CN112662697B - 一种莱茵衣藻tctn1表达质粒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种莱茵衣藻TCTN1表达质粒及其构建方法和应用，其核苷酸序列如SEQ ID.No.1所示；所述莱茵衣藻TCTN1表达质粒包括潮霉素B筛选基因、表达TCTN1基因的内源性启动子、TCTN1 gDNA、3’末端的3×HA标签和终止TCTN1转录的终止子rbcS2；其构建方法包括以下步骤：克隆莱茵衣藻TCTN1基因片段；构建含TCTN1片段的T载体质粒；获得末端磷酸化TCTN1片段；制备pHyg‑3HA载体；构建和验证pHyg‑TCTN1‑3HA质粒。本发明通过该衣藻TCTN1的表达质粒能够高效筛选稳定表达TCTN1‑HA融合蛋白的藻株，从而标记衣藻纤毛过渡区，了解过渡区的结构与复合体的功能。

Description

一种莱茵衣藻TCTN1表达质粒及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种莱茵衣藻TCTN1表达质粒及其构建方法和应用。

背景技术

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是单细胞真核生物，具有光合酵母的称号，同时也是模式生物之一。其生长条件简单、易于培养、培养成本低；细胞周期短、繁殖力强；衣藻的全基因组测序已完成，cDNA文库已建立；它有纤毛，其纤毛结构成分和高等动物有很大相似性，纤毛同步化组装、易于观察、分离、提取和纯化；衣藻的转基因方法成熟。因此，衣藻作为纤毛疾病研究、植物光合作用、生物油脂代谢机制的研究模型广泛应用于分子生物学领域。

TCTN1基因属于Tectonic蛋白的基因家族，其对应蛋白是膜结合蛋白，是纤毛过渡区的组成成分。已有研究表明，TCTN家族在哺乳动物内与其他已知纤毛过渡区蛋白形成一个巨大的复合体蛋白，它作为门控分子的一部分，影响着纤毛内蛋白的组分以及Shh信号等信号通路。它与纤毛疾病相关，已有研究表明它的突变会导致Joubert Syndrome、Meckel-Gruber Syndrome等多种综合征，影响神经、呼吸等多器官多系统的正常发育。然而其背后的致病分子机理了解的并不多，影响了其药物的研发与治疗方案的制定。

以衣藻为模式生物研究纤毛疾病的分子机理是纤毛研究的方向之一。该研究首先要确定目标基因与纤毛相关表型的关联性，需要通过基因互补回复表型。该TCTN1表达质粒能通过转化衣藻进而筛选获得表达TCTN1-HA融合蛋白的藻株，可用于TCTN1基因对应突变体的功能与分子机制的研究。而TCTN1定位于纤毛过渡区，因此该表达质粒可以作为纤毛过渡区的分子标记。另外，目前针对于衣藻的TCTN1没有商业化抗体，所以利用该TCTN1基因表达质粒所带有的3×HA标签可进行免疫印迹、免疫荧光、免疫共沉淀、免疫金颗粒等相关分析，最终获悉TCTN1的作用机制、相互作用蛋白、衣藻纤毛过渡区的结构与复合体的功能等。

因此，寻求一种莱茵衣藻TCTN1表达质粒及其构建方法显得尤为重要。

发明内容

本发明提供一种莱茵衣藻TCTN1表达质粒及其构建方法和应用，通过该衣藻TCTN1的表达质粒能够高效筛选稳定表达TCTN1-HA融合蛋白的藻株，从而标记衣藻纤毛过渡区，了解过渡区的结构与复合体的功能。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种莱茵衣藻TCTN1表达质粒，所述莱茵衣藻TCTN1表达质粒包括潮霉素B筛选基因、表达TCTN1基因的内源性启动子、TCTN1gDNA、3’末端的3×HA标签和终止TCTN1转录的终止子rbcS2；其中，潮霉素B筛选基因的核苷酸序列如SEQ ID.No.11所示，表达TCTN1基因的内源性启动子的核苷酸序列如SEQID.No.12所示，TCTN1gDNA的核苷酸序列如SEQ ID.No.13所示，3’末端的3×HA标签的核苷酸序列如SEQ ID.No.14所示，终止子rbcS2的核苷酸序列如SEQ ID.No.15所示，所述莱茵衣藻TCTN1表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID.No.1所示。

本发明还提供了一种莱茵衣藻TCTN1表达质粒的构建方法，包括以下步骤：

(1)克隆莱茵衣藻TCTN1基因片段：提取野生型莱茵衣藻21gr基因组，设计上游嵌套引物F₁和F₂，下游嵌套引物R，引物F₁、F₂、和R分别具有SEQ ID.No.2、SEQ ID.No.3和SEQID.No.4碱基序列，进行PCR扩增得到TCTN1基因片段的扩增产物，该扩增产物包括TCTN1内源性启动子和TCTN1 gDNA；对扩增产物进行电泳分析、纯化回收、检测DNA浓度后待用；

