KR102320656B1 - 아세틴 화합물의 생물학적 제조 방법 - Google Patents

아세틴 화합물의 생물학적 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 O-아세틸 전이효소를 이용해서 글리세롤에 아세틸기를 전이시켜서 모노아세틴, 다이아세틴, 트리아세틴을 생물학적으로 제조하는 방법에 관한 것으로서, 지속가능하고 환경오염을 유발하지 않으며 안전하고 더 좋은 품질의 아세틴을 얻을 수 있는 제조 방법 및 제조용 조성물에 관한 것이다.

Description

아세틴 화합물의 생물학적 제조 방법{A BIOLOGICAL METHOD FOR PREPARING ACETINS}
본 발명은 아세틴 화합물의 제조 방법 및 아세틴 제조용 조성물에 관한 것이다.
아세틴(acetins)은 글리세롤(glycerol)의 수산기(-OH)에 초산기(acetyl group)가 에스터(ester) 결합을 하고 있는 물질로, 결합된 초산기의 수에 따라서 1 개가 붙은 모노아세틴(monoacetin), 2 개가 붙은 다이아세틴(diacetin), 3 개가 붙은 트리아세틴(triacetin)으로 구분한다. 트리아세틴은 글리세린 트리아세테이트(glycerin triacetate) 또는 트리글리세라이드 1,2,3-트라아세톡시프로페인(triglyceride 1,2,3-triacetoxypropane)으로도 알려져 있다.
아세틴은 향료 용매와 습윤제 등의 식품첨가물로 사용되고, 제약산업에서 보습제, 가소제 및 용제로 사용된다. 트리아세틴은 또한 가솔린의 엔진 노킹(engine knocking)을 줄이는 항노크제(antiknock agent)와 바이오디젤의 저온 및 점도 특성을 개선 할 수 있는 연료 첨가제로 사용될 수 있다. 바이오디젤 생산공정에서 다량의 부산물로 발생하는 폐글리세롤을 이용해서 바이오디젤의 연료첨가제로 활용될 수 있는 아세틴을 만드는 것은 최근 바이오리파이너리 산업분야에서 화두가 되고 있는 폐기물 또는 부산물의 발생을 줄이거나 재활용을 하는 제로-웨이스트(Zero-Wastes)의 개념을 실현할 수 있는 기술을 제공하는 것이다. 5 대 담배 회사가 발표 한 1994년 보고서에서 따르면 트리아세틴은 담배 제조 첨가물의 하나로 담배필터 제조 공정의 가소제로도 사용된다. 또한 긴 우주비행 임무를 수행하는 우주비행사들의 인공 우주식품에서 비행사들에게 필요한 에너지의 절반 이상을 공급하는 중요한 재료로 활용되고 있다. 미국 식품의약국(FDA)은 매우 안전한 식품첨가물(Generally Recognized as Safe: GRAS)로 인정하고 있다.
한편, 아세틴 물질은 점성을 갖는 무색, 무취의 액체이다. 기존의 아세틴 물질은 글리세롤에 초산 또는 무수초산을 화학반응을 통해 결합시킨 인공 화학 합성 물질이다.
기존에 생물학적으로 아세틴을 제조하는 방식이 없었으나, 생물학적인 방법을 통해서 아세틴 물질을 생산함으로써 지속가능하고 환경오염을 유발하지 않으며 안전하고 더 좋은 품질의 아세틴 물질의 생산 방법에 대한 요구가 꾸준히 있었다.
본 발명자들은 아세틴 화합물들은 글리세롤 또는 글리세롤의 유도체들에 초산기를 에스테르화 반응을 통해서 결합시키는 효소들에 의해서 생물학적인 방식으로 제조될 수 있다는 것을 밝혀냈고, 자연계에 글리세롤을 탄소원으로 이용하는 장내세균(엔테로박테리아속, Enterobacteriaceae)의 일부에서 미량의 모노아세틴이 생성되는 것 또한 밝혀내었다.
이에 따라 본 발명자들은 글리세롤 또는 포도당을 출발기질로 해서 모노아세틴, 다이아세틴, 트리아세틴을 생산할 수 있는 재조합 미생물을 만들어서, 본 발명을 완성하기에 이르렀다(도 1, 도 2).
한국등록특허 제0275593호
본 발명은 아세틴 화합물의 생물학적 제조 방법 및 아세틴 화합물의 제조용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 제1 O-아세틸 전이효소(O-acetyl transferase) 존재 하에 아세틸-CoA와 글리세롤을 반응시켜 모노아세틴 또는 다이아세틴을 얻는 단계;를 포함하는 아세틴의 제조 방법.
2. 위 1에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 말토오스 O-아세틸 전이효소인, 아세틴의 제조 방법.
3. 위 1에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 70에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파르트산(ASP)이고, 위치 84에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴(ASN)이고, 위치 114에 상응하는 위치의 아미노산이 히스티딘(HIS)이고, 위치 126에 상응하는 위치의 아미노산이 글루탐산(GLU)인, 아세틴의 제조 방법.
4. 위 3에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 15에 상응하는 위치의 아미노산이 티로신(TYR) 또는 페닐알라닌(PHE)이고, 위치 26에 상응하는 위치의 아미노산이 아르기닌(ARG) 또는 글루타민(GLN)이고, 위치 30에 상응하는 위치의 아미노산이 아르기닌(ARG) 또는 리신(LYS)이고, 위치 71에 상응하는 위치의 아미노산이 티로신(TYR)이고, 위치 82에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 티로신(TYR)인 아세틴의 제조 방법.
5. 위 1에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 서열로 이루어진 것인, 아세틴의 제조 방법.
6. 위 1에 있어서, 제2 O-아세틸 전이효소 존재 하에 상기 반응 생성물인 다이아세틴을 아세틸-CoA와 반응시켜 트리아세틴을 얻는 단계;를 더 포함하는, 아세틴의 제조 방법.
7. 위 6에 있어서, 상기 제2 O-아세틸 전이효소는 서열번호 7의 아미노산 서열의 위치 31에 상응하는 위치의 아미노산이 시스테인(CYS) 또는 류신(LEU)이고, 위치 102에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 이소류신(ILE)이고, 위치 143에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 타이로신(TYR)이고, 위치 166에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 타이로신(TYR)이고, 위치 170에 상응하는 위치의 아미노산이 발린(VAL), 이소류신(ILE), 또는 류신(LEU)이고, 위치 193에 상응하는 위치의 아미노산이 히스티딘(HIS)인 아세틴의 제조 방법.
8. 위 6에 있어서, 상기 제2 O-아세틸 전이효소는 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나의 서열로 이루어진 것인, 아세틴의 제조 방법.
9. 제1 O-아세틸 전이효소(O-acetyl transferase)를 코딩하는 유전자를 발현하는 미생물을 글리세롤을 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계;를 포함하는 아세틴의 제조 방법.
10. 위 9에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 말토오스 O-아세틸 전이효소인, 아세틴의 제조 방법.
11. 위 9에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 70에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파르트산(ASP)이고, 위치 84에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴(ASN)이고, 위치 114에 상응하는 위치의 아미노산이 히스티딘(HIS)이고, 위치 126에 상응하는 위치의 아미노산이 글루탐산(GLU)인, 아세틴의 제조 방법.
12. 위 9에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 15에 상응하는 위치의 아미노산이 티로신(TYR) 또는 페닐알라닌(PHE)이고, 위치 26에 상응하는 위치의 아미노산이 아르기닌(ARG) 또는 글루타민(GLN)이고, 위치 30에 상응하는 위치의 아미노산이 아르기닌(ARG) 또는 리신(LYS)이고, 위치 71에 상응하는 위치의 아미노산이 티로신(TYR)이고, 위치 82에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 티로신(TYR)인, 아세틴의 제조 방법.
13. 위 9에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 16 내지 21의 서열 중 어느 하나의 서열로 이루어진 것인, 아세틴의 제조 방법.
14. 위 9에 있어서, 상기 미생물은 다이아세틴에 아세틸기를 전이하는 제2 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자를 더 발현하는 것인, 아세틴의 제조 방법.
15. 위 14에 있어서, 상기 제2 O-아세틸 전이효소는 서열번호 7의 아미노산 서열의 위치 31에 상응하는 위치의 아미노산이 시스테인(CYS) 또는 류신(LEU)이고, 위치 102에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 이소류신(ILE)이고, 위치 143에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 타이로신(TYR)이고, 위치 166에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 타이로신(TYR)이고, 위치 170에 상응하는 위치의 아미노산이 발린(VAL), 이소류신(ILE), 또는 류신(LEU)이고, 위치 193에 상응하는 위치의 아미노산이 히스티딘(HIS)인, 아세틴의 제조 방법.
16. 위 14에 있어서, 상기 제2 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 24 내지 27 중 어느 하나의 서열로 이루어진 것인, 아세틴의 제조 방법.
17. 위 9에 있어서, 상기 미생물은 아세틸에스테라제(acetylesterase)를 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실된 것인, 아세틴의 제조 방법.
18. 위 9에 있어서, 상기 미생물은 글리세롤 3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase) 및 글리세롤 3-탈인산효소(DL-glycerol-3-phosphatase)를 코딩하는 유전자를 더 발현하고, 상기 배지는 포도당을 포함하는 것인, 아세틴의 제조 방법.
19. 제1 O-아세틸 전이효소(O-acetyl transferase)를 코딩하는 유전자를 발현하는 미생물을 포함하는 아세틴 제조용 조성물.
20. 위 19에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 말토오스 O-아세틸 전이효소인, 아세틴 제조용 조성물.
21. 위 19에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 70에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파르트산(ASP)이고, 위치 84에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴(ASN)이고, 위치 114에 상응하는 위치의 아미노산이 히스티딘(HIS)이고, 위치 126에 상응하는 위치의 아미노산이 글루탐산(GLU)인, 아세틴 제조용 조성물.
22. 위 19에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 15에 상응하는 위치의 아미노산이 티로신(TYR) 또는 페닐알라닌(PHE)이고, 위치 26에 상응하는 위치의 아미노산이 아르기닌(ARG) 또는 글루타민(GLN)이고, 위치 30에 상응하는 위치의 아미노산이 아르기닌(ARG) 또는 리신(LYS)이고, 위치 71에 상응하는 위치의 아미노산이 티로신(TYR)이고, 위치 82에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 티로신(TYR)인, 아세틴 제조용 조성물.
23. 위 19에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 16 내지 21 중 어느 하나의 서열로 이루어진 것인, 아세틴 제조용 조성물.
24. 위 19에 있어서, 상기 미생물은 다이아세틴에 아세틸기를 전이하는 제2 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자를 더 발현하는 것인, 아세틴 제조용 조성물.
25. 위 24에 있어서, 상기 제2 O-아세틸 전이효소는 서열번호 7의 아미노산 서열의 위치 31에 상응하는 위치의 아미노산이 시스테인(CYS) 또는 류신(LEU)이고, 위치 102에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 이소류신(ILE)이고, 위치 143에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 타이로신(TYR)이고, 위치 166에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 타이로신(TYR)이고, 위치 170에 상응하는 위치의 아미노산이 발린(VAL), 이소류신(ILE), 또는 류신(LEU)이고, 위치 193에 상응하는 위치의 아미노산이 히스티딘(HIS)인, 아세틴 제조용 조성물.
26. 위 24에 있어서, 상기 제2 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 24 내지 27 중 어느 하나의 서열로 이루어진 것인, 아세틴 제조용 조성물.
27. 위 19에 있어서, 상기 미생물은 아세틸에스테라제(acetylesterase)를 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실된 것인, 아세틴 제조용 조성물.
28. 위 19에 있어서, 상기 미생물은 글리세롤 3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase) 및 글리세롤 3-탈인산효소(DL-glycerol-3-phosphatase)를 코딩하는 유전자를 더 발현하는 것인, 아세틴 제조용 조성물.
본 발명에 따르면 생물학적인 방법을 통해서 아세틴 물질을 제조함으로써 지속가능하고 환경오염을 유발하지 않으며 안전하고 더 좋은 품질의 아세틴 물질을 제조하는 방법을 제공한다.
도 1은 세포 내로 유입된 글리세롤이 모노아세틴, 다이아세틴, 트리아세틴으로 전환되는 경로를 나타낸 것이다.
도 2는 세포 내로 유입된 포도당이 모노아세틴, 다이아세틴, 트리아세틴으로 전환되는 경로를 나타낸 것이다.
도 3의 (A)는 모노아세틴과 다이아세틴을 생산하기 위해서 글리세롤에 아세틸기를 전이할 수 있는 대장균 내의 O-acetyltransferases 후보 유전자들을 선별하고 각 유전자들을 pTrc99A 발현벡터에 클로닝해서 만들어진 플라스미드 pMD1 - pMD8의 구조 도면 이고, (B)는 (A)의 플라스미드들로 형질전환 된 재조합 대장균 DH-MD1 - DH-MD8에서의 모노아세틴과 다이아세틴 생산성을 비교한 도면이며(DH-MD0는 공벡터인 pTrc99A로 형질전환 된 재조합 대장균을 나타냄.), (C)는 대장균 maltose O-acetyltransferase (Maa)의 구조와 아미노산 서열을 근거로 글리세롤에 아세틸기를 전이할 것으로 추정되는 다른 미생물 유래의 후보 유전자들을 선별하고 각 유전자들을 pTrc99A 발현벡터에 클로닝해서 만들어진 플라스미드 pMD9 - pMD13의 구조 도면이고, (D)는 이 플라스미드들로 형질전환 된 재조합 대장균 DH-MD9 - DH-MD13에서의 모노아세틴과 다이아세틴 생산성을 비교한 도면이다.
도 4의 (A)는 모노아세틴과 다이아세틴 생산성이 가장 좋았던 B. subtilis의 Maa 유전자(Bs-maa)를 pTrc99A, pET28a, pSTV28 발현벡터에 클로닝해서 만들어진 플라스미드 pMD13, pMD14, pMDT1의 구조 도면이고, (B)는 상기 플라스미드들로 형질전환 된 재조합 대장균 DH-MD13, DH-MD14, DH-MDT1에서의 모노아세틴, 다이아세틴, 트리아세틴 생산성을 비교한 도면이며, (C)는 각 재조합 대장균의 균체 증식을 비교한 도면이다.
도 5의 (A)는 모노아세틴(1), 다이아세틴(2), 트리아세틴(3)의 혼합 표준화합물(STD)과 재조합 대장균 DH-MD06, DH-MD8, DH-MDT1의 배양액을 에틸아세테이트로 추출한 후 GC로분석한 가스크로마토그램 도면이고, (B)는 GC-MS로 각 시료에서 얻어진 모노아세틴, 다이아세틴, 트리아세틴의 질량분석을 표준화합물(STD)의 질량분석과 비교한 도면이다.
