JP6976860B2 - 誘導性共発現系における使用のためのベクター - Google Patents
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Description
本出願は、2012年8月5日出願の米国仮出願第61/679,751号、及び2012年12月29日出願の米国仮出願第61/747,246号の合衆国法典第35編119条(e)項に基づく優先権の利益を主張する、2013年8月5日出願の国際出願第PCT/US2013/053562号の合衆国法典第35編371条に基づく国内段階移行である、米国出願第14/419,653号の一部継続出願である、米国出願第14/740,475号の一部継続出願であり、これら全ての開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子的に提出された配列表を含み、この配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の誘導性共発現系は、2つ以上の発現コンストラクトを含む宿主細胞が関与し、発現コンストラクトは遺伝子産物の発現を指示する誘導性プロモーターを含み、宿主細胞は、遺伝子産物の均質的誘導性発現を可能とする変異した遺伝子機能を有する。図1は、本発明の誘導性共発現系の略図を示し、次の構成要素を有する:(1)宿主細胞、(2)宿主ゲノム(遺伝子変異を含む)、(3)遺伝子産物の発現を指示する誘導性プロモーターを含む発現ベクター「X」、(4)別の遺伝子産物の発現を指示する誘導性プロモーターを含む異なる発現ベクター「Y」、(5)発現の化学的誘導物質、及び(6)多量体共発現産物。図3は、図1に示すものに類似の略図を示し、誘導性プロモーター((3)及び(4))と、同じ発現ベクター上に存在する誘導性プロモーターによって発現される産物のためのコード配列とを有する。
多くの共発現用途での本発明の誘導性共発現系の利用、及び産物の特性においては、幅広い多用途性がある。
共発現を促進するための宿主細胞内へのゲノム変異の導入
上記のように、宿主細胞の遺伝子発現におけるある特定の変化は、所望の遺伝子産物(複数可)の共発現を向上し得る。ある特定の宿主細胞、大腸菌ASE(DGH)細胞を、大腸菌SHuffle(登録商標)Express細胞から導出した。それらの表現型は、大腸菌SHuffle(登録商標)Express ΔaraBAD Δsbm−ygfDGH ΔaraEp::J23104として表される。大腸菌ASE(DGH)細胞を以下の通りに産出した:欠失及び変異を、ゲノム配列をシームレスに取り除く、対抗選択による欠失として記載されるリコンビニアリング方法を用いて、Gene Bridges GmbH(Heidelberg,Germany)により、大腸菌SHuffle(登録商標)Express宿主細胞ゲノムにおいて作製した。宿主細胞のaraBADオペロンの欠失を作製して、宿主細胞によるアラビノース異化反応を低減することで、アラビノース誘導物質のより多くを、araBADプロモーターを含む発現コンストラクトから共発現される遺伝子産物を誘導するために利用できるようにした。この欠失は、いくつかのコドンのAraDコード領域以外の全てを通る天然のaraBADプロモーターのほとんどが除去されるように、大腸菌ゲノム(ゲノムヌクレオチド配列内の位置は、表1におけるように全て付与される)の70,135〜65,867(マイナス鎖)の位置に対応する、araBADオペロンの4269塩基対を除去する。欠失接合部(位置70,136|位置65,866)の周囲のヌクレオチド配列(マイナス鎖)は、TTAT|TACGである。別の欠失をsbm−ygfDGH(scpA−argK−scpBCとも呼ばれる)オペロン内で作製することで、2−メチルシトレートの生合成に関与する遺伝子の機能を排除し、外的に供給されたプロピオネートに対する宿主細胞のプロピオネート誘導性プロモーターの感受性を増加させた。sbm−ygfDGH欠失により5542塩基対(大腸菌ゲノムの位置3,058,754〜3,064,295)を除去することで、sbm−ygfDGHプロモーター、及びygfHコード配列の最後のコドン以外の全てのオペロンを取り出しながら、隣接するygfIコード配列及び停止コドンをそのまま残す。欠失接合部(位置3,058,753|位置3,064,296)の周囲のヌクレオチド配列(プラス鎖)は、ACAA|GGGTである。大腸菌SHuffle(登録商標)Express宿主細胞ゲノムにおいて作製したこれらの欠失に加えて、Gene Bridges GmbHは、位置3,472,574〜3,472,200のマイナス鎖上に延びる、ゲノムrpsL遺伝子コード配列における点突然変異を導入し、位置3,472,447でAをGに変更し、Lys43のコドンをArgのコドンに変化させ、突然変異体rpsL‐Arg43遺伝子が発現されるときにストレプトマイシン耐性表現型をもたらす。上記のようなより厳密な制御誘導性の発現を可能にする、宿主細胞ゲノムに対する別の変異は、アラビノースに対して応答性ではなくむしろ常時発現性であるaraEプロモーターを作製することである。CRP−cAMP及びAraC結合部位を含む、ほとんどの天然のaraEプロモーターを、97塩基対(位置2,980,335〜2,980,239(マイナス鎖))を欠失させ、その配列を常時発現性J23104プロモーターの35塩基対で置き換えることにより取り除いた(配列番号1;J23104のヌクレオチド配列は、partsregistry.orgのウェブサイト、parts.igem.org/Main_Pageから得た)。結果として得られた、変異araEプロモーター内の接合部部位配列は、TGAA|TTGA …TAGC | TTCAであった。
