CN111269294B - 纤维寡糖转运蛋白LacY的突变位点、突变转运蛋白LacY及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，具体涉及纤维寡糖转运蛋白LacY的突变位点、突变转运蛋白LacY及其制备方法和应用。本发明的高效转运纤维寡糖的突变转运蛋白的制备方法，包括：(1)定向进化LacY对纤维寡糖的底物特异性；(2)分析步骤(1)进化样品的氨基酸序列，获取突变位点；(3)构建突变转运蛋白LacY的表达载体，并进行表达获得突变转运蛋白LacY。本发明还提供用上述方法得到的纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖的突变转运蛋白LacY的表达载体，含所述表达载体的微生物，以及他们在纤维质利用领域的应用方法。本发明方法制得的突变转运蛋白LacY能够高效转运纤维寡糖，提高纤维质的利用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及纤维寡糖转运蛋白LacY的突变位点、突变转运蛋白LacY及其制备方法和应用。
背景技术
纤维质是世界上蕴藏量最丰富的天然高分子化合物，绝大多数由绿色植物通过光合作用合成。当前利用纤维质生产工业副产品，如酒精等，首先需将纤维质进行理化处理或者用纤维素酶等预处理将纤维质降解成葡萄糖，再供微生物利用生产工业副产品。事实上经过预处理的纤维质降解产物中还含有大量的纤维二糖、纤维三糖等纤维寡糖，但是微生物中由于缺乏特异性的纤维寡糖转运蛋白，微生物无法高效利用纤维寡糖，导致资源浪费，纤维质利用率低。
LacY是乳糖或半乳糖转运蛋白，其对纤维寡糖的转运效率非常低，且当前在细菌中并未发现其他特异性转运纤维寡糖的转运蛋白，因此在纤维质利用领域，尤其是利用细菌发酵纤维质获取工业副产品方面受到制约。
发明内容
鉴于此，有必要针对上述问题提供纤维寡糖转运蛋白LacY的突变型、突变转运蛋白LacY及其制备方法和应用。本发明利用定向进化方式进化LacY的底物特异性，从而提供一种能高效转运纤维寡糖进胞内供细菌利用的转运蛋白，使其能够高效转运纤维寡糖，进化后的LacY能提高纤维质的利用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
纤维二糖转运蛋白LacY的突变位点，包括A177T、A177V、R142C、L62M中任意一个突变位点或至少任意X个突变位点的组合而成；X大于等于2且小于等于4。
一种高效转运纤维二糖的突变转运蛋白LacY的表达载体，包括所述的纤维二糖转运蛋白LacY的突变位点或突变位点组合。
进一步的，所述转运纤维二糖的突变转运蛋白LacY的表达载体中LacY的启动子为J23109，cepA(纤维二糖磷酸化酶)的启动子为J23102。野生型LacY表达载体序列见SEQ IDNO：2，其中LacY序列为野生型的LacY序列，图谱见图1，针对不同突变型的载体序列替换相应位点为突变后序列即可。
纤维三糖转运蛋白LacY的突变位点，包括A177V、F140Y、R142C、I79T、V316I、V326I、V416I中任意一个突变位点或至少任意Y个突变位点的组合而成；Y大于等于2且小于等于7。
一种高效转运纤维三糖的突变转运蛋白LacY的表达载体，包括所述的纤维三糖转运蛋白LacY的突变位点或突变位点组合。
纤维四糖转运蛋白LacY的突变位点，包括A177T、A177V、R142C、G150S、V326I、A51V、G96E、A203D、M83V、I92V中任意一个突变位点或至少任意Z个突变位点的组合而成；Z大于等于2且小于等于10。
一种高效转运纤维四糖的突变转运蛋白LacY的表达载体，包括所述纤维四糖转运蛋白LacY的突变位点或突变位点组合。
进一步的，所述转运纤维三糖或转运纤维四糖的突变转运蛋白LacY的表达载体中包括LacY的启动子J23109、cepA(纤维二糖磷酸化酶)的启动子J23102、纤维寡糖磷酸化酶cepB。野生型LacY表达载体为J23102-cepA-J23102-cepB-J23109-LacY,图谱见图4，序列见SEQ ID NO：3，其中LacY序列为野生型的LacY序列，针对不同突变型的载体序列替换相应位点为突变后序列即可。
相较于野生型LacY的氨基酸序列(见SEQ ID NO：1)和核酸序列(见SEQ ID NO：4)，本发明的各氨基酸突变位点及对应的核酸序列突变如下表所示：
表1
一种高效转运纤维寡糖的突变转运蛋白LacY的制备方法，包括：
(1)定向进化LacY对纤维寡糖的底物特异性；
(2)分析步骤(1)进化样品的氨基酸序列，获取突变位点；
(3)构建突变转运蛋白LacY的表达载体，并进行表达获得突变转运蛋白。
进一步的，所述高效转运纤维寡糖的突变转运蛋白LacY的制备方法，还包括：(4)以纤维寡糖做碳源进行代谢实验，鉴定突变后的LacY代谢纤维寡糖的能力。
进一步的，步骤(1)采用噬菌体辅助持续定向进化系统进行定向进化。
进一步的，步骤(1)的纤维寡糖包括纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖等。
进一步的，所述步骤(3)中表达突变转运蛋白LacY的表达载体的微生物为LacY缺陷型的大肠杆菌。