도 6의 (A)는 다이아세틴을 트리아세틴으로 전환하는 chloramphenicol-O-acetyltransferase 유전자(cat)와 B. subtilis의 Maa 유전자(Bs-maa)를 pTrc99A 발현벡터에 클로닝해서 만들어진 플라스미드 pMDT2의 구조 도면이고, (B)와 (C)는 상기 플라스미드로 형질전환 된 재조합 대장균 DH-MDT2의 아세틴 복합물의 생산성과 조성을 대조구인 DH-MDT1와 비교한 도면이며, (D)는 재조합 대장균 DH-MDT2에서의 아세틴 복합물의 배양시간에 따른 생산 변화를 나타낸 도면이다.
도 7의 (A)는 Chloramphenicol O-acetyltransferase의 구조와 아미노산 서열을 근거로 다이아세틴에 아세틸기를 전이할 것으로 추정되는 후보 유전자들을 다양한 미생물들에서 발견하고 플라스미드 pMD13에 클로닝 해서 만들어진 플라스미드 pMDT2 - pMDT7의 구조 도면이고, (B)는 상기 플라스미드로 형질전환 된 재조합균주 DH-MDT2 - DH-MDT7의 아세틴 복합물 생산량 비교한 도면이며, (C)는 상기 재조합 균주들의 균체 증식을 비교한 도면이다.
도 8은 대장균 균종과 글리세롤 농도에 따른 아세틴 복합물의 생산성을 비교한 것으로서, (A)는 대장균 DH5α, AceCo, BW25113, W3110, MG1655를 플라스미드 pMDT2로 형질전환 한 재조합 대장균 DH-MDT2, AC-MDT2, BW-MDT2, W3-MDT2, MG-MDT2를 배양해서 아세틴 복합물 생산성을 비교한 것이며, (B)는 상기 재조합 대장균들의 균체 증식을 비교한 것이고, (C)는 재조합 균주 MG-MDT2의 배양에서 글리세롤 농도에 따른 아세틴 복합물 생산성을 나타낸 것이며, (D)는 상기 균주의 글리세롤 농도에 따른 균체 증식을 비교한 것이다.
도 9 는 대장균 BW25113에서 acetylesterase 유전자(aes)의 증폭 및 결손을 통한 아세틴 화합물의 변화를 관찰한 것으로서, (A)와 (B)는 대장균 BW25113에 pTrc99A와 pTAes로 각각 형질전환 한 재조합균주 BW-Empty와 BW-Aes를 15 g/L의 트리아세틴 표준화합물이 첨가된 2YT 배지에 접종하고 트리아세틴의 분해 양상을 관찰한 것이며, (C)는 BW25113과 aes 유전자가 결손된 JW0465 균주를 플라스미드 pMDT2로 형질전환 시킨 재조합균주 BW-MDT2와 BW-MDT2(Daes)를 10% (v/v) 글리세롤이 첨가된 2YT 배지에서 배양해서 아세틴 복합물 생산성을 비교한 것이며, (D)는 상기 재조합 균주들의 균체 증식을 비교한 것이다.
도 10의 (A)는 포도당으로부터 아세틴 복합물 생산을 위해서 사카라마이세스 세레비지애 유래 글리세롤 생산 유전자인 Sc-gpd1과 Sc-gpp2를 pMDT2 플라스미드에 클로닝해서 만들어진 플라스미드 pMDT8의 구조 도면이고, (B)는 상기 플라스미드로 형질전환 된 재조합 대장균 DH-MDT8의 포도당으로부터의 아세틴 복합물 생산, (C)는 상기 대장균들의 균체 증식, (D)는 배양액의 pH변화를 나타낸 것이다.
도 11은 BsMAA 말토오스 아세틸전이효소의 기질 결합 부위 구조를 도시한 것이다. 글리세롤 아세틸화 반응의 핵심잔기는 아미노산 서열의 위치 70의 아스파르트산(ASP), 위치 84의 아스파라긴(ASN), 위치 114의 히스티딘(HIS), 위치 126의 글루탐산(GLU) 이다.
도 12는 Bacillus subtilis MAA-like enzymes의 서열 정렬(alignment) 결과이다.
도 13은 CAT 클로람페니콜-O-아세틸 전이효소(Chloramphenicol-O-acetyltransferase)의 기질결합 부위 구조를 도시한 것이다. 다이아세틴 아세틸화 반응의 핵심잔기는 아미노산 서열의 위치 102의 페닐알라닌(PHE), 위치 143의 페닐알라닌(PHE), 위치 193의 히스티딘(HIS)이다. 서열의 위치 102와 143의 잔기는 유사한 성질의 아미노산인 이소류신(ILE)과 티로신(TYR)으로 각각 대체될 수 있다. 이것은 제2 O-아세틸 전이효소들의 아미노산 서열 정렬 비교 도면 14에서 알 수 있다.
도 14는 CAT-like enzymes의 서열 정렬 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 제1 O-아세틸 전이효소(O-acetyl transferase) 존재 하에 아세틸-CoA와 글리세롤을 반응시켜 모노아세틴 또는 다이아세틴을 얻는 단계;를 포함하는 아세틴의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 제1 O-아세틸 전이효소는 상기 아세틸-CoA에서 O-아세틸을 글리세롤로 전이시킬 수 있고, 예를 들면 말토오스 O-아세틸 전이효소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제1 O-아세틸 전이효소는 생물로부터 유래된 것이거나, 합성된 것일 수 있다.
또한, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 제1 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자를 가진 미생물에서 발현되는 것일 수 있고, 상기 미생물 내 제1 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자는 해당 미생물에 내재된 것일 수 있고, 유전자공학기술로 외부에서 미생물 내로 도입된 것일 수 있으며, 이 경우 글리세롤과 아세틸-CoA는 미생물 내에서 반응되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 아세틴은 모노아세틴(monoacetin), 다이아세틴(diacetin) 또는 트리아세틴(triacetin)을 포함할 수 있고, 이들의 복합물일 수 있다.
상기 제1 O-아세틸 전이효소는 글리세롤과 아세틸-CoA의 반응에서 촉매로 작용하여 모노아세틴이 생성될 수 있고, 모노아세틴은 제1 O-아세틸 전이효소 존재 하에 아세틸-CoA와 한 번 더 반응하여 다이아세틴을 생성할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 70에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파르트산(ASP)이고, 위치 84에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴(ASN)이고, 위치 114에 상응하는 위치의 아미노산이 히스티딘(HIS)이고, 위치 126에 상응하는 위치의 아미노산이 글루탐산(GLU)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 15에 상응하는 위치의 아미노산이 티로신(TYR) 또는 페닐알라닌(PHE)이고, 위치 26에 상응하는 위치의 아미노산이 아르기닌(ARG) 또는 글루타민(GLN)이고, 위치 30에 상응하는 위치의 아미노산이 아르기닌(ARG) 또는 리신(LYS)이고, 위치 71에 상응하는 위치의 아미노산이 티로신(TYR)이고, 위치 82에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 티로신(TYR)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제1 O-아세틸 전이효소의 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 15에 상응하는 위치의 아미노산인 티로신(TYR) 또는 페닐알라닌(PHE), 위치 26에 상응하는 위치의 아미노산인 아르기닌(ARG) 또는 글루타민(GLN), 위치 30에 상응하는 위치의 아미노산인 아르기닌(ARG) 또는 리신(LYS), 위치 71에 상응하는 위치의 아미노산인 티로신(TYR) 및 위치 82에 상응하는 위치의 아미노산인 페닐알라닌(PHE) 또는 티로신(TYR)은 기질결합포켓(substrate binding pocket)을 형성하는 잔기로서, 상대적으로 보존이 잘 되어있으며, 아세틴을 제조하는 데 중요한 역할을 하는 아미노산 잔기에 해당한다.
상기 제1 O-아세틸 전이효소의 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 70에 상응하는 위치의 아미노산인 아스파르트산(ASP), 위치 84에 상응하는 위치의 아미노산인 아스파라긴(ASN) 및 위치 126에 상응하는 위치의 아미노산인 글루탐산(GLU)은 글리세롤을 안정화시키는 아미노산 잔기로서, 상대적으로 보존이 잘 되어있으며, 아세틴을 제조하는 데 중요한 역할을 하는 아미노산 잔기에 해당한다.
상기 제1 O-아세틸 전이효소의 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 114에 상응하는 위치의 아미노산인 히스티딘(HIS)은 촉매 역할을 하는 잔기로서, 상대적으로 보존이 잘 되어있으며, 아세틴을 제조하는 데 중요한 역할을 하는 아미노산 잔기에 해당한다.
또한, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 그 아미노산 서열이 서열번호 5의 아미노산 서열과 상동성이 50% 이상일 수 있다.
상기 말토오스 O-아세틸 전이효소는 예를 들어, 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli)의 말토오스 O-아세틸 전이효소(서열번호 1), 스타필로코커스 카노수스(Staphylococcus carnosus)의 말토오스 O-아세틸 전이효소(서열번호 2), 할알칼리코커스 젓갈리(Halalkalicoccus jeotgali)의 말토오스 O-아세틸 전이효소(서열번호 3), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)의 말토오스 O-아세틸 전이효소(서열번호 4), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 말토오스 O-아세틸 전이효소(서열번호 5) 또는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)의 말토오스 O-아세틸 전이효소(서열번호 6)일 수 있고, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 말토오스 O-아세틸 전이효소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
에셰리키아 콜라이(Escherichia coli)의 말토오스 O-아세틸 전이효소(서열번호 1) 아미노산 서열은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 말토오스 O-아세틸 전이효소(서열번호 5) 아미노산 서열과 상동성이 65%이고, 스타필로코커스 카노수스(Staphylococcus carnosus)의 말토오스 O-아세틸 전이효소(서열번호 2) 아미노산 서열은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 말토오스 O-아세틸 전이효소(서열번호 5) 아미노산 서열과 상동성이 58%이고, 할알칼리코커스 젓갈리(Halalkalicoccus jeotgali)의 말토오스 O-아세틸 전이효소(서열번호 3) 아미노산 서열은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 말토오스 O-아세틸 전이효소(서열번호 5) 아미노산 서열과 상동성이 53%이고, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)의 말토오스 O-아세틸 전이효소(서열번호 4) 아미노산 서열은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 말토오스 O-아세틸 전이효소(서열번호 5) 아미노산 서열과 상동성이 55%이고, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)의 말토오스 O-아세틸 전이효소(서열번호 6) 아미노산 서열은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 말토오스 O-아세틸 전이효소(서열번호 5) 아미노산 서열과 상동성이 50%이다.
또한, 본 발명의 아세틴의 제조 방법은 제2 O-아세틸 전이효소 존재 하에 상기 반응 생성물인 다이아세틴을 아세틸-CoA와 반응시키는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 제2 O-아세틸 전이효소는 서열번호 7의 아미노산 서열의 위치 31에 상응하는 위치의 아미노산이 시스테인(CYS) 또는 류신(LEU)이고, 위치 102에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 이소류신(ILE)이고, 위치 143에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 타이로신(TYR)이고, 위치 166에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 타이로신(TYR)이고, 위치 170에 상응하는 위치의 아미노산이 발린(VAL), 이소류신(ILE), 또는 류신(LEU)이고, 위치 193에 상응하는 위치의 아미노산이 히스티딘(HIS)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
제2-아세틸 전이효소는 다이아세틴에 아세틸기를 전이해 트리아세틴을 생성할 수 있고, 예를 들면 클로람페니콜-O-아세틸 전이효소(Chloramphenicol-O-acetyltransferase)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
클로람페니콜-O-아세틸 전이효소는 예를 들면 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 서열번호 7의 클로람페니콜-O-아세틸 전이효소(서열번호 7)는 예를 들어, 클로람페니콜 저항성 항생제 마커를 갖는 pSTV28 벡터에서 발현되는 것일 수 있고, 클로람페니콜 저항성 항생제 마커를 갖는 미생물에서 발현되는 것일 수 있고, pSTV28 벡터를 선천적 또는 후천적으로 갖는 미생물에서 발현되는 것일 수 있고, 합성에 의해 제조될 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제1 O-아세틸 전이효소 및 상기 제2 O-아세틸 전이효소 존재 하에 상기 글리세롤과 아세틸-CoA가 반응하는 경우, 모노아세틴, 다이아세틴, 트리아세틴의 복합물이 생성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제2 O-아세틸 전이효소는 클로람페니콜-O-아세틸 전이효소이거나, 그와 유사한 단백질 서열 및 구조를 가져, 다이아세틴에 아세틸기를 전이시켜 트리아세틴을 생성할 수 있다.
상기 제2 O-아세틸 전이효소는 제2 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자를 가진 미생물에서 발현되는 것일 수 있고, 상기 미생물 내 제2 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자는 해당 미생물에 내재된 것일 수 있고, 유전자공학기술로 외부에서 미생물 내로 도입된 것일 수 있으며, 이 경우 글리세롤과 아세틸-CoA는 미생물 내에서 반응되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제2 O-아세틸 전이효소는 생물로부터 유래된 것이거나, 합성된 것일 수 있다.
상기 제2 O-아세틸 전이효소는 서열번호 7의 아미노산 서열의 위치 31에 상응하는 위치의 아미노산이 시스테인(CYS) 또는 류신(LEU)이고, 위치 93에 상응하는 위치의 아미노산인 트레오닌(THR) 또는 프롤린(PRO), 위치 102에 상응하는 위치의 아미노산인 페닐알라닌(PHE) 또는 이소류신(ILE), 위치 143에 상응하는 위치의 아미노산인 페닐알라닌(PHE) 또는 티로신(TYR) , 위치 166에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 타이로신(TYR) 및 위치 170에 상응하는 위치의 아미노산인 발린(VAL), 이소류신(ILE) 및 류신(LEU) 중 어느 하나는 기질결합포켓(substrate binding pocket)을 형성하는 잔기로서, 상대적으로 보존이 잘 되어있으며, 아세틴을 제조하는 데 중요한 역할을 하는 아미노산 잔기에 해당한다.
상기 제2 O-아세틸 전이효소는 서열번호 7의 아미노산 서열의 위치 193에 상응하는 위치의 아미노산인 히스티딘(HIS)은 촉매 역할을 하는 잔기로서, 상대적으로 보존이 잘 되어있으며, 아세틴을 제조하는 데 중요한 역할을 하는 아미노산 잔기에 해당한다.
또한, 상기 제2 O-아세틸 전이효소는 그 아미노산 서열이 서열번호 7의 아미노산 서열과 상동성이 32% 이상일 수 있다.