(2)构建含TCTN1片段的T载体质粒：在步骤(1)获得的TCTN1基因片段末端加A后与T-VectorpMD19相连接，并通过通用引物M13+与M13-，以及设计的引物S1、S2、S3、R1测序验证其正确性得到含TCTN1片段的T载体质粒；引物R1、S1、S2、S3分别具有SEQ ID.No.5、SEQID.No.6、SEQ ID.No.7和SEQ ID.No.8碱基序列；通用引物M13+与M13-分别具有SEQID.No.9、SEQ ID.No.10碱基序列；

(3)获得末端磷酸化的TCTN1片段：对步骤(2)获得的含TCTN1片段的T载体质粒用限制性内切酶EcoRV进行酶切处理，得到末端磷酸化的TCTN1片段；

(4)预处理pHyg-3HA载体：利用限制性内切酶EcoRV对已有衣藻蛋白表达载体pHyg-3HA进行酶切处理，获得长度为4777bp的线性化片段，然后进行去磷酸化处理，测定浓度后待用；

(5)构建pHyg-TCTN1-3HA表达质粒：将末端磷酸化的TCTN1片段与步骤(4)预处理后的pHyg-3HA载体相连，获得衣藻外源基因TCTN1表达质粒pHyg-TCTN1-3HA，全长为10547bp；

(6)验证pHyg-TCTN1-3HA表达质粒：将构建的pHyg-TCTN1-3HA表达质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态中，获得阳性克隆后挑取进行摇菌培养，试剂盒提取质粒，测定质粒浓度后用HindIII进行酶切处理；当酶切处理后出现五条片段10bp、1260bp、2958bp、1729bp、4590bp，则表明TCTN1成功正向连接pHyg-3HA载体，pHyg-TCTN1-3HA质粒构建成功。

优选的，所述步骤(1)中PCR体系及程序为：

优选的，所述步骤(1)中电泳分析是利用1％琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，纯化回收是使用胶回收试剂盒纯化。

优选的，所述步骤(6)中采用热激法将构建的pHyg-TCTN1-3HA质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态中。

本发明还提供一种莱茵衣藻TCTN1表达质粒在标记衣藻纤毛基部过渡区中的应用，筛选获得表达衣藻过渡区蛋白TCTN1的转化藻株，转化藻株稳定表达TCTN1-HA融合蛋白，TCTN1-HA融合蛋白标记衣藻纤毛基部过渡区；所述筛选过程包括配制TAP液体培养基；Hyg⁺抗性筛选平板；限制性内切酶NdeI酶切后获得pHyg-TCTN1-3HA线性化片段；培养待转化的衣藻细胞；收集细胞和方波电击转化；转化子筛选与鉴定。

与现有技术相比，本发明成功构建了衣藻纤毛过渡区基因TCTN1表达质粒pHyg-TCTN1-3HA，将该表达质粒转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α后进行菌液培养、提质粒，利用限制性内切酶NdeI将该质粒酶切获得线性化片段，然后通过方波电击法转化插入实验藻株，该方法通过抗性基因Hyg⁺和蛋白检测标签3×HA能够高效筛选表达衣藻过渡区基因TCTN1的转化株，而且该外源基因能稳定遗传并表达TCTN1-HA融合蛋白，进而标记衣藻纤毛基部过渡区，有利于研究纤毛过渡区的结构、MKS等复合体的功能、蛋白相互作用等。

附图说明

图1是克隆的衣藻纤毛过渡区基因TCTN1 gDNA的1％琼脂糖凝胶电泳图；

图2是制备的线性化pHyg-3HA载体(4777bp)的1％琼脂糖凝胶电泳图；

图3是HindIII酶切检测TCTN1是否与pHyg-3HA载体连接成功的1％琼脂糖凝胶电泳图；图中箭头指的是正连酶切后应有的特异性条带；

以上图中，marker为已知分子量的DNA片段，从上到下依次为8000bp、5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；

图4是莱茵衣藻TCTN1表达质粒pHyg-TCTN1-3HA序列结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。下述方法中，若无特殊说明，则为常规方法。

一种莱茵衣藻TCTN1表达质粒，所述莱茵衣藻TCTN1表达质粒包括潮霉素B筛选基因、表达TCTN1基因的内源性启动子、TCTN1 gDNA、3’末端的3×HA标签和终止TCTN1转录的终止子rbcS2；其中，潮霉素B筛选基因的核苷酸序列如SEQ ID.No.11所示，表达TCTN1基因的内源性启动子的核苷酸序列如SEQ ID.No.12所示，TCTN1 gDNA的核苷酸序列如SEQID.No.13所示，3’末端的3×HA标签的核苷酸序列如SEQ ID.No.14所示，终止子rbcS2的核苷酸序列如SEQ ID.No.15所示，所述莱茵衣藻TCTN1表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID.No.1所示。

