的阶段(如发酵的晚期阶段)中产生的基因产物。在一些实施方式中，本发明的可诱导共表达系统可以包含phoA启动子。在其它实施方式中，本发明的可诱导共表达系统包含非phoA启动子的一个或多个诱导型启动子。
表1.大肠杆菌诱导型启动子和相关基因的基因组位置[1]
表1的注解：
[1]所有基因组序列位置是指大肠杆菌K-12亚株MG1655的基因组序列，其由National Center for Biotechnology Information(NCBI)作为NCBI ReferenceSequence NC 000913.2,11-JAN-2012提供。
[2]启动子区域的5'(或“上游”)末端的位置是近似的；对于“双向”启动子，在转录起始位点之间大致等距的核苷酸序列位置选择为这两个单个启动子的指定的5'“末端”。实际上，表达构建体的启动子部分可以在其5'末端具有比如表中所示的启动子序列稍少的序列，或它可以具有包括从如表中所示的启动子序列的5'(或“上游”)区域的另外序列的核苷酸序列，只要它保持以可诱导方式启动下游编码序列的转录的能力。
[3]Smith和Schleif,“Nucleotide sequence of the L-arabinose regulatoryregion of Escherichia coli K12”,J Biol Chem 1978Oct 10；253(19):6931-6933。
[4]“RNA pol”在整个表中指RNA聚合酶。
[5]Miyada等,“DNA sequence of the araC regulatory gene fromEscherichia coli B/r”,Nucleic Acids Res 1980Nov 25；8(22):5267-5274。
[6]Stoner和Schleif,“E.coli araE regulatory region araE codes for thelow affinity L-arabinose uptake protein”,GenBank Database Accession X00272.1,修正日期06-JUL-1989。
[7]Hendrickson等,“Sequence elements in the Escherichia coli araFGHprotomer”,J Bacteriol 1992Nov；174(21):6862-6871。
[8]美国专利No.8178338B2；May 15 2012；Keasling,Jay；图9。
[9]Wickstrum等,“The AraC/XylS family activator RhaS negativelyautoregulates rhaSR expression by preventing cyclic AMP receptor proteinactivation”,J Bacteriol 2010Jan；192(1):225-232。
[10]Vía等,“Transcriptional regulation of the Escherichia coli rhaTgene”,Microbiology 1996Jul；142(Pt 7):1833-1840。
[11]Song和Park,“Organization and regulation of the D-xylose operonsin Escherichia coli K-12:XylR acts as a transcriptional activator”,JBacteriol.1997Nov；179(22):7025-7032。
[12]Davis和Henderson,“The cloning and DNA sequence of the gene xylEfor xylose-proton symport in Escherichia coli K12”,J Biol Chem1987Oct 15；262(29):13928-13932。
表达构建体。表达构建体是设计用于一个或多个目标基因产物的表达的多核苷酸，并因此不是天然发生的分子。表达构建体可以整合到宿主细胞染色体中或作为独立于宿主细胞染色体复制的多核苷酸分子(如质粒或人工染色体)保持在宿主细胞内。表达构建体的实例是由一个或多个多核苷酸序列插入到宿主细胞染色体中而得到的多核苷酸，其中插入的多核苷酸序列改变染色体编码序列的表达。表达载体是特别地用于一个或多个基因产物的表达的质粒表达构建体。一个或多个表达构建体可以整合到宿主细胞染色体中或保持在染色体外多核苷酸如质粒或人工染色体上。以下是可在用于基因产物表达或共表达的表达构建体中使用的特定类型的多核苷酸序列的说明。
复制起点。表达构建体必须包含复制起点(也称为复制子)以作为独立复制的多核苷酸保持在宿主细胞内。使用相同的复制机制的不同复制子不能通过重复的细胞分裂一起保持在单一宿主细胞中。结果，质粒可以根据它们包含的复制起点分类到不相容性组中，如表2中所示。
表2.用于表达构建体中的复制起点和代表性质粒[1]
表2的注解：
[1]采自www.bio.davidson.edu/courses/Molbio/Protocols/ORIs.html,及Sambrook和Russell,“Molecular Cloning:A laboratory manual”,3rd Ed.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001。
[2]Kües和Stahl,“Replication of plasmids in gram-negative bacteria”,Microbiol Rev 1989Dec；53(4):491-516。
[3]pPRO33质粒(美国专利No.8178338B2；May 15 2012；Keasling,Jay)可从Addgene(www.addgene.org)作为Addgene质粒17810获得。
[4]openwetware.org/wiki/CH391L/S12/Origins_of_Replication；03Aug2013访问。
复制起点在其它标准中可特别地基于不相容性组、拷贝数和/或宿主范围选择用于表达构建体中。如上所述，如果两个或更多个不同表达构建体用于相同宿主细胞中以共表达多个基因产物，不同表达构建体包含来自不同不相容性组的复制起点的情况是最好的：例如，一个表达构建体中的pMB1复制子和另一表达构建体中的p15A复制子。细胞中相对于宿主染色体分子数的表达构建体平均拷贝数通过该表达构建体中包含的复制起点确定。拷贝数范围可以从每细胞几个拷贝到几百个(表2)。在本发明的一个实施方式中，使用包含通过相同诱导剂激活的诱导型启动子但具有不同复制起点的不同表达构建体。通过选择将各不同表达构建体以特定的近似拷贝数保持在细胞中的复制起点，有可能相对于从不同表达构建体表达的另一基因产物调整从一个表达构建体表达的基因产物的总体产生水平。举例来说，为共表达多聚蛋白质的亚基A和B，产生包含colEl复制子、ara启动子和由ara启动子表达的亚基A的编码序列的表达构建体：“colEl-Para-A”。产生包含p15A复制子、ara启动子和亚基B的编码序列的另一表达构建体：“p15A-Para-B”。这两个表达构建体可以一起保持在相同宿主细胞中，且亚基A和B两者的表达通过添加一种诱导剂(阿拉伯糖)到生长培养基中诱导。如果亚基A的表达水平需要相对于亚基B的表达水平显著提高以使得这两个亚基的表达量的化学计量比更接近于所需的比率，例如，可以产生具有如在pUC9质粒的复制起点(“pUC9ori”)中发现的修饰pMB1复制子的用于亚基A的新表达构建体：pUC9ori-Para-A。从高拷贝数表达构建体如pUC9ori-Para-A表达亚基A应当相对于从p15A-Para-B的亚基B表达提高所产生的亚基A的量。以相似的方式，使用以较低拷贝数保持表达构建体的复制起点如pSC101可以降低从该构建体表达的基因产物的总体水平。复制起点的选择也可以确定哪些宿主细胞可以保持包含该复制子的表达构建体。例如，包含colEl复制起点的表达构建体具有相对窄的可用宿主范围，肠杆菌科内的物种，而包含RK2复制子的表达构建体可以保持在大肠杆菌、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginsa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、棕色固氮菌(azotobacter vinelandii)和真养产碱杆菌(Alcaligeneseutrophus)中，且如果表达构建体包含RK2复制子和来自RK2质粒的一些调节基因，它可以保持在多样的如苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcocaceticus)和球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的宿主细胞中(Kües和Stahl,“Replication of plasmids in gram-negative bacteria”,MicrobiolRev 1989Dec；53(4):491-516)。
类似的考虑可以用于建立在真核细胞中可诱导表达或共表达的表达构建体。例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的2-微米环状质粒与来自其它酵母菌株的质粒如pSR1(ATCC保藏No.48233和66069；Araki等,“Molecular and functional organizationof yeast plasmid pSR1”,J Mol Biol 1985Mar 20；182(2):191-203)和pKD1(ATCC保藏No.37519；Chen等,“Sequence organization of the circular plasmid pKD1from theyeast Kluyveromyces drosophilarum”,Nucleic Acids Res 1986Jun 11；14(11):4471-4481)相容。
选择标记。表达构建体通常包含编码宿主细胞在选择培养基中存活或生长必需的蛋白质的选择基因，也称为选择标记。不包含含有选择基因的表达构建体的宿主细胞在培养基中不能存活。典型的选择基因编码赋予对抗生素或其它毒素的抗性的或补充宿主细胞的营养缺陷型的蛋白质。选择方案的一个实例利用药物如抗生素以抑止宿主细胞的生长。包含含有选择标记的表达构建体的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白质并从选择方案存活下来。通常用于选择标记的选择的抗生素(及表示提供抗生素抗性表型的基因的缩写)的一些实例是：氨苄青霉素(AmpR)、氯霉素(CmlR或CmR)、卡那霉素(KanR)、壮观霉素(SpcR)、链霉素(StrR)和四环素(TetR)。表2中的许多代表性质粒包含选择标记如pBR322(AmpR,TetR)；pMOB45(CmR,TetR)；pACYC177(AmpR,KanR)和pGBM1(SpcR,StrR)。通常包括选择基因的原始启动子区域以及其基因产物的编码序列作为表达构建体的选择标记部分的一部分。或者，选择基因的编码序列可以由组成型启动子表达。
诱导型启动子。如本文中描述的，存在几种可作为本发明可诱导共表达系统的部分包括在表达构建体中的不同诱导型启动子。优选的诱导型启动子与通过参照大肠杆菌K-12亚株MG1655基因组序列在表1中定义的启动子多核苷酸序列的至少30(更优选至少40，和最优选至少50)个连续碱基共有至少80％的多核苷酸序列同一性(更优选至少90％同一性，和最优选至少95％同一性)，其中百分多核苷酸序列同一性使用实施例11的方法确定。在“标准”诱导条件下(参见实施例5)，优选的诱导型启动子具有相应的大肠杆菌K-12亚株MG1655的“野生型”诱导型启动子强度的至少75％(更优选至少100％，和最优选至少110％))，如使用De Mey等的定量PCR方法测定的(实施例6)。在表达构建体内，诱导型启动子设置于可诱导地表达的基因产物的编码序列的5'侧(或“上游”)，以使得诱导型启动子的存在将沿相对于编码基因产物的多核苷酸编码链的5'-3'方向指导基因产物编码序列的转录。
核糖体结合位点。对于多肽基因产物，转录起始位点和待可诱导地表达的基因产物编码序列的起始密码子之间区域的核苷酸序列对应于多肽基因产物的mRNA的5'非翻译区(“UTR”)。优选地，对应于5'UTR的表达构建体区域包含类似于在宿主细胞物种中发现的共有核糖体结合位点(RBS，也称为Shine-Dalgarno序列)的多核苷酸序列。在原核生物(古细菌(archaea)和细菌)中，RBS共有序列是GGAGG或GGAGGU，且在细菌如大肠杆菌中，RBS共有序列是AGGAGG或AGGAGGU。RBS通常与起始密码子分隔5-10个插入核苷酸。在表达构建体中，RBS序列优选与AGGAGGU共有序列至少55％相同，更优选至少70％相同，和最优选至少85％相同，且与起始密码子分隔5-10个插入核苷酸，更优选6-9个插入核苷酸，和最优选6-7插入核苷酸。给定RBS产生所需的翻译起始率的能力可以在网站salis.psu.edu/software/RBSLibraryCalculatorSearchMode上使用RBS Calculator计算；相同的工具可用于对于100,000+倍范围的翻译率优化合成的RBS(Salis,“The ribosome binding sitecalculator”,Methods Enzymol 2011；498:19-42)。
多克隆位点。多克隆位点(MCS)，也称为多接头，是包含彼此密切靠近或彼此重叠的多个限制性位点的多核苷酸。MCS中的限制性位点通常在MCS序列内出现一次，且优选地不在质粒的其余部分或其它多核苷酸构建体内存在，从而允许限制性酶仅在MCS内切割质粒或其它多核苷酸构建体。MCS序列的实例是表达载体的pBAD系列(包括pBAD18、pBAD18-Cm、pBAD18-Kan、pBAD24、pBAD28、pBAD30和pBAD33)中的那些(Guzman等,“Tightregulation,modulation,and high-level expression by vectors containing thearabinose PBAD promoter”,J Bacteriol 1995Jul；177(14):4121-4130)；或源自pBAD载体的pPRO系列表达载体(如pPRO18、pPRO18-Cm、pPRO18-Kan、pPRO24、pPRO30和pPRO33)中的那些(美国专利No.8178338B2；May 15 2012；Keasling,Jay)。多克隆位点可以用于建立表达构建体：通过将多克隆位点置于启动子序列的3'侧(或下游)，MCS可用于将待表达或共表达的基因产物的编码序列插入到构建体中相对于启动子的适当位置，以使得编码序列的转录发生。取决于哪些限制性酶用于在MCS内切割，在编码序列或其它多核苷酸序列插入到表达构建体中后有可能某些部分的MCS序列保留在表达构建体内。任何残留的MCS序列可以在插入序列的上游或下游或两侧。核糖体结合位点可以置于MCS的上游，优选紧邻MCS或与MCS仅分隔几个核苷酸，在该情况中RBS在插入MCS中的任何编码序列的上游。另一替代方式是包括MCS内的核糖体结合位点，在该情况中用于在MCS内切割的限制性酶的选择将决定是否RBS保留且与插入序列具有什么样的关系。进一步的替代方式是包括将在MCS处插入到表达构建体中，优选与任何编码序列具有适当关系的多核苷酸序列内的RBS，以刺激从转录的信使RNA的翻译起始。