상기 제2 O-아세틸 전이효소는 구체적으로는, 서열번호 7의 클로람페니콜-O-아세틸 전이효소, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 O-아세틸 전이효소(서열번호 8), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 O-아세틸 전이효소(서열번호 9) 또는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)의 O-아세틸 전이효소(서열번호 10)일 수 있고, 바람직하게는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 O-아세틸 전이효소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 O-아세틸 전이효소(서열번호 8) 아미노산 서열은 클로람페니콜-O-아세틸 전이효소(서열번호 7) 아미노산 서열과 상동성이 43% 이상이고, 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 O-아세틸 전이효소(서열번호 9) 아미노산 서열은 클로람페니콜-O-아세틸 전이효소(서열번호 7) 아미노산 서열과 상동성이 62%이고, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)의 O-아세틸 전이효소(서열번호 10) 아미노산 서열은 클로람페니콜-O-아세틸 전이효소(서열번호 7) 아미노산 서열과 상동성이 32%이다.
또한, 본 발명의 아세틴의 제조 방법은 포도당을 글리세롤 3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase) 및 글리세롤 3-탈인산효소(DL-glycerol-3-phosphatase)와 순차적으로 반응시켜 상기 글리세롤을 얻는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 글리세롤의 경우 포도당으로부터 효소와 반응시키는 생합성을 통해 얻을 수 있고, 이의 구체적인 예로서, 포도당을 글리세롤 3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase, GPD1) 및 글리세롤 3-탈인산효소(DL-glycerol-3-phosphatase, GPP2)와 순차적으로 반응시켜 상기 글리세롤을 얻는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 글리세롤 3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase) 및 글리세롤 3-탈인산효소(DL-glycerol-3-phosphatase)는 화학적으로 합성될 수 있다.
또한, 상기 글리세롤 3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase) 및 글리세롤 3-탈인산효소(DL-glycerol-3-phosphatase)는 글리세롤 3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase) 및 글리세롤 3-탈인산효소(DL-glycerol-3-phosphatase)를 코딩하는 유전자를 가진 미생물에서 발현되는 것일 수 있고, 상기 미생물 내 글리세롤 3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase) 및 글리세롤 3-탈인산효소(DL-glycerol-3-phosphatase)를 코딩하는 유전자는 해당 미생물에 내재된 것일 수 있고, 유전자공학기술로 외부에서 미생물 내로 도입된 것일 수 있으며, 이 경우 포도당으로부터 글리세롤을 얻는 것은 미생물 내에서 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 글리세롤 3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)는 미생물 종류에 따라 다른 아미노산 서열을 가질 수 있고, 해당 미생물에서 해당경로의 중간대사물질인 글리세론 인산(glycerone phosphate, DHAP)을 글리세롤 3-인산(glycerol-3-phosphate, G3P)으로 전환할 수 있는 것이면 족하다. 예를 들어, 사카라마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 경우, 서열번호 14의 사카라마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 글리세롤 3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase, GPD1)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 글리세롤 3-탈인산효소(DL-glycerol-3-phosphatase)는 미생물 종류에 따라 다른 아미노산 서열을 가질 수 있고, 해당 미생물에서 해당경로의 중간대사물질인 글리세롤 3-인산(glycerol-3-phosphate, G3P)을 글리세롤(glycerol)로 전환할 수 있는 것이면 족하며, 예를 들어, 사카라마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 경우, 서열번호 15의 사카라마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 글리세롤 3-탈인산효소(DL-glycerol-3-phosphatase, GPP2)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 포도당은 해당경로(Embden-Meyerhof pathway)를 통해 중간대사물질인 글리세론 인산(glycerone phosphate, DHAP)을 형성하고, 상기 글로세론 인산은 글리세롤 3-인산 탈수소효소와 반응하여 글리세롤 3-인산으로 전환될 수 있고, 상기 글리세롤 3-인산(glycerol-3-phosphate, G3P)은 글리세롤 3-탈인산효소와 반응하여 글리세롤(glycerol)이 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 제1 O-아세틸 전이효소(O-acetyl transferase)를 코딩하는 유전자를 발현하는 미생물을 글리세롤을 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계;를 포함하는 아세틴의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 70에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파르트산(ASP)이고, 위치 84에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴(ASN)이고, 위치 114에 상응하는 위치의 아미노산이 히스티딘(HIS)이고, 위치 126에 상응하는 위치의 아미노산이 글루탐산(GLU)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 15에 상응하는 위치의 아미노산이 티로신(TYR) 또는 페닐알라닌(PHE)이고, 위치 26에 상응하는 위치의 아미노산이 아르기닌(ARG) 또는 글루타민(GLN)이고, 위치 30에 상응하는 위치의 아미노산이 아르기닌(ARG) 또는 리신(LYS)이고, 위치 71에 상응하는 위치의 아미노산이 티로신(TYR)이고, 위치 82에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 티로신(TYR)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 그 아미노산 서열이 서열번호 5의 아미노산 서열과 상동성이 50% 이상일 수 있다.
상기 제1 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자는 예를 들어, 말토오스 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자일 수 있고, 상기 말토오스 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자는 예를 들어, 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli)의 말토오스 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자(maa , 서열번호 16), 스타필로코커스 카노수스(Staphylococcus carnosus)의 말토오스 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자(Sc-maa, 서열번호 17), 할알칼리코커스 젓갈리(Halalkalicoccus jeotgali)의 말토오스 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자(Hj-maa, 서열번호 18), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)의 말토오스 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자(Lb-maa, 서열번호 19), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 말토오스 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자(Bs-maa, 서열번호 20) 또는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)의 말토오스 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자(Pp-maa, 서열번호 21)일 수 있고, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 말토오스 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 미생물은 배지 내에서 배양되어 제1 O-아세틸 전이효소를 발현할 수 있고, 상기 제1 O-아세틸 전이효소가 글리세롤과 아세틸-CoA의 반응을 촉매하여 모노아세틴을 생성할 수 있고, 상기 모노아세틴과 아세틸-CoA의 반응을 한 번 더 촉매하여 다이아세틴을 생성할 수 있다.
상기 미생물은 제1 O-아세틸 전이 효소를 발현하는 미생물이라면 제한없이 사용가능하며, 예를 들어, 원핵 세포, 진핵 세포, 또는 분리된 동물세포로 액체 배지에서 배양될 수 있는 것일 수 있다. 상기 미생물은 예를 들면, 박테리아, 곰팡이, 또는 이들의 조합일 수 있다. 박테리아는 그람 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 또는 이들의 조합일 수 있다. 그람 음성 박테리아는 에세리키아 (Escherichia) 속일 수 있다. 그람 양성 박테리아는 바실러스 속, 코리네박테리움 속, 유산균 등 또는 이들의 조합일 수 있다. 곰팡이는 사카라마이세스 세레비지애, 클루베로마이세스 등 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 미생물은 구체적으로 대장균(E.coli)일 수 있고, 보다 구체적으로 DH5α, DH5α(DE3), AceCo, BW25113, W3110 또는 MG1655일 수 있다. 상기 미생물은 대장균 중 생산성 측면에서 바람직하게는 DH5α(DE3), BW25113, W3110 또는 MG1655일 수 있고, 보다 바람직하게는 MG1655일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 미생물은 제1 O-아세틸 전이효소(O-acetyl transferase)를 코딩하는 유전자를 선천적으로 보유하는 미생물일 수 있고, 형질전환, 형질도입 등의 생명공학적 기술 등에 의해 상기 유전자를 후천적으로 보유하는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 형질전환은 재조합 플라스미드를 상기 미생물 내부에 도입함으로써 이루어질 수 있고, 상기 재조합 플라스미드는 벡터에 상기 제1 O-아세틸 전이효소(O-acetyl transferase)를 코딩하는 유전자가 삽입된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 벡터는 예를 들어, pTrc99A(서열번호 78), pET28a(서열번호 79) 또는 pSTV28(서열번호 77)일 수 있고, 바람직하게는 pSTV28일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유전자 삽입 시, 상기 벡터와 상기 유전자를 제한효소로 자르고 ligase로 연결되어 클로닝되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지는 상기 미생물의 증식, 또는 배양을 목적으로 미생물이 일반적으로 생존하고 번식하는 자연 환경과 유사한 영양 상태를 유지 하도록 고안된 물질로서 자라는데 필요한 모든 영양소를 첨가하여 만든 액체 및 고체의 물질로서, 글리세롤 뿐만 아니라 아세틸-CoA를 포함하는 배지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 상기 미생물은 다이아세틴에 아세틸기를 전이하는 제2 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자를 더 발현하는 것일 수 있다.
상기 제2 O-아세틸 전이효소는 서열번호 7의 아미노산 서열의 위치 31에 상응하는 위치의 아미노산이 시스테인(CYS) 또는 류신(LEU)이고, 위치 102에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 이소류신(ILE)이고, 위치 143에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 타이로신(TYR)이고, 위치 166에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 타이로신(TYR)이고, 위치 170에 상응하는 위치의 아미노산이 발린(VAL), 이소류신(ILE), 또는 류신(LEU)이고, 위치 193에 상응하는 위치의 아미노산이 히스티딘(HIS) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 미생물은 배지 내 배양되며, 제1 O-아세틸 전이효소 외에 추가적으로 클로람페니콜-O-아세틸 전이효소 또는 2 O-아세틸 전이효소를 더 발현할 수 있다.
상기 클로람페니콜-O-아세틸 전이효소(서열번호 7)를 코딩하는 유전자(cat, 서열번호 24)는 클로람페니콜 저항성 항생제 마커를 갖는 벡터에 존재할 수 있고, 상기 벡터는 예를 들어 pSTV28 벡터일 수 있고, 해당 벡터는 미생물이라면 제한없이 도입되어 해당 미생물로부터 클로람페니콜-O-아세틸 전이효소가 발현될 수 있고, 예를 들어 대장균에 상기 벡터가 도입되어 대장균으로부터 클로람페니콜-O-아세틸 전이효소가 발현될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제2 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자는 예를 들어, 클로람페니콜-O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자(cat, 서열번호 24), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자(Bc-Oat, 서열번호 25), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자(Pa-Oat, 서열번호 26) 또는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)의 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자(Ca-Oat, 서열번호 27)일 수 있고, 바람직하게는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 제2 O-아세틸 전이효소는 그 아미노산 서열이 서열번호 7의 아미노산 서열과 상동성이 32% 이상일 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 미생물은 아세틸에스테라제(acetylesterase)를 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실된 것일 수 있다.
에스터 화합물인 아세틴은 에스터 결합 분해 효소(esterases)에 의해서 글리세롤과 아세테이트로 분해될 수 있고, 상기 아세틴을 분해하는 에스터 결합 분해 효소는 예를 들어 아세틸에스테라제일 수 있다.
상기 아세틸에스테라제를 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실된 미생물의 경우 아세틸에스테라제를 발현하지 않아, 아세틴의 생산량이 증가될 수 있다.
상기 아세틸에스테라제는 미생물 종류에 따라 다른 서열을 가질 수 있고, 이를 코딩하는 유전자도 마찬가지로 다른 서열을 가질 수 있는 바, 해당 미생물에서 아세틸에스테라제를 코딩하는 유전자(aes)가 감쇄 또는 결실된 것일 수 있다. 예를 들어, 대장균의 경우, 서열번호 13의 아세틸에스테라제를 코딩하는 서열번호 30의 유전자가 감쇄 또는 결실된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 미생물은 제1 O-아세틸 전이 효소를 발현하는 미생물이라면 제한없이 사용가능하며, 전술한 범위 내의 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 상기 미생물의 본 배양 시 초기 균체 농도가 OD600nm에서 0.05 내지 0.15일 때, 상기 배지에 포함된 글리세롤의 농도는 3%(v/v) 내지 13%(v/v)일 수 있으며, 바람직하게는 초기 균체 농도가 OD600nm에서 0.08 내지 0.12일 때, 글리세롤의 농도는 5%(v/v) 내지 11%(v/v)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 글리세롤 농도를 가지는 배지에서 상기 균체의 농도로 미생물을 배양할 경우, 아세틴이 다량 생성될 수 있다.
상기 글리세롤의 농도가 13%(v/v) 초과인 경우, 과도한 삼투압 증가의 영향으로 균체 증식과 아세틴 생산이 모두 감소할 수 있으며, 농도가 3%(v/v) 미만인 경우, 기질의 농도가 적어서 아세틴의 생산량이 적을 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 미생물은 글리세롤 3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase) 및 글리세롤 3-탈인산효소(DL-glycerol-3-phosphatase)를 코딩하는 유전자를 더 발현하고, 상기 배지는 포도당을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
전술한 바와 같이 상기 미생물은 글리세롤 3-인산 탈수소효소 및 글리세롤 3-탈인산효소를 발현하며, 포도당은 해당경로를 통해 글리세론 인산으로 변환된 후 상기 효소들을 통해 글리세롤로 변환될 수 있다.
상기 글리세롤 3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(Gpd1)는 미생물 종류에 따라 다른 염기 서열을 가질 수 있고, 해당 미생물에서 해당경로의 중간대사물질인 글리세론 인산(glycerone phosphate, DHAP)을 글리세롤 3-인산(glycerol-3-phosphate, G3P)으로 전환할 수 있는 것이면 족하다. 예를 들어, 사카라마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 경우, 서열번호 31의 사카라마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 글리세롤 3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(Sc-gpd1)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 글리세롤 3-탈인산효소(DL-glycerol-3-phosphatase)를 코딩하는 유전자(Gpp2)는 미생물 종류에 따라 다른 염기 서열을 가질 수 있고, 해당 미생물에서 해당경로의 중간대사물질인 글리세롤 3-인산(glycerol-3-phosphate, G3P)을 글리세롤(glycerol)로 전환할 수 있는 것이면 족하다. 예를 들어, 사카라마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 경우, 서열번호 32의 사카라마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 글리세롤 3-탈인산효소(DL-glycerol-3-phosphatase)를 코딩하는 유전자(Sc-gpp2)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 글리세롤은 전술한 제1 O-아세틸 전이효소 및 클로람페니콜-O-아세틸 전이효소 또는 제2 O-아세틸 전이효소 등에 의해 아세틴 복합물로 변환될 수 있다.
또한, 본 발명은 제1 O-아세틸 전이효소(O-acetyl transferase)를 코딩하는 유전자를 발현하는 미생물을 포함하는 아세틴 제조용 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 글리세롤과 접촉하는 경우 전술한 범위 및 방법으로 아세틴을 제조할 수 있다.
상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 70에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파르트산(ASP)이고, 위치 84에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴(ASN)이고, 위치 114에 상응하는 위치의 아미노산이 히스티딘(HIS)이고, 위치 126에 상응하는 위치의 아미노산이 글루탐산(GLU)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 15에 상응하는 위치의 아미노산이 티로신(TYR) 또는 페닐알라닌(PHE)이고, 위치 26에 상응하는 위치의 아미노산이 아르기닌(ARG) 또는 글루타민(GLN)이고, 위치 30에 상응하는 위치의 아미노산이 아르기닌(ARG) 또는 리신(LYS)이고, 위치 71에 상응하는 위치의 아미노산이 티로신(TYR)이고, 위치 82에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 티로신(TYR)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 그 아미노산 서열이 서열번호 5의 아미노산 서열과 상동성이 50% 이상일 수 있다.