一种莱茵衣藻TCTN1表达质粒的构建方法，包括以下步骤：

(1)克隆莱茵衣藻TCTN1基因片段：提取野生型莱茵衣藻21gr基因组，设计上游嵌套引物F₁和F₂，下游嵌套引物R，上游设计两个嵌套引物是为了增强扩增能力确保TCTN1扩增成功；经实验发现引物对F1-R与F2-R均可扩增出目标产物，如图1所示，选择序列更长的DNA片段F1-R进行后续实验。上游嵌套引物位于TCTN1基因启动子上游，该扩增片段不包括终止密码子，因为该片段连接到pHyg-3HA载体时，TCTN1基因C端需要融合表达3×HA标签，标签后已包含终止密码子；引物F₁、F₂、和R分别具有SEQ ID.No.2、SEQ ID.No.3和SEQ ID.No.4碱基序列，进行PCR扩增得到TCTN1基因片段的扩增产物，该扩增产物包括TCTN1内源性启动子和TCTN1 gDNA；对扩增产物利用1％琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，然后使用胶回收试剂盒纯化，检测DNA浓度后待用；

PCR体系及程序为：

(2)构建含TCTN1片段的T载体质粒：在步骤(1)获得的TCTN1基因片段末端加A后与T-VectorpMD19相连接，并通过通用引物M13+与M13-，以及设计的引物S1、S2、S3、R1测序验证其正确性得到含TCTN1片段的T载体质粒；引物R1、S1、S2、S3分别具有SEQ ID.No.5、SEQID.No.6、SEQ ID.No.7和SEQ ID.No.8碱基序列；通用引物M13+与M13-分别具有SEQID.No.9、SEQ ID.No.10碱基序列；

(3)获得末端磷酸化的TCTN1片段：对步骤(2)获得的含TCTN1片段的T载体质粒用限制性内切酶EcoRV进行酶切处理，得到末端磷酸化的TCTN1片段；

(4)预处理pHyg-3HA载体：利用限制性内切酶EcoRV对已有衣藻蛋白表达载体pHyg-3HA进行酶切处理，获得长度为4777bp的线性化片段，如图2所示，切胶回收后，进行去磷酸化处理，测定浓度后待用；

(5)构建pHyg-TCTN1-3HA表达质粒：将末端磷酸化的TCTN1片段与步骤(4)预处理后的pHyg-3HA载体相连，获得衣藻外源基因TCTN1表达质粒pHyg-TCTN1-3HA，全长为10547bp，如图4所示，其最终的序列结构示意图；

(6)验证pHyg-TCTN1-3HA表达质粒：因为EcoRV酶切的粘性末端是平口的，为了验证TCTN1是否是正向连接，采用热激法将构建的pHyg-TCTN1-3HA表达质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态中，获得阳性克隆后挑取进行摇菌培养，试剂盒提取质粒，测定质粒浓度后用HindIII进行酶切处理；如图3所示，当酶切处理后出现五条片段10bp、1260bp、2958bp、1729bp、4590bp，则表明TCTN1成功正向连接pHyg-3HA载体，pHyg-TCTN1-3HA质粒构建成功。用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，由于10bp太小应有四条带，正向连接与反向连接的区别主要看是否有2958bp这条片段。

一种莱茵衣藻TCTN1表达质粒在标记衣藻纤毛基部过渡区中的应用，应用过程为：筛选获得表达衣藻过渡区蛋白TCTN1的转化藻株，转化藻株稳定表达TCTN1-HA融合蛋白，TCTN1-HA融合蛋白标记衣藻纤毛基部过渡区；所述筛选过程包括配制TAP液体培养基；Hyg⁺抗性筛选平板；限制性内切酶NdeI酶切后获得pHyg-TCTN1-3HA线性化片段；培养待转化的衣藻细胞；收集细胞和方波电击转化；转化子筛选与鉴定；具体过程如下所示。

a.配制TAP液体培养基

TAP液体培养基配方：TAP盐溶液(NH₄Cl 15g/L,MgSO₄·7H₂O 4g/L,CaCl₂·2H₂O2g/L)25ml/L，磷酸盐溶液(K₂HPO₄288 g/L,KH₂PO₄144 g/L)0.375ml/L，Hutner微量元素(EDTA二钠盐50g/L,ZnSO₄·7H₂O 22g/L,H₃BO₃11.4 g/L,MnCl₂·4H₂O 5.06g/L,CoCl₂·6H₂O1.61g/L,CuSO₄·5H₂O 1.57g/L,(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1.1g/L,FeSO₄·7H₂O 4.99g/L，用KOH或者HCl调节pH至7.0)1ml/L，乙酸1ml/L，Tris 2.42g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min；

b.Hyg⁺抗性筛选平板

按以上TAP液体培养基配制后，再加入琼脂粉15g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min；冷却至55℃后在超净工作台向里加潮霉素B(Hyg⁺，50mg/ml的储液，2500×稀释)，使培养基中Hyg⁺最终浓度为20μg/ml，摇匀后倒平板备用；

c.制备pHyg-TCTN1-3HA线性化片段

将pHyg-TCTN1-3HA质粒用限制性内切酶NdeI进行酶切，获得线性化片段10547bp，用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，胶回收纯化后测浓度，待用。

d.培养待转化的衣藻细胞：在超净工作台中，用接种环挑取新鲜的实验藻株接种到灭过菌TAP液体培养基吹气瓶中，在23±0.5℃，8000Lx光强的条件下连续光照通气，培养3-4天至细胞浓度为1-2×10⁷个细胞/ml，进行细胞转接到新鲜的灭过菌的TAP液体吹气瓶中，浓度稀释成1×10⁶个细胞/ml，继续连续光照培养20h，使其终浓度达4×10⁶个细胞/ml，即可用来电击转化。

e.收集细胞和方波电击转化：

①电击杯处理：对0.4cm的电击杯进行预冷处理，在超净工作台中，每个电击杯用1ml的无水乙醇洗一遍，晾干，再用无菌的1×TAP+60mM山梨醇溶液洗一遍，晾干，放至-20℃预冷；