从组成型启动子的表达。本发明的表达构建体也可以包含从组成型启动子表达的编码序列。与诱导型启动子不同，组成型启动子在大多数生长条件下启动连续的基因产物产生。组成型启动子的一个实例是Tn3bla基因的组成型启动子，Tn3bla基因编码β-内酰胺酶且造成通过许多质粒(包括pBR322(ATCC 31344)、pACYC177(ATCC 37031)和pBAD24(ATCC87399))赋予宿主细胞的氨苄青霉素抗性(AmpR)表型。可用于表达构建体中的另一组成型启动子是大肠杆菌脂蛋白基因,lpp(其位于大肠杆菌K-12亚株MG1655中的位置1755731-1755406(正链)处)的启动子(Inouye和Inouye,“Up-promoter mutations in the Ippgene of Escherichia coli”,Nucleic Acids Res 1985May 10；13(9):3101-3110)。已用于在大肠杆菌中异质基因表达的组成型启动子的进一步实例是trpLEDCBA启动子，其位于大肠杆菌K-12亚株MG1655的位置1321169-1321133(负链)(Windass等,“The constructionof a synthetic Escherichia coli trp promoter and its use in the expression ofa synthetic interferon gene”,Nucleic Acids Res 1982Nov 11；10(21):6639-6657)。组成型启动子可用于表达构建体中以用于选择标记的表达，如本文中所述，且也用于可用于共表达所需产物的其它基因产物的组成型表达。例如，诱导型启动子的转录调节子如AraC、PrpR、RhaR和XylR，如果不由双向诱导型启动子表达，可以替代地在与它们调节的诱导型启动子相同的表达构建体上或在不同的表达构建体上由组成型启动子表达。类似地，可用于诱导剂如PrpEC、AraE或Rha的产生或转运的基因产物或者改变细胞的还原-氧化环境的蛋白质，举例来说，可以由表达构建体内的组成型启动子表达。可用于共表达基因产物的产生的基因产物及最终的所需产物也包括伴侣蛋白、辅因子转录蛋白等。
信号肽。通过本发明的方法表达或共表达的多肽基因产物可以包含信号肽或缺乏信号肽，这取决于是否希望这类基因产物分别从宿主细胞胞质输出到周质中或保留在胞质中。信号肽(也称为信号序列、前导序列或前导肽)结构上特征在于具有形成单一α-螺旋倾向的疏水氨基酸的延伸段，大约5-20个氨基酸长且通常约10-15个氨基酸长。这种疏水性延伸段通常之前紧接富含带正电的氨基酸(特别是赖氨酸)的较短延伸段。未从成熟多肽切除的信号肽通常以被信号肽酶识别和切割的氨基酸延伸段结束。信号肽功能上特征在于在翻译同时或翻译后直接转运多肽通过原核生物的质膜(或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌的内膜)或转运到真核细胞的内质网中的能力。例如，信号肽使得多肽能够被转运到宿主细胞如大肠杆菌的周质空间中的程度可以使用如实施例12中提供的方法通过分离周质蛋白质和保留在胞质中的蛋白质来确定。
宿主细胞。本发明的可诱导共表达系统设计为表达多个基因产物；在本发明的某些实施方式中，基因产物在宿主细胞中共表达。提供了允许多聚产物的成分高效和经济地可诱导共表达的宿主细胞的实例。除了培养物中分离的细胞外，宿主细胞还可以包括作为多细胞生物体的部分的细胞或在不同的生物体或生物体系统内生长的细胞。另外，本发明的可诱导共表达系统的表达构建体可以用于无细胞系统中，如基于麦胚抽提物或基于细菌细胞抽提物的那些，如使用大肠杆菌提取物和孵育设备如RTS ProteoMaster(RocheDiagnostics GmbH；Mannheim,Germany)的连续交换无细胞(CECF)蛋白质合成系统(Jun等,“Continuous-exchange cell-free protein synthesis using PCR-generated DNA andan RNase E-deficient extract”,Biotechniques 2008Mar；44(3):387-391)。
原核宿主细胞。在本发明的一些实施方式中，设计用于基因产物共表达的表达构建体提供在宿主细胞中，优选原核宿主细胞。原核宿主细胞可以包括古细菌(如沃氏盐杆菌(Haloferax volcanii)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus))、革兰氏阳性细菌(如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans))或革兰氏阴性细菌，包括α-变形菌(Alphaproteobacteria)(根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、新月柄杆菌、球形红细菌和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti))、β-变形菌(Betaproteobacteria)(真养产碱杆菌)和γ-变形菌(Gammaproteobacteria)(乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii)、大肠杆菌、绿脓假单胞菌和恶臭假单胞菌)。优选的宿主细胞包括肠杆菌科的γ-变形菌，如肠杆菌属(Enterobacter)、欧文菌属(Erwinia)、埃希氏杆菌属(Escherichia)(包括大肠杆菌)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(包括鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(包括粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans))和志贺氏菌属(Shigella)。
真核宿主细胞。许多另外类型的宿主细胞可以用于本发明的可诱导共表达系统，包括真核细胞如酵母(休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、其它克鲁维酵母菌种、毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母、巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)，也称为卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酵母(Dekkera)/酒香酵母(Brettanomyces)种和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))；其它真菌(构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、里氏木霉(Trichoderma reesia))；昆虫细胞系(果蝇(Drosophilamelanogaster)Schneider 2细胞和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞)；和哺乳动物细胞系包括永生化细胞系(中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人胚肾(HEK,293或HEK-293)细胞和人肝细胞癌细胞(Hep G2))。上述宿主细胞可从美国典型培养物保藏中心获得。
宿主细胞基因功能的改变。可以对包含可诱导表达构建体的宿主细胞的基因功能进行某些改变以促进诱导剂对宿主细胞群体的有效和同质诱导。优选地，表达构建体、宿主细胞基因型和诱导条件的组合导致培养物中的至少75％(更优选至少85％，和最优选至少95％)的细胞由各诱导的启动子表达基因产物，如通过实施例6中描述的Khlebnikov等的方法测量的。对于大肠杆菌以外的宿主细胞，这些改变可以涉及结构上与大肠杆菌基因相似的基因或者完成宿主细胞内与大肠杆菌基因的功能相似的功能的基因的功能。宿主细胞基因功能的改变包括通过删除整体的基因蛋白质-编码序列，或删除基因的足够大的部分、将序列插入基因中或另外地改变基因序列以使得从该基因形成降低的功能性基因产物水平而消除或降低基因功能。宿主细胞基因功能的改变也包括通过例如改变原始启动子以产生指导基因的更高转录水平的更强启动子或将无义突变引入产生更高活性的基因产物的蛋白质-编码序列中而提高基因功能。宿主细胞基因功能的改变包括以任何方式改变基因功能，包括例如改变原始诱导型启动子以产生组成型激活的启动子。除了对于诱导剂转运和代谢的基因功能的改变(如本文中对于诱导型启动子所描述的)和伴侣蛋白表达的改变外，也可能改变碳分解代谢产物阻遏(CCR)调控系统和/或宿主细胞的还原-氧化环境。
碳分解代谢产物阻遏(CCR)。宿主内活性CCR调控系统的存在可以影响诱导剂激活从诱导型启动子的转录的能力。例如，当宿主细胞如大肠杆菌在含葡萄糖的培养基中生长时，利用其它碳源所需要的基因如araBAD和prpBCDE操纵子以低水平(如果有的话)表达，即使阿拉伯糖或丙酸盐诱导剂也存在于生长培养基中。也存在葡萄糖以外碳源利用的等级：如在ara和prp诱导型启动子系统的情况中，其中阿拉伯糖的存在降低丙酸盐诱导从prpBCDE启动子的表达的能力(Park等,“The mechanism of sugar-mediated cataboliterepression of the propionate catabolic gene in Escherichia coli”,Gene2012Aug1；504(1):116-121；Epub 2012May 3)。因此，细胞的CCR机制使得其更难以在可诱导共表达系统中使用两种或更多种碳源诱导剂，因为作为优选碳源的诱导剂的存在抑制较不优选碳源的诱导。Park等作者尝试通过使用产生改变的cAMP受体蛋白质(其可以独立于cAMP发挥功能)的突变体crp基因或参与CCR调节的PTS(磷酸转移酶系统)基因的缺失缓解阿拉伯糖对prp启动子的阻遏；两种途径大部分是成功的。但是，Park等作者使用的PTS-敲除的菌株是基于菌株TP2811，其是大肠杆菌ptsHI-crr操纵子的删除(Hernández-Montalvo等,“Characterization of sugar mixtures utilization by an Escherichia coli mutantdevoid of the phosphotransferase system”,Appl Microbiol Biotechnol 2001Oct；57(1-2):186-191)。整个ptsHI-crr操纵子的删除已发现比仅crr基因的删除更显著地影响总cAMP合成(Lévy等,“Cyclic AMP synthesis in Escherichia coli strains bearingknown deletions in the pts phosphotransferase operon”,Gene 1990Jan31；86(1):27-33)。不同的途径是消除或降低宿主细胞中ptsG基因的功能，其编码葡萄糖特异性EII A(EII Aglc)，大肠杆菌中CCR的一种关键元件(Kim等,“Simultaneous consumption ofpentose and hexose sugars:an optimal microbial phenotype for efficientfermentation of lignocellulosic biomass”,Appl Microbiol Biotechnol 2010Nov；88(5):1077-1085,Epub 2010Sep 14)。宿主细胞如大肠杆菌的基因组中的另一改变(其导致增加的prp启动子的转录)是消除或降低其编码AscG的ascG基因的基因功能。AscG是β-D-葡苷糖利用操纵子ascFB在正常生长条件下的阻遏物，且也阻遏prp启动子的转录；AscG编码序列的破坏已显示增加从prp启动子的转录(Ishida等,“Participation of regulatorAscG of the beta-glucoside utilization operon in regulation of the propionatecatabolism operon”,J Bacteriol 2009Oct；191(19):6136-6144；Epub 2009Jul 24)。进一步的替代方式是通过将可由较不优选的碳源诱导剂诱导的启动子的转录调节子置于强组成型启动子的控制下或更优选的碳源诱导剂的控制下增加其表达。例如，为提高在更优选的阿拉伯糖存在下较不优选的碳源木糖的利用所需的基因的诱导，XylR的编码序列置于大肠杆菌araBAD操纵子中(Groff等,“Supplementation of intracellular XylR leadsto coutilization of hemicellulose sugars”,Appl Environ Microbiol 2012Apr；78(7):2221-2229,Epub 2012Jan 27)。包含可诱导共表达构建体的宿主细胞因此优选包括对于可由较不优选的碳源诱导剂诱导的启动子的转录调节子的提高的基因功能水平及对于涉及CCR系统的基因如crr和/或ptsG和/或ascG的消除或降低的基因功能水平。
经过遗传修饰以使得缺乏代谢诱导剂成另一化合物的能力的本发明宿主细胞不必然表现出该诱导剂对通过较不优选的碳源调节的启动子的CCR。显著的CCR效应的这种缺乏在使用非常低浓度的非代谢诱导剂时观察到；令人惊异地，那些非常低的浓度对于产生基因产物的最佳产率也是最有效的。例如，基因产物的共表达可以通过从L-阿拉伯糖诱导araBAD启动子表达一种基因产物组分和从丙酸盐诱导prpBCDE启动子表达另一种基因产物组分来完成。在如大肠杆菌EB0001和EB0002细胞的宿主细胞(以下实施例1中描述的)中，共表达通常在低于100微摩尔/OD单位细胞(0.0015％)的L-阿拉伯糖诱导剂浓度下产生多聚基因产物的最佳产率，且在这些L-阿拉伯糖浓度下观察到非常低的或没有观察到prpBCDE启动子的L-阿拉伯糖介导的CCR。
辅因子的细胞转运。当使用本发明的可诱导共表达系统产生需要辅因子以发挥功能的酶时，有利的是使用能够从可得的前体合成辅因子或将其从环境中摄取的宿主细胞。常见的辅因子包括ATP、辅酶A、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、NAD+/NADH和亚铁血红素。
宿主细胞还原-氧化环境。许多多聚基因产物如抗体包含二硫键。大肠杆菌和许多其它细胞的胞质正常情况下通过硫氧还蛋白和谷氧还蛋白/谷胱甘肽酶系统维持在还原状态中。这排除了胞质中二硫键的形成，且需要二硫键的蛋白质输出到其中二硫键形成和异构化通过包含DsbABCD和DsbG的Dsb系统催化的周质中。增加的半胱氨酸氧化酶DsbA、二硫键异构酶DsbC或Dsb蛋白的组合(其全都正常地转运到周质中)的表达已用于需要二硫键的异源蛋白质的表达中(Makino等,“Strain engineering for improved expression ofrecombinant protein in bacteria”,Microb Cell Fact 2011May 14；10:32)。也可能表达这些Dsb蛋白质的胞质形式，如DsbC的胞质形式(“cDsbC”)，其缺乏信号肽且因此不转运到周质中。胞质Dsb蛋白质如cDsbC可用于使得宿主细胞的胞质更高氧化且因此更有助于胞质中产生的异源蛋白质中二硫键的形成。宿主细胞胞质也可以通过直接改变硫氧还蛋白和谷氧还蛋白/谷胱甘肽酶系统使得更高氧化：谷胱甘肽还原酶(gor)或谷胱甘肽合成酶(gshB)以及硫氧还蛋白还原酶(trxB)缺陷的突变体菌株赋予胞质氧化性。这些菌株不能够还原核糖核苷酸并因此不能在不存在外源还原剂如二硫苏糖醇(DTT)的情况下生长。编码过氧化物氧化还原蛋白(peroxiredoxin)AhpC的基因ahpC中的抑制基因突变(ahpC*)将其转化为产生还原的谷胱甘肽的二硫键还原酶，从而允许电子输送到酶核糖核苷酸还原酶和使得gor和trxB缺陷或gshB和trxB缺陷的细胞能够在DTT不存在下生长。不同种类的AhpC突变形式可以允许γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶(gshA)活性缺陷的和trxB缺陷的菌株在DTT不存在下生长；这些包括AhpC V164G、AhpC S71F、AhpC E173/S71F、AhpC E171Ter和AhpCdup162-169(Faulkner等,“Functional plasticity of a peroxidase allows evolutionof diverse disulfide-reducing pathways”,Proc Natl Acad Sci U S A 2008May 6；105(18):6735-6740,Epub 2008May 2)。在具有氧化的胞质的这类菌株中，暴露的蛋白质半胱氨酸在硫氧还蛋白以其反向生理功能催化的过程中变得更容易氧化，从而导致二硫键的形成。