ΔaraBAD fhuA2[lon]ompT ahpCΔ gal λatt::pNEB3−r1−cDsbC(Spec,lacI)ΔtrxB sulA11 R(mcr−73::miniTn10−−TetS)2[dcm]R(zgb−210::Tn10−−TetS)ΔaraEp::J23104 ΔscpA−argK−scpBC endA1 rpsL−Arg43 Δgor Δ(mcrC−mrr)114::IS10
ΔaraBAD fhuA2 ΔprpD[lon] ompT ahpCΔ gal λatt::pNEB3−r1−cDsbC(Spec, lacI)ΔtrxB sulA11 R(mcr−73::miniTn10−−TetS)2[dcm] R(zgb−210::Tn10−−TetS)ΔaraEp::J23104 ΔscpA−argK−scpBC endA1 rpsL−Arg43 Δgor Δ(mcrC−mrr)114::IS10
誘導性プロモーターを含む発現ベクター
A.発現ベクターpPRO43
発現ベクターpPRO43(配列番号2)を、関心の遺伝子産物をプロピオネート誘導性prpBCDEプロモーターから発現させるために使用し、pPRO33発現ベクターのヌクレオチド配列を参照して構築した。Guzman et al.,“Tight regulation,modulation,and high−level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter” J Bacteriol 1995 Jul;177(14):4121−4130、及び米国特許第8178338B2号;May 15 2012;Keasling,Jayに記載されているように、pPRO33のヌクレオチド配列を、pBAD18ベクター(GenBank受入番号X81838.1)、prpR‐PprpB領域の大腸菌ゲノム配列、及びpBAD33ベクターの配列からコンパイルした。pPRO33ヌクレオチド配列をシーケンシングによって確認し、これを配列番号3に提供する。
発現ベクターpPRO430(配列番号4)を、pPRO43のヌクレオチド配列(配列番号2)に基づいてDNA2.0によって合成した。pPRO430ベクターは、ともに、p15複製起点、クロラムフェニコール(CmR)への耐性を授ける遺伝子、上記の大腸菌における発現のために最適化したprpRコード配列、及び中にコード配列を挿入することができる、プロピオネート誘導性prpBCDEプロモーターの下流にあるクローニング部位を含むという点で、pPRO43に類似している。pPRO430発現ベクターは、それがクローニング部位の上流に最適化されたRBS配列(AGGAGGAAAACATA(配列番号4のヌクレオチド3566〜3579))を有するという点で、pPRO43とは異なる。pPRO430発現ベクターはまた、一部のヌクレオチド配列の除去、及びより短いターミネーターの使用によって、pPRO43と比較して簡素化されており、その結果、pPRO430ヌクレオチド配列(配列番号4)は、pPRO43ヌクレオチド配列(配列番号2)の5883塩基と比較して、3698塩基しか有しない。pPRO430(CloDF13)発現ベクター(配列番号5)は、BfuAI制限部位に挟まれているpPRO430におけるp15複製起点が、pPRO430におけるよりコピー数の多いCloDF13複製起点(CloDF13)によって置き換えられることを除いて、pPRO430と同一である。
発現ベクターpBAD240(配列番号6)を、pBAD24(GenBank Database受入番号X81837.1(25−OCT−1995))のヌクレオチド配列に基づいてDNA2.0によって合成した。発現ベクターpBAD240は、中にコード配列を挿入することができるクローニング部位の上流にある最適化されたRBS配列(AGGAGGTAAAAA(配列番号6のヌクレオチド3125〜3136)を有することにおいてpBAD24とは異なる。pBAD240ヌクレオチド配列はまた、一部のヌクレオチド配列の除去、及びより短いターミネーターの使用によって、pBAD24と比較して簡素化されており、その結果、pBAD240ヌクレオチド配列(配列番号C)は、pBAD24ヌクレオチド配列の4542塩基と比較して、3255塩基しか有しない。pBAD240発現ベクターはまた、pBAD24のアンピシリン耐性遺伝子ではなく、カナマイシンへの耐性を授ける遺伝子(KanR)を含む。