②细胞计数、收集与处理：在超净工作台中，对培养好的细胞取液体进行细胞计数，每个转化需要250μl浓度为1×10⁸个/ml的细胞液，计算所需体积进行离心2500rpm，3min；去上清，用预冷的无菌1×TAP+6mM山梨醇进行重悬，再离心2500rpm，3min；去上清，用预冷的无菌1×TAP+60mM山梨醇重悬至转化体积，在冰上放置10min；

③方波电击转化：每个预冷的电击杯中加入250μl的1×10⁸个/ml藻液和约500ng的pHyg-TCTN1-3HA线性化片段，混匀后迅速转移至冰上，使用BTX ECM830电击仪，设置参数为500V、4ms、6波段、电击间隔时间为100ms，电击完毕后迅速冰上放置10min。然后将电击结束的细胞分别转移至含有10ml无菌的1×TAP+60mM山梨醇溶液的标记好的50ml灭菌离心管中，在23±0.5℃、弱光、摇床慢速过夜恢复12-16h；

④涂板

提前配制20％淀粉溶液，将其用水乙醇洗一遍，1000rpm离心2min；去上清，蒸馏水洗两次，每次1000rpm离心2min；去上清，70％乙醇定体积后室温放置。在超净工作台中混匀，按照每个转化需要2ml量取所需体积，1000rpm离心1min；用TAP洗两次，每次1000rpm离心1min；去上清，无菌的1×TAP+60mM山梨醇溶液洗一次，1000rpm离心1min；用无菌的1×TAP+60mM山梨醇重悬至相应体积，加入无菌的20％PEG 6000使最终浓度为0.4％。过夜恢复后的细胞2500rpm离心3min，去上清，每管加入2ml上述制备好的20％淀粉溶液重悬混匀，每个Hyg⁺抗性筛选平板加入1ml混匀液，摇晃使其均匀涂布，标记晾干后用封口膜封口，倒置于光照培养箱，23±0.5℃、14/10小时明暗光周期、8000Lx条件下培养4-7天。

f.转化子筛选与鉴定

在超净工作台中挑取Hyg⁺抗性筛选平板上长出的转化子，涂抹在画方块格并标记好的TAP平板上，倒置于光照培养箱，23±0.5℃、14/10小时明暗光周期、8000Lx条件下培养3-4天。然后在超净台向24孔板中每个孔加入1.5ml液体TAP，做好标记，挑取藻进相对应的孔中，封口置于光照培养箱，23±0.5℃、14/10小时明暗光周期、8000Lx条件下摇床培养2-3天。收集细胞，将每个转化藻株细胞离心收集，每个1.5ml EP管1×10⁷个细胞，置于-80℃冻存。使用Western Blot方法进行进一步的鉴定，将冻存样品处理制样进行蛋白电泳、转膜、封闭、一抗孵育(HA抗体)、洗膜、二抗孵育、洗膜、显色，成功转化的样品应该在95kD左右。

通过以上步骤，可以高效筛选获得表达衣藻过渡区蛋白TCTN1的藻株，该藻株表达了TCTN1-HA融合蛋白，即可以作为过渡区的标记，也可以进一步研究过渡区的结构与复合体的功能等。

序列表

<110> 江苏师范大学

<120> 一种莱茵衣藻TCTN1表达质粒及其构建方法和应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10547

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequens)

<400> 1

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

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tacgtcacct gccagcgcga cctgagcgcc ctggacctgg ccagcgcctg cagctcggcc 3600

ggctcaggcg gcgtgctgac gccgcagtac tacagcaaca tgcgcttcat caccgggcgg 3660

gggaccggct tcgcgccgca ggctcccgtc actgtggcca tcaaggtaag catgtggcct 3720

gtgtaagggg catctgaagc atagccgcgg caaacttgct atacaccagc gttcagtccg 3780

tgccttcagc cgtcgaccta atgaccgctg attccccttg tgcgtggcct gtccctggcc 3840

gcagtatctg aaccccgcca caggcaacct gacgtctgtg aacaacaccg tcagcaccta 3900

taacgccacc acgggcatgt gcaccaacgt gatcaccgac ctgaacatca ccatgtatta 3960

ctcgctgtct aaccctgacg catcagacac gcccggatac atcgatgcgg tgcgtcgtgc 4020

gtcatactcg gcgctggggt cggcaaccgg gttagcatta tttgcacagc acggtggatt 4080

tgtgcacaca cagcgaaaag tcgagacgcc agtttggggt ctcctttcat tctgtgacct 4140

tgagctgggc gactctgcac ccagggtaat cttggcattg accggcccat tacattcccc 4200

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gcagaacgtg cgtgtgagct ggatggagac gcaggtgccc cagcccattg aggtcatcgt 4320