可对宿主细胞进行的另一改变是从宿主细胞胞质中酵母线粒体的内膜空间表达巯基氧化酶Erv1p，其已显示在大肠杆菌的胞质中甚至在不存在gor或trxB中的突变的情况下增加多种复合物，真核生物起源的二硫键键合的蛋白质的产生(Nguyen等,“Pre-expression of a sulfhydryl oxidase significantly increases the yields ofeukaryotic disulfide containing protein expressed in the cytoplasm of E.coli”Microb Cell Fact 2011Jan 7；10:1)。包含可诱导共表达构建体的宿主细胞优选也表达cDsbC和/或Erv1p，是trxB基因功能缺乏的，也是gor、gshB或gshA的基因功能缺乏的，且表达至少一种AhpC的适当突变体形式，以使得宿主细胞可以在DTT不存在下生长。
多肽基因产物的糖基化。宿主细胞可以具有其使多肽糖基化的能力的改变。例如，真核宿主细胞可以具有糖基转移酶和/或寡糖转移酶基因的消除或降低的基因功能，从而损害多肽形成糖蛋白的正常真核糖基化。不使多肽正常糖基化的原核宿主细胞如大肠杆菌可以改变以表达提供糖基化功能的一组真核生物和原核生物基因(DeLisa等,“Glycosylated protein expression in prokaryotes”,WO2009089154A2,2009Jul 16)。
具有改变的基因功能的可用宿主细胞株。为产生用于本发明的可诱导共表达系统和方法中的优选宿主细胞株，有利的是以早已包含所需遗传改变的株开始(表3)。
表3.宿主细胞株
改变宿主细胞基因功能的方法。具有许多本领域中已知用于进行宿主细胞基因的改变以消除、降低或改变基因功能的方法。进行宿主细胞如大肠杆菌和其它原核细胞中基因的靶向破坏的方法已经被描述(Muyrers等,“Rapid modification of bacterialartificial chromosomes by ET-recombination”,Nucleic Acids Res 1999Mar 15；27(6):1555-1557；Datsenko和Wanner,“One-step inactivation of chromosomal gene inEscherichia coli K-12using PCR products”,Proc Natl Acad Sci U S A 2000Jun 6；97(12):6640-6645)，且使用类似的Red/ET重组方法的试剂盒是商购可得的(例如，来自Gene Bridges GmbH,Heidelberg,德国的Quick&Easy E.coli Gene Deletion Kit)。在本发明的一个实施方式中，宿主细胞的一个或多个基因的功能通过鉴定待破坏基因的编码序列内的核苷酸序列(如本文中通过引用序列的基因组位置并入的大肠杆菌K-12亚株MG1655编码序列中的一个)，和更特别地通过选择该编码序列内各50个核苷酸的两个邻接延伸段而消除或降低。Quick&Easy E.coli Gene Deletion Kit然后按照制造商的指示用于将含有选择标记的多核苷酸构建体插入到所选择的编码序列的邻接延伸段之间，从而消除或降低基因的正常功能。Red/ET重组方法也可以用于以预测促进特定转录水平的不同启动子如组成型启动子或人工启动子的序列替换启动子序列(De Mey等,“Promoter knock-in:anovel rational method for the fine tuning of gene”,BMC Biotechnol 2010Mar 24；10:26)。宿主细胞基因的功能也可以通过RNA沉默方法消除或降低(Man等,“Artificialtrans-encoded small non-coding RNAs specifically silence the selected geneexpression in bacteria”,Nucleic Acids Res 2011Apr；39(8):e50,Epub 2011Feb3)。此外，改变宿主细胞基因功能的已知突变可以通过传统的遗传方法引入宿主细胞中。
本发明的可诱导共表达系统
本发明的可诱导共表达系统涉及包含两个或更多个表达构建体的宿主细胞，其中表达构建体包含指导基因产物的表达的诱导型启动子，且宿主细胞具有允许基因产物的同质诱导表达的改变的基因功能。图1显示本发明的可诱导共表达系统的示意性图解，其具有以下成分：(1)宿主细胞，(2)宿主基因组(包括遗传改变)，(3)包含指导基因产物表达的诱导型启动子的表达载体“X”，(4)包含指导另一基因产物表达的诱导型启动子的不同表达载体“Y”，(5)表达的化学诱导剂和(6)多聚的共表达产物。图3显示了与图1中所示相似的示意性图解，在相同的表达载体上存在诱导型启动子((3)和(4))及通过诱导型启动子表达的产物的编码序列。
图2显示本发明可诱导共表达系统的特定实施例的示意性图解，其在带有允许可同质诱导的表达的适宜基因组改变的大肠杆菌宿主细胞中与pPRO33(美国专利No.8178338B2；May 15 2012；Keasling,Jay)(或者pPRO43、pPRO430、pPRO430(CloDF13)、pPRO44或pPRO45)表达载体上的丙酸盐诱导启动子(prpBCDE启动子)结合利用pBAD24(或pBAD240)表达载体上的araBAD启动子。以这种方式，可以实现多聚产物各成分的表达的紧密控制和优化以用于多种共表达应用中。在这一实施方式中，宿主细胞(1)是通常用于蛋白质表达领域中的革兰氏阴性细菌大肠杆菌。宿主基因组(2)是具有利于同质诱导蛋白质共表达的突变或其它改变的宿主细胞生物体的基因组，包括缺乏信号肽的二硫键异构酶DsbC的胞质形式的表达。在这一实施方式中，基因组改变包括araBAD操纵子敲除突变及从组成型启动子的araE和araFGH的表达或araEFGH缺陷背景中lacY基因(A117C)中的点突变以利于用外源施加的L-阿拉伯糖对质粒基ara启动子的同质诱导，且也包括灭活的丙酸盐代谢基因prpD以利于用外源施加的丙酸盐(其在体内转化为2-甲基柠檬酸盐)对质粒基丙酸盐启动子的同质诱导。可用于可诱导共表达系统且可以引入宿主细胞中的其它基因组改变包括，但不限于：scpA-argK-scpBC操纵子的靶向灭活以减少从prpBCDE启动子的背景表达；从L-阿拉伯糖诱导启动子如araBAD启动子的较不优选碳源(丙酸盐)的转录调节子(prpR)的表达和/或参与CCR系统的基因如crr和/或ptsG的消除或降低的基因功能以避免在L-阿拉伯糖存在下丙酸盐对诱导的CCR系统的抑制；谷胱甘肽还原酶(gor)或谷胱甘肽合成酶(gshB)以及硫氧还蛋白还原酶(trxB)的基因功能水平的降低和/或宿主细胞胞质中酵母线粒体巯基氧化酶Erv1p的表达以提供宿主细胞胞质中强度较低的还原环境和促进二硫键形成；伴侣蛋白如DnaK/DnaJ/GrpE、DsbC/DsbG、GroEL/GroES、IbpA/IbpB、Skp、Tig(触发因子)和/或FkpA的提高的表达水平(如从强组成型启动子)；和其它突变以降低内源蛋白酶活性(如Lon和OmpT蛋白酶的活性)和重组酶活性。
如图2中所示，两个相容的表达载体(3,4)保持在宿主细胞中以允许两个不同基因产物的同时表达(共表达)。在这一实施方式中，一个表达载体(“L-阿拉伯糖诱导的表达载体”)包含L-阿拉伯糖诱导的启动子，并与pBAD或其中araBAD启动子驱动克隆到多克隆位点(MCS)中的插入表达序列的表达的相关质粒相似或相同。L-阿拉伯糖诱导的表达载体也包含抗生素抗性基因(如Tn3bla基因，其编码β-内酰胺酶并赋予对氨苄青霉素的抗性，或编码氨基糖苷3’-磷酸转移酶和赋予对卡那霉素的抗性的基因)的编码序列以利于包含完整表达载体的宿主细胞(细菌集落)的选择。复制起点(ORI)是细菌宿主细胞内质粒的扩增需要的。L-阿拉伯糖诱导的表达质粒也包含编码araC(一种允许araBAD启动子的L-阿拉伯糖诱导)的多核苷酸序列，且通过转录阻遏降低非诱导状态中的“泄漏(leaky)”背景表达。其它表达载体(“丙酸盐诱导的表达载体”)与pPRO或其中丙酸盐诱导的启动子驱动克隆到多克隆位点(MCS)中的插入表达序列的表达的相关质粒相似或相同。质粒也包含抗生素抗性基因(如编码氯霉素乙酰转移酶的cat基因，其赋予对氯霉素的抗性)的编码序列以利于包含完整表达载体的宿主细胞的选择。复制起点(ORI)是细菌宿主细胞内质粒的扩增需要的。另外，丙酸盐诱导的表达载体包含编码prpR(一种允许prpBCDE启动子的丙酸盐(2-甲基柠檬酸盐)诱导的转录调节子)的多核苷酸序列，且降低非诱导状态中的“泄漏”背景表达。为利于诱导的单独滴定、质粒相容性和表达载体的共扩增，有利的是,表达载体包含响应于不同诱导剂的启动子、相容的复制起点和不同抗生素抗性标记。在本发明的一个实施方式中，包含L-阿拉伯糖诱导的araBAD启动子的pBAD24(pMB1或“pBR322”ORI,AmpR)或相关表达载体如pBAD240(pMB1ORI,KanR)在宿主细胞中与包含丙酸盐诱导的prpBCDE启动子的pPRO33、pPRO43、pPRO430或相关表达载体(p15A ORI,CmR)组合。包含丙酸盐诱导prpBCDE启动子的相容表达载体如pPRO430(CloDF13)、pPRO44(RSF1030ORI)或pPRO45(CloDF13)也可以与包含araBAD启动子的表达载体(pMB1ORI)组合使用。表达载体使用补充有适宜抗生素：氨苄青霉素、氯霉素和/或卡那霉素的生长培养基共扩增和维持。在一个实施方式中，一个表达载体包含编码全长抗体的重链的多核苷酸序列，和另一表达载体包含编码全长抗体的轻链的多核苷酸序列，各编码序列同框克隆到相应表达载体的MCS中。对于特定基因产物如抗体的产生，针对宿主生物体的编码序列优化(在其它考虑中特别地包括对于密码子偏倚性和GC含量的调整)将确定待插入到共表达系统的表达构建体中的编码序列。
再参照图2，基因产物的共表达通过便宜的外源施加的化学代谢产物L-阿拉伯糖和丙酸盐(5)诱导。各基因产物的表达诱导水平用其自身的化学诱导剂独立地滴定，从而有助于蛋白质共表达的优化。这对于蛋白质复合物和需要结合伴体以稳定化的蛋白质的表达是有用的，且可以有利于另外难以表达的蛋白质如具有差溶解性或细胞毒性的那些蛋白质的表达。在这一实例中，在诱导时，抗体重链和短链各自独立地表达，然后蛋白质接合并形成链间二硫键(在细菌宿主的胞质内)，其允许由重链和轻链构成的全长抗体的形成和稳定化。蛋白质可以被指导到宿主生物体的各个不同区室。例如，在大肠杆菌中，蛋白质可以在胞质、细胞膜、周质中表达或分泌到培养基中。在适宜的孵育时间后，收集细胞和培养基，且提取总蛋白质，其包括共表达的基因产物(6)。在提取后，所需的产物可以根据共表达系统中产生的基因产物的特性使用本领域中公知的多种方法(例如液相色谱)纯化。在图2中所示的实施例中，多聚产物(全长抗体)使用色谱方法提取和纯化。纯化的完整抗体在非变性凝胶上使用标准技术可视化，包括蛋白质-结合染料或免疫组织化学。全长抗体产物然后可以用于多种研究、诊断或其它应用。
图4显示与图2中所示相似的示意性图解，相同的表达载体上存在阿拉伯糖诱导启动子(3)、丙酸盐诱导启动子(4)及抗体重链和轻链的编码序列。也可能从丙酸盐诱导启动子表达抗体重链和从阿拉伯糖诱导启动子表达抗体轻链。
通过本发明的方法制备的产物
在多种共表达应用中利用本发明的可诱导共表达系统及在产物的性质中具有广泛的多样性。
糖基化。通过本发明的方法共表达的基因产物可以是糖基化的或未糖基化的。在本发明的一个实施方式中，共表达的基因产物是多肽。糖基化的多肽是包含共价连接的糖基基团的多肽，且包括包含通常与该多肽的特定残基连接的所有糖基基团的多肽(完全糖基化的多肽)、部分糖基化的多肽、具有一个或多个残基(其中通常不发生糖基化)处的糖基化(改变的糖基化)的多肽和用结构上与通常连接于一个或多个指明的残基的糖基基团不同的至少一个糖基基团糖基化(修饰的糖基化)的多肽。修饰的糖基化的实例是通过在缺乏使多肽岩藻糖基化的能力的宿主细胞中表达多肽来产生“脱岩藻糖基化”或“缺乏岩藻糖”的多肽，在与其连接的糖基基团中缺乏岩藻糖基部分的多肽。未糖基化的多肽是不包含共价结合的糖基基团的多肽。未糖基化的多肽可以是多肽脱糖基化或非糖基化多肽产生的结果。脱糖基化的多肽可以通过使糖基化多肽酶促地脱糖基化而获得，而非糖基化多肽可以通过在不具有使多肽糖基化的能力的宿主细胞(如原核细胞或其中至少一个糖基化酶的功能已经被消除或降低的细胞)中表达多肽而产生。在特定的实施方式中，共表达的多肽是非糖基化的，且在更特别的实施方式中，非糖基化的多肽在原核细胞如大肠杆菌中共表达。
基因产物的其它修饰。通过本发明的方法共表达的基因产物可以与其它类型的分子共价连接。可以与共表达基因产物共价连接的分子的实例(非限制本发明的范围)包括多肽(如受体、配体、细胞因子、生长因子、多肽激素、DNA-结合结构域、蛋白质相互作用结构域如PDZ结构域、激酶结构域、抗体和任何这类多肽的片段)；水溶性聚合物(如聚乙二醇(PEG)、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚氧乙烯化多元醇(如甘油)、聚乙二醇丙醛及类似的化合物、衍生物或其混合物)；和细胞毒性剂(如化疗剂、生长抑制剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)和放射性同位素)。
另外，通过本发明的方法共表达的基因产物可以设计为包括帮助基因产物的纯化和/或检测的分子部分。许多这类部分是本领域中已知的；举例来说，多肽基因产物可以设计为包括在其N-或C-末端的多组氨酸“标签”序列-六个或更多个组氨酸，优选6-10个组氨酸残基和最优选6个组氨酸的延伸。在多肽末端上多组氨酸序列的存在允许其被钴-或镍-基亲和介质结合并与其它多肽分离。多组氨酸标签序列可以通过外肽酶除去。作为另一实例，荧光蛋白序列可以表达为多肽基因产物的部分，使得荧光蛋白的氨基酸序列优选添加在多肽基因产物的氨基酸序列的N-或C-末端。所得的融合蛋白在暴露于特定波长的光时发荧光，从而允许融合蛋白质的存在目视地检测。公知的荧光蛋白是维多利亚水母(Aequoreavictoria)的绿色荧光蛋白，且许多其它的荧光蛋白以及它们的编码核苷酸序列是商购可得的。
抗体。在本发明的一个实施方式中，共表达的基因产物是抗体。术语“抗体”以最广泛的意义使用并特别地包括“原始”抗体、全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)、单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段和能够结合抗原的源自抗体的其它多肽。除非本文中另外表明，免疫球蛋白重链中残基的编号(“EU编号”)是如Kabat等,Sequence of protein of Immunological Interest,Fifth Edition,1991,NationalInstitute of Health,Bethesda,Maryland中的EU索引的编号(人IgG1EU抗体的残基编号)。
“原始”抗体通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链构成。各轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而链间二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间存在变化。各重链和轻链也具有规律地间隔的链中二硫键。各重链在其N-末端具有可变结构域(VH)，接着是多个恒定结构域。各轻链具有其N-末端的可变结构域(VL)和其C-末端的恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对准，且轻链可变结构域与重链的可变结构域对准。术语“可变”是指可变结构域的特定部分在抗体之间的序列中广泛不同的事实，并用于各特定抗体对抗原的结合和特异性中。但是，变异性不是均匀地分布在抗体的整个可变结构域中。它集中于轻链和重链可变结构域两者的称为高变区(HVR)的三个片段中。可变结构域的较高保守性的部分称为框架区(FR)。原始重链和轻链的可变结构域各自包含通过三个HVR连接的四个FR区，其与来自另一链的HVR一起造成抗体的抗原结合位点的形成。