一种包含所述突变转运蛋白LacY的表达载体的宿主微生物。
所述纤维寡糖转运蛋白LacY突变位点、包含所述转运蛋白LacY突变位点的表达载体或包含所述表达载体的微生物在纤维质利用、生物发酵等领域的应用。
本发明有益效果：
现有技术并没有系统去研究LacY对不同纤维寡糖的转运效率，本发明以纤维寡糖作为效应物直接定向进化LacY并获得不同的LacY突变体，对不同的LacY突变体做纤维寡糖代谢实验，证实突变后的LacY确实比野生型的LacY具有更高利用纤维寡糖的能力。
LacY的A177V突变体能够提高蔗糖转运效率，纤维二糖、麦芽糖抑制LacY A177V突变体转运β-ONPG的能力比野生型的LacY高，侧面反映LacY的A177V突变体提高了对纤维二糖或麦芽糖的亲和力。本发明直接利用纤维二糖、三糖、四糖等纤维寡糖作为LacY的效应物去定向进化，所得突变体可以明显提高纤维素的利用率。
本发明所有突变位点具有针对性，是针对能够提高纤维寡糖转运效率的突变库，能提高纤维质的利用效率。
附图说明
图1为纤维二糖的LacY突变体表达载体图谱。
图2为不同LacY突变体工程菌株代谢纤维二糖的生长曲线。
图3为不同LacY突变体的工程菌株消耗纤维二糖的耗糖曲线。
图4为纤维三糖和纤维四糖LacY突变体表达载体图谱。
图5为不同LacY突变体工程菌株代谢纤维三糖的生长曲线。
图6为不同LacY突变体工程菌株代谢纤维三糖的耗糖曲线。
图7为不同LacY突变体工程菌株代谢纤维四糖的生长曲线。
图8为不同LacY突变体工程菌株代谢纤维四糖的耗糖曲线。
图9为辅助质粒AP1的基因图谱。
图10为辅助质粒AP2的基因图谱。
图11为质粒MP的基因图谱。
具体实施方式
为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。
本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。
实施例1针对不同纤维寡糖定向进化获得的LacY突变位点
1.进化宿主的构建：
1)gIII蛋白表达质粒AP1的构建：gIII蛋白由启动子J23109启动，启动子下游插入CelR蛋白的识别位点核酸序列。AP1图谱见图9，AP1(SEQ ID NO:5)。
2)功能蛋白CelR蛋白的表达质粒AP2构建：CelR由组成型启动子表达，图谱见图10，AP2(SEQ ID NO:6)。
3)诱变质粒MP由David R Liu实验室赠送，图谱见图11，MP可以再DNA复制过程中提供更高的突变率，MP(SEQ ID NO:7)。
4)AP1、AP2及MP共转化S1030感受态细胞，获得宿主S1030-AP1/AP2/MP。
2.PACE进化LacY的底物特异性
1)宿主S1030-AP1/AP2/MP培养至对数期(0D600＝0.4)。
2)第一轮进化，200uL进化体系中，初始纤维二糖终浓度29mM，初始野生型SP-lacY噬菌体1.2×105pfu/mL，阿拉伯糖终浓度始终为1％，补加宿主S1030-AP1/AP2/MP至200uL，37℃，培养进化1h。取样，梯度稀释，稀释后的噬菌体10μL与190μL对数期宿主S1030-AP1/AP2/MP混合，37℃放置15min，与50℃含有0.5％纤维二糖的0.5％的软琼脂1mL混匀，均匀铺在直径60cm固体琼脂板上，静置10min，凝固后置于37℃过夜培养，计算噬菌斑的数量，确定体系中噬菌体的浓度。取单个噬菌斑，扩增噬菌体上LacY基因片段，送往华大测序，查看突变情况。
3)第二轮进化，取第一轮进化体系离心后的上清20μL作为待进化的噬菌体SP-lacY(此时的噬菌体为野生型SP-lacY及其各种突变体的混合噬菌体)，纤维二糖终浓度为14.5mM，阿拉伯糖终浓度始终为1％，补加新鲜宿主S1030-AP1/AP2/MP至200uL，37℃，培养进化1h。取样计算体系中噬菌体浓度并检测突变情况。
4)以此类推，第三轮取第二轮上清100μL继续进化，并降低纤维二糖浓度，第四轮直至最后一轮(纤维二糖做53轮，纤维三糖做50轮进化，纤维四糖做200轮进化)同理。
纤维三糖和纤维四糖的进化同理，只需将上述方法中纤维二糖换成对应的纤维寡糖即可。
通过上述定向进化得出：针对LacY对纤维二糖定向进化累积的突变位点为A177T、A177V、R142C、L62M；针对LacY对纤维三糖定向进化累积的突变位点为A177V、F140Y、R142C、I79T、V316I、V326I、V416I；针对LacY对纤维四糖定向进化累积的突变位点为A177T、A177V、R142C、G150S、V326I、A51V、G96E、A203D、M83V、I92V。
通过上述的PACE进化系统,在进化过程中不断下调纤维寡糖的浓度,这样筛选压力会不断变大,导致LacY必须产生正面突变是LacY能够转运更多的纤维寡糖进胞内,才能使噬菌体保留下来(噬菌体上携带突变后的LacY位点),否则不突变或者不好的突变由于纤维寡糖浓度不断下降,携带这种不突变或者不好突变LacY的噬菌体就会被自动淘汰,因为缺纤维寡糖,来不及产生子代就被稀释掉了，随着时间的推移,每隔一段时间取样测序,我们就会发现突变位点从无到有,从一个突变位点到多个,从占比10％到最终100％,是个自动的过程。