cagcggcaac cccggctacg tcaccggttt cccattgttg gtgagcgggc agtccgatct 4380

atttgccggg tccactaggg cgcggtttag gctaacacgc actcaccatt ccccaacagc 4440

agtcgtccca tgtgctgttg ccagccagcc accaatggcg gtcggtgcct caaggtcaat 4500

cagcgaggcc accacaccgt cacgccgcca atgggcgctc aaatcaacct cccctggggc 4560

tattatatcg cacccgttga caggcgggcg tccttgcgag cactgtagac gcgacgacgg 4620

gcgacaccaa gcaggccgtc agccggtttg ttgagggcat gccgattccg gtgcctggac 4680

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ccaagtacgt gcaaacggtg atttcgtccg tctaccagag cattgtcgac aacaagttgt 4980

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ccggttctgt ccccgctgtg agcagctggc gaccaggcgg cagtgttgtt cctcttgtag 5520

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actgctctca agtgctgaag cggtagctta gctccccgtt tcgtgctgat cagtcttttt 6300

caacacgtaa aaagcggagg agttttgcaa ttttgttggt tgtaacgatc ctccgttgat 6360

tttggcctct ttctccatgg gcgggctggg cgtatttgaa gcgggtacca tcaagcttct 6420

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tatagcgagc taccaaagcc atattcaaac acctagatca ctaccacttc tacacaggcc 6660

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tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt 9660

taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa 9720

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 9780

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 9840

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 9900

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 9960

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 10020

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 10080

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ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 10320

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 10380

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agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaaga 10547

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequens)

<400> 2

acaatgtccg acaccactc 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequens)

<400> 3

atgcccagga tgggcacatc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequens)

<400> 4

ttacgcacgc gcacggaatg 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequens)

<400> 5

accgcatcga tgtatccg 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequens)

<400> 6

ctactacgtc acctgccag 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequens)

<400> 7

caattgccag tcattatc 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequens)

<400> 8

atcgcacccg ttgacagg 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequens)

<400> 9

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequens)

<400> 10

caggaaacag ctatgacc 18

<210> 11

<211> 1705

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequens)

<400> 11

ctttcttgcg ctatgacact tccagcaaaa ggtagggcgg gctgcgagac ggcttcccgg 60

cgctgcatgc aacaccgatg atgcttcgac cccccgaagc tccttcgggg ctgcatgggc 120

gctccgatgc cgctccaggg cgagcgctgt ttaaatagcc aggcccccga ttgcaaagac 180

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caacccgcaa acatgacaca agaatccctg ttacttctcg accgtattga ttcggatgat 360

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<400> 12

acaatgtccg acaccactct gtccaaaaga gcacgcgcag ttagtatcca acgcagttca 60

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tgcctctggc tccatcgctg ctccttccgt cccagcctcc tccccagcgc cattgctgca 480

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ggagaatgtg agcgtggcac gccgagcaag gtgcccaggg cgtggcggcg ttgcacgctc 2340

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tggaataggt tatatgtgta agaatcatag ttatcgatga gcaaagttcg catttttact 2520

cttagcttgt caagagctag cggcactgaa gtaaaagcct agtaagccat tcacgccatt 2580

cgtggcgcgg ctgtgccctt cattgtaaac aaccggcccg acctttatgt ttggactagt 2640

ccggcagtgc aattgaccac aagcacggct tacaggaatt attttggaac gaggctgcca 2700

tttttcaaac tgttatctca caaaacaccg tgtttccgcc ccgcgtaatg 2750

<210> 13

<211> 6074

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequens)