术语“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C-末端区域，并包括原始Fc区和变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能发生变化，人IgG重链Fc区可以限定为从Cys226或Pro230位的氨基酸残基延伸到其羧基末端的延伸段。或者Fc区可以限定为从保守的CH2免疫球蛋白结构域的N-末端残基(Ala231)延伸到C-末端，并可以包括多个保守的结构域如CH2、CH3和CH4。原始Fc区的C-末端赖氨酸(根据编号系统的残基447)可以例如在抗体的产生或纯化过程中或通过编码抗体重链的核酸重组工程化而除去。因此，完整抗体的组合物可以包含所有K447残基被除去的抗体群体、K447残基未被除去的抗体群体和具有含或不含K447残基的抗体的混合物的抗体群体。抗体的Fc区对于免疫细胞的募集和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)是重要的。特别地，由抗体引发的ADCC反应的特性依赖于Fc区与位于许多细胞类型的表面上的受体(FcR)的相互作用。人类含有至少五种不同类别的Fc受体。抗体与FcR的结合决定其募集其它免疫细胞的能力和募集的细胞类型。因此，使具有改变的Fc区(其可以仅募集特定种类的细胞)的抗体工程化的能力对于治疗可能是特别重要的(美国专利申请20090136936Al,05-28-2009,Georgiou,George)。哺乳动物细胞产生的原始抗体通常包含一般通过N-连接与Fc区CH2结构域的Asn297的连接的分支的二天线寡糖。在某些实施方式，本发明的方法产生的抗体不是糖基化的或是非糖基化的，例如由于Fc区的残基297的置换或由于在不具有多肽糖基化的能力的宿主细胞中表达。由于改变的ADCC反应，未糖基化的抗体可以刺激较低水平的炎性反应如神经炎症。而且，因为具有非糖基化的Fc区的抗体对于Fc受体具有非常低的结合亲和力，这类抗体不结合携带这些受体的大量的免疫细胞。这是一种显著的优势，因为它减少了非特异性结合且也提高抗体的体内半衰期，从而使这一特性在治疗中非常有利。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”互换地使用以指基本上完整的“原始”形式的抗体而不是以下定义的抗体片段。该术语特别是指具有各包含可变结构域和Fc区的重链的抗体。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选地包含其抗原结合部分。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fc、Fd和Fv片段；双特异抗体；线性抗体；单链抗体分子如scFv；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“人抗体”是具有与由人产生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。“嵌合”抗体是其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或与其共有特定的氨基酸序列同一性水平，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体的对应序列相同或与其共有特定的氨基酸序列同一性水平的抗体以及这类抗体的片段。“人源化”抗体是包含最少的源自非人免疫球蛋白分子的氨基酸残基的嵌合抗体。在一个实施方式中，人源化抗体是其中人免疫球蛋白(受体抗体)的HVR残基被来自非人物种如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的免疫球蛋白HVR(供体抗体)的残基替换的受体抗体。在一些情况中，人受体抗体的FR残基被对应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含未在受体抗体中或供体抗体中发现的残基。术语“单克隆抗体”是指从基本上均质抗体的群体获得的抗体，其中构成该群体的单个抗体除了可能少量存在的可能的突变(如天然发生的突变)外是相同的。因此，修饰语“单克隆”指示抗体不是离散抗体的混合物的特征。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的各单克隆抗体针对抗原上的相同单一决定簇。除了其特异性外，单克隆抗体制剂是有利的，因为它们通常不被其它免疫球蛋白污染。
分子如抗体的“结合亲和力”一般是指分子的单一结合位点与其结合伴体(如抗体及与其所结合的抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(如抗体和抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对于其伴体Y的亲和力一般可以通过解离常数(Kd)代表。低亲和力抗体(较高Kd)一般缓慢地结合抗原并倾向于容易地解离，而高亲和力抗体(较低Kd)一般更快地结合抗原并倾向于保持结合更长时间。测量结合亲和力的多种方式是本领域中已知的，其中任何一种可以用于本发明的目的。用于测量结合亲和力的特定说明性方法描述于实施例8中。通过本发明的方法产生和/或用于本发明的方法中的抗体和抗体片段优选具有低于100nM的结合亲和力，更优选具有低于10nM的结合亲和力，和最优选具有低于2nM的结合亲和力，如通过实施例8中描述的表面等离子体共振分析测量的。
识别非糖基化抗体的抗体(二级)。在没有糖基化酶的基于大肠杆菌或其它原核表达系统中产生抗体通常得到非糖基化的抗体，其可以用作一级抗体。除了使用本发明可诱导共表达系统产生非糖基化一级抗体外，本发明的可诱导共表达系统也可以用于有效地产生特异性地识别非糖基化一级抗体的二级抗体。本发明的一个方面是能够检测未糖基化的或非糖基化的一级抗体的二级抗体系统用于研究、分析、诊断或治疗目的。作为一个实施例，二级抗体系统具有以下组分：表位、一级抗体、二级抗体和检测系统。表位是抗原(通常蛋白质)的一部分，其是在引入活的动物体中或另外地可被抗体识别时产生免疫反应的抗原决定簇。实际上，目标表位可以存在于混合物或组织中。在一个实施方式中，表位是人体组织的癌细胞中表达的蛋白质。一级抗体是识别和结合该表位和优选特异性结合该表位的抗体片段、单一全长抗体(单克隆)或不同全长抗体的混合物(多克隆)。这一实例中的全长抗体包含通过二硫键接合的两个重链多肽和两个轻链多肽。各链包含恒定区(Fc)和可变区(Fv)。在全长抗体中具有两个抗原结合位点。在本发明的一个实施方式中，一级抗体是识别和结合目标表位的全长非糖基化抗体(如在大肠杆菌基表达系统中产生的)。二级抗体是识别和结合非糖基化一级抗体和优选特异性结合非糖基化一级抗体的抗体片段、单一全长抗体(单克隆)或不同全长抗体的混合物(多克隆)。在本发明的一个实施方式中，二级抗体是识别和结合全长一级抗体的非糖基化Fc部分的全长抗体。在这种情况中，抗体结合位点经选择和/或工程化以特异性识别具有或不具有C-末端赖氨酸残基的非糖基化一级抗体的Fc部分。在其它实施方式中，二级抗体可以工程化以识别非糖基化一级抗体的另外的区域(表位)或另外的工程化表位，包括但不限于与一级抗体共价连接的多肽序列。二级抗体可以针对全长非糖基化抗体分子(包括各种免疫球蛋白类别如IgG、IgA等)或抗体片段如Fc或Fab上的单一或多个位点(表位)。因此，以这种方式产生的一些二级抗体具有对于任何非糖基化全长抗体的广谱特异性。本发明的一级和二级抗体也可以包括通过传统方法(使用免疫的兔的多克隆抗体产生和使用小鼠杂交瘤的单克隆抗体产生)和重组DNA技术如用于鉴定抗原结合多肽的噬菌体展示方法产生的那些。
检测系统一般包含与二级抗体连接或结合二级抗体的试剂，从而使得能够进行二级抗体的检测、可视化和/或定量。各种检测系统是本领域中公知的，包括但不限于荧光染料、酶、放射性同位素或重金属。它们可以涉及或不涉及另外的多肽与二级抗体的物理连接。这一二级抗体系统的应用包括但不限于免疫组织化学、Western印迹和酶联免疫吸附分析(ELISA)。例如，在用于免疫组织化学的一个实施方式中，目标表位存在于薄组织切片上，然后非糖基化一级抗体应用于该组织并使其结合该表位。未结合的一级抗体被除去，且然后能够特异性结合非糖基化一级抗体的二级抗体应用于该组织并使其结合一级抗体。未结合的二级抗体被除去，且然后应用检测系统试剂。例如，如果二级抗体与酶连接，则显色酶底物应用于组织并使其反应。然后可以进行反应性酶底物的直接显微或荧光可视化。其它检测方法是本领域中公知的。使用识别非糖基化抗体的二级抗体的系统的优势包括，但不限于以下：1)在免疫组织化学中提高的特异性，因为二级抗体设计为结合不会另外地存在于真核生物组织中的一级抗体的非糖基化Fc部分；2)由于提高的对于一级抗体的特异性而降低的背景染色；3)降低的二级抗体系统生产的费用，因为一级和/或二级抗体可以在原核生物如大肠杆菌中产生；和4)避免不必要地利用哺乳动物包括小鼠和兔，因为抗体开发的整个过程可以在原核生物如大肠杆菌中进行。
工业应用中使用的酶。许多工业过程利用可通过本发明的方法产生的酶。这些过程包括废水的处理及其它生物整治和/或脱毒过程；造纸和纺织工业中材料的漂白；和生物质降解成可有效地发酵为生物燃料的材料。在许多情况中，希望的是在微生物宿主细胞中产生用于这些应用的酶，但活性酶由于酶折叠和/或对辅因子的需要的问题而难以大量表达。在本发明的某些实施方式中，本发明的可诱导共表达方法用于产生具有工业应用的酶，如阿拉伯糖和木糖利用酶(例如，木糖异构酶(EC 5.3.1.5))或木质素降解过氧化物酶(例如，木素过氧化物酶(EC 1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)、多能过氧化物酶(VP,EC 1.11.1.16)或漆酶(EC 1.10.3.2))。
实施例1
基因组改变引入宿主细胞中以促进共表达
如上所述，宿主细胞基因表达中的特定变化可以改善所需基因产物的共表达。特定宿主细胞(大肠杆菌ASE(DGH)细胞)源自大肠杆菌Express细胞，且其基因型可以表示为：大肠杆菌ExpressΔaraBADΔsbm-ygfDGHΔaraEp::J23104。大肠杆菌ASE(DGH)细胞如下产生：删除和改变在大肠杆菌Express宿主细胞基因组中由Gene Bridges GmbH(Heidelberg,德国)使用无缝地去除基因组序列的重组工程方法(描述为通过反选择的删除)进行。进行宿主细胞araBAD操纵子的删除以降低宿主细胞的阿拉伯糖分解代谢，使得更多的阿拉伯糖诱导剂可用于从包含araBAD启动子的表达构建体诱导共表达的基因产物。这一删除除去araBAD操纵子的4269个碱基对，对应于大肠杆菌基因组的位置70,135-65,867(负链)(基因组核苷酸序列内的位置全部如表1中给出)，以使得除AraD编码区域的少量密码子以外的原始araBAD启动子的大部分被除去。删除接合点(位置70,136|位置65,866)附近的核苷酸序列(负链)是：TTAT|TACG。另一删除在sbm-ygfDGH(也称为scpA-argK-scpBC)操纵子内进行，从而消除参与2-甲基柠檬酸生物合成的基因的功能，以提高宿主细胞的丙酸盐诱导启动子对外源供应的丙酸盐的敏感性。sbm-ygfDGH删除除去5542个碱基对(大肠杆菌基因组中的位置3,058,754-3,064,295)，除去sbm-ygfDGH启动子和除ygfH编码序列的最后密码子之外的所有操纵子，而保留邻接的ygfI编码序列和终止密码子完整。删除接合点(位置3,058,753|位置3,064,296)附近的核苷酸序列(正链)是：ACAA|GGGT。除大肠杆菌Express宿主细胞基因组中进行的这些删除外，GeneBridges GmbH在基因组rpsL基因编码序列(其在负链上从位置3,472,574延伸到3,472,200)中引用点突变，改变位置3,472,447处的A为G，从而将Lys43的密码子改变为Arg的密码子，这在突变体rpsL-Arg43基因表达时产生链霉素抗性表型。对宿主细胞基因组的另一改变(允许如上所述更紧密地控制可诱导的表达)是使得araE启动子为组成型的而不是响应于阿拉伯糖。大部分的原始araE启动子(包括CRP-cAMP和AraC结合位点)通过删除97个碱基对(位置2,980,335-2,980,239(负链))和用组成型J23104启动子(SEQ ID NO:1；J23104的核苷酸序列获自partsregistry.org网站，parts.igem.org/Main_Page)的35-碱基对的序列替换该序列而除去。改变的araE启动子内的最终接合位点序列是：TGAA|TTGA…TAGC|TTCA。
大肠杆菌ASE(DGH)(也称为EB0001的菌株)的基因型可以表示为：
ΔaraBAD fhuA2[lon]ompT ahpCΔgalλatt::pNEB3-r1-cDsbC(Spec,lacI)ΔtrxBsulA11R(mcr-73::miniTn10--TetS)2[dcm]R(zgb-210::Tn10--TetS)ΔaraEp::J23104ΔscpA-argK-scpBC endA1rpsL-Arg43ΔgorΔ(mcrC-mrr)114::IS10
菌株EB0002具有可以表示为EB0001prpD或表示为以下的基因型：
ΔaraBAD fhuA2ΔprpD[lon]ompT ahpCΔgalλatt::pNEB3-r1-cDsbC(Spec,lacI)ΔtrxB sulA11 R(mcr-73::miniTn10--TetS)2[dcm]R(zgb-210::Tn10--TetS)ΔaraEp::J23104ΔscpA-argK-scpBC endA1rpsL-Arg43ΔgorΔ(mcrC-mrr)114::IS10
具有任何这些基因组改变中的任一种或它们的任何组合的大肠杆菌宿主细胞如大肠杆菌Express宿主细胞或EB0001细胞或EB0002细胞可以用于基因产物的可诱导共表达。
实施例2
包含诱导型启动子的表达载体
A.表达载体pPRO43
表达载体pPRO43(SEQ ID NO:2)用于从丙酸盐诱导prpBCDE启动子表达目标基因产物，并参照pPRO33表达载体的核苷酸序列构建。pPRO33的核苷酸序列从pBAD18载体(GenBank登录No.X81838.1)、prpR-PprpB区的大肠杆菌基因组序列和pBAD33载体的序列汇编，如Guzman等,"Tight regulation,modulation,and high-level expression byvectors containing the arabinose PBAD promoter",J Bacteriol 1995Jul；177(14):4121-4130和US专利No.8178338B2；May 15 2012；Keasling,Jay中所述的。pPRO33的核苷酸序列通过测序确认并提供在SEQ ID NO:3中。
在pPRO43中，编码转录激活剂prpR的核苷酸序列使用Welch等,"Designparameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli",PLoS One2009Sep 14；4(9):e7002；doi:10.1371/journal.pone.0007002中所描述的那些方法通过DNA2.0(Menlo Park,CA)优化以用于在大肠杆菌中表达。pPRO43中的优化prpR序列包括RBS和在所示链的相反链上prpR编码序列(其是SEQ ID NO:2的核苷酸1593-7)上游的其它序列。pPRO43载体还具有仅一个HindIII限制性位点(其在多克隆位点(MCS)中)，与具有两个HindIII位点(一个在MCS中和第二个在prpR编码序列中)的pPRO33相反。
B.表达载体pPRO430和pPRO430(CloDF13)
表达载体pPRO430(SEQ ID NO:4)基于pPRO43的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)通过DNA2.0合成。pPRO430载体与pPRO43相似在于两者均包含p15复制起点、赋予对氯霉素的抗性的基因(CmR)、如上所述对于在大肠杆菌中表达而优化的prpR编码序列和编码序列可以插入其中的、丙酸盐诱导prpBCDE启动子下游的克隆位点。pPRO430表达载体与pPRO43不同在于它具有克隆位点上游的优化的RBS序列—AGGAGGAAAACATA(SEQ ID NO:4的核苷酸3566-3579)。pPRO430表达载体还通过除去一些核苷酸序列和使用较短的终止子相对于pPRO43进行改进，其结果是pPRO430核苷酸序列(SEQ ID NO:4)仅具有3698个碱基，与5883个碱基的pPRO43核苷酸序列(SEQ ID NO:2)相比。pPRO430(CloDF13)表达载体(SEQ ID NO:5)与pPRO430相同，除了pPRO430中的BfuAI限制性位点侧翼的p15复制起点被pPRO430(CloDF13)中的较高拷贝数的CloDF13复制起点替代。