発現ベクターpPRO44(配列番号7)及びpPRO45(配列番号8)を、pPRO43のヌクレオチド配列(配列番号2)に基づいて、pPRO44(RSF1030)発現ベクターとpPRO45(CloDF13)発現ベクターとで異なる複製起点を使用して作製した。pPRO43、RSF1030複製起点、及びCloDF13複製起点のためのプライマーを、各複製起点配列の上流にSpeI制限部位を、下流にAatII制限部位を加えるために設計した。pPRO43及びRSF1030ヌクレオチド配列を、これらのプライマー(それぞれ、配列番号9及び10、ならびに配列番号11及び12)を使用して増幅し、増幅した産物をSpeI及びAatIIによって分解させ、所望の制限断片をゲル精製し、ともにライゲーションして、pPRO44(配列番号7)を作製した。結果として得られたpPRO44発現ベクターを配列決定して、PCR増幅の間に変異が導入されなかったことを確認した。pPRO45を作製するために、CloDF13ヌクレオチド配列を、プライマー(配列番号13及び14)を使用して増幅して、SpeI及びAatII部位を加え、CloDF13増幅産物及びpPRO44をSpeI及びAatII制限酵素によって分解させ、所望の断片をゲル精製した後、ともにライゲーションして、pPRO45(配列番号8)を形成した。pPRO45のCloDF13部分を配列決定して、PCR増幅の間に変異が導入されなかったことを確認した。
細菌細胞における蛍光タンパク質の誘導性共発現用二重プロモーターベクターpSOLの使用
A.二重プロモーターpSOL発現ベクターの構築。
「二重ベクター」または「pSOL」と称される、2つの異なる誘導性プロモーターを含む発現ベクターを図5に概略的に示す。このベクターは、DNA2.0(Menlo Park,CA)によって合成され、大腸菌宿主細胞における発現のために最適化されたいくつかのポリヌクレオチド配列、または「要素」を含む。pSOLにおいて利用されるポリヌクレオチド要素の説明は表4で以下に提供し、pSOLのヌクレオチド配列は配列番号15として提供する。
二重プロモーターpSOLベクターからの共発現のレベルをpBAD24発現ベクターとpPRO33発現ベクターとの組み合わせからの共発現と比較するために、pBAD24及びpPRO33ベクターを使用して、それぞれ、蛍光タンパク質黄色蛍光タンパク質(YellowFP)及び赤色蛍光タンパク質(RedFP)を発現させた。pSOL中のL−アラビノース誘導性araBADプロモーターを使用してYellowFPを発現させ、プロピオネート誘導性prpBCDEプロモーターを使用してRedFPを発現させた。YellowFPは、515nmの励起により528nm〜530nmで最大の発光を有し(Nagai et al.,“A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell−biological applications”,Nat Biotechnol 2002 Jan;20(1):87−90)、RedFPは、587nmの励起により610nmで最大の発光を有する(Shaner et al.,“Improved monomeric red,orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp.red fluorescent protein”,Nat Biotechnol 2004 Dec;22(12):1567−1572;Epub 2004 Nov 21)。
行A、B:ASE(DGH)コロニー1中のpBAD24−YellowFP/pPRO33−RedFP
行C、D:ASE(DGH)コロニー2中のpBAD24−YellowFP/pPRO33−RedFP
行E、F:ASE(DGH)コロニー1中のpSOL−YellowFP−RedFP
行G、H:ASE(DGH)コロニー2中のpSOL−YellowFP−RedFP
二重プロモーターpSOLベクターを使用するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)とのプレプロインスリンの共発現によって産出されるプレプロインスリンの量を、pBAD240(配列番号6)発現ベクターとpPRO430(配列番号4)発現ベクターとの組み合わせを使用する共発現によって産出されるプレプロインスリンの量と比較した(これらのベクターの構築については実施例2を参照)。
インフリキシマブの誘導性共発現
インフリキシマブは、TNFアルファ、炎症性サイトカインに結合するキメラモノクローナル抗体であり、自己免疫疾患(クローン病、リウマチ性関節炎、乾癬等)のようなTNFアルファを伴う症状の治療において使用される。インフリキシマブは、重鎖(配列番号16として示されるアミノ酸配列)及び軽鎖(配列番号17として示されるアミノ酸配列)から形成され、これらの鎖の各々は、マウス抗TNFアルファ抗体の可変ドメイン配列、及びヒト定常ドメインを有する。大腸菌における発現のためのコドン最適化及び配列番号16及び17をコードするポリヌクレオチドの合成を、DNA2.0(Menlo Park,CA)によって行った。