<400> 13

caattgccag tcattatcct gtagtcttta tctgtaaact ttgtaaagac cgtgcagacc 60

gaacagcctt aacttcgcca gaaccgcacg cggcgagctc ctgcattaca ttctaggcgt 120

tagaaagtaa ttagacgccc ttcgaggtac tggacaccat ccagcgcctt ggaacccgag 180

cagctgagga acaggcggga gctgcgggaa ctcgtcgcgc cgacgccttt cgctagcctg 240

ccattgcact cgttcgggcg actgcagctg gttaagcttc agtaagcttg ccaggatggg 300

cggcgtggca cgcaggtccc acccgcccag ccagacgggg caaggagggc accaaccacc 360

gcgactagcg ggcggtacct gggtgccctt gctgttggtg tccttcattg cggccgtggg 420

gcgcatgccc gcggtaacag gtcagcttac aacaatacca acatatccgg tggactggga 480

tgctgtgccc acgattccac caaccagcac caacctcacg gcgaactgca actgtgacct 540

ccggcaagag gcatgcgacc tggggtgctg ctgcgactcg atgtgccctg cggggctcag 600

cacgctcttt accgaccagg gcacgtgcct gccgcaaggg aacgagcagc agacgttgaa 660

gtattgcgtg ccctcgggct atgtacagaa ggtgcgaact gggctctgct tggcacacgc 720

tatacgagag aagaagagtg cctggcaaca aggccatgac gcgcttgttt gttcagcttg 780

tcacacgtgt ggtgcctcaa tcctggacac caacacggga cctgcggacc ccgacctcgc 840

gcaggtcaac ctgccgtcta gcagcgactt ctacgtcata gcgcagcagg cggcggaggt 900

caaattcttc tcgcagctgc tgtgcatcgt ggacgacagc aaccccaacc tgggagcgaa 960

ctatcccggt gcgtctcttg ccaaaaaaca cgtggtgatt gctgctttat cagggctgcg 1020

ccgctcgact gcgggcgcgc tggggcacgg gtcgggtgcg ctggccttgc cctgcccaca 1080

tcaaaaggtt tactcatccg cgccctcata tccccgcaca gacccgcccg ctgggcctgt 1140

gggcgacaac caggagctgg ctcagtgccc cgccgccgtg tcgcccccaa ccaagtccac 1200

cgactaccgc tacggcagca ccgtgtacct gcagtacagc ggcagcagca gcagcgtgcc 1260

caacggcact gcggggctgc aaccgctcac catccccttc cccgccttca cggggctgtg 1320

caacgacgag acggcagtgg gattcctggt cggcacgcct accggtagca aggtggggac 1380

cgatggggcg cgggagggtt cagcaggcga agggctggtt cgctgtggga gaccagctga 1440

agacaccgta aggagcctgc cattgcgggg gttggcatac catggcgggg gtggagcgcg 1500

ccatgcagaa aagcaacata acaactgaca ggcggtcaga ctgaagcttg gtcacattgg 1560

gcggcctctt cgacgctcac cctgtgcgca catcgcttcg ccgccctgct cctcggaccc 1620

cagaactact acgtcacctg ccagcgcgac ctgagcgccc tggacctggc cagcgcctgc 1680

agctcggccg gctcaggcgg cgtgctgacg ccgcagtact acagcaacat gcgcttcatc 1740

accgggcggg ggaccggctt cgcgccgcag gctcccgtca ctgtggccat caaggtaagc 1800

atgtggcctg tgtaaggggc atctgaagca tagccgcggc aaacttgcta tacaccagcg 1860

ttcagtccgt gccttcagcc gtcgacctaa tgaccgctga ttccccttgt gcgtggcctg 1920

tccctggccg cagtatctga accccgccac aggcaacctg acgtctgtga acaacaccgt 1980

caattgccag tcattatcct gtagtcttta tctgtaaact ttgtaaagac cgtgcagacc 2040

gaacagcctt aacttcgcca gaaccgcacg cggcgagctc ctgcattaca ttctaggcgt 2100

tagaaagtaa ttagacgccc ttcgaggtac tggacaccat ccagcgcctt ggaacccgag 2160

cagctgagga acaggcggga gctgcgggaa ctcgtcgcgc cgacgccttt cgctagcctg 2220

ccattgcact cgttcgggcg actgcagctg gttaagcttc agtaagcttg ccaggatggg 2280

cggcgtggca cgcaggtccc acccgcccag ccagacgggg caaggagggc accaaccacc 2340

gcgactagcg ggcggtacct gggtgccctt gctgttggtg tccttcattg cggccgtggg 2400

gcgcatgccc gcggtaacag gtcagcttac aacaatacca acatatccgg tggactggga 2460

tgctgtgccc acgattccac caaccagcac caacctcacg gcgaactgca actgtgacct 2520

ccggcaagag gcatgcgacc tggggtgctg ctgcgactcg atgtgccctg cggggctcag 2580

cacgctcttt accgaccagg gcacgtgcct gccgcaaggg aacgagcagc agacgttgaa 2640

gtattgcgtg ccctcgggct atgtacagaa ggtgcgaact gggctctgct tggcacacgc 2700

tatacgagag aagaagagtg cctggcaaca aggccatgac gcgcttgttt gttcagcttg 2760

tcacacgtgt ggtgcctcaa tcctggacac caacacggga cctgcggacc ccgacctcgc 2820

gcaggtcaac ctgccgtcta gcagcgactt ctacgtcata gcgcagcagg cggcggaggt 2880

caaattcttc tcgcagctgc tgtgcatcgt ggacgacagc aaccccaacc tgggagcgaa 2940

ctatcccggt gcgtctcttg ccaaaaaaca cgtggtgatt gctgctttat cagggctgcg 3000

ccgctcgact gcgggcgcgc tggggcacgg gtcgggtgcg ctggccttgc cctgcccaca 3060