实施例2工程菌株的构建
将实施例1中针对纤维二糖获得的不同的突变位点组合构建不同的LacY突变体表达载体(图1，序列见SEQ ID NO：2)，LacY的启动子为J23109，cepA的启动子为J23102，cepA是纤维二糖磷酸化酶，可以直接将LacY转运进胞内的纤维二糖降解为葡萄糖和1磷酸葡萄糖供细菌代谢利用。
将实施例1中针对纤维三糖或纤维四糖获得的不同突变位点组合构建不同的LacY突变体表达载体(图4，序列见SEQ ID NO：3)，cepA的启动子为J23102、cepB的启动子为J23102，LacY的启动子为J23109,cepB可以将纤维三糖和纤维四糖降解为纤维二糖和1磷酸葡糖糖，然后cepA将纤维二糖降解为葡萄糖和1磷酸葡萄糖供细菌代谢利用。
载体的构建是分子生物学基本技能，本领域技术人员根据习惯或手册即可完成。所用表达宿主为LacY基因缺陷型大肠杆菌S1030(David R Liu实验室提供，遗传信息参见《Nat Chem Biol.2014March；10(3):216–222》)，宿主也可以由其他商业化的LacY基因缺陷型的大肠杆菌代替。表达载体电转或化转S1030感受态细胞，通过壮观霉素筛选阳性克隆，测序验证正确获得不同LacY突变体的工程菌株；大肠杆菌的感受态制备及转化方法是本领域的基本技能，本领域技术人员按常规操作或相关实验手册操作即可。
实施例3LacY突变体工程菌株代谢实验
按实施例2中构建方法，构建得到工程菌株S1030(对照)、S1030-LacY、S1030-cepA-LacYW(野生型)、S1030-cepA-LacYA177T、S1030-cepA-LacYA177V、S1030-cepA-LacYA177V/R142C、S1030-cepA-LacYA177V/L62M、S1030-cepA-LacYA177V/R142C/L62M在M9培养基中培养并以纤维二糖为唯一碳源；测定不同工程菌株生长曲线和纤维二糖的消耗曲线，以此判断不同LacY突变体转运纤维二糖的效率。
从结果可以得出生长速度和耗糖速率(参见图2、图3)都是A177V/L62M>A177V>A177V/R142C/L62M>A177V/R142C>A177T>LacYW，因此转运纤维二糖的效率排序为：A177V/L62M>A177V>A177V/R142C/L62M>A177V/R142C>A177T>LacYW。
按实施例2中构建方法，构建得到工程菌株S1030(对照)、S1030-cepA-cepB-LacYW(野生型)、S1030-cepA-cepB-LacYA177V、S1030-cepA-cepB-LacYA177V/F140Y、S1030-cepA-cepB-LacYA177V/F140Y/R142C在M9培养基中培养并以纤维三糖为唯一碳源；测定不同工程菌株生长曲线和纤维三糖的消耗曲线(图5、图6)，以此判断不同LacY突变体转运纤维三糖的效率。
按实施例2中构建方法，构建得到工程菌株S1030(对照)、S1030-cepA-cepB-LacYW(野生型)、S1030-cepA-cepB-LacYA177V、S1030-cepA-cepB-LacYA177T/R142C、S1030-cepA-cepB-LacYA177V/G150S、S1030-cepA-cepB-LacYA177V/V326I在M9培养基中培养并以纤维四糖为唯一碳源；测定不同工程菌株生长曲线和纤维四糖的消耗曲线(图7、图8)，以此判断不同LacY突变体转运纤维四糖的效率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州中国科学先进技术研究所
<120> 纤维寡糖转运蛋白LacY的突变位点、突变转运蛋白LacY及其制备方法和应用
<130> P201900062
<141> 2019-01-25
<150> 2018114829827
<151> 2018-12-05
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Tyr Tyr Leu Lys Asn Thr Asn Phe Trp Met Phe Gly Leu Phe Phe
1 5 10 15
Phe Phe Tyr Phe Phe Ile Met Gly Ala Tyr Phe Pro Phe Phe Pro Ile
20 25 30
Trp Leu His Asp Ile Asn His Ile Ser Lys Ser Asp Thr Gly Ile Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ile Ser Leu Phe Ser Leu Leu Phe Gln Pro Leu Phe Gly
50 55 60
Leu Leu Ser Asp Lys Leu Gly Leu Arg Lys Tyr Leu Leu Trp Ile Ile
65 70 75 80
Thr Gly Met Leu Val Met Phe Ala Pro Phe Phe Ile Phe Ile Phe Gly
85 90 95
Pro Leu Leu Gln Tyr Asn Ile Leu Val Gly Ser Ile Val Gly Gly Ile