C.表达载体pBAD240
表达载体pBAD240(SEQ ID NO:6)基于pBAD24的核苷酸序列(GenBank数据库登录No.X81837.1(25-OCT-1995))通过DNA2.0合成。表达载体pBAD240与pBAD24不同在于具有编码序列可以插入其中的克隆位点上游的优化的RBS序列—AGGAGGAAAAA(SEQ ID NO:6的核苷酸3125-3136)。pBAD240核苷酸序列还通过除去一些核苷酸序列和使用较短的终止子相对于pBAD24进行改进，其结果是pBAD240核苷酸序列(SEQ ID NO:C)仅具有3225个碱基，与4542个碱基的pBAD24核苷酸序列相比。pBAD240表达载体还包括赋予对卡那霉素的抗性的基因(KanR)，而不是pBAD24中的氨苄青霉素抗性基因。
D.表达载体pPRO44和pPRO45
表达载体pPRO44(SEQ ID NO:7)和pPRO45(SEQ ID NO:8)基于pPRO43的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)产生，其中不同的复制起点用于pPRO44(RSF1030)和pPRO45(CloDF13)表达载体中。引物针对pPRO43、RSF1030复制起点和CloDF13复制起点设计以添加各复制起点序列上游的SpeI限制性位点和下游的AatII限制性位点。pPRO43和RSF1030核苷酸序列使用那些引物(分别地SEQ ID NO:9和10，及SEQ ID NO:11和12)扩增，扩增的产物使用SpeI和AatII消化，且所需的限制性片段进行凝胶纯化并连接在一起以产生pPRO44(SEQ ID NO:7)。得到的pPRO44表达载体被测序以确认没有通过PCR扩增引入突变。为产生pPRO45，CloDF13核苷酸序列使用引物(SEQ ID NO:13和14)扩增以添加SpeI和AatII位点，CloDF13扩增产物和pPRO44使用SpeI和AatII限制性酶消化，且所需的片段进行凝胶纯化并然后连接在一起以形成pPRO45(SEQ ID NO:8)。pPRO45的CloDF13部分被测序以确认没有通过PCR扩增引入突变。
实施例3
双启动子载体pSOL用于细菌细胞中荧光蛋白的可诱导共表达的用途
A.双启动子pSOL表达载体的构建
包含两种不同诱导型启动子的表达载体(称为“双重载体”或“pSOL”)示意性地显示于图5中。这一载体通过DNA2.0(Menlo Park,CA)合成并包含对于在大肠杆菌宿主细胞中的表达而优化的几个多核苷酸序列或“元件”。用于pSOL中的多核苷酸元件的描述在下面如表4中提供；pSOL的核苷酸序列作为SEQ ID NO:15提供。
表4.pSOL双启动子表达载体的多核苷酸元件
特别地，pSOL表达载体包含两种不同的诱导型启动子，其可用于目标蛋白的可诱导共表达：阿拉伯糖诱导araBAD启动子和丙酸盐诱导prpBCDE启动子。pSOL的变体也可以用于目标蛋白的可诱导共表达，如其中araBAD启动子和prpBCDE启动子的位置相对于复制起点切换的基于pSOL的表达载体。pSOL表达载体的其它可用的变体包括其中AraC转录激活剂的编码序列和/或PrpR转录激活剂的编码序列不存在于表达载体中，而是相反地从单独的多核苷酸(如不同的染色体外元件)或宿主基因组表达的那些变体。pSOL表达载体的另外的变体是包含插入在例如SEQ ID NO:15的pSOL核苷酸位置5304和29之间的第三诱导型启动子的那些变体，使得第三诱导型启动子在prpB启动子及其相关克隆位点和终止子的下游且以与prpB启动子相同的方向定向。pSOL表达载体的这类变体中的第三诱导型启动子可以例如是鼠李糖诱导启动子如rhaSR启动子、木糖诱导启动子如xlyAB启动子或通过磷酸盐耗竭诱导的启动子如phoA启动子。
B.荧光蛋白的可诱导共表达
为比较双启动子pSOL载体的共表达与pBAD24和pPRO33表达载体的组合的共表达的水平，pBAD24和pPRO33载体分别用于表达黄色荧光蛋白(YellowFP)和红色荧光蛋白(RedFP)。pSOL中的L-阿拉伯糖诱导araBAD启动子用于表达YellowFP，和丙酸盐诱导prpBCDE启动子用于表达RedFP。YellowFP具有528nm-530nm的最大发射及515nm的激发(Nagai等,"A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficientmaturation for cell-biological applications",Nat Biotechnol 2002Jan；20(1):87-90)，且RedFP具有610nm的最大发射及587nm的激发(Shaner等,"Improved monomeric red,orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp.redfluorescent protein",Nat Biotechnol 2004Dec；22(12):1567-1572；Epub 2004Nov21)。
为构建pBAD24-YellowFP和pPRO33-RedFP质粒，YellowFP和RedFP的编码序列通过DNA 2.0进行优化以用于在大肠杆菌中表达。YellowFP和RedFP的优化编码序列用NheI和SalI两者消化，且消化的插入片段分别连接到NheI/SalI-切割的pBAD24和pPRO33中。在pSOL的情况中，DNA 2.0使用基于扩增的Electra克隆系统分别将YellowFP和RedFP的优化编码序列插入到pSOL表达载体中araBAD启动子和prpBCDE启动子区域中的优化核糖体结合位点的下游。pBAD24-YellowFP和pPRO33-RedFP表达构建体共转化到大肠杆菌ASE(DGH)细胞中(大肠杆菌ASE(DGH)细胞描述于实施例1中)，且pSOL-YellowFP-RedFP表达构建体也单独地转化到大肠杆菌ASE(DGH)细胞中。
pBAD24-YellowFP/pPRO33-RedFP在ASE(DGH)('pBAD,pPRO')中和pSOL-YellowFP-RedFP在ASE(DGH)('pSOL')中的培养物分别在包含氯霉素+氨苄青霉素或包含卡那霉素的LB培养基中在37℃下伴随275RPM振摇生长过夜。在0.7的OD600下，细胞在2x 6mL的LB培养基+抗生素中稀释到OD600 0.01并在30℃下伴随275RPM振摇生长直到达到OD600 0.75。细胞在30℃下以3800x g沉淀7分钟，并重悬在M9培养基+抗生素(无额外的碳源)中达到OD6000.7。重悬的细胞在多孔板中以200微升/孔接种如下：
A,B行：pBAD24-YellowFP/pPRO33-RedFP，ASE(DGH)集落1中
C,D行：pBAD24-YellowFP/pPRO33-RedFP，ASE(DGH)集落2中
E,F行：pSOL-YellowFP-RedFP，ASE(DGH)集落1中
G,H行：pSOL-YellowFP-RedFP，ASE(DGH)集落2中
细胞通过添加不同浓度的丙酸盐(手动)和L-阿拉伯糖(数字分配器)诱导，丙酸盐浓度为0mM、1mM、2.5mM、5mM和20mM，且L-阿拉伯糖浓度为0微摩尔、0.67微摩尔、3.33微摩尔、6.66微摩尔和66.61微摩尔。
平板在Biotek SynergyTM 4酶标仪(BioTek Instruments Inc.,Winooski,Vermont)中30℃下使用“快速”振摇速度孵育，且荧光每15分钟监测，共8小时。荧光值对于在相同诱导剂浓度下培养的样品进行平均，且荧光如图6和7中所示随时间作图。图6显示从丙酸盐诱导prpBCDE启动子表达的随时间来自RedFP的荧光的水平。各平均化样品组的诱导剂浓度显示在图例中，其中首先列出丙酸盐浓度，接着是L-阿拉伯糖浓度。图7显示从L-阿拉伯糖诱导araBAD启动子表达的随时间来自YellowFP的荧光的水平。各平均化样品组的诱导剂浓度显示在图例中，其中首先列出L-阿拉伯糖浓度，接着是丙酸盐浓度。对于诱导剂浓度的各个组合，如通过所观察的荧光水平指示的，所测量的从pSOL双启动子表达载体上存在的诱导型启动子的荧光蛋白表达比从pBAD24-YellowFP/pPRO33-RedFP组合中存在的相应诱导型启动子的表达更高。从pSOL相对于pBAD24和pPRO33的这种提高的荧光蛋白表达水平不仅对于图6和7中显示的诱导剂浓度的组合观察到，而且对于为清楚的原因从图形中省略的诱导剂浓度的组合也观察到。
C.前胰岛素原与蛋白质二硫键异构酶的可诱导共表达
通过使用双启动子pSOL载体的前胰岛素原与蛋白质二硫键异构酶(PDI)的共表达产生的前胰岛素原的量与通过使用pBAD240(SEQ ID NO:6)和pPRO430(SEQ ID NO:4)表达载体的组合(对于这些载体的构建参见实施例2)的共表达产生的前胰岛素原的量比较。
pBAD240和pPRO430载体分别用于表达前胰岛素原和蛋白质二硫键异构酶(PDI)。pSOL中的L-阿拉伯糖诱导araBAD启动子用于表达前胰岛素原，和丙酸盐诱导prpBCDE启动子用于表达PDI。通过用氧化钙处理使得成为转化感受态的EB0001细胞(也称为大肠杆菌ASE(DGH)细胞，参见实施例1)添加到包含pBAD240-前胰岛素原和pPRO430-PDI载体两者的溶液，然后在42℃下热休克20秒，并允许在冰上静置5分钟。共转化细胞在37℃下伴随275RPM振摇1小时在900微升SOC outgrowth培养基(New England Biolabs目录号B9020S)中回收，之后接种到包含25微克/mL卡那霉素和12微克/mL氯霉素的琼脂平板上。对于包含pPRO430的细胞的生长，50微克/mL卡那霉素和12微克/mL氯霉素的抗生素浓度用于液体培养条件中。EB0001细胞以相同的方式用单一pSOL-前胰岛素原-PDI载体转化，但接种到琼脂平板上，和随后在仅包含50微克/mL卡那霉素的液体培养物中生长。挑取来自各次转化的单一集落并在30℃下伴随275RPM振摇在LB培养基+适当抗生素中培养过夜直到达到稳定期；这些培养物用于建立EB0001菌株中的pBAD240-前胰岛素原/pPRO430-PDI和EB0001菌株中的pSOL-前胰岛素原-PDI的甘油原液。
为使细胞生长直到诱导，从各甘油原液进行直接接种到具有适宜抗生素的100mLLB培养基中，并在30℃下伴随275RPM振摇培养过夜。在稀释到具有适宜抗生素的100mL新鲜LB培养基中以达到OD600 0.2后，细胞再次在30℃下伴随275RPM振摇培养直到OD600达到0.6-0.8。此时，适宜体积进行沉淀(3800x g，10分钟)使得在80mL诱导培养基(M9+适当抗生素)中的重悬浮得到OD6000.7-0.75。
重悬浮在诱导培养基中的细胞以3mL/孔接种到24-孔深孔培养板中进行诱导。培养物然后在平板中通过对于各诱导剂条件掺入10微升的300X诱导剂原液进行诱导，并在27℃下伴随275RPM振摇孵育6小时。各孔中培养物的OD600在6小时孵育后通过添加100微升的培养物到100微升的双蒸水中和使用Epoch酶标仪(BioTek,Winooski,Vermont)进行测量，其利用以下曲线拟合转换为小池OD：OD600_小池＝(OD600_平板*1.9796)-0.07。各孔中的细胞然后通过在室温下以3800x g沉淀7分钟收获。上清液从沉淀吸出且细胞沉淀样品储存在-80℃下。
各细胞沉淀中前胰岛素原的量按照制造商的指示使用在WES系统(ProteinSimple,San Jose,California)上运行的毛细管电泳Western印迹测定。储存的细胞沉淀在冰上解冻10分钟，然后在裂解缓冲液(磷酸钾pH 8，1％辛基葡糖苷；1X蛋白酶抑制剂；2U核酸酶(benzonase)(EMD#70746,EMD Millipore,Billerica,Massachusetts)/mL培养物；和2.25kU rLysozyme(EMD#71110,EMD Millipore,Billerica,Massachusetts)/mL培养物)中以比诱导后收获时的培养物浓度高2倍的细胞浓度进行裂解。裂解通过在冰上孵育10分钟进行，然后样品在4℃下以20,000x g旋转澄清15分钟。在制备用于WES分析时，裂解产物稀释到0.1X WES缓冲液中，使它们达到0.02X的终浓度。对于各样品，5微升的稀释样品添加到1.25微升还原5X样品缓冲液(具有荧光标准品且添加DTT达到200mM的终浓度)。在加载到WES系统上之前，样品在95℃下加热10分钟。用于检测前胰岛素原的一抗是小鼠抗-胰岛素抗体，和二抗是用辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗-小鼠抗体。WES分析的结果显示于表5和6中。
表5.在使用两个单独载体与PDI共表达时产生的前胰岛素原的量(微克/mL/OD)
表6.在使用单一pSOL载体与PDI共表达时产生的前胰岛素原的量(微克/mL/OD)
表5和6中的结果的比较表明，在相当的诱导剂浓度下，pSOL载体比双载体共表达系统产生高2-8倍的前胰岛素原量。
实施例4
英夫利昔单抗的可诱导共表达
英夫利昔单抗是结合TNF-α(一种炎性细胞因子)的嵌合单克隆抗体，且用于治疗涉及TNF-α的状况如自身免疫性疾病(克罗恩氏病、类风湿性关节炎、银屑病等)。英夫利昔单抗由重链(显示为SEQ ID NO:16的氨基酸序列)和轻链(显示为SEQ ID NO:17的氨基酸序列)形成；这些链各自具有源自小鼠抗-TNF-α抗体的可变结构域序列和人恒定结构域。针对在大肠杆菌中表达的密码子优化和编码SEQ ID NO:16和17的多核苷酸的合成通过DNA2.0(Menlo Park,CA)进行。
DNA2.0Electra克隆方法(www.dna20.com/products/expression-vectors/electra-system)用于产生英夫利昔单抗表达构建体。通过插入英夫利昔单抗重链的优化编码序列到pBAD240表达载体的Electra克隆位点中形成的表达构建体是pBAD240-英夫利昔单抗_HC，其具有如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。通过插入英夫利昔单抗轻链的优化编码序列到pPRO430表达载体的Electra克隆位点中形成的表达构建体是pPRO430-英夫利昔单抗_LC，其具有如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列。优化的英夫利昔单抗重链和轻链编码序列两者以相似的方式克隆到pSOL表达载体(SEQ ID NO:15)中，其中重链从araBAD启动子表达，和轻链从prpBCDE启动子表达。所得的pSOL-英夫利昔单抗表达载体具有SEQ IDNO:20中显示的核苷酸序列。pBAD240-英夫利昔单抗_HC和pPRO430-英夫利昔单抗_LC表达构建体用于在42℃下通过热休克共转化大肠杆菌ASE(DGH)细胞，接着在37℃下生长过夜，且pSOL-英夫利昔单抗表达构建体类似地转化到大肠杆菌ASE(DGH)细胞中，从而产生ASE(DGH)(pBAD240-英夫利昔单抗_HC/pPRO430-英夫利昔单抗_LC)细胞和ASE(DGH)(pSOL-英夫利昔单抗)细胞。
这些细胞总体地如实施例3中所述生长，包括按照需要添加选择化合物如卡那霉素和/或氯霉素，且为了抗体表达的诱导，细胞以大约0.7(0.6-1.0)的OD600重悬在M9培养基中(没有另外的碳源)中。然后细胞通过添加阿拉伯糖(最初以包括0.1％的浓度)和丙酸盐(最初以包括50mM的浓度)诱导。阿拉伯糖和丙酸盐浓度的调整可以如实施例5中所述进行。在诱导后，其中已经产生抗体的宿主细胞使用如溶菌酶的酶通过化学裂解破坏，或通过机械破坏方法如超声处理或使用Microfluidics M-110Y型微流化器(MicrofluidicsInternational Corp.,Westwood,Massachusetts)的微流化破坏。在室温下以20,000x g离心15分钟用于分离出不溶性部分，且收集包含可溶性蛋白质(包括表达的抗体)的上清液。