상기 제1 O-아세틸 전이효소는 말토오스 O-아세틸 전이효소일 수 있고, 보다 구체적으로는 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 카노수스(Staphylococcus carnosus), 할알칼리코커스 젓갈리(Halalkalicoccus jeotgali), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)의 말토오스 O-아세틸 전이효소일 수 있고, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 말토오스 O-아세틸 전이효소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제1 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자는 예를 들어, 말토오스 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자일 수 있고, 상기 말토오스 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자는 예를 들어, 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli)의 말토오스 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자(maa , 서열번호 16), 스타필로코커스 카노수스(Staphylococcus carnosus)의 말토오스 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자(Sc-maa, 서열번호 17), 할알칼리코커스 젓갈리(Halalkalicoccus jeotgali)의 말토오스 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자(Hj-maa, 서열번호 18), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)의 말토오스 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자(Lb-maa, 서열번호 19), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 말토오스 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자(Bs-maa, 서열번호 20) 또는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)의 말토오스 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자(Pp-maa, 서열번호 21)일 수 있고, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 말토오스 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 미생물은 다이아세틴에 아세틸기를 전이하는 제2 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자를 더 발현하는 것일 수 있다.
상기 제2 O-아세틸 전이효소는 서열번호 7의 아미노산 서열의 위치 31에 상응하는 위치의 아미노산이 시스테인(CYS) 또는 류신(LEU)이고, 위치 102에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 이소류신(ILE)이고, 위치 143에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 타이로신(TYR)이고, 위치 166에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 타이로신(TYR)이고, 위치 170에 상응하는 위치의 아미노산이 발린(VAL), 이소류신(ILE), 또는 류신(LEU)이고, 위치 193에 상응하는 위치의 아미노산이 히스티딘(HIS)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 클로람페니콜-O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자는 클로람페니콜 저항성 항생제 마커를 갖는 벡터에 존재할 수 있고, 예를 들어 pSTV28 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제2 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자는 예를 들어, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)의 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자일 수 있고, 바람직하게는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 제2 O-아세틸 전이효소는 그 아미노산 서열이 서열번호 7의 아미노산 서열과 상동성이 32% 이상일 수 있다.
또한, 상기 미생물은 아세틸에스테라제(acetylesterase)를 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실된 것일 수 있다.
에스터 화합물인 아세틴은 에스터 결합 분해 효소(esterases)에 의해서 글리세롤과 아세테이트로 분해될 수 있고, 상기 아세틴을 분해하는 에스터 결합 분해 효소는 예를 들어 아세틸에스테라제일 수 있다.
상기 아세틸에스테라제를 코딩하는 유전자(aes)가 감쇄 또는 결실된 미생물의 경우 아세틸에스테라제를 발현하지 않아, 아세틴의 생산량을 증가시킬 수 있다.
상기 아세틸에스테라제는 미생물 종류에 따라 다른 서열을 가질 수 있고, 이를 코딩하는 유전자도 마찬가지로 다른 서열을 가질 수 있는 바, 해당 미생물에서 아세틸에스테라제를 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실된 것일 수 있다. 예를 들어, 대장균의 경우, 서열번호 13의 아세틸에스테라제를 코딩하는 서열번호 30의 유전자가 감쇄 또는 결실된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 미생물은 전술한 바와 같으나, 구체적으로 대장균(E.coli)일 수 있고, 보다 구체적으로는 DH5α, DH5α(DE3), AceCo, BW25113, W3110 또는 MG1655일 수 있고, 바람직하게는 MG1655일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 미생물은 글리세롤 3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase) 및 글리세롤 3-탈인산효소(DL-glycerol-3-phosphatase)를 코딩하는 유전자를 더 발현하는 것일 수 있다.
전술한 바와 같이 상기 미생물은 글리세롤 3-인산 탈수소효소 및 글리세롤 3-탈인산효소를 발현하며, 포도당은 해당경로 및 상기 효소들을 통해 글리세롤로 변환될 수 있다.
상기 글리세롤 3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(Gpd1)는 미생물 종류에 따라 다른 염기 서열을 가질 수 있고, 해당 미생물에서 해당경로의 중간대사물질인 글리세론 인산(glycerone phosphate, DHAP)을 글리세롤 3-인산(glycerol-3-phosphate, G3P)으로 전환할 수 있는 것이면 족하다. 예를 들어, 사카라마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 경우, 서열번호 31의 사카라마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 글리세롤 3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(Sc-gpd1)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 글리세롤 3-탈인산효소(DL-glycerol-3-phosphatase)를 코딩하는 유전자(Gpp2)는 미생물 종류에 따라 다른 염기 서열을 가질 수 있고, 해당 미생물에서 해당경로의 중간대사물질인 글리세롤 3-인산(glycerol-3-phosphate, G3P)을 글리세롤(glycerol)로 전환할 수 있는 것이면 족하다. 예를 들어, 사카라마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 경우, 서열번호 32의 사카라마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 글리세롤 3-탈인산효소(DL-glycerol-3-phosphatase)를 코딩하는 유전자(Sc-gpp2)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 글리세롤은 전술한 O-아세틸 전이효소 및 클로람페니콜-O-아세틸 전이효소 등에 의해 아세틴 복합물로 변환될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 하기 실시예에 사용된 플라스미드와 균주는 표 1에, PCR primer들은 표 2에 정리하였다.
Names Descriptions Sources
Plasmids
pSTV28 P lac expression vector, pACYC184 origin, lacZα, Cmr Takara Co., Ltd
pTrc99A P trc expression vector, pBR322 origin, lacIq, Ampr Amersham Bioscience
pET28a (+) PT7 expression vector, pBR322 origin, lacI, and Kanr Novagen
pMD1 pTrc99A vector containing lacA from E. coli -
pMD2 pTrc99A vector containing cysE from E. coli -
pMD3 pTrc99A vector containing yjgM from E. coli -
pMD4 pTrc99A vector containing yjaB from E. coli -
pMD5 pTrc99A vector containing yiiD from E. coli -
pMD6 pTrc99A vector containing wecH from E. coli -
pMD7 pTrc99A vector containing nhoA from E. coli -
pMD8 pTrc99A vector containing maa from E. coli -
pMD9 pTrc99A vector containing maa from S. carnosus -
pMD10 pTrc99A vector containing maa from H. jeotgali -
pMD11 pTrc99A vector containing maa from L. brevis -
pMD12 pTrc99A vector containing maa from P. putida -
pMD13 pTrc99A vector containing maa from B. subtilis -
pMD14 pET28a vector containing maa from B. subtilis -
pT-CAT pTrc99A vector containing cat from pSTV28 -
pMDT1 pSTV28 vector containing maa from B. subtilis -
pMDT2 pTrc99A vector containing cat from pSTV28 and maa from B. subtilis -
pMDT3 pTrc99A vector containing oat from B. cereus and maa from B. subtilis -
pMDT4 pTrc99A vector containing oat from P. aeruginosa and maa from B. subtilis -
pMDT5 pTrc99A vector containing oat from C. acetobutylicum and maa from B. subtilis -
pMDT6 pTrc99A vector containing oat from M. abscessus and maa from B. subtilis -
pMDT7 pTrc99A vector containing oat from L. brevis and maa from B. subtilis -
pMDT8 pMDT2 containing gpd1 and gpp2 from S. cerevisiae -
Strains
MG1655 E. coli K-12; F- lambda-, ilvG-, rfb-50, rph-1 ATCC
700926
DH5α E. coli K-12; F-, Φ80lacZ△M15, △(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rK-, mK+) phoA, supE44, λ-, thi-1 ATCC98040
BW25113 △(araD-araB)567, △lacZ4787(::rrnB-3), lambda - , rph-1, △(rhaD-rhaB)568, hsdR514 NBRP, NIG
AceCo MG1655 △ackA-pta, poxB, ldhA, dld, adhE, pps, atoDA Ref. 1
W3110 E. coli K-12; F-, λ- IN (rrnD-rrnE)1 ATCC27325
DH5α (DE3) E. coli K-12; F-, Φ80lacZ△M15, △(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rK-, mK+) phoA, supE44, λ-, thi-1, λ(DE3) -
JW0465 BW25113 △aes NBRP, NIG
DH-MD0 E. coli DH5α harboring pTrc99A -
DH-MD1 E. coli DH5α harboring pMD1 -
DH-MD2 E. coli DH5α harboring pMD2 -
DH-MD3 E. coli DH5α harboring pMD3 -
DH-MD4 E. coli DH5α harboring pMD4 -
DH-MD5 E. coli DH5α harboring pMD5 -
DH-MD6 E. coli DH5α harboring pMD6 -
DH-MD7 E. coli DH5α harboring pMD7 -
DH-MD8 E. coli DH5α harboring pMD8 -
DH-MD9 E. coli DH5α harboring pMD9 -
DH-MD10 E. coli DH5α harboring pMD10 -
DH-MD11 E. coli DH5α harboring pMD11 -
DH-MD12 E. coli DH5α harboring pMD12 -
DH-MD13 E. coli DH5α harboring pMD13 -
DH-MD14 E. coli DH5α(DE3) harboring pMD14 -
DH-MDT1 E. coli DH5α harboring pMDT1 -
DH-EMPT E. coli DH5α harboring pTrc99A -
DH-CAT E. coli DH5α harboring pT-CAT -
DH-MDT2 E. coli DH5α harboring pMDT2 -
DH-MDT3 E. coli DH5α harboring pMDT3 -
DH-MDT4 E. coli DH5α harboring pMDT4 -
DH-MDT5 E. coli DH5α harboring pMDT5 -
DH-MDT6 E. coli DH5α harboring pMDT6 -
DH-MDT7 E. coli DH5α harboring pMDT7 -
AC-MDT2 E. coli AceCo harboring pMDT2 -
BW-MDT2 E. coli BW25113 harboring pMDT2 -
W3-MDT2 E. coli W3110 harboring pMDT2 -
MG-MDT2 E. coli MG1655 harboring pMDT2 -
BW-Empty E. coli BW25113 harboring pTrc99A -
BW-Aes E. coli BW25113 harboring pT-Aes -
BW-MDT2 (Daes) E. coli JW0465 harboring pMDT2 -
DH-MDT8 E. coli DH5α harboring pMDT8 -
Ref. 1. Kim, J.-H. et al. Isoprene production by Escherichia coli through the exogenous mevalonate pathway with reduced formation of fermentation byproducts. Microbial Cell Factories 15, 214 (2016).
Primers a, b, c Descriptions (5'-> 3') 서열번호
Ec-lacA-F CTGGATCC AGGAGGTAATAAAATGGAACATGCCAATGACCG 33
Ec-lacA-R GTTTCTAGATTAAACTGACGATTCAACTTTATAATC 34
Ec-cysE-F CTGGATCC AGGAGGTAATAAAATGTCGTGTGAAGAACTGGAAATTG 35
Ec-cysE-R GTTTCTAGATTAGATCCCATCCCCATACTC 36
Ec-yjgm-F CTGGATCC AGGAGGTAATAAAATGAATAACATTGCGCCGC 37
Ec-yjgM-R GTTTCTAGATTAGAGTTCGCGCAACATCC 38
Ec-yjaB-F CTGGATCC AGGAGGTAATAAAATGGTTATTAGTATTCGCCGCTC 39
Ec-yjaB-R GTTTCTAGATTACGCCCCCACATACGC 40
Ec-yiiD-F CTGGATCC AGGAGGTAATAAAATGAGCCAGCTTCCAGGG 41
Ec-nhoA-F CTGGATCC AGGAGGTAATAAAATGACGCCCATTCTGAATCAC 42
Ec-nhoA-R GTTTCTAGATTATTTTCCCGCCTCCGGG 43
Ec-wecH-F CTGGATCC AGGAGGTAATAAAATGCAGCCCAAAATTTACTGG 44
Ec-WecH-R GTTTCTAGATTAACTCACTAATCTGTTTCTGTCG 45
Ec-yiiD-R GTTTCTAGATTACTCTTCTTCGTTCCCGC 46
Ec-maa-F CTGGATCC AGGAGGTAATAAAATGAGCACAGAAAAAGAAAAGATG 47
Ec-maa-R GTTTCTAGATTACAATTTTTTAATTATTCTGGCTG 48
Sc-maa-F CTGGATCC AGGAGGTAATAAAATGACCACCGAGAAGGAAAAAATG 49
Sc-maa-R GTTTCTAGATTAATCCAGCGGCACTTCAC 50
Hj-maa-F CTGGATCC AGGAGGTAATAAAATGACCAGCGAGAAGGAACG 51
Hj-maa-R GTTTCTAGATTAATCAACGTCCTTCAGCACA 52
Lb-maa-F CTGGATCC AGGAGGTAATAAAATGGACAAGAGCGAGAAGG 53
Lb-maa-R GTTTCTAGATTATTTCAGCGGCTTAATCAC 54
Pp-maa-F CTGGATCC AGGAGGTAATAAAATGAGCCTGAGCGAGAAGCAC 55
Pp-maa-R GTTTCTAGATTATTGACCCTGATCCGGCTG 56
Bs-maa-F CTGGATCC AGGAGGTAATAAAATGCTGCGTACCGAGAAGG 57
Bs-maa-R GTTTCTAGATTACAGTTGTTTCAGAATACGCGC 58
Cat-F CTAGGAGCTC AGGAGAAATATAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATAC 60
Cat-R CTGGATCCTTACGCCCCGCCCTGCC 61
Trc-Bs.maa-F AGATCTGAGTCGACAGTATCGGCGGG 62
Trc-Bs.maa-R TATATTTCTCCTGAGGATCCCCGGGTACCG 63
Bc-Oat-F CTCGGTACCCGG GGATCC TC AGGAGAAATATAATGGACTTCCACCAGATC 64
Bc-Oat-R CCCGCCGATACT GTCGACAGATCTTACAGCCATTCCTCAAAG 65
Ca-Oat-F CTCGGTACCCGG GGATCC TC AGGAGAAATATAATGAACAGCAACTTCCAC 66
Ca-Oat-R CCCGCCGATACT GTCGACAGATCTTAACGAATCCACTCTTTC 67
Lb-Oat-F CTCGGTACCCGG GGATCC TC AGGAGAAATATAATGACCGAGCTGAACACCC 68
Lb-Oat-R CCCGCCGATACT GTCGACAGATCTTACGCGGTCAGCCACAG 69
Ma-Oat-F CTCGGTACCCGG GGATCC TC AGGAGAAATATAATGCCGGCGGAGCACGCG 70
Ma-Oat-R CCCGCCGATACT GTCGACAGATCTTAATCACGAACCCAATCCGGGTCCG 71
Pa-Oat-F CTCGGTACCCGG GGATCC TC AGGAGAAATATAATGAGCTACACCCGTGTTG 72
Pa-Oat-R CCCGCCGATACT GTCGACAGATCTTAGCCACCCGCTTCATC 73
Ec-aes-F CTGGATCCGTCACCCAACCCTTTATGAAGCCGGAAAACAAACTACC 74
Ec-aes-R TATCGTCGACTTAAAGCTGAGCGGTAAAGAACTG 75
Sc-gpd1-F GCGGATCC AGGAGGTAATAAAATGTCTGCTGCTGCTGATAGATTAAAC 76
Sc-gpd1-R AATGCTGCAGTTAATCTTCATGTAGATCTAATTCTTCAATC 59
Sc-gpp2-F TGCTGCAG AGGAGGTAATTTATATGGGATTGACTACTAAACCTCTATC 22
Sc-gpp2-R CCCAAGCTTACCATTTCAACAGATCGTCC 23
aRestriction enzyme sites are underlined.bRBS sequences are italic.
cThe overlapping sequences are bolded.