誘導物質を変化させることによる共発現の滴定
本発明の発現系を用いて多量体産物の産生を最適化するために、誘導物質の濃度を独立して調整または滴定することができる。誘導性プロモーター(L−アラビノース誘導性、プロピオネート誘導性、L−ラムノース誘導性、またはD−キシロース誘導性プロモーター等)を含む発現コンストラクトを含有する宿主細胞を、適切な抗生物質を含むM9最小培地で、所望の濃度(例えば、約0.5のOD600)に増殖させ、その後、細胞を、グリセロール等の炭素源なしで、適切な抗生物質、及び様々な濃度の各誘導物質によって任意に調製した、少量のM9最小培地にアリコートする。少量の滴定を、200〜500mlの振盪フラスコ中で行った。発現を誘導するのに必要なL−アラビノース、L−ラムノース、またはD−キシロースの濃度は、典型的には、細胞のOD単位あたり0.02%未満である(多くの場合、0.02%を大きく下回る)。滴定実験では、L−アラビノースの試験濃度は、全て細胞のOD単位あたり、2%〜1.5%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.005%、0.002%、0.001%、0.0005%、0.0002%、0.0001%、0.00005%、0.00002%、0.00001%、0.000005%、0.000002%、0.000001%、0.0000005%、0.0000002%、0.0000001%、0.00000005%、0.00000002%、及び0.00000001%の範囲であり得る。66.61マイクロモルのL−アラビノースの濃度は、0.001%のL−アラビノースに相当する。L−アラビノース、L−ラムノース、またはD−キシロースについての代替的な滴定実験は、モル濃度に関して表した以下の濃度の試験であろう:全て細胞のOD単位あたり、250mM、100mM、50mM、25mM、10mM、5mM、2.5mM、1.0mM、500マイクロモル、250マイクロモル、100マイクロモル、75マイクロモル、50マイクロモル、25マイクロモル、10マイクロモル、5.0マイクロモル、2.5マイクロモル、1.0マイクロモル、500nM、250nM、100nM、50nM、25nM、10nM、5.0nM、2.5nM、1.0nM、500pM、250pM、100pM、50pM、25pM、10pM、5.0pM、2.5pM、及び1.0pM。プロピオネートについては、試験する濃度は、全て細胞のOD単位あたり、1M〜750mM、500mM、250mM、100mM、75mM、50mM、25mM、10mM、5mM、1mM、750マイクロモル、500マイクロモル、250マイクロモル、100マイクロモル、50マイクロモル、25マイクロモル、10マイクロモル、5.0マイクロモル、2.5マイクロモル、1.0マイクロモル、500nM、250nM、100nM、50nM、25nM、10nM、5.0nM、2.5nM、及び1.0nMの範囲であり得る。
プロモーターの強度の測定及び誘導性発現の均質性
プロモーターの強度を、適切な対照に対して相対的な、そのプロモーターで開始される遺伝子産物の転写の量として測定する。発現コンストラクトにおける遺伝子産物の発現を方向づける構成的プロモーターについて、適切な対照は、「野生型」バージョンのプロモーター、または「ハウスキーピング」遺伝子由来のプロモーターが、試験されるプロモーターの代わりに使用されることを除いて、同じ発現コンストラクトを使用し得る。誘導性プロモーターについては、プロモーター由来の遺伝子産物の発現を誘導条件下及び非誘導条件下で比較することができる。
De Mey et al.の方法(”Promoter knock−in:a novel rational method for the fine tuning of genes”,BMC Biotechnol 2010 Mar 24;10:26)を使用して、培養で増殖され得る宿主細胞におけるプロモーターの相対的な強度を測定する。試験されるプロモーターを有する発現コンストラクトを含む宿主細胞、及び対照の発現コンストラクトを含む対照宿主細胞を、3通りに培養で増殖する。1mlサンプルを、mRNA及びタンパク質収集のためにOD600=1.0で収集する。RNeasyミニキット(QIAGEN,The Netherlands)を用いて総RNA抽出を行う。RNAの純度を、QIAGENにより推奨されるように、FAアガロースゲル上で確認し、RNA濃度を、260nmの吸光度を測定することにより決定する。2マイクログラムのRNAを使用してcDNAを合成し、この合成には、ランダムプライマー及びRevertAid H Minus M‐MulVリバース転写酵素(Fermentas,Glen Burnie,Maryland)を使用した。プロモーターの強度は、プロモーターから産生される転写物に対応するcDNAを増幅するために設計されたフォワード及びリバースプライマーを用いて、iCycler IQ(登録商標)(Bio−Rad,Eke,Belgium)で行われるRT‐qPCRにより測定する