100 105 110
Tyr Leu Gly Phe Cys Phe Asn Ala Gly Ala Pro Ala Val Glu Ala Phe
115 120 125
Ile Glu Lys Val Ser Arg Arg Ser Asn Phe Glu Phe Gly Arg Ala Arg
130 135 140
Met Phe Gly Cys Val Gly Trp Ala Leu Cys Ala Ser Ile Val Gly Ile
145 150 155 160
Met Phe Thr Ile Asn Asn Gln Phe Val Phe Trp Leu Gly Ser Gly Cys
165 170 175
Ala Leu Ile Leu Ala Val Leu Leu Phe Phe Ala Lys Thr Asp Ala Pro
180 185 190
Ser Ser Ala Thr Val Ala Asn Ala Val Gly Ala Asn His Ser Ala Phe
195 200 205
Ser Leu Lys Leu Ala Leu Glu Leu Phe Arg Gln Pro Lys Leu Trp Phe
210 215 220
Leu Ser Leu Tyr Val Ile Gly Val Ser Cys Thr Tyr Asp Val Phe Asp
225 230 235 240
Gln Gln Phe Ala Asn Phe Phe Thr Ser Phe Phe Ala Thr Gly Glu Gln
245 250 255
Gly Thr Arg Val Phe Gly Tyr Val Thr Thr Met Gly Glu Leu Leu Asn
260 265 270
Ala Ser Ile Met Phe Phe Ala Pro Leu Ile Ile Asn Arg Ile Gly Gly
275 280 285
Lys Asn Ala Leu Leu Leu Ala Gly Thr Ile Met Ser Val Arg Ile Ile
290 295 300
Gly Ser Ser Phe Ala Thr Ser Ala Leu Glu Val Val Ile Leu Lys Thr
305 310 315 320
Leu His Met Phe Glu Val Pro Phe Leu Leu Val Gly Cys Phe Lys Tyr
325 330 335
Ile Thr Ser Gln Phe Glu Val Arg Phe Ser Ala Thr Ile Tyr Leu Val
340 345 350
Cys Phe Cys Phe Phe Lys Gln Leu Ala Met Ile Phe Met Ser Val Leu
355 360 365
Ala Gly Asn Met Tyr Glu Ser Ile Gly Phe Gln Gly Ala Tyr Leu Val
370 375 380
Leu Gly Leu Val Ala Leu Gly Phe Thr Leu Ile Ser Val Phe Thr Leu
385 390 395 400
Ser Gly Pro Gly Pro Leu Ser Leu Leu Arg Arg Gln Val Asn Glu Val
405 410 415
Ala
<210> 2
<211> 6114
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtcaaagtg gccgaacttc ataagctttt tctcctcttt ctctaactag tgctagcaca 60
gtacctagga ctgagctagc tgtcaaggta cctttacagc tagctcagtc ctagggactg 120
tgctagcgaa ttctagagaa agaggagaaa ctcgagatgt actatttaaa aaacacaaac 180
ttttggatgt tcggtttatt ctttttcttt tactttttta tcatgggagc ctacttcccg 240
tttttcccga tttggctaca tgacatcaac catatcagca aaagtgatac gggtattatt 300
tttgccgcta tttctctgtt ctcgctatta ttccaaccgc tgtttggtct gctttctgac 360
aaactcgggc tgcgcaaata cctgctgtgg attattaccg gcatgttagt gatgtttgcg 420
ccgttcttta tttttatctt cgggccactg ttacaataca acattttagt aggatcgatt 480
gttggtggta tttatctagg cttttgtttt aacgccggtg cgccagcagt agaggcattt 540
attgagaaag tcagccgtcg cagtaatttc gaatttggtc gcgcgcggat gtttggctgt 600