실시예
1. 대장균 유래 O-acetyltransferases 효소들을 이용한 모노아세틴과 다이아세틴 생산
모노아세틴과 다이아세틴을 생산하기 위해서 글리세롤에 아세틸기를 전이할 수 있는 대장균 내의 O-acetyltransferases 후보 유전자들을 8종 선별하고 각 유전자들을 pTrc99A 발현벡터(서열번호 78)에 클로닝해서 플라스미드 pMD1 - pMD8를 구축하였다. 후보 유전자들은 galactoside O-acetyltransferase, maltose O-acetyltransferase(서열번호 1), serine acetyltransferase, O-acetyltransferase WecH, arylamine N-acetyltransferase를 각각 코딩하는 lacA(서열번호 80), maa(서열번호 16), cysE(서열번호 81), wecH(서열번호 82), nhoA(서열번호 83)와 3종의 O-acetyltransferase 추정 유전자 yjgm(서열번호 84), yjaB(서열번호 85), yiiD(서열번호 86)를 대장균 MG1655의 염색체를 주형으로 해서 PCR 증폭을 통해서 얻었다. 이 때 사용한 PCR primer들은 Ec-lacA-F(서열번호 33)/Ec-lacA-R(서열번호 34), Ec-maa-F(서열번호 47)/Ec-maa-R(서열번호 48), Ec-cysE-F(서열번호 35)/Ec-cysE-R(서열번호 36), Ec-wecH-F(서열번호 44)/Ec-wecH-R(서열번호 45), Ec-nhoA-F(서열번호 42)/Ec-nhoA-R(서열번호 43), Ec-yjgm-F(서열번호 37)/Ec-yjgM-R(서열번호 38), Ec-yjaB-F(서열번호 39)/Ec-yjaB-R(서열번호 40), Ec-yiiD-F(서열번호 41)/Ec-yiiD-R(서열번호 46)이다. 상기 PCR 반응산물은 BamHI과 XbaI을 이용해서 pTrc99A 벡터에 클로닝 되었다. 이렇게 구축한 플라스미드 pDM1 - pDM8로 대장균 DH5α를 형질전환해서 재조합균주 DH-MD1 ~ DH-MD8을 만들고 모노아세틴 및 다이아세틴 생성을 분석하였다(도 3).
종 배양은 LB 복합배지(10 g tryptone, 5 g yeast extract and 10 g sodium chloride per liter)를 이용해서 37℃에서 약 12시간 진탕 배양을 했다. 본 배양은 M9 최소배지(Na2HPO4·7H2O, 12.8 g/L; KH2PO4, 3g/L; NaCl, 0.5 g/L; NH4Cl, 1 g/L; MgSO4, 1mM; CaCl2, 100 mM)에 5 g/L의 yeast extract와 2% (v/v)의 glycerol을 첨가하고, 배양온도 37℃와 진탕속도 250rpm에서 48시간 동안 진행했다. 재조합균주에 도입된 플라스미드의 항생제 마커에 따라서 100 mg/L ampicillin, 50 mg/L chloramphenicol, 또는 50 mg/L kanamycin 항생제를 첨가했다. 본 배양의 초기 균체 농도는 OD600nm에서 0.1이 되게 하였고, 플라스미드에 도입한 유전자들의 발현을 위해서 0.5 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 배양 초기에 첨가하였다.
아세틴 화합물의 분석은 HP-INNOVAX column (19091N-133, 30 m in length, 0.250 mm in internal diameter and 0.25 μm film thicknesses)이 장착된 GC (Agilent Technologies 7890A, 미국)와 GC-MS (GC-MS-QP2010, SHIMADZU, 일본)를 이용했다. 아세틴 표준화합물은 Sigma (미국)에서 구입하였다. 본 배양에서 생산된 아세틴 복합물은 ethyl acetate 용매를 이용해서 배양액으로부터 추출하고, 추출 시료의 1 μL를 GC 또는 GC-MS에 주입하였다. GC의 오븐 온도는 50℃에서 시작해서 20℃/min의 속도로 90℃까지, 15℃/min의 속도로 150℃까지, 20℃/min의 속도로 190℃까지, 15℃/min의 속도로 230℃까지 올리고, 2 분간 유지하였다. 불꽃 이온 검출기(FID)의 온도는 280℃로 유지했다. 상기 분석방법에 따른 분석결과는 도 5에 나타내었다.
도 3의 재조합균주 DH-MD1 ~ DH-MD8의 배양결과에 따르면 pMD8 플라스미드로 형질전환된 DH-MD8 균주에서만 모노아세틴과 다이아세틴이 생산되었다. 이것은 대장균 유래 8종의 O-acetyltransferases 후보 유전자들 중에서 maltose O-acetyltransferase 유전자(maa)만이 글리세롤에 아세틸기를 전이할 수 있는 능력이 있다는 것이다.
2. 대장균 Maa 유사 효소들을 이용한 모노아세틴 생산
대장균에서 발굴된 Maa 보다 더 우수한 활성을 갖는 O-acetyl transferases를 발굴하기 위해서 대장균 Maa의 아미노산 서열로 BLAST 검색을 하고, Staphylococcus carnosus, Halalkalicoccus jeotgali, Lactobacillus brevis, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida 미생물로부터 추가로 5종의 maltose O-acetyl transferases(Sc-mOat(서열번호 2), Hj-mOat(서열번호 3), Lb-mOat(서열번호 4), Bs-mOat(서열번호 5), Pp-mOat(서열번호 6))를 확보하고 이들을 대장균에 발현 한 후에 모노아세틴과 다이아세틴 생산성을 비교했다(도 3).
상기 미생물 유래 유전자들은 숙주인 대장균에서의 발현을 최적화하기 위해서 GenScript (미국)에서 대장균 코돈 이용도에 맞춰서 합성을 했다. 상기 합성한 유전자들을 Sc-maa-F(서열번호 49)/Sc-maa-R(서열번호 50), Hj-maa-F(서열번호 51)/Hj-maa-R(서열번호 52), Lb-maa-F(서열번호 53)/Lb-maa-R(서열번호 54), Pp-maa-F(서열번호 55)/Pp-maa-R(서열번호 56), Bs-maa-F(서열번호 57)/Bs-maa-R(서열번호 58)의 PCR primers를 이용해서 증폭하여 얻은 Sc-maa(서열번호 17), Hj-maa(서열번호 18), Lb-maa(서열번호 19), Pp-maa(서열번호 21), Bs-maa(서열번호 20) 유전자를 BamHI과 XbaI을 이용해서 pTrc99A 벡터에 클로닝 하였다. 이렇게 구축한 플라스미드 pMD9 - pMD13로 대장균 DH5α를 형질전환해서 재조합균주 DH-MD9 ~ DH-MD13을 만들고 모노아세틴과 다이아세틴 생산성을 비교하였다(도 3).
비교 결과 B. subtilis의 Maa (Bs-maa)가 가장 높은 모노아세틴과 다이아세틴 생산성을 보인 것을 확인하였다. 배양방법과 분석방법은 실시예 1과 동일하다.
3. Chloramphenicol-O-acetyltransferase를 이용한 트리아세틴 생산
모노아세틴과 다이아세틴 생산성이 가장 좋았던 B. subtilis의 Maa 유전자(Bs-maa)의 발현 최적화를 위해서 pTrc99A(서열번호 78), pET28a(서열번호 79), pSTV28(서열번호 77) 등의 다양한 발현벡터에 클로닝해서 pMD13, pMD14, pMDT1) 플라스미드를 구축하고, 이 플라스미드들로 형질전환 된 재조합 대장균 DH-MD13, DH-MD14, DH-MDT1를 만들었다. T7 프로모터를 갖는 pMD14의 형질전환 숙주 균주로는 대장균 DH5α(DE3)를 이용했다. DH5α(DE3) 균주는 Novagen 회사(미국)의 λDE3 Lysogenization Kit를 이용해서 대장균 DH5α로부터 만들었다. DH-MDT1 균주에서 모노아세틴과 다이아세틴 생산성이 가장 높았을 뿐만 아니라 트리아세틴의 생산까지 관찰되었다(도 4).
이것은 pSTV28 벡터의 항생제 마커인 chloramphenicol-O-acetyltransferase (CAT, 서열번호 7)에 의한 것으로 추정된다. CAT은 광범위한 기질특이성을 갖고 있어서 다양한 기질들에 아세틸기를 전이시키는 것으로 알려져 있다. 모노아세틴과 다이아세틴에 추가적인 아세틸기 전이를 통해 트리아세틴(triacetin)을 생산하는 CAT 효소 유전자(cat, 서열번호 24)의 발현을 강화하기 위해서 pMD13 플라스미드의 Bs-maa 유전자 앞에 도입한 pMDT2 플라스미드를 구축하였다(도 6).
이를 위해서 Cat-F(서열번호 60)/Cat-R(서열번호 61)의 PCR primers를 이용해서 pSTV28로부터 cat 유전자를 PCR 증폭하고, SacI과 BamHI으로 절단해서 pMD13의 해당 제한효소 부위로 도입하였다. pMDT2로 형질전환 된 DH-MDT2 제조합균주의 모노아세틴, 다이아세틴, 트리아세틴의 복합물 생산량과 트리아세틴의 비율이 모두 DH-MDT1 균주에 비해서 크게 증가했다. 배양방법과 분석방법은 실시예 1과 동일하다.
4. CAT 유사 효소들을 이용한 트리아세틴 화합물 생산
모노아세틴과 다이아세틴을 트리아세틴으로 전환하는 효소들을 추가로 발굴하기 위해서 CAT 효소의 아미노산 서열로 BLAST 검색을 실시하였다. 이 검색을 통해서 상동성이 높은 5종의 O-acetyltransferases (OAT, Bc-OAT(서열번호 8), Pa-OAT(서열번호 9), Ca-OAT(서열번호 10), Ma-OAT(서열번호 11), Lb-OAT(서열번호 12))를 Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium acetobutylicum, Mycobacterium abscessus, Lactobacillus brevis에서 도출하고 숙주인 대장균에서의 발현을 최적화하기 위해서 GenScript 회사(미국)에서 대장균 코돈 이용도에 맞춰서 합성을 했다.
상기 미생물 유래 OAT 합성 유전자들(Bc-Oat(서열번호 25), Pa-Oat(서열번호 26), Ca-Oat(서열번호 27), Ma-Oat(서열번호 28), Lb-Oat(서열번호 29))을 Bc.Oat-F(서열번호 64)/Bc.Oat-R(서열번호 65), Pa.Oat-F(서열번호 72)/Pa.Oat-R(서열번호 73), Ca.Oat-F(서열번호 66)/Ca.Oat-R(서열번호 67), Ma.Oat-F(서열번호 70)/Ma.Oat-R(서열번호 71), Lb.Oat-F(서열번호 68)/Lb.Oat-R(서열번호 69)의 PCR primers를 이용해서 증폭한다.
이렇게 증폭한 각 유전자들의 단편은 pMD13 기반의 플라스미드 골격과 HiFi DNA assembly 방법으로 연결해서 플라스미드 pMDT3 ~ pMDT7을 구축하였다(도 7).
HiFi DNA assembly는 NEB 회사(미국)의 HiFi DNA assembly kit를 이용했고, 상기 pMD13 기반의 플라스미드 골격은 pMD13을 주형으로 Trc-Bs.maa-F(서열번호 62)와 Trc-Bs.maa-R(서열번호 63)를 PCR primer로 PCR을 수행해서 얻었다. pMDT3 ~ pMDT7 플라스미드로 형질전환 된 재조합균주 DH-MDT2 ~ DH-MDT7의 아세틴 복합물 생산량을 비교하였다(도 7).
그 결과 OAT 유전자 종류에 따라서 아세틴 복합물의 생산량에 큰 차이가 있었고, L. brevis와 M. abscessus 유래의 O-acetyltransferase는 트리아세틴 생산 능력이 없었고, B. cereus, P. aeruginosa, C. acetobutylicum의 유래의 O-acetyltransferase는 트리아세틴을 생산했지만 pSTV28의 항생제 마커인 CAT에 비해서는 생산성이 낮았다. 배양방법과 분석방법은 실시예 1과 동일하다.
5. 대장균 균종 및 글리세롤 첨가량에 따른 아세틴 복합물 생성량 변화
앞의 실시예들에서 숙주로 대장균 DH5α를 이용했다. 대장균의 종류에 따른 아세틴 화합물의 생산성을 비교하기 위해서 본 실시예에서는 숙주로 대장균 AceCo, BW25113, W3110, MG1655를 플라스미드 pMDT2로 형질전환 한 재조합 대장균 DH-MDT2, AC-MDT2, BW-MDT2, W3-MDT2, MG-MDT2를 배양해서 아세틴 복합물 생산성을 비교했다(도 8A, 8B).
재조합균주 MG-MDT2에서 아세틴 복합물 생산성이 가장 높았기 때문에 대장균 MG1655가 아세틴 화합물 생산에 가장 적합한 숙주라는 것을 알았다. 배양방법과 분석방법은 실시예 1과 동일하다.
가장 높은 아세틴 화합물 생산성을 보인 재조합균주 MG-MDT2에서 기질인 글리세롤 첨가량에 따른 아세틴 화합물 생산성을 고찰하기 위해서 모든 배양조건과 분석방법은 실시예1과 동일하고 다만 첨가하는 글리세롤의 농도를 2 ~ 15% (v/v)로 변화시켰다(도 8C, 8D).