英夫利昔单抗抗体按照制造商的指示使用在WES系统(ProteinSimple,San Jose,California)上运行的毛细管电泳Western印迹检测和定量(也参见实施例3)。可溶性蛋白质提取物加载到毛细管组中，蛋白质按照大小电泳分离，和然后样品中的抗体用封闭步骤(而不是使用一抗)和与HRP-标记的山羊抗-人二抗(其识别人抗体重链和轻链)孵育进行检测。抗体检测通过向毛细管添加化学发光底物且直接捕获在酶催化的反应期间发射的光来完成。分子量估计值对于各次运行使用标准曲线计算，该标准曲线使用12k至230kDa范围的六个生物素化蛋白质生成。荧光标准品包括在样品加载缓冲液中，对各样品给出用于将样品与分子量标准进行比对的内标。
为测定以给定分子量存在的蛋白质的量，已知量的蛋白质标准品在一些毛细管中运行。在这种情况下，系列稀释液由具有已知蛋白质浓度的可商购英夫利昔单抗制备(例如以10微克/mL开始并稀释到1.0纳克/mL)。大约五个WES系统毛细管用于运行系列稀释液。对于在实验和系列稀释毛细管两者中的各英夫利昔单抗蛋白质条带，代表蛋白质条带的化学发光强度的曲线通过WES系统软件生成，并评估曲线下面积，其中这些面积的标准曲线对于英夫利昔单抗系列稀释毛细管中的英夫利昔单抗蛋白质条带作图。为测定实验样品的浓度，代表实验英夫利昔单抗样品的化学发光强度的各曲线下面积可以与对于已知英夫利昔单抗浓度的样品生成的标准曲线进行比较。
英夫利昔单抗抗体可以如实施例7中所述进一步纯化，且英夫利昔单抗抗体的另外的表征描述于实施例8(抗体结合亲和力的测量)和实施例9(表征共表达产物中存在的二硫键)中。
实施例5
通过不同诱导剂浓度的共表达的滴定
为优化使用本发明的表达系统的多聚产物的产生，有可能独立地调节或滴定诱导剂的浓度。包含含有诱导型启动子如L-阿拉伯糖诱导启动子、丙酸盐诱导启动子、L-鼠李糖诱导启动子或D-木糖诱导启动子的表达构建体的宿主细胞在包含适宜抗生素的M9最低培养基中生长到所需密度(如大约0.5的OD600)，然后细胞等分到小体积的M9最低培养基(任选地没有碳源如甘油并用适宜抗生素和变化浓度的各诱导剂制备)中。小体积滴定可以在200-500ml摇瓶中进行。诱导表达必要的L-阿拉伯糖、L-鼠李糖或D-木糖的浓度通常低于(且经常显著低于)0.02％/OD单位细胞。在滴定试验中，测试的L-阿拉伯糖浓度范围可以是2％-1.5％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.005％、0.002％、0.001％、0.0005％、0.0002％、0.0001％、0.00005％、0.00002％、0.00001％、0.000005％、0.000002％、0.000001％、0.0000005％、0.0000002％、0.0000001％、0.00000005％、0.00000002％和0.00000001％，全部是按照每OD单位细胞。66.61微摩尔L-阿拉伯糖的浓度对应于0.001％L-阿拉伯糖。L-阿拉伯糖、L-鼠李糖或D-木糖的可选滴定试验是测试以摩尔浓度表示的以下浓度：250mM、100mM、50mM、25mM、10mM、5mM、2.5mM、1.0mM、500微摩尔、250微摩尔、100微摩尔、75微摩尔、50微摩尔、25微摩尔、10微摩尔、5.0微摩尔、2.5微摩尔、1.0微摩尔、500nM、250nM、100nM、50nM、25nM、10nM、5.0nM、2.5nM、1.0nM、500pM、250pM、100pM、50pM、25pM、10pM、5.0pM、2.5pM和1.0pM，全部是按照每OD单位细胞。对于丙酸盐，待测试的浓度范围可以为1M-750mM、500mM、250mM、100mM、75mM、50mM、25mM、10mM、5mM、1mM、750微摩尔、500微摩尔、250微摩尔、100微摩尔、50微摩尔、25微摩尔、10微摩尔、5.0微摩尔、2.5微摩尔、1.0微摩尔、500nM、250nM、100nM、50nM、25nM、10nM、5.0nM、2.5nM和1.0nM，全部是按照每OD单位细胞。
对于测试的L-阿拉伯糖(或L-鼠李糖或D-木糖)的各浓度“x”，添加到含浓度“x”的第一诱导剂的各管中的不同诱导剂如丙酸盐的浓度在各系列的样品中变化。或者，滴定试验可能以诱导剂浓度的“标准”组合开始，其对于具有至少一个编码代谢诱导剂的蛋白质的基因的降低的基因功能水平的宿主细胞为0.0015％(100微摩尔)/OD单元细胞的L-阿拉伯糖、L-鼠李糖或D-木糖任何一种，和/或100微摩尔(或50微摩尔和250微摩尔之间的浓度)/OD单元细胞的丙酸盐。对于其中代谢诱导剂的蛋白质为功能性的宿主细胞，诱导剂浓度的“标准”组合是0.2％(13mM)/OD单元细胞的L-阿拉伯糖、L-鼠李糖或D-木糖的任何一种，和/或83mM(或50mM和100mM之间的浓度)/OD单元细胞的丙酸盐。测试了从该“标准”组合的浓度开始变化的另外的诱导剂浓度组合；在一系列滴定试验中，来自初始实验的结果可以用于“微调”用于之后实验中的诱导剂浓度。类似的滴定试验可以对于用于本发明可诱导共表达系统中的任何诱导剂组合进行，包括但不限于L-阿拉伯糖、丙酸盐、L-鼠李糖和D-木糖。在诱导剂存在下生长6小时后，细胞成团，所需的产物从细胞提取，且按细胞质量值的产物产率通过定量免疫分析如ELISA或通过产物的纯化和280nm下UV吸光度的定量来测定。
也可能使用高通量分析滴定诱导剂浓度，其中待表达的蛋白质经工程化以包括荧光蛋白质部分，如mKate2红色荧光蛋白质(Evrogen,Moscow,Russia)提供的部分，或来自维多利亚水母和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的增强绿色荧光蛋白质。在高通量滴定试验中测定通过不同浓度诱导剂产生的基因产物的量和活性的另一途径是使用能够测量生物分子结合相互作用的传感器，如检测表面等离子体共振的传感器或利用生物层干涉测量法(BLI)的传感器(例如,来自forteBIO,Menlo Park,CA的QK系统)。如果可得以足够特异性结合所表达的基因产物的抗体，则基因产物可以如以上实施例3中所述使用毛细管电泳Western印迹(如在WES系统上运行的)进行检测和定量。
实施例6
启动子强度和可诱导表达的同质性的测量
启动子的强度作为相对于合适的对照在该启动子处启动的基因产物转录的量被测量。对于指导表达构建体中基因产物的表达的组成型启动子，合适的对照可以使用相同的表达构建体，除了使用该启动子的“野生型”形式或来自“管家”基因的启动子取代待测试的启动子外。对于诱导型启动子，从该启动子的基因产物表达可以在诱导和非诱导条件下比较。
A.使用定量PCR测定由该启动子转录的RNA的水平而测量启动子强度
De Mey等的方法(“Promoter knock-in:a novel rational method for thefine tuning of gene”,BMC Biotechnol 2010Mar 24；10:26)用于测定启动子在可以在培养物中生长的宿主细胞中的相对强度。包含具有待测试启动子的表达构建体的宿主细胞和包含对照表达构建体的对照宿主细胞在培养物中一式三份地生长。在OD600＝1.0下收集一ml样品用于mRNA和蛋白质的收集。总RNA提取使用RNeasy小型试剂盒(QIAGEN,TheNetherlands)进行。RNA的纯度如QIAGEN推荐的在FA-琼脂糖凝胶上验证且RNA浓度通过测量260nm下的吸光度测定。两微克的RNA用于使用随机引物和RevertAid H Minus M-MulV反转录酶(Fermentas,Glen Burnie,Maryland)合成cDNA。启动子的强度使用设计为扩增对应于由该启动子产生的转录物的cDNA的正向和反向引物通过在iCycler(Bio-Rad,Eke,Belgium)中完成的RT-qPCR测定。(为这一目的，De Mey等作者使用Fw-ppc-qPCR和Rv-ppc-qPCR引物及来自对照管家基因rpoB的引物Fw-rpoB-qPCR和Rv-rpoB-qPCR。)SYBR GreenERqPCR supermix(Life Technologies,Grand Island,New York)用于进行简短的UDG(尿嘧啶DNA糖基化酶)孵育(50℃，2min)，紧接着PCR扩增(95℃，8.5min；40个循环的95℃，15s及60℃，1min)和解链曲线分析(95℃，1min；55℃，1min和80个循环的55℃+0.5℃/循环，10s)以鉴定引物二聚体的存在和分析反应的特异性。PCR循环之前的这一UDG孵育步骤破坏来自之前反应的任何污染的含dU产物。UDG然后在正常PCR循环期间通过高温灭活，从而允许真正的靶序列的扩增。各样品一式三份地进行。相对表达率使用PE Applied Biosystems(PerkinElmer,Forster City,California)的“Delta-delta ct方法”计算。
B.使用荧光报道基因测量诱导型启动子强度和诱导的同质性
这些试验使用Khlebnikov等的方法(“Regulatable arabinose-inducible geneexpression system with consistent control in all cells of a culture”,JBacteriol 2000Dec；182(24):7029-7034)进行。测量诱导型启动子的诱导的试验在补充有3.4％甘油作为碳源的C培养基中进行(Helmstetter,“DNA synthesis during thedivision cycle of rapidly growing Escherichia coli B/r”,J Mol Biol 1968Feb14；31(3):507-518)。包含含有控制荧光报道基因表达的至少一个诱导型启动子的表达构建体的大肠杆菌菌株在37℃下抗生素选择下生长到0.6-0.8的600nm光密度(OD600)。细胞通过离心(15,000x g)收集，在没有碳源的C培养基中洗涤，重悬于含抗生素、甘油和/或诱导剂(用于基因表达的诱导)的C培养基中达到0.1-0.2的OD600，并孵育6h。在生长期间中常规地获取样品用于分析。培养物荧光在具有360/40-nm波长激发和520/10-nm波长发射滤波器的Versafluor Fluorometer(Bio-Rad Inc.,Hercules,California)上测量。在诱导时来自诱导型启动子的表达的强度可以表示为诱导的细胞的最大群体平均荧光(荧光/OD比率)相对于对照(如未诱导)细胞的最大群体平均荧光的比率。为确定细胞群体内诱导的同质性，流式细胞分析在配备有氩激光器(488nm发射波长和15mW)和525-nm波长带通滤波器的Beckman-Coulter EPICS XL流式细胞仪(Beckman Instruments Inc.,Palo Alto,California)上进行。在分析前，采样的细胞用经过过滤(过滤器孔径0.22微米)的磷酸盐缓冲盐水洗涤，稀释到0.05的OD600，并置于冰上。对于各样品，以500-1,000事件/s的速率收集30,000个事件。诱导的(荧光)细胞在各样品中的百分比可以从流式细胞分析数据计算。
实施例7
抗体的纯化
通过本发明可诱导共表达系统产生的抗体通过以10,000x g离心裂解的宿主细胞的样品10分钟以除去任何细胞和碎片而纯化。上清液通过0.45微粒滤器过滤。1-ml重组蛋白质G-4B柱(Life Technologies,Grand Island,New York)设置用于获得1ml/min的流率，并用于以下缓冲液：结合缓冲液：0.02M磷酸钠,pH 7.0；洗脱缓冲液：0.1M甘氨酸-HCl,pH 2.7；和中和缓冲液：1M Tris-HCl,pH 9.0。柱用5倍柱体积(5ml)的结合缓冲液平衡，然后样品施加到柱上。柱用5-10倍柱体积的结合缓冲液洗涤以除去杂质和未结合的物质，持续直到无蛋白质在洗脱液中检测到(通过280nm的UV吸光度确定)。柱然后用5倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱，且柱立即用5-10倍柱体积的结合缓冲液再平衡。
实施例8
抗体结合亲和力的测量
抗体结合亲和力(表示为“Kd”或“Kd值”)通过用目标抗体的Fab形式及其抗原进行的放射标记抗原结合分析(RIA)测量，如以下分析所述的。全长抗体的Fab形式的产生在本领域中公知。Fab对抗原的溶液结合亲和力通过在滴定系列的未标记抗原存在下用最小浓度的(125I)-标记的抗原平衡Fab，然后用抗-Fab抗体涂覆的板捕获结合的抗原来测量(参见，例如,Chen等,“Selection and analysis of an optimized anti-VEGF antibody:crystal structure of an affinity-matured Fab in complex with antigen”,J MolBiol 1999Nov 5；293(4):865-881)。为建立用于该分析的条件，微量滴定板(DYNEXTechnologies,Inc.,Chantilly,Virginia)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5微克/ml的捕获抗-Fab抗体(Cappel Labs,West Chester,Pennsylvania)涂覆过夜，且随后在室温下(大约23℃)用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白封闭二至五小时。在非吸附板(Nunc#269620；Thermo Scientific,Rochester,New York)中，100pM或26pM[125I]-抗原与系列稀释的目标Fab混合(例如，与Presta等,“Humanization of an anti-vascular endothelial growthfactor monoclonal antibody for the therapy of solid tumors and otherdisorders”,Cancer Res 1997Oct 15；57(20):4593-4599中抗-VEGF抗体,Fab-12的评估一致)。目标Fab然后孵育过夜；但是，孵育可以持续更长时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。之后，混合物转移到捕获板用于在室温下孵育(例如，一小时)。溶液然后移除且板用PBS中的0.1％TWEEN-20TM表面活性剂洗涤8次。当板已经干燥，添加150微升/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；PerkinElmer,Waltham,Massachusetts)，且板在TOPCOUNTTMγ计数器(PerkinElmer)上计数10分钟。给出低于或等于最大结合的20％的各Fab的浓度选择用于竞争结合分析。
或者，Kd或Kd值使用具有固定的抗原CM5芯片以～10反应单位(RU)在25℃下使用或仪(BIAcore,Inc.,Piscataway,NewJersey)利用表面等离子体共振测量。简言之，羧甲基化的萄聚糖生物传感器芯片(CM5,BIAcore Inc.)用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基-丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按照供应商的指示活化。抗原用10mM乙酸钠,pH4.8稀释到5微克/ml(～0.2微摩尔)，之后以5微升/分钟的流率注射以获得大约10RU的偶联蛋白质。在抗原注射后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，两倍系列稀释的Fab(0.78nM-500nM)25℃下在具有0.05％TWEEN 20TM表面活性剂的PBS(PBST)中以大约25微升/分钟的流率注射。结合速率(kon)和解离速率(koff)使用简单的一对一Langmuir结合模型(Evaluation Software 3.2版)通过同时拟合结合和解离传感图来计算。平衡解离常数(Kd)计算为比率koff/kon。如果结合速率通过以上的表面等离子体共振分析超过106M-1s-1，则结合速率可以如分光光度计(如配备停止流的分光光度计(stop-flow-equippedspectrophotometer)(Aviv Instruments)或具有搅拌池的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中测量的，在增加浓度的抗原存在下，通过使用测量PBS,pH 7.2中20nM抗-抗原抗体(Fab形式)25℃下的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的提高或降低的荧光淬灭技术来测定。