tcaaaaggtt tactcatccg cgccctcata tccccgcaca gacccgcccg ctgggcctgt 3120

gggcgacaac caggagctgg ctcagtgccc cgccgccgtg tcgcccccaa ccaagtccac 3180

cgactaccgc tacggcagca ccgtgtacct gcagtacagc ggcagcagca gcagcgtgcc 3240

caacggcact gcggggctgc aaccgctcac catccccttc cccgccttca cggggctgtg 3300

caacgacgag acggcagtgg gattcctggt cggcacgcct accggtagca aggtggggac 3360

cgatggggcg cgggagggtt cagcaggcga agggctggtt cgctgtggga gaccagctga 3420

agacaccgta aggagcctgc cattgcgggg gttggcatac catggcgggg gtggagcgcg 3480

ccatgcagaa aagcaacata acaactgaca ggcggtcaga ctgaagcttg gtcacattgg 3540

gcggcctctt cgacgctcac cctgtgcgca catcgcttcg ccgccctgct cctcggaccc 3600

cagaactact acgtcacctg ccagcgcgac ctgagcgccc tggacctggc cagcgcctgc 3660

agctcggccg gctcaggcgg cgtgctgacg ccgcagtact acagcaacat gcgcttcatc 3720

accgggcggg ggaccggctt cgcgccgcag gctcccgtca ctgtggccat caaggtaagc 3780

atgtggcctg tgtaaggggc atctgaagca tagccgcggc aaacttgcta tacaccagcg 3840

ttcagtccgt gccttcagcc gtcgacctaa tgaccgctga ttccccttgt gcgtggcctg 3900

tccctggccg cagtatctga accccgccac aggcaacctg acgtctgtga acaacaccgt 3960

cagcacctat aacgccacca cgggcatgtg caccaacgtg atcaccgacc tgaacatcac 4020

catgtattac tcgctgtcta accctgacgc atcagacacg cccggataca tcgatgcggt 4080

gcgtcgtgcg tcatactcgg cgctggggtc ggcaaccggg ttagcattat ttgcacagca 4140

cggtggattt gtgcacacac agcgaaaagt cgagacgcca gtttggggtc tcctttcatt 4200

ctgtgacctt gagctgggcg actctgcacc cagggtaatc ttggcattga ccggcccatt 4260

acattcccca taacagatgg agctgacgtt cgttataacg gacgttctgg cagcgcggtc 4320

gccgctgttg cagaacgtgc gtgtgagctg gatggagacg caggtgcccc agcccattga 4380

ggtcatcgtc agcggcaacc ccggctacgt caccggtttc ccattgttgg tgagcgggca 4440

gtccgatcta tttgccgggt ccactagggc gcggtttagg ctaacacgca ctcaccattc 4500

cccaacagca gtcgtcccat gtgctgttgc cagccagcca ccaatggcgg tcggtgcctc 4560

aaggtcaatc agcgaggcca ccacaccgtc acgccgccaa tgggcgctca aatcaacctc 4620

ccctggggct attatatcgc acccgttgac aggcgggcgt ccttgcgagc actgtagacg 4680

cgacgacggg cgacaccaag caggccgtca gccggtttgt tgagggcatg ccgattccgg 4740

tgcctggaca tgccggcgcg tgcgagccca cctccattgg caacgtggca tacggcgcca 4800

acatcaccag cacttgcagc atcagcctca ccgcgaacca gctgcgtgac ttttgcacgt 4860

gagtggtgat ggcggtgcga agctagcacg cggcatgggg ctggggaaca aagtggatgt 4920

gcctggagga atggccgtga ccacgtgctg ccgtgtcttg ttgttacagg ttggaaggca 4980

ccaaccccgc caagtacgtg caaacggtga tttcgtccgt ctaccagagc attgtcgaca 5040

acaagttgta tgtgggcgag tggggcgacg ccaactacac caacaccaac gagtggctta 5100

aggtgcgcgg ccgtggcgct ctggaagtaa caacctggca aagcggaggg caggaagtag 5160

aagcgtagtt gaacgggtat gacacattgt ctgcatcttt tttgagtgca cagggcgttg 5220

ccgcgttgta atgtcgtcca cgttgagtct cattcaatcc gggatttggg aacgactacg 5280

gcatgctgct ttacagtgaa acctgactgc cctgctctcg ttccgccgct gccaacccaa 5340

ccggccggaa tgctgcgcgc gcaggtgtct gtgtccggct acccatttgg caacctaggc 5400

tacacgtccg ccgacaacgc ctgcactggc gtcatcatcg gctttgacct gcagatagtc 5460

accggcgtgg cctttgcctc caataacctg cagcagaagg cgagtacagc gcttgagggc 5520

cgctactgcc cggttctgtc cccgctgtga gcagctggcg accaggcggc agtgttgttc 5580

ctcttgtagc agcttcaagc cacgcccatg cgtcaagttt gaaagcggcc agctcaacgc 5640

ccatgcgtca agtttgaaag cggccagctc acctgcacct gtcccccgca cccattgggg 5700

cttggcagtg actaccactc cttgtcccgc cccaccccac accaccgctg cccattaccg 5760

tacgcctgca ggtgctgtac gccaacctgt gcttcaagac gggcgtttgg gacttcccgg 5820

agtacctgcc cggcaacacc tcccgccgct tctacctgga cttctccacc agcttcatcc 5880

gcctgccgca gcagagcgag gaggtgacca agcccgcgcc gccgctggta gtgccgctgc 5940

ccgcagacat cttctacccc ttcgtggtga cggacggcgc ggcggtggac acgcggccgg 6000

ccgtgtgggg catgctgacg gcagcggcag cggctctgac actgctgcag cttttgccat 6060

tccgtgcgcg tgcg 6074

<210> 14

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequens)