아세틴 복합물의 생산량은 출발기질인 글리세롤의 첨가량이 증가할수록 높아졌으나, 15% 이상의 과도한 글리세롤 첨가의 경우에는 과도한 삼투압 증가의 영향으로 균체 증식과 아세틴 생산이 모두 감소하는 결과를 얻었다.
6. 아세틴 화합물을 분해하는 효소 유전자 제거를 통한 생산성 향상
에스터 화합물인 아세틴은 에스터 결합 분해 효소(esterases, 서열번호 13)에 의해서 글리세롤과 아세테이트로 분해될 수 있기 때문에 대장균의 acetylesterase 효소 유전자(aes, 서열번호 30)의 증폭 또는 결손의 영향을 고찰했다(도 9).
Aes 유전자 단편은 대장균 MG1655의 염색체를 주형으로 Ec-aes-F(서열번호 74)와 Ec-aes-R(서열번호 75)을 프라이머로 이용해서 PCR 증폭해서 얻었고, BamHI과 SalI 제한효소로 pTrc99A에 클로닝 해서 플라스미드 pTAes를 구축하였다. Aes 효소에 의한 트리아세틴의 분해를 관찰하기 위해서 대장균 BW25113을 공벡터 pTrc99A와 플라스미드 pTAes로 형질전환한 재조합균주 BW-Empty와 BW-Aes를 제조하고, 트리아세틴 표준화합물 15 g/L가 첨가된 배지에서 배양하였다. 배양조건은 상기 실시 예들에서 이용한 아세틴 복합물 생산조건과 동일하게 수행하였다(도 9A, 9B).
BW-Empty와 BW-Aes 균주에서 모두 트리아세틴 표준화합물의 분해가 일어났지만 분해의 정도는 aes 유전자를 과발현시킨 BW-Aes에서 훨씬 더 큰 것을 확인했다. 트리아세틴의 분해로 배양액에는 소량의 다이아세틴이 측정되었지만 모노아세틴은 검출되지 않았다. 이것은 모노아세틴의 분해가 더 빠르게 일어나기 때문인 것으로 추정된다.
Aes가 아세틴 화합물을 분해한다는 상기 결과로부터 유전자 aes가 결손된 JW0465와 야생형 균주인 BW25113을 pMDT2로 형질전환 해서 재조합균주 BW-MDT2와 BW-MDT2(Daes)를 제조하고, 이들 재조합 균주들에서의 아세틴 복합물 생산과 균체 증식을 비교했다(도 9C, 9D).
JW0465 균주는 BW25113 균주에서 aes 유전자가 결손된 균주로 NBRP (NIG, 일본)에서 분양을 받았다. 기질인 글리세롤을 10% (v/v) 첨가한 2YT 복합배지(16 g tryptone, 10 g yeast extract, and 5 g sodium chloride per liter)에서 배양을 했고, 기타 배양 및 분석조건은 상기 실시 예들과 동일하게 실시하였다.
Aes가 결손된 BW-MDT2(Daes) 균주에서 아세틴의 분해가 차단됨으로써 아세틴 복합물 생산량이 BW-MDT2 균주에 비해서 약 2배 이상 높은 것을 확인했다. 반면에 두 재조합 균주의 균체 증식에서는 차이가 없었다. 이 결과로부터 Aes가 아세틴 화합물의 분해에 관련되고, 이 유전자를 결손하면 아세틴 복합물의 생산성을 향상시킬 수 있다는 것을 알았다.
7. 포도당을 기질로 이용한 아세틴 화합물의 생산
도 2에 제시한 바와 같이 해당경로(Embden-Meyerhof pathway)의 중간 대사산물인 글리세론 인산(glycerone phosphate, DHAP)은 글리세롤 3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)와 글리세롤 3-탈인산효소(DL-glycerol-3-phosphatase)에 의해 글리세롤 3-인산을 거쳐서 글리세롤로 전환될 수 있다. 따라서 포도당을 출발기질로 하는 아세틴 복합물의 생산도 글리세롤 3-인산 탈수소효소와 글리세롤 3-탈인산효소의 추가 과발현을 통해서 가능하다. 글리세롤 3-인산 탈수소효소와 글리세롤 3-탈인산효소로 사카라마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 Gpd1(서열번호 14)과 Gpp2(서열번호 15)를 이용했다.
도 10은 포도당으로부터 아세틴 복합물 생산을 위해서 사카라마이세스 세레비지애 유래 글리세롤 생산 유전자인 Sc-gpd1(서열번호 31)과 Sc-gpp2(서열번호 32)를 pMDT2 플라스미드에 클로닝해서 만들어진 플라스미드 pMDT8의 구조 도면(A)과 이 플라스미드로 형질전환 된 재조합 대장균 DH-MDT8의 포도당으로부터의 아세틴 복합물 생산과 균체 증식, 배양액의 pH변화를 대조구인 DH-MDT2와 비교한 도면(B), 도면(C), 도면(D)를 나타내고 있다.
사카라마이세스 세레비지애의 염색체를 주형으로 Sc-gpd1-F(서열번호 76)와 Sc-gpd1-R(서열번호 59)을 프라이머로 이용해서 Sc-gpd1을 PCR 증폭하고, Sc-gpp2-F(서열번호 22)와 Sc-gpp2-R(서열번호 23)을 프라이머로 이용해서 Sc-gpp2을 PCR 증폭해서, 전자는 BamHI과 PstI 제한효소로, 후자는 PstI과 HindIII 제한효소로 절단해서 pMDT2 플라스미드의 해당 제한효소 부위로 도입해서 플라스미드 pMDT8를 구축했다. 배양은 재조합균주 DH-MDT2와 DH-MDT8을 글리세롤 대신에 포도당 1% (w/v)를 첨가한 2YT 복합배지에서 접종해서 48시간 동안 진행했다. 기타 배양 및 분석조건은 상기 실시 예와 동일하게 수행했다.
두 재조합 균주 중에서 유전자 Sc-gpd1과 Sc-gpp2가 발현된 DH-MDT8 균주에서만 아세틴 복합물이 생산되었고, 균체 증식 및 배양액의 pH는 유사했다.
<110> GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY OFFICE OF ACADEMY AND INDUSTRY COLLABORATION KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> A BIOLOGICAL METHOD FOR PREPARING ACETINS <130> 18P01058 <150> KR 10-2018-0129090 <151> 2018-10-26 <160> 86 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 183 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Ser Thr Glu Lys Glu Lys Met Ile Ala Gly Glu Leu Tyr Arg Ser 1 5 10 15 Ala Asp Glu Thr Leu Ser Arg Asp Arg Leu Arg Ala Arg Gln Leu Ile 20 25 30 His Arg Tyr Asn His Ser Leu Ala Glu Glu His Thr Leu Arg Gln Gln 35 40 45 Ile Leu Ala Asp Leu Phe Gly Gln Val Thr Glu Ala Tyr Ile Glu Pro 50 55 60 Thr Phe Arg Cys Asp Tyr Gly Tyr Asn Ile Phe Leu Gly Asn Asn Phe 65 70 75 80 Phe Ala Asn Phe Asp Cys Val Met Leu Asp Val Cys Pro Ile Arg Ile 85 90 95 Gly Asp Asn Cys Met Leu Ala Pro Gly Val His Ile Tyr Thr Ala Thr 100 105 110 His Pro Ile Asp Pro Val Ala Arg Asn Ser Gly Ala Glu Leu Gly Lys 115 120 125 Pro Val Thr Ile Gly Asn Asn Val Trp Ile Gly Gly Arg Ala Val Ile 130 135 140 Asn Pro Gly Val Thr Ile Gly Asp Asn Val Val Val Ala Ser Gly Ala 145 150 155 160 Val Val Thr Lys Asp Val Pro Asp Asn Val Val Val Gly Gly Asn Pro 165 170 175 Ala Arg Ile Ile Lys Lys Leu 180 <210> 2 <211> 185 <212> PRT <213> Staphylococcus carnosus <400> 2 Met Thr Thr Glu Lys Glu Lys Met Leu Ser Gly Gln Leu Tyr Asn Ser 1 5 10 15 Arg Asp Pro Gln Leu Val Lys Glu Arg His Lys Ala Arg His Ala Thr 20 25 30 Lys Ala Ile Asn Asn Ala Phe Ser Ile Lys Glu Arg His Phe Leu Leu 35 40 45 Arg Gln Ser Ile Gly His Cys Gly Asp Asn Val Phe Ile Glu Pro Asp 50 55 60 Ile His Phe Asp Tyr Gly Tyr Asn Ile Ser Leu Gly Asn His Phe Tyr 65 70 75 80 Ala Asn Phe Asn Pro Val Met Leu Asp Val Ala Pro Ile Thr Ile Gly 85 90 95 Asn His Val Leu Leu Gly Pro Asn Val Gln Leu Ile Thr Ala Thr His 100 105 110 Pro Leu Asn Pro Ala Glu Arg Ala Ser Gly Leu Glu Leu Ala Phe Pro 115 120 125 Ile Met Ile Gly Asp His Val Trp Ile Gly Ala Gly Ala Ile Val Leu 130 135 140 Pro Gly Val Thr Ile Gly Asp Asn Val Val Val Gly Ala Gly Ser Val 145 150 155 160 Val Thr Lys Asp Ile Pro Asp Asn Gln Val Val Ala Gly Asn Pro Ala 165 170 175 Arg Phe Ile Arg Glu Val Pro Leu Asp 180 185 <210> 3 <211> 184 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Halalkalicoccus jeotgali <400> 3 Met Thr Ser Glu Lys Glu Arg Met Leu Arg Gly Glu Pro Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Ser Asp Ser Glu Leu Val Ala Glu Arg Gln His Ala Arg Glu Leu Thr 20 25 30 Arg Lys Tyr Asn Arg Thr Thr Ala Thr Glu Ser Asp Arg Arg Glu Arg 35 40 45 Leu Leu Glu Glu Leu Phe Gly Ser Val Glu Asp Ala Thr Val Glu Pro 50 55 60 Pro Ile Arg Cys Asp Tyr Gly Tyr Asn Val His Val Gly Glu Asn Phe 65 70 75 80 Tyr Ala Asn Phe Asp Cys Val Ile Leu Asp Val Arg Arg Val Glu Phe 85 90 95 Gly Thr Arg Cys Leu Leu Gly Pro Gly Val His Val Tyr Thr Ala Thr 100 105 110 His Pro Leu Asp Ala Glu Glu Arg Ala Ala Gly Leu Glu Ser Gly Ala 115 120 125 Pro Val Thr Val Gly Asp Asp Val Trp Ile Gly Gly Arg Ala Val Leu 130 135 140 Asn Ser Gly Val Ser Val Gly Asp Gly Ser Val Ile Ala Ser Gly Ala 145 150 155 160 Val Val Thr Glu Asp Val 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putida <400> 6 Met Ser Leu Ser Glu Lys His Lys Met Leu Thr Gly Gln Leu Tyr His 1 5 10 15 Ala Gly Cys Pro Glu Leu Gln Ala Glu Gln Ile Ala Asn Lys His Trp 20 25 30 Met His Arg Tyr Asn Asn Ser Val Glu Leu Leu Asn Asp Ala Arg His 35 40 45 Gly Leu Leu Val Glu His Phe Gly Gln Val Gly Glu Gly Ala Val Ile 50 55 60 Arg Pro Pro Phe Tyr Cys Asp Tyr Gly Tyr Asn Ile Ser Val Gly Arg 65 70 75 80 Asn Thr Phe Met Asn Phe Asn Cys Val Ile Leu Asp Val Val Pro Val 85 90 95 Arg Ile Gly Asp Asp Cys Gln Ile Gly Pro Asn Val Gln Ile Tyr Thr 100 105 110 Ala Asp His Pro Leu Asp Pro Glu Val Arg Arg Ser Gly Leu Glu Ser 115 120 125 Gly Arg Thr Val Thr Ile Gly Asp Asn Val Trp Ile Gly Gly Ala Ala 130 135 140 Ile Ile Leu Pro Gly Val Thr Ile Gly Asp Asn Ala Ile Val Gly Ala 145 150 155 160 Gly Ser Val Val Thr Arg Asp Val Pro Ala Gly Ala Thr Val Val Gly 165 170 175 Asn Pro Ala Arg Val Arg Gln Pro Asp Gln Gly Gln 180 185 <210> 7 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pSTV28 VECTOR <400> 7 Met Glu Lys Lys 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<212> DNA <213> Staphylococcus carnosus <400> 17 atgaccaccg agaaggaaaa aatgctgagc ggtcagctgt acaacagccg tgacccgcaa 60 ctggttaagg agcgtcacaa agcgcgtcac gcgaccaagg cgatcaacaa cgcgttcagc 120 attaaaacgt cactttctgc tgcgtcagag catcggtcac tgcggcgaca acgtgttcat 180 cgagccggaa ttcacttcga ttacggttac aacattagcc tgggcaacca cttctatgcg 240 aactttaacc cgttagctgg atgtggcgcc gatcaccatt ggtaaccacg ttctgctggg 300 cccgaacgtg caactgatcc cgcgacccac ccgctgaacc cggcggagcg tgcgagcggt 360 ctggaactgg cgttcccgat catattggcg accacgtttg gattggtgcg ggtgcgattg 420 ttctgccggg tgtgaccatt gcgataactg gttgtgggtg cgggcagcgt tgtgaccaag 480 gacatcccgg ataaccaggt tgtgcgggca accggcgcgt tttattcgtg aagtgccgct 540 ggattaa 547 <210> 18 <211> 554 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Halalkalicoccus jeotgali <400> 18 atgaccagcg agaaggaacg tatgctgcgt ggtgagccgt acgacgcgag cgatagcgag 60 ctggttgcgg aacgtcagca cgcgcgtgaa ctgacccgta aatataaccg taccaccgcg 120 accgagagcg accgtcgtga acgtctgctg gaggaactgt tcggtagcgt ggaggacgcg 180 accgttgaac cgccgatccg ttgcgattac ggttataacg ttcacgttgg cgagaacttc 240 tacgcgaact ttgactgcgt tattctggat gtgcgtcgtg ttgaatttgg cacccgttgc 300 ctgctgggtc cgggtgttca cgtttatacc gcgacccacc cgctggatgc ggaggaacgt 360 gcggcgggtc tggagagcgg tgcgccggtg accgttggtg acgatgtgtg gatcggtggc 420 cgtgcggttc tgaacagcgg cgtgagcttg gtgacggcag cgtgattgcg agcggtgcgg 480 tggttaccga agatgttccg gcgggcgcgc tggttggtgg caacccggcg cgtgtgctga 540 aggacgttga ttaa 554 <210> 19 <211> 563 <212> DNA <213> Lactobacillus brevis <400> 19 atggacaaga gcgagaagga aaaaatgatc accggcgagc tgttcaacgt gtacgatccg 60 gagctgttgc ggaacgtggc gcggcgcgtc agcaagtgga ggcgctgaac gagctgggtg 120 aacaggaccc ggaaaagagc cagcaactgg ttaaacgtct gttcggcgcg accggtgacc 180 aagttgaggt tcacgcgacc tttcgttgcg attacggcta taacatctac gtgggtgaaa 240 acttctttgc gaactatgac tgcaccattc tggatgttgc gccgatccgt attggcaagc 300 actgcctgct gggtccgaaa gtgcagattt acagcgttaa ccatccggcg gagccggaac 360 tgcgtcgtaa cggcgcgatg ggcattggca agccggtgac cctgggtgac gatgtgtggg 420 ttggtggcgg tgcgatcatc tgtccgggtg tgaccctggg tgataacgtg atcgttgcgg 480 cgggcgcggt ggttaccaag agcttcggta gcaacgtggt tctgggcggt aacccggcgc 540 gtgtgattaa gccgctgaaa taa 563 <210> 20 <211> 554 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 20 atgctgcgta ccgagaagga aaaaatggcg gcgggtgagc tgtacaacag cgaagaccag 60 caactgctgc tggagcgtaa gcacgcgcgt cagctgatcc gtcaatataa cgaaaccccg 120 gaagacgatg cggtgcgtac caagctgctg aaagaactgc tgggtagcgt gggcgatcag 180 gttaccatcc tgccgacctt ccgttgcgac tacggttatc acatccacat tggcgatcac 240 accttcgtga actttgactg cgttattctg gatgtgtgcg aggttcgtat cggctgccac 300 tgcctgattg cgccgggtgt tcacatctac accgcgggcc acccgctgga cccgattgag 360 cgtaagagcg gtaaagaatt tggcaaaccg gtgaccattg gtgatcaggt ttggatcggt 420 ggccgtgcgg tgattaatcc gggtgtgacc atcggcgaca acgcggtgat tgcgagcggc 480 agcgtggtta ccaaggatgt tccggcgaac accgggttgg tggcaacccg gcgcgtattc 540 tgaaacaact gtaa 554 <210> 21 <211> 563 <212> DNA <213> Pseudomonas putida <400> 21 atgagcctga gcgagaagca caaaatgctg accggtcaac tgtatcatgc gggttgcccg 60 gagctgcaag cggaacaaat tgcgaacaag