用于测定抗体-抗原结合的平衡解离常数(Kd)的另一方法使用Octet Red系统(ForteBio,Pall Corporation,Port Washington,New York)(www.fortebio.com/octet-RED96.html)。初始测量步骤测定基线，接着以25nM的浓度加载His-标记的抗原到1X KB+缓冲液(0.01％BSA，PBS中的0.002％Tween-20，pH7.4)中的Ni-NTA生物传感器上10分钟，接着进行另一基线测量步骤(1X KB+缓冲液，仅2分钟)。传感器然后浸入含有抗体的孔中(结合步骤)10分钟，接着在1X KB+缓冲液中的20分钟洗涤以测量解离。平衡解离常数(Kd)使用测定koff和kon速率的Octet软件计算为koff/kon比率。
实施例9
表征表达产物中存在的二硫键
蛋白质表达产物中二硫键的数目和位置可以通过在非还原条件下用蛋白酶如胰蛋白酶消化蛋白质并使得所得肽片段进行与顺序电子转移解离(ETD)和碰撞诱导的解离(CID)MS步骤(MS2,MS3)结合的质谱法(MS)来测定(Nili等,“Defining the disulfidebonds of insulin-like growth factor-binding protein-5by tandem massspectrometry with electron transfer dissociation and collision-induceddissociation”,J Biol Chem 2012Jan 6；287(2):1510-1519；Epub 201 1Nov 22)。
共表达的蛋白质的消化。为防止二硫键重排，任何游离半胱氨酸残基首先通过烷基化封闭：表达的蛋白质在20℃下在具有4M尿素的缓冲液中避光与烷基化剂碘乙酰胺(5mM)在振摇情况下孵育30分钟。可选地和优选地，NEM用作烷化试剂，与在变性条件(6MGuaHCl)下进行的还原/烷基化结合的胰蛋白酶蛋白质水解。在烷基化后，共表达的蛋白质使用预制凝胶通过非还原SDS-PAGE分离。或者，共表达的蛋白质在电泳后在凝胶中与碘乙酰胺或NEM，或者作为对照在没有该试剂的情况下孵育。蛋白质条带进行染色、用双重去离子水脱色、切割和在500微升的50mM碳酸氢铵、50％(v/v)乙腈中20℃下伴随振摇孵育30分钟两次。蛋白质样品在100％乙腈中脱水2分钟，通过真空离心干燥并用10mg/ml的胰蛋白酶或糜蛋白酶在含50mM碳酸氢铵和5mM氯化钙的缓冲液中在冰上重新水化15分钟。除去过量缓冲液并用50微升的没有酶的相同缓冲液更换，之后对于胰蛋白酶和糜蛋白酶分别在37℃或20℃下伴随振摇孵育16小时。消化通过添加3微升的88％甲酸停止，且在短暂涡旋后，除去上清液并储存在-20℃下直到分析。如果胰酶水解(trypsinolysis)提供不足的序列覆盖率(<75％)，则使用替代的蛋白质片段化方法(LysC、Glu-C或CNBr)。在NEM存在的情况下在酸性条件下使用还原剂TCEP(三(2-羧基乙基)膦)提供得到具有部分完整二硫键的片段的途径。二硫键完整的消化图谱与还原(DTT或TCEP)的消化图谱进行比较。
二硫键通过质谱定位。肽在含0.1％甲酸的流动相中以20微升/分钟注射到1mm x8mm捕集柱(Michrom BioResources,Inc.,Auburn,CA)上。捕集盒然后在线设置含有5mmZorbax SB-C18固定相的0.5mm x 250mm柱(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)，且肽用1100系列毛细管HPLC(Agilent Technologies)通过2-30％乙腈梯度以10微升/分钟经90分钟分离；或者，使用适合于UPLC的C18柱。肽使用具有ETD源(Thermo FisherScientific Inc.,Waltham,Massachusetts)的LTQ Velos线性离子阱进行分析。电喷雾离子化使用Captive Spray源(Michrom Bioresources,Inc.)或者优选地3.0kV下未包被的、牵引熔融硅发射器(uncoated,pulled fused silica emitter)(New Objective Inc.,Woburn,Massachuetts)进行。或者，中等大小蛋白水解片段的分析使用Thermo LTQ-FT MS(7特斯拉)仪或Synapt G2-Si四极行波离子迁移飞行时间(ToF)质谱仪(Waters Corp.,Milford,Massachusetts)进行。优选地，肽使用Orbitrap FusionTM TribridTM质谱仪(Thermo Fisher Scientific)进行分析。二硫键连接的肽在胰蛋白酶化后由于两个N-末端和羧基末端的两个碱性碱基(精氨酸或赖氨酸)的存在而具有+4或更大的电荷状态。这些二硫键连接的肽优先地通过Orbitrap FusionTM仪分离，使得二硫键可以使用ETD片段化断裂。监查MS扫描(suevey MS scan)之后是由对于普查扫描中最高强度的离子的CID和ETD MS2扫描组成的七个数据相关扫描，之后是对ETD MS2扫描中第一至第五高强度离子的五个MS3CID扫描。CID扫描使用标准化的碰撞能量35，和ETD扫描使用100ms激活时间，使得补充激活成为可能。启动MS2CID和ETD扫描的最小信号是10,000，用于启动MS3CID扫描的最小信号是1000，且所有MS2和MS3扫描的分离宽度是3.0m/z。软件的动态排除特征用1的重复计数、100的排除列表大小和30s的排除持续时间实现。使用用于收集ETD MS2扫描的目标特定交联物质的包含列表。MS2和MS3扫描的独立数据文件使用ZSA负荷状态(charge state)分析通过Bioworks 3.3(Thermo Fisher Scientific)产生。MS2和MS3扫描与肽序列的匹配通过Sequest(V27,Rev 12,Thermo Scientific)进行。该分析在没有酶特异性的情况下进行，母离子质量公差为2.5、片段质量公差为1.0，和对于氧化的甲硫氨酸残基+16的可变质量。结果然后使用程序Scaffold(V3_00_08,Proteome Software,Portland,OR)进行分析，使用95和99％的最小肽和蛋白质概率。用于数据解释的软件工具还包括具有Disulfinator节点的Proteome DiscovererTM 2.0(Thermo Fisher Scientific)。来自MS3结果的肽按照扫描数分选，且含半胱氨酸的肽从由ETD MS2扫描中观察到的五个最高强度离子产生的MS3扫描的组鉴别。参与到二硫键连接的物质中的半胱氨酸肽的身份进一步通过在普查扫描和ETDMS2扫描中观察到的母离子质量的人工检查来确认。
实施例10
表达产物从细菌细胞周质、从原生质球和从全细胞的分离
本发明的可诱导表达系统可用于表达在细胞的不同区室如胞质或周质中累积的基因产物。宿主细胞如大肠杆菌或酿酒酵母具有外细胞膜或细胞壁，且可以在外膜或壁除去时形成原生质球。在这种宿主中形成的表达的蛋白质可以特别地使用以下方法从周质或从原生质球或从全细胞纯化(Schoenfeld,“Convenient,rapid enrichment ofperiplasmic and spheroplasmic protein fractions using the new PeriPrepsTMPeriplasting Kit”,Epicentre Forum 1998 5(1):5；参见www.epibio.com/newsletter/f5_l/f5_lpp.asp)。使用PeriPrepsTM Periplasting Kit(Biotechnologies,Madison WI；方案可在www.epibio.com/pdftechlit/107pl0612.pdf获得)的这一方法设计用于大肠杆菌和其它革兰氏阴性细菌，但一般方法可以改进以用于其它宿主细胞如酿酒酵母。
1.细菌宿主细胞培养物仅生长到后对数期，因为静止期的较老的细胞培养物通常表现出对溶菌酶处理的一些抗性。如果重组蛋白质的表达过度，则细胞可能过早地裂解；因此，细胞培养物不在可能诱导过度蛋白质合成的丰富培养基中或较高生长温度下生长。然后诱导蛋白质表达；细胞应当处于对数期或早静止期。
2.细胞培养物通过在室温下以最低1,000x g离心10分钟而成团。注：细胞必须是新鲜的，非冷冻的。测定细胞团的湿重以计算这一方案所需的试剂量。
3.细胞完全重悬于每克细胞最少2ml的PeriPreps Periplasting Buffer(200mMTris-HCl pH 7.5,20％蔗糖,1mM EDTA和30U/微升Ready-Lyse Lysozyme)中，或者通过涡旋混合或者通过吸液直到细胞悬液是均质的。注：过度搅拌可以引起原生质球的过早裂解，导致周质部分被胞质蛋白质污染。
4.在室温下孵育五分钟。最佳地，Ready-Lyse Lysozyme在室温下是活性的。在较低温度(0℃-4℃)下的裂解需要额外的孵育时间；在这样的温度下孵育时间延伸2-4倍。
5.在4℃下对于每克原始细胞团重量(步骤2)添加3ml的纯化水并通过反转混合。
6.在冰上孵育10分钟。
7.裂解的细胞通过在室温下以最低4,000x g离心15分钟而沉淀。
8.包含周质部分的上清液转移到清洁管中。
9.为降解污染的核酸，OmniCleave Endonuclease任选地添加到PeriPreps LysisBuffer。包含核酸酶通常提高蛋白质的产率和裂解产物操作的简易性，但核酸酶的添加在一些情况中是不希望的：例如，如果残留核酸酶活性或对镁辅因子的短时暴露干扰后续分析或纯化蛋白质的使用，则核酸酶的使用应当避免。相同地，添加EDTA到裂解产物中以灭活OmniCleave Endonuclease可能干扰后续分析或纯化蛋白质的使用。如果添加核酸酶，2微升的OmniCleave Endonuclease和10微升的1.0M MgCl2对于步骤10中需要的各微升的Lysis Buffer用PeriPreps Lysis Buffer(10mM Tris-HCl pH 7.5,50mM KC1,1mM EDTA和0.1％脱氧胆酸)稀释到最多1ml。
10.团块对于每克原始细胞团重量重悬在5ml的PeriPreps Lysis Buffer中。
11.团块在室温下孵育10分钟(如果包括核酸酶，OmniCleave Endonuclease活性将引起粘度的显著降低；孵育继续直到细胞悬液具有水的稠度)。
12.细胞碎片通过在4℃下以最低4,000x g离心15分钟而沉淀。
13.包含原生质球的上清液转移到清洁管中。
14.如果OmniCleave Endonuclease添加到PeriPreps Lysis Buffer中，20微升的500mM EDTA添加到每毫升所得的原生质球部分中以螯合镁(裂解产物中EDTA的最终浓度是10mM)。在核酸用OmniCleave Endonuclease水解后，裂解产物可以包含显著量的单核苷酸或寡核苷酸。这些降解产物的存在可以影响裂解产物的进一步处理：例如，核苷酸可以通过与树脂相互作用降低阴离子交换树脂的结合能力。
上述方案可以利用以下改进用于制备总细胞蛋白质。在步骤2中沉淀的细胞可以是新鲜的或冷冻的；在步骤4，细胞孵育15分钟；步骤5-8省略；在步骤10，每克原始细胞团重量添加3ml的PeriPreps Lysis Buffer。
在制备周质或原生质球或全细胞蛋白质样品后，样品可以通过多种蛋白质鉴定和/或定量方法中的任一种进行分析。在一个实施例中，周质和原生质球蛋白质的成功分级分离通过用SDS-PAGE分析一等份的周质和原生质球部分而确认(两微升的各部分一般足以通过用Coomassie Brilliant Blue染色而可视化)。独特蛋白质的存在或特定蛋白质在给定部分中的富集表明成功的分级分离。例如，如果宿主细胞包含具有氨苄青霉素抗性标记的高拷贝数质粒，则主要在周质部分中的β-内酰胺酶(31.5kDa)的存在表明成功的分级分离。周质空间中发现的其它大肠杆菌蛋白质包括碱性磷酸酶(50kDa)和延伸因子Tu(43kDa)。给定部分中发现的蛋白质的量可以使用多种方法中的任一种(如SDS-PAGE和染色或标记的蛋白质条带的光密度分析、放射标记蛋白质的闪烁计数、酶联免疫吸附分析(ELISA)或闪烁迫近分析，以及其它方法)定量。如与原生质球部分比较的比较的周质部分中发现的蛋白质的量表明蛋白质从胞质输出到周质中的程度。
实施例11
多核苷酸或氨基酸序列相似性的测定
百分多核苷酸序列或氨基酸序列同一性定义为在两个比对的序列中相同的比对符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列的比对中的符号的总数(包括空位)。两个序列之间的相似性程度(百分同一性)可以通过使用在网站blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi可得的Needleman-Wunsch Global Sequence Alignment Tool中由NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI)实施的Needleman和Wunschas的总体比对方法(J.Mol.Biol.48:443,1970)比对序列来确定。在一个实施方式中，Needleman和Wunsch比对参数设置为默认值(匹配/失配评分分别为2和-3，且存在和延伸的空位损失分别为5和2)。序列比较领域的技术人员使用的其它程序也可以用于比对序列，例如基本局部比对检索工具或程序(Altschul等,“Basic local alignment search tool”,J MolBiol 1990Oct 5；215(3):403-410)，如由NCBI实施的，其使用在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi网站描述的默认参数设置。BLAST算法具有多个任选的参数，包括可以如下使用的两个：(A)包括过滤器以掩蔽查询序列的具有低组成复杂性的片段或由短周期性内部重复序列组成的片段，其优选不使用或设置为“Off”，和(B)报告针对数据库序列的匹配的统计显著性域值，称为“预测(Expect)”或E-评分(仅偶然发现为匹配的预期概念；如果归因于匹配的统计显著性大于这一E-评分域值，匹配将不报告)。如果这一“预测”或E-评分值从默认值(10)调节，优选的域值是0.5，或按照增加优先级的顺序，0.25、0.1、0.05、0.01、0.001、0.0001、0.00001和0.000001。
在实施本发明中，任选地使用分子生物学、微生物学和重组DNA技术中的许多常规技术。这类常规技术涉及载体、宿主细胞和重组方法。这些技术是公知的且在例如Berger和Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology volume152Academic Press,Mc,San Diego,CA；Sambrook等,Molecular Cloning-A LaboratoryManual(3rd Ed.),Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NewYork,2000；及Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等编辑,CurrentProtocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.,(2006增刊)中说明。其它可用的参考文献，例如用于细胞分离和培养及用于后续核酸或蛋白质分离，包括Freshney(1994)Culture of Animal Cell,a Manual ofBasic Technique,第三版,Wiley-Liss,New York及其中引用的参考文献；Payne等(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley&Sons,Inc.New York,NY；Gamborg和Phillips(Eds.)(1995)Plant Cell,Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual,Springer-Verlag(Berlin Heidelberg NewYork)；及Atlas和Parks(Eds.)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRCPress,Boca Raton,FL。制备核酸的方法(例如，通过体外扩增、从细胞纯化或化学合成)、操作核酸的方法(例如，通过定点诱变、限制性酶消化、连接反应等)和可用于操作和制备核酸的各种载体、细胞系等描述于以上参考文献中。另外，基本上任何多核苷酸(包括标记的或生物素化多核苷酸)可以是从多个商业来源的任一个定制或标准订购的。