<400> 14

tacccctacg acgtgcccga ctacgcctac ccctacgacg tgcccgacta cgccgatcga 60

tccggaccgt acccctacga cgtgcccgac tacgccgcta gcagtact 108

<210> 15

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequens)

<400> 15

tcgaggatcc ccgctccgtg taaatggagg cgctcgttga tctgagcctt gccccctgac 60

gaacggcggt ggatggaaga tactgctctc aagtgctgaa gcggtagctt agctccccgt 120

ttcgtgctga tcagtctttt tcaacacgta aaaagcggag gagttttgca attttgttgg 180

ttgtaacgat cctccgttga ttttggcctc tttctccatg ggcgggctgg gcgtatttga 240

agcgggtacc 250

Claims (6)

1.一种莱茵衣藻TCTN1表达质粒，其特征在于，所述莱茵衣藻TCTN1表达质粒包括潮霉素B筛选基因、表达TCTN1基因的内源性启动子、TCTN1gDNA、3’末端的3×HA标签和终止TCTN1转录的终止子rbcS2；其中，潮霉素B筛选基因的核苷酸序列如SEQ ID.No.11所示，表达TCTN1基因的内源性启动子的核苷酸序列如SEQ ID.No.12所示，TCTN1 gDNA的核苷酸序列如SEQID.No.13所示，3’末端的3×HA标签的核苷酸序列如SEQ ID.No.14所示，终止子rbcS2的核苷酸序列如SEQ ID.No.15所示，所述莱茵衣藻TCTN1表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID.No.1所示。

2.一种莱茵衣藻TCTN1表达质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)克隆莱茵衣藻TCTN1基因片段：提取野生型莱茵衣藻21gr基因组，设计上游嵌套引物F₁和F₂，下游嵌套引物R，引物F₁、F₂、和R分别具有SEQID.No.2、SEQ ID.No.3和SEQID.No.4碱基序列，进行PCR扩增得到TCTN1基因片段的扩增产物，该扩增产物包括TCTN1内源性启动子和TCTN1 gDNA；对扩增产物进行电泳分析、纯化回收、检测DNA浓度后待用；

(2)构建含TCTN1片段的T载体质粒：在步骤(1)获得的TCTN1基因片段末端加A后与T-Vector pMD19相连接，并通过通用引物M13+与M13-，以及设计的引物S1、S2、S3、R1测序验证其正确性得到含TCTN1片段的T载体质粒；引物R1、S1、S2、S3分别具有SEQ ID.No.5、SEQID.No.6、SEQ ID.No.7和SEQ ID.No.8碱基序列；通用引物M13+与M13-分别具有SEQID.No.9、SEQID.No.10碱基序列；

(3)获得末端磷酸化的TCTN1片段：对步骤(2)获得的含TCTN1片段的T载体质粒用限制性内切酶EcoRV进行酶切处理，得到末端磷酸化的TCTN1片段；

(4)预处理pHyg-3HA载体：利用限制性内切酶EcoRV对已有衣藻蛋白表达载体pHyg-3HA进行酶切处理，获得长度为4777bp的线性化片段，然后进行去磷酸化处理，测定浓度后待用；

(5)构建pHyg-TCTN1-3HA表达质粒：将末端磷酸化的TCTN1片段与步骤(4)预处理后的pHyg-3HA载体相连，获得衣藻外源基因TCTN1表达质粒pHyg-TCTN1-3HA，全长为10547bp；

(6)验证pHyg-TCTN1-3HA表达质粒：将构建的pHyg-TCTN1-3HA表达质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态中，获得阳性克隆后挑取进行摇菌培养，试剂盒提取质粒，测定质粒浓度后用HindIII进行酶切处理；当酶切处理后出现五条片段10bp、1260bp、2958bp、1729bp、4590bp，则表明TCTN1成功正向连接pHyg-3HA载体，pHyg-TCTN1-3HA质粒构建成功。

3.根据权利要求2所述的一种莱茵衣藻TCTN1表达质粒的构建方法，其特征在于，步骤(1)中PCR的体系及程序为：

4.根据权利要求2所述的一种莱茵衣藻TCTN1表达质粒的构建方法，其特征在于，所步骤(1)中电泳分析是利用1％琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，纯化回收是使用胶回收试剂盒纯化。

5.根据权利要求2所述的一种莱茵衣藻TCTN1表达质粒的构建方法，其特征在于，所述步骤(6)中将构建的pHyg-TCTN1-3HA质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态中是采用热激法。

6.根据权利要求1所述的一种莱茵衣藻TCTN1表达质粒在标记衣藻纤毛基部过渡区中的应用，其特征在于，筛选获得表达衣藻过渡区蛋白TCTN1的转化藻株，转化藻株稳定表达TCTN1-HA融合蛋白，TCTN1-HA融合蛋白标记衣藻纤毛基部过渡区；所述筛选过程包括配制TAP液体培养基；Hyg⁺抗性筛选平板；限制性内切酶NdeI酶切后获得pHyg-TCTN1-3HA线性化片段；培养待转化的衣藻细胞；收集细胞和方波电击转化；转化子筛选与鉴定。

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