cactggatgc accgttataa caacagcgtg 120 gaactgtgaa cgacgcgcgt cacggtctgc tggttgagca cttcggccaa gtgggtgaag 180 gcgcggttat tcgtccgccg ttttactgcg actacggtta taacatcagc gtgggccgta 240 acaccttcat gaacttaact gcgtgatcct ggatgtggtt ccggttcgta tcggtgacga 300 ttgccagatt ggcccgaacg gcaaatctat accgcggacc acccgctgga cccggaagtg 360 cgtcgtagcg gtctggaaag cggccgtacc gtgaccattg gtgacaacgt ttggatcggt 420 ggcgcggcga tcattctgcc gggtgtgacc atcggcgaca acgcgattgt tggtgcgggc 480 agcgtggtta cccgtgatgt tccggcgggg cgaccgtggt tggtaacccg gcgcgtgttc 540 gtcagccgga tcagggtcaa taa 563 <210> 22 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sc-gpp2-F <400> 22 tgctgcagag gaggtaattt atatgggatt gactactaaa cctctatc 48 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sc-gpp2-R <400> 23 cccaagctta ccatttcaac agatcgtcc 29 <210> 24 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSTV28 VECTOR <400> 24 atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60 cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat 120 attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt 180 cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaatttc gtatggcaat gaaagacggt 240 gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa 300 acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat 360 tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag 420 aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg 480 gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc 540 gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatcatg ccgtctgtga tggcttccat 600 gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag tactgcgatg agtggcaggg cggggcgtaa 660 660 <210> 25 <211> 636 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 25 atggacttcc accagatcga cattgatcgt tggaaccgta agccgtactt tgagcactat 60 atcaaggggt aagtgcagct acagcgtgac cgcgaacctg aacgttaccg cgctgctgaa 120 cggcctgcta aaaaaacatg aagctgtacc cggcgttcat ctatatgatt agccgtgtgg 180 ttaacagcca 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cgtgaaaagt 360 accgtaacga tcacagctat tttccgaaag gttcatcgaa aacgtgtttt atgttagcgc 420 gaacccgtgg gttagcttca ccagcttcga ttttaacttc gcgagcgcga acaacttctt 480 tgcgccgctg tttaccgtgg gcaagtacta tagccaagcg ggtaaaaccc tggtgccgct 540 ggcggtgcaa gttcaccatg cggtttgcga tggttttcat gcggccgtct ggtgaccgag 600 ctgcaaaagc tgtgcgatga agcgggtggc taa 633 <210> 27 <211> 655 <212> DNA <213> Clostridium acetobutylicum <400> 27 atgaacagca acttccacgc gatcgacatg aacacctacc cgcgtgcgca cacctacaac 60 tattttacaa gaccgtgagc accctgatct atagcatcaa cattaccctg gatgttacca 120 ttctgcgtgc gacctgaaga acaaaggtct gaaattcttt ccggcgtacg tgtatctggt 180 tacccgtgcg atcggtcgca ccaggagttc ctgatggcga ttcaaaacga catgctgggc 240 tactgggatt gccgtacccc gtctatccga tctttcacga ggacgataag accattacct 300 ttctgtggac cgagtacaac gaagactcga ggtgttttac aagaactaca tcagcgatat 360 tcgtgaatac ggtaacaacc acggcatcat gcgagcaagg acgctccgcc gagcaacaac 420 tacatcatta gctgcattcc gtggttcagc tttaacacct gagcatgcag ctgcaaaacg 480 cgaaaaacta ctatgcgccg atcttcgaag cgggtcgttt taccgaaacc aacggcatca 540 ttaccctgcc gctgagcatc accgtgaacc acgcgaccgt tgacgctacc acattaagct 600 gctgctggat gagctgcaat ggagcatgag ccacccgaaa gagtggattc gttaa 655 <210> 28 <211> 680 <212> DNA <213> Mycobacterium abscessus <400> 28 atgccggcgg agcacgcgct gctggttgtg atggcgacct tcgaaccgct ggacctgcaa 60 caatgccgcg tcgtgagtgg tttgaacact acctggatcg ttgcccgacc tactatagca 120 tgaccgtgga ctggacatca ccaacctgcg tgcggcggtt gacgcgagcg gtcgtaagac 180 ctatccgacc cagattgggc gctggcgacc gtggttaacc gtcacccgga gttccgtatg 240 gcgctggacg atcaaggtat ccgggtgtgt gggacgtggt tgatccggcg ttcaccgttt 300 ttaacccgga ccgtgaaacc ttgcgggtat cagcgcgcgt tacaccccgg acttcgatgc 360 gtttcacagc gaggcggcgg aactgcgagc gaatatcgta acgcgagcac cctgttcccg 420 cagggcgcgc cgcgtccgcg taacgtgttg acatcagcag cattccgtgg acccgtttca 480 ccggttttac cctgaccatt gcgccgggtt ggggcacctg gcgccgatct tcaccattgg 540 taaattttac gagcaggaag gccgtaccat gatgccgcgg cgctgcaaat tcaccatgcg 600 gcggcggacg gctatcacag cgcgcgtctg gtggaggaac tcgtcaaatc attgcggacc 660 cggattgggt tcgtgattaa 680 <210> 29 <211> 663 <212> DNA <213> Lactobacillus brevis <400> 29 atgaccgagc tgaacaccca tgcgaccccg attgaccaga ccacctgggc gcgtcgtgaa 60 tacttcacta cttcaccaag atgatgccga ccggtttcac cctgaacgtg gacatggaca 120 tcaccgcgac caaagcgtgg ctgaccaagc acgatcgtaa attcaacccg gcgtacctgt 180 atctggttac caagctatta ccaaacaccc ggagtttcgt gtgggtcagg ttgacggcca 240 actggtggaa tacgatgttc tgcacccgag ctatagcacc tttcacggtg acgatctgac 300 cattagcaac ctgtggaccg cgtatacccg agcttcgagc agtttcacca aaactacctg 360 gcggaccagg cgacctatgg cgatcaacat accccgatgc cgaaggcgcc gcaaggtgcg 420 aacacctaca tgatcggcag cattccgtgg acccacttca acagctatac cccgctgccg 480 tttaccccgc tgaacacctt ctttccggtg atccaggcgg tcgtttcacc tttaaagatg 540 gccaatggct gatgccgctg agcttcacca ttcaccacgc ggtgcggacg gctaccacgt 600 tagccagttc tttaacgagc tgcaacgtgt ttttgatcac ccggaacttg gctgaccgcg 660 taa 663 <210> 30 <211> 960 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 30 atgaagccgg aaaacaaact acctgttctg gaccttattt ctgctgaaat gaagaccgtt 60 gtgaatactc ttcagccgga tttaccgccc tggcccgcaa cgggaacgat tgctgagcaa 120 cgacagtatt acacgcttga gcgccgattc tggaatgcgg gcgctccaga aatggcaacc 180 agagcttaca tggttccaac aaaatatggg caggtggaaa cacgtctctt ttgtccgcag 240 ccagatagcc cagcgacgct attttatttg catggaggcg gttttattct cggcaatctc 300 gatacccacg atcgcatcat gcgcctgctg gcaagctaca gccaatgtac ggtgattggt 360 attgattaca ccctttcacc tgaagcgcgt tttccgcaag cgatagagga aattgtggct 420 gcttgttgtt atttccacca gcaggcggag gattatcaaa tcaatatgtc ccgcattggc 480 tttgccggtg attccgcagg tgccatgctg gcgctcgcca gtgcgttgtg gttgcgtgat 540 aaacagatcg attgcggtaa agttgcgggc gttttgctgt ggtatgggct ttacggatta 600 cgggattccg tgactcgtcg tctgttgggc ggtgtctggg atggcttaac gcaacaggat 660 ttgcagatgt acgaagaggc atatttaagc aacgacgcgg accgcgagtc gccgtattac 720 tgtctgttta ataatgatct cactcgcgaa gttccgccct gttttattgc cggggcggag 780 ttcgatccgc tgctggatga cagccgtctg ctttaccaga cgttagcggc gcatcagcag 840 ccctgtgagt tcaaactcta cccaggcacg ctgcacgcct ttttgcatta ttcacggatg 900 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tgaagaacgt tgttgcctta ggttgtggtt tcgtcgaagg tctaggctgg 780 ggtaacaacg cttctgctgc catccaaaga gtcggtttgg gtgagatcat cagattcggt 840 caaatgtttt tcccagaatc tagagaagaa acatactacc aagagtctgc tggtgttgct 900 gatttgatca ccacctgcgc tggtggtaga aacgtcaagg ttgctaggct aatggctact 960 tctggtaagg acgcctggga atgtgaaaag gagttgttga atggccaatc cgctcaaggt 1020 ttaattacct gcaaagaagt tcacgaatgg ttggaaacat gtggctctgt cgaagacttc 1080 ccattatttg aagccgtata ccaaatcgtt tacaacaact acccaatgaa gaacctgccg 1140 gacatgattg aagaattaga tctacatgaa gattag 1176 <210> 32 <211> 753 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 32 atgggattga ctactaaacc tctatctttg aaagttaacg ccgctttgtt cgacgtcgac 60 ggtaccatta tcatctctca accagccatt gctgcattct ggagggattt cggtaaggac 120 aaaccttatt tcgatgctga acacgttatc caagtctcgc atggttggag aacgtttgat 180 gccattgcta agttcgctcc agactttgcc aatgaagagt atgttaacaa attagaagct 240 gaaattccgg tcaagtacgg tgaaaaatcc attgaagtcc caggtgcagt taagctgtgc 300 aacgctttga acgctctacc aaaagagaaa tgggctgtgg caacttccgg 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caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa 5100 ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt 5160 cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac 5220 ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta 5280 gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg 5340 cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgcca 5369 <210> 80 <211> 612 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 80 atgaacatgc caatgaccga aagaataaga gcaggcaagc tatttaccga tatgtgcgaa 60 ggcttaccgg aaaaaagact tcgtgggaaa acgttaatgt atgagtttaa tcactcgcat 120 ccatcagaag ttgaaaaaag agaaagcctg attaaagaaa tgtttgccac ggtaggggaa 180 aacgcctggg tagaaccgcc tgtctatttc tcttacggtt ccaacatcca tataggccgc 240 aatttttatg caaatttcaa tttaaccatt gtcgatgact acacggtaac aatcggtgat 300 aacgtactga ttgcacccaa cgttactctt tccgttacgg gacaccctgt acaccatgaa 360 ttgagaaaaa acggcgagat gtactctttt ccgataacga ttggcaataa cgtctggatc 420 ggaagtcatg tggttattaa tccaggcgtc accatcgggg ataattctgt tattggcgcg 480 ggtagtatcg tcacaaaaga cattccacca aacgtcgtgg cggctggcgt tccttgtcgg 540 gttattcgcg aaataaacga ccgggataag cactattatt tcaaagatta taaagttgaa 600 tcgtcagttt aa 612 <210> 81 <211> 822 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 81 atgtcgtgtg aagaactgga aattgtctgg aacaatatta aagccgaagc cagaacgctg 60 gcggactgtg agccaatgct ggccagtttt taccacgcga cgctactcaa gcacgaaaac 120 cttggcagtg cactgagcta catgctggcg aacaagctgt catcgccaat tatgcctgct 180 attgctatcc gtgaagtggt ggaagaagcc tacgccgctg acccggaaat gatcgcctct 240 gcggcctgtg atattcaggc ggtgcgtacc cgcgacccgg cagtcgataa atactcaacc 300 ccgttgttat acctgaaggg ttttcatgcc ttgcaggcct atcgcatcgg tcactggttg 360 tggaatcagg ggcgtcgcgc actggcaatc tttctgcaaa accaggtttc tgtgacgttc 420 caggtcgata ttcacccggc agcaaaaatt ggtcgcggta tcatgcttga ccacgcgaca 480 ggcatcgtcg ttggtgaaac ggcggtgatt gaaaacgacg tatcgattct gcaatctgtg 540 acgcttggcg gtacgggtaa atctggtggt gaccgtcacc cgaaaattcg tgaaggtgtg 600 atgattggcg cgggcgcgaa aatcctcggc aatattgaag ttgggcgcgg cgcgaagatt 660 ggcgcaggtt ccgtggtgct gcaaccggtg ccgccgcata ccaccgccgc tggcgttccg 720 gctcgtattg tcggtaaacc agacagcgat aagccatcaa tggatatgga ccagcatttc 780 aacggtatta accatacatt tgagtatggg gatgggatct aa 822 <210> 82 <211> 996 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 82 atgcagccca aaatttactg gattgataac ctgcgaggga tagcgtgttt aatggtggtg 60 atgattcaca ccactacctg gtatgtgacc aatgctcata gtgttagccc cgtcacatgg 120 gatatcgcca atgttctgaa ttctgcctct cgtgtcagcg tgccgctatt tttcatgatt 180 tccggctatc tcttttttgg cgaacgcagc gcccagccgc gccatttctt gcgtatcggc 240 ttatgtctga ttttttatag cgcaatcgca ctgctctaca ttgcgctgtt tacctccatc 300 aatatggagt tagcgctgaa aaacctgctg caaaagccag tgttttacca cttgtggttt 360 ttcttcgcga ttgcggtgat ttatctggtt tcaccgctga ttcaggtgaa gaacgtcggc 420 ggaaaaatgt