gttggctggg cgctgtgtgc ctcgattgtc ggcatcatgt tcaccatcaa taatcagttt 660
gttttctggc tgggctctgg ctgtgcactc atcctcgccg ttttactctt tttcgccaaa 720
acggatgcgc cctcttctgc cacggttgcc aatgcggtag gtgccaacca ttcggcattt 780
agccttaagc tggcactgga actgttcaga cagccaaaac tgtggttttt gtcactgtat 840
gttattggcg tttcctgcac ctacgatgtt tttgaccaac agtttgctaa tttctttact 900
tcgttctttg ctaccggtga acagggtacg cgggtatttg gctacgtaac gacaatgggc 960
gaattactta acgcctcgat tatgttcttt gcgccactga tcattaatcg catcggtggg 1020
aaaaacgccc tgctgctggc tggcactatt atgtctgtac gtattattgg ctcatcgttc 1080
gccacctcag cgctggaagt ggttattctg aaaacgctgc atatgtttga agtaccgttc 1140
ctgctggtgg gctgctttaa atatattacc agccagtttg aagtgcgttt ttcagcgacg 1200
atttatctgg tctgtttctg cttctttaag caactggcga tgatttttat gtctgtactg 1260
gcgggcaata tgtatgaaag catcggtttc cagggcgctt atctggtgct gggtctggtg 1320
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ctgcgtcgtc aggtgaatga agtcgcttaa ctgcaggtcc ctaagtctcc tcagcaaaac 1440
gaaaggccca gtctttcgac tgagcctttc gttttatttg accggatgtc ctcttgttca 1500
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gcggatgaac aggcagacat ctgtgaatcg cttcacgacc acgctgatga gctttaccgc 1740
agctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag 1800
acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca 1860
gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg 1920
tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt 1980
gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct 2040
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 2100
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 2160
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 2220
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 2280
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 2340
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 2400
ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 2460
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 2520
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gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 2640
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tggtgacgaa actcagtgtt acggtacatg ggttcctatt gggcttgcta tccctgaaaa 420
tgagggtggt ggctctgagg gtggcggttc tgagggtggc ggttctgagg gtggcggtac 480