本发明已经依照发现或提议包含用于实施本发明的特定模式的特定实施方式进行了描述。本领域技术人员可以理解，根据本公开，可以在示例的实施方式中进行多种修饰和改变而不脱离本发明的预期范围。
所有引用的参考文献，包括专利公开，通过引用全文并入本文中。通过公布的基因组位置或其它描述指代的核苷酸和其它遗传序列也明确地通过引用并入本文中。
序列表中呈现的序列

Claims (60)

1.一种包含两个或更多个诱导型启动子的表达构建体，
其中至少一个诱导型启动子是丙酸盐诱导启动子和至少一个另外的诱导型启动子是L-阿拉伯糖诱导启动子；
且其中所述表达构建体包含选自以下的核苷酸序列：
(a)与SEQ ID NO:15的核苷酸1833-5304的至少3000个连续碱基具有至少80％同一性的核苷酸序列；
(b)与SEQ ID NO:15的核苷酸1833-5304的至少3250个连续碱基具有至少80％同一性的核苷酸序列；
(c)与SEQ ID NO:15的至少3000个连续碱基具有至少80％同一性的核苷酸序列；
(d)与SEQ ID NO:15的至少3250个连续碱基具有至少80％同一性的核苷酸序列；
(e)与SEQ ID NO:15的至少3500个连续碱基具有至少80％同一性的核苷酸序列；
(f)与SEQ ID NO:15的至少4000个连续碱基具有至少80％同一性的核苷酸序列；和
(g)与SEQ ID NO:15的至少5000个连续碱基具有至少80％同一性的核苷酸序列。
2.一种包含两个或更多个诱导型启动子的表达构建体，
其中至少一个诱导型启动子是丙酸盐诱导启动子和至少一个另外的诱导型启动子是L-阿拉伯糖诱导启动子；
且其中所述表达构建体包含选自以下的核苷酸序列：
(a)与SEQ ID NO:15的核苷酸2818-3259具有至少80％同一性的核苷酸序列；
(b)与SEQ ID NO:15的核苷酸4937-5304具有至少80％同一性的核苷酸序列；和
(c)包含(a)和(b)两者的核苷酸序列。
3.权利要求1-2任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体包含至少一个选自以下的核苷酸序列：
(a)与SEQ ID NO:15的核苷酸2818-3259的至少425个连续碱基具有至少87％同一性的核苷酸序列；
(b)与SEQ ID NO:15的核苷酸2818-3259的至少400个连续碱基具有至少90％同一性的核苷酸序列；
(c)与SEQ ID NO:15的核苷酸2818-3259的至少350个连续碱基具有至少95％同一性的核苷酸序列；
(d)与SEQ ID NO:15的核苷酸4937-5304的至少350个连续碱基具有至少80％同一性的核苷酸序列；和
(e)与SEQ ID NO:15的核苷酸4937-5304的至少300个连续碱基具有至少90％同一性的核苷酸序列。
4.权利要求3所述的表达构建体，其中所述表达构建体包含至少一个选自以下的核苷酸序列：
(a)与SEQ ID NO:15的核苷酸2818-3259具有至少87％同一性的核苷酸序列；
(b)与SEQ ID NO:15的核苷酸2818-3259具有至少90％同一性的核苷酸序列；
(c)与SEQ ID NO:15的核苷酸2818-3259具有至少95％同一性的核苷酸序列；
(d)与SEQ ID NO:15的核苷酸4937-5304具有至少80％同一性的核苷酸序列；
(e)与SEQ ID NO:15的核苷酸4937-5304具有至少90％同一性的核苷酸序列；和
(f)与SEQ ID NO:15的核苷酸4937-5304具有至少95％同一性的核苷酸序列。
5.权利要求1-4任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体包含选自SEQ ID NO:15的核苷酸3140-3151和SEQ ID NO:15的核苷酸5172-5185的至少一个核苷酸序列。
6.权利要求1-5任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体包含选自SEQ ID NO:15的核苷酸2818-3259和SEQ ID NO:15的核苷酸4937-5304的至少一个核苷酸序列。
7.权利要求6所述的表达构建体，其中所述表达构建体包含SEQ ID NO:15的核苷酸2818-3259和SEQ ID NO:15的核苷酸4937-5304。
8.一种包含两个或更多个诱导型启动子的表达构建体，
其中至少一个诱导型启动子是丙酸盐诱导启动子和至少一个另外的诱导型启动子是L-阿拉伯糖诱导启动子；
且其中所述表达构建体包含选自以下的核苷酸序列：
(a)与SEQ ID NO:15的核苷酸1833-5304的至少3000个连续碱基具有至少90％同一性的核苷酸序列；
(b)与SEQ ID NO:15的核苷酸1833-5304的至少3250个连续碱基具有至少90％同一性的核苷酸序列；
(c)与SEQ ID NO:15的核苷酸1833-5304的至少3250个连续碱基具有至少95％同一性的核苷酸序列；和
(d)与SEQ ID NO:15的核苷酸1833-5304的至少3250个连续碱基具有至少80％同一性的核苷酸序列。
9.一种包含两个或更多个诱导型启动子的表达构建体，
其中至少一个诱导型启动子是丙酸盐诱导启动子和至少一个另外的诱导型启动子是L-阿拉伯糖诱导启动子；
且其中所述表达构建体包含选自以下的核苷酸序列：
(a)与SEQ ID NO:15的核苷酸1833-5304具有至少80％同一性的核苷酸序列；
(b)与SEQ ID NO:15的核苷酸1833-5304具有至少90％同一性的核苷酸序列；和
(c)与SEQ ID NO:15的核苷酸1833-5304具有至少95％同一性的核苷酸序列。
10.权利要求8-9任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体包含SEQ ID NO:15。
11.权利要求1-10任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体是染色体外的。
12.权利要求1-11任一项所述的表达构建体，还包含选自鼠李糖诱导启动子、木糖诱导启动子、乳糖诱导启动子和通过磷酸盐耗竭诱导的启动子的至少一个诱导型启动子。
13.权利要求12所述的表达构建体，其中至少一个诱导型启动子选自rhaSR启动子、xlyA启动子、lacZYA启动子和phoA启动子。
14.权利要求1-13任一项所述的表达构建体，进一步包含编码与诱导型启动子结合的转录调节子的至少一个多核苷酸序列。
15.权利要求14所述的表达构建体，其中所述转录调节子选自AraC、PrpR、RhaR和XylR。
16.权利要求1-15任一项所述的表达构建体，进一步包含编码从诱导型启动子转录的至少一个基因产物的至少一个多核苷酸序列。
17.包含权利要求1-16任一项所述的表达构建体的试剂盒。
18.包含权利要求1-16任一项所述的表达构建体的宿主细胞。
19.权利要求18所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
20.权利要求19所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
21.权利要求18-20任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞具有至少一个基因的基因功能的改变，所述至少一个基因编码用于至少一个诱导型启动子的诱导剂的转运蛋白。
22.权利要求21所述的宿主细胞，其中所述编码转运蛋白的基因选自araE、araF、araG、araH、rhaT、xylF、xylG和xylH。
23.权利要求22所述的宿主细胞，其中所述基因功能的改变是araE从组成型启动子的表达。
24.权利要求18-23任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞具有至少一个基因的降低的基因功能水平，所述至少一个基因编码代谢至少一个诱导型启动子的诱导剂的蛋白质。
25.权利要求24所述的宿主细胞，其中所述编码代谢至少一个所述诱导型启动子的诱导剂的蛋白质的基因选自araA、araB、prpB、prpD、rhaA、rhaB、rhaD、xylA和xylB。
26.权利要求18-25任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞具有至少一个基因的降低的基因功能水平，所述至少一个基因编码参与至少一个诱导型启动子的诱导剂的生物合成的蛋白质。
27.权利要求26的宿主细胞，其中所述编码参与至少一个诱导型启动子的诱导剂的生物合成的蛋白质的基因选自scpA/sbm、argK/ygfD、scpB/ygfG、scpC/ygfH、rmlA、rmlB、rmlC和rmlD。
28.权利要求18-27任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞具有硫氧还蛋白还原酶基因的降低的基因功能水平。
29.权利要求28所述的宿主细胞，其中所述硫氧还蛋白还原酶基因是trxB。
30.权利要求18-29任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞具有至少一个谷胱甘肽合成酶基因的降低的基因功能水平。
31.权利要求30所述的宿主细胞，其中所述谷胱甘肽合成酶基因选自gshA和gshB。
32.权利要求18-31任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞表达AhpC的至少一个突变体形式。
33.权利要求18-32任一项所述的宿主细胞，包含含有至少一个L-阿拉伯糖诱导启动子和编码AraC的多核苷酸序列的表达构建体，其中所述宿主细胞具有编码代谢至少一个所述L-阿拉伯糖诱导启动子的诱导剂的蛋白质的至少一个基因的降低的基因功能，其中所述基因选自araA和araB。
34.权利要求18-32任一项所述的宿主细胞，包含含有至少一个丙酸盐诱导启动子和编码PrpR的多核苷酸序列的表达构建体，其中所述宿主细胞具有编码代谢至少一个所述丙酸盐诱导启动子的诱导剂的蛋白质的至少一个基因的降低的基因功能，其中所述基因选自prpB和prpD。
35.权利要求18-34任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含以下的一种或多种：(a)araBAD基因的删除；(b)araE基因的改变的基因功能；(c)lacY(A177C)基因；(d)prpB基因的降低的基因功能；(e)sbm/scpA-ygfD/argK-ygfGH/scpBC基因的降低的基因功能；(f)gor和trxB基因的降低的基因功能；(g)编码AhpC的突变体形式的多核苷酸；(h)AscG基因的降低的基因功能；(i)编码缺乏信号肽的DsbC形式的多核苷酸；(j)编码Erv1p的多核苷酸；和(k)编码蛋白质二硫键异构酶的多核苷酸。
36.包含权利要求1-16任一项所述的表达构建体和宿主细胞的试剂盒。
37.权利要求36所述的试剂盒，其中所述宿主细胞是原核细胞。
38.权利要求37所述的试剂盒，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
39.权利要求36-38任一项所述的试剂盒，其中所述宿主细胞具有至少一个基因的基因功能的改变，所述至少一个基因编码用于至少一个诱导型启动子的诱导剂的转运蛋白。
40.权利要求39所述的试剂盒，其中所述编码转运蛋白的基因选自araE、araF、araG、araH、rhaT、xylF、xylG和xylH。
41.权利要求40所述的试剂盒，其中所述基因功能的改变是araE从组成型启动子的表达。
42.权利要求36-41任一项所述的试剂盒，其中所述宿主细胞具有至少一个基因的降低的基因功能水平，所述至少一个基因编码代谢至少一个诱导型启动子的诱导剂的蛋白质。
43.权利要求42所述的试剂盒，其中所述编码代谢至少一个所述诱导型启动子的诱导剂的蛋白质的基因选自araA、araB、prpB、prpD、rhaA、rhaB、rhaD、xylA和xylB。
44.权利要求36-43任一项所述的试剂盒，其中所述宿主细胞具有至少一个基因的降低的基因功能水平，所述至少一个基因编码参与至少一个诱导型启动子的诱导剂的生物合成的蛋白质。
45.权利要求44所述的试剂盒，其中所述编码参与至少一个诱导型启动子的诱导剂的生物合成的蛋白质的基因选自scpA/sbm、argK/ygfD、scpB/ygfG、scpC/ygfH、rmlA、rmlB、rmlC和rmlD。
46.权利要求36-45任一项所述的试剂盒，其中所述宿主细胞具有硫氧还蛋白还原酶基因的降低的基因功能水平。
47.权利要求46所述的试剂盒，其中所述硫氧还蛋白还原酶基因是trxB。
48.权利要求36-47任一项所述的试剂盒，其中所述宿主细胞具有谷胱甘肽合成酶基因的降低的基因功能水平。
49.权利要求48所述的试剂盒，其中所述谷胱甘肽合成酶基因选自gshA和gshB。
50.权利要求36-49任一项所述的试剂盒，其中所述宿主细胞表达AhpC的突变体形式。
51.权利要求36-50任一项所述的试剂盒，包含含有至少一个L-阿拉伯糖诱导启动子和编码AraC的多核苷酸序列的表达构建体，其中所述宿主细胞具有编码代谢至少一个所述L-阿拉伯糖诱导启动子的诱导剂的蛋白质的至少一个基因的降低的基因功能，其中所述基因选自araA和araB。
52.权利要求36-50任一项所述的试剂盒，包含含有至少一个丙酸盐诱导启动子和编码PrpR的多核苷酸序列的表达构建体，其中所述宿主细胞具有编码代谢至少一个所述丙酸盐诱导启动子的诱导剂的蛋白质的至少一个基因的降低的基因功能，其中所述基因选自prpB和prpD。
53.权利要求36-52任一项所述的试剂盒，其中所述宿主细胞包含以下的一种或多种：(a)araBAD基因的删除；(b)araE基因的改变的基因功能；(c)lacY(A177C)基因；(d)prpB基因的降低的基因功能；(e)sbm/scpA-ygfD/argK-ygfGH/scpBC基因的降低的基因功能；(f)gor和trxB基因的降低的基因功能；(g)编码AhpC的突变体形式的多核苷酸；(h)AscG基因的降低的基因功能；(i)编码缺乏信号肽的DsbC形式的多核苷酸；(j)编码Erv1p的多核苷酸；和(k)编码蛋白质二硫键异构酶的多核苷酸。
54.一种产生基因产物的方法，该方法包括使权利要求18-35任一项所述的宿主细胞的培养物生长，并添加各个所述诱导型启动子的诱导剂到所述培养物中，其中所述宿主细胞包含至少一个表达构建体，该表达构建体包含编码从各诱导型启动子转录的至少一种基因产物的至少一个多核苷酸序列。
55.权利要求55所述的方法，其中所述方法还包括从所述培养物纯化至少一种基因产物。
56.权利要求55-56任一项所述的方法，其中所述基因产物是多聚产物的部分。
57.权利要求55-57任一项所述的方法，其中所述至少一种基因产物选自：(a)免疫球蛋白重链；(b)免疫球蛋白轻链；和(c)(a)-(b)中任一的片段。
58.权利要求58所述的方法，其中所述多聚产物是抗体。
59.权利要求55-56任一项所述的方法，其中所述基因产物是前胰岛素原。
60.权利要求60所述的方法，其中所述前胰岛素原从L-阿拉伯糖诱导启动子表达。
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