tgctggtgct aatggcggtg attggcatta tcgctaaccc aaacacagtg 480 ccgcagaaaa ttgacggttt tgaatggctg ccaattaact tatatatcaa tggcgatact 540 ttttactaca ttctgtatgg catgttgggc cgcgctatag ggatgatgga cacacagcat 600 aaagcactgt cgtgggtgag cgccgcgctg tttgcgacgg gggtttttat tatctctcgc 660 gggacattat atgaattgca gtggcgcgga aattttgccg atacctggta tctttactgt 720 gggccgatgg tttttatctg cgcaatcgcg ctattgactc tggttaaaaa cacgctggat 780 acgcgtacca ttcgcggact tggcttaatc tcccgccatt cattgggtat atacggattc 840 cacgccttga ttatccatgc gctgcgcacc cggggaattg agcttaaaaa ttggccaata 900 ctggatatta tttggatctt ttgcgcgacg ttggcagcga gtttgttact ttctatgctg 960 gtacaacgaa tcgacagaaa cagattagtg agttaa 996 <210> 83 <211> 846 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 83 atgacgccca ttctgaatca ctattttgcc cgtattaact ggtcgggagc tgctgcggtc 60 aatattgata cgcttcgtgc attgcacctg aaacacaatt gcaccattcc gtttgaaaac 120 ctcgacgttt tgctgccgag ggaaatacag cttgataatc aatcgccgga agagaaactg 180 gtgatagccc gtcgtggcgg ttactgtttt gagcagaatg gcgtgtttga gcgggtgtta 240 cgcgagctgg ggtttaacgt tcgcagcttg ttagggcgcg tagtgttatc aaatccgcca 300 gcattaccgc cgcgcaccca tcgtttgctg ttggtggaac tggaagagga aaaatggatt 360 gctgatgtcg gtttcggtgg gcagacgcta accgcgccga ttcgtttagt ttccgatctc 420 gtgcagacca cgccacacgg agagtatcgg ttgttgcagg agggtgatga ttgggtgttg 480 cagtttaatc atcatcagca ttggcagtcg atgtaccgtt ttgatctctg cgagcagcaa 540 caaagcgatt atgtgatggg caatttctgg tcggcgcact ggccgcagtc gcattttcgc 600 catcatttgc tgatgtgccg ccatttgccg gacggcggca agctgacact gaccaatttt 660 cattttaccc attatgaaaa tgggcacgcg gtggagcagc gaaatctacc ggatgtggcg 720 tcattatatg ctgtgatgca agaacagttt ggtctgggcg tggatgatgc gaaacatggc 780 tttaccgtgg atgagttagc gctggtgatg gcggcgtttg atacgcaccc ggaggcggga 840 aaataa 846 <210> 84 <211> 504 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 84 atgaataaca ttgcgccgca atcacctgta atgcgtcgcc tgacgctgca ggataatcct 60 gctatcgccc gcgtcattcg tcaggtatcc gccgaatacg gtcttaccgc tgataaaggc 120 tacaccgtcg ccgatccgaa tcttgacgag ctgtatcaag tatatagtca gcctggccat 180 gcatattggg tcgttgagta cgagggtgaa gtggtcggcg gcggtgggat agcgccatta 240 accgggagtg agtcggatat ttgcgaactg caaaagatgt attttcttcc ggctatccgc 300 ggcaaagggc tggcaaaaaa actggcctta atggcgatgg agcaggcgcg agagatgggt 360 ttcaaacgct gctatctgga aacgaccgct tttttaaagg aagccattgc gctttatgag 420 catttgggct ttgagcatat cgactatgcg cttggctgca cgggccatgt cgattgtgaa 480 gtgcggatgt tgcgcgaact ctaa 504 <210> 85 <211> 444 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 85 atggttatta gtattcgccg ctcacggcat gaggaagggg aggaactcgt tgcgatttgg 60 tgtcgttctg tcgatgccac tcacgatttt ctatcagcag agtatcggac cgagctggag 120 gacctagttc gttccttcct gccggaagcg ccgttgtggg tcgcggttaa tgagcgggat 180 cagccggttg gatttatgtt gctaagtggg cagcatatgg atgcgctgtt tatcgatcct 240 gatgtgcgcg gctgcggcgt aggtcgggtg ctggtggagc atgcgctctc gatggcaccg 300 gaactgacaa ccaacgttaa tgagcaaaat gagcaggcgg ttgggttcta taagaaggtg 360 ggttttaagg ttacgggacg ctctgaggtg gacgatttgg ggaaaccgta tccgttgctg 420 aatctggcgt atgtgggggc gtaa 444 <210> 86 <211> 990 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 86 atgagccagc ttccagggtt gtcacgggaa acaagagaga gtatcgctat gtatcacctt 60 cgggttccac aaacagaaga agaattagag cgttactatc agtttcgctg ggaaatgttg 120 cgtaagcccc tgcatcaacc aaaaggttcg gaacgcgacg cgtgggatgc gatggcgcat 180 caccagatgg tcgtcgacga gcagggtaat ctggtggcgg taggccgact gtatattaat 240 gccgacaatg aagcgtccat tcgctttatg gccgttcatc ccgacgtgca ggacaaaggg 300 ttaggcacgc tgatggcgat gaccctggag tcggtggcgc gtcaggaagg cgttaagcgc 360 gtgacctgta gcgcccgtga agacgcggtg gagtttttcg ccaagctggg gtttgttaat 420 cagggagaaa tcaccacgcc aaccaccacg ccgattcgcc attttttgat gattaagccc 480 gtcgccactc tggatgacat tctgcatcgc ggcgactggt gcgcgcagct gcaacaggcg 540 tggtacgaac atatcccgct tagtgaaaaa atgggcgtgc gcattcagca atataccggg 600 caaaaattta tcactaccat gccagaaacc ggcaatcaga atccgcacca tacgctgttt 660 gccgggagtt tattctcact ggcgacgctc actggttggg gacttatctg gctgatgctg 720 cgtgaacgcc acctcggcgg aacgattatt cttgcggatg cgcatatccg ctacagcaag 780 ccgattagcg gtaaacctca tgcggtagcc gacctcggtg ccttaagcgg cgatctcgac 840 cgtctggcgc gcggacgaaa agcacgggtg cagatgcagg tcgaaatctt tggcgacgag 900 acgccgggtg cagtgtttga aggcacgtat atcgttctgc ccgcgaagcc atttggcccg 960 tatgaagagg gcgggaacga agaagagtaa 990

Claims (28)

  1. 아세틸-CoA에서 O-아세틸을 글리세롤에 전이하는 제1 O-아세틸 전이효소(O-acetyl transferase) 존재 하에 아세틸-CoA와 글리세롤을 반응시켜 모노아세틴 또는 다이아세틴을 얻는 단계;를 포함하는 아세틴의 제조 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 말토오스 O-아세틸 전이효소인, 아세틴의 제조 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 70에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파르트산(ASP)이고, 위치 84에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴(ASN)이고, 위치 114에 상응하는 위치의 아미노산이 히스티딘(HIS)이고, 위치 126에 상응하는 위치의 아미노산이 글루탐산(GLU)인, 아세틴의 제조 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 15에 상응하는 위치의 아미노산이 티로신(TYR) 또는 페닐알라닌(PHE)이고, 위치 26에 상응하는 위치의 아미노산이 아르기닌(ARG) 또는 글루타민(GLN)이고, 위치 30에 상응하는 위치의 아미노산이 아르기닌(ARG) 또는 리신(LYS)이고, 위치 71에 상응하는 위치의 아미노산이 티로신(TYR)이고, 위치 82에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 티로신(TYR)인 아세틴의 제조 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 서열로 이루어진 것인, 아세틴의 제조 방법.
  6. 아세틸-CoA에서 O-아세틸을 다이아세틴에 전이하는 제2 O-아세틸 전이효소 존재 하에 다이아세틴을 아세틸-CoA와 반응시켜 트리아세틴을 얻는 단계;를 포함하는, 아세틴의 제조 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 제2 O-아세틸 전이효소는 서열번호 7의 아미노산 서열의 위치 31에 상응하는 위치의 아미노산이 시스테인(CYS) 또는 류신(LEU)이고, 위치 102에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 이소류신(ILE)이고, 위치 143에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 타이로신(TYR)이고, 위치 166에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 타이로신(TYR)이고, 위치 170에 상응하는 위치의 아미노산이 발린(VAL), 이소류신(ILE), 또는 류신(LEU)이고, 위치 193에 상응하는 위치의 아미노산이 히스티딘(HIS)인, 아세틴의 제조 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 제2 O-아세틸 전이효소는 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나의 서열로 이루어진 것인, 아세틴의 제조 방법.
  9. 아세틸-CoA에서 O-아세틸을 글리세롤에 전이하는 제1 O-아세틸 전이효소(O-acetyl transferase)를 코딩하는 유전자를 발현하는 미생물을 글리세롤을 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계;를 포함하는 아세틴의 제조 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 말토오스 O-아세틸 전이효소인, 아세틴의 제조 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 70에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파르트산(ASP)이고, 위치 84에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴(ASN)이고, 위치 114에 상응하는 위치의 아미노산이 히스티딘(HIS)이고, 위치 126에 상응하는 위치의 아미노산이 글루탐산(GLU)인, 아세틴의 제조 방법.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 15에 상응하는 위치의 아미노산이 티로신(TYR) 또는 페닐알라닌(PHE)이고, 위치 26에 상응하는 위치의 아미노산이 아르기닌(ARG) 또는 글루타민(GLN)이고, 위치 30에 상응하는 위치의 아미노산이 아르기닌(ARG) 또는 리신(LYS)이고, 위치 71에 상응하는 위치의 아미노산이 티로신(TYR)이고, 위치 82에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 티로신(TYR)인, 아세틴의 제조 방법.
  13. 청구항 9에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 16 내지 21의 서열 중 어느 하나의 서열로 이루어진 것인, 아세틴의 제조 방법.
  14. 아세틸-CoA에서 O-아세틸을 다이아세틴에 전이하는 제2 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자를 발현하는 미생물을 다이아세틴을 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 아세틴의 제조 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 제2 O-아세틸 전이효소는 서열번호 7의 아미노산 서열의 위치 31에 상응하는 위치의 아미노산이 시스테인(CYS) 또는 류신(LEU)이고, 위치 102에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 이소류신(ILE)이고, 위치 143에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 타이로신(TYR)이고, 위치 166에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 타이로신(TYR)이고, 위치 170에 상응하는 위치의 아미노산이 발린(VAL), 이소류신(ILE), 또는 류신(LEU)이고, 위치 193에 상응하는 위치의 아미노산이 히스티딘(HIS)인, 아세틴의 제조 방법.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 제2 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 24 내지 27 중 어느 하나의 서열로 이루어진 것인, 아세틴의 제조 방법.
  17. 청구항 9에 있어서, 상기 미생물은 아세틸에스테라제(acetylesterase)를 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실된 것인, 아세틴의 제조 방법.
  18. 청구항 9에 있어서, 상기 미생물은 글리세롤 3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase) 및 글리세롤 3-탈인산효소(DL-glycerol-3-phosphatase)를 코딩하는 유전자를 더 발현하고, 상기 배지는 포도당을 포함하는 것인, 아세틴의 제조 방법.
  19. 아세틸-CoA에서 O-아세틸을 글리세롤에 전이하는 제1 O-아세틸 전이효소(O-acetyl transferase)를 코딩하는 유전자를 발현하는 미생물을 포함하는 아세틴 제조용 조성물.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 말토오스 O-아세틸 전이효소인, 아세틴 제조용 조성물.
  21. 청구항 19에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 70에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파르트산(ASP)이고, 위치 84에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴(ASN)이고, 위치 114에 상응하는 위치의 아미노산이 히스티딘(HIS)이고, 위치 126에 상응하는 위치의 아미노산이 글루탐산(GLU)인, 아세틴 제조용 조성물.
  22. 청구항 19에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소는 서열번호 5의 아미노산 서열의 위치 15에 상응하는 위치의 아미노산이 티로신(TYR) 또는 페닐알라닌(PHE)이고, 위치 26에 상응하는 위치의 아미노산이 아르기닌(ARG) 또는 글루타민(GLN)이고, 위치 30에 상응하는 위치의 아미노산이 아르기닌(ARG) 또는 리신(LYS)이고, 위치 71에 상응하는 위치의 아미노산이 티로신(TYR)이고, 위치 82에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 티로신(TYR)인, 아세틴 제조용 조성물.
  23. 청구항 19에 있어서, 상기 제1 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 16 내지 21 중 어느 하나의 서열로 이루어진 것인, 아세틴 제조용 조성물.
  24. 아세틸-CoA에서 O-아세틸을 다이아세틴에 전이하는 제2 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자를 발현하는 미생물을 포함하는, 아세틴 제조용 조성물.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 제2 O-아세틸 전이효소는 서열번호 7의 아미노산 서열의 위치 31에 상응하는 위치의 아미노산이 시스테인(CYS) 또는 류신(LEU)이고, 위치 102에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 이소류신(ILE)이고, 위치 143에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 타이로신(TYR)이고, 위치 166에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌(PHE) 또는 타이로신(TYR)이고, 위치 170에 상응하는 위치의 아미노산이 발린(VAL), 이소류신(ILE), 또는 류신(LEU)이고, 위치 193에 상응하는 위치의 아미노산이 히스티딘(HIS)인, 아세틴 제조용 조성물.
  26. 청구항 24에 있어서, 상기 제2 O-아세틸 전이효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 24 내지 27 중 어느 하나의 서열로 이루어진 것인, 아세틴 제조용 조성물.
  27. 청구항 19에 있어서, 상기 미생물은 아세틸에스테라제(acetylesterase)를 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실된 것인, 아세틴 제조용 조성물.
  28. 청구항 19에 있어서, 상기 미생물은 글리세롤 3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase) 및 글리세롤 3-탈인산효소(DL-glycerol-3-phosphatase)를 코딩하는 유전자를 더 발현하는 것인, 아세틴 제조용 조성물.
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