taaacctcct gagtacggtg atacacctat tccgggctat acttatatca accctctcga 540
cggcacttat ccgcctggta ctgagcaaaa ccccgctaat cctaatcctt ctcttgagga 600
gtctcagcct cttaatactt tcatgtttca gaataatagg ttccgaaata ggcagggggc 660
attaactgtt tatacgggca ctgttactca aggcactgac cccgttaaaa cttattacca 720
gtacactcct gtatcatcaa aagccatgta tgacgcttac tggaacggta aattcagaga 780
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<210> 6
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<400> 6
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tttggtac 3428
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<211> 6537
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cactcggtcg ctacgctccg ggcgtgagac tgcggcgggc gctgcggaca catacaaagt 60
tacccacaga ttccgtggat aagcagggga ctaacatgtg aggcaaaaca gcagggccgc 120
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taagcagttc cccaactgac ttaaccttcg atcaaaccac ctccccaggt ggttttttcg 720
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tctactgaac cgctctagat ttcagtgcaa tttatctctt caaatgtagc acctgaagtc 840
agcccaggag gaagaggaca tccggtcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg 900
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cgaagcgaag ccggtcaaaa cgattaaaga caaggttcgc gcaatgcgtg aacttctgct 4020
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Claims (6)
1.一种高效转运纤维二糖的LacY突变体，其特征在于，所述LacY突变体为对野生型LacY进行以下位点突变：A177V/R142C、A177V/L62M或A177V/R142C/L62M，所述野生型LacY的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种高效转运纤维三糖的LacY突变体，其特征在于，所述LacY突变体为对野生型LacY进行以下位点突变：A177V/F140Y或A177V/F140Y/R142C，所述野生型LacY的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.一种高效转运纤维四糖的LacY突变体，其特征在于，所述LacY突变体为对野生型LacY进行以下位点突变：A177T/R142C、A177V/G150S或A177V/V326I，所述野生型LacY的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.权利要求1所述的高效转运纤维二糖的LacY突变体在转运纤维二糖上应用。
5.权利要求2所述的高效转运纤维三糖的LacY突变体在转运纤维三糖上应用。
6.权利要求3所述的高效转运纤维四糖的LacY突变体在转运纤维四糖上应用。
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| Steven C.King等.Characterization of Escherichia coli lactose carrier mutants that transport protons without a cosubstrate. Probes for the energy barrier to uncoupled transport.《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》.1990,第265卷(第17期),第9650页右栏第1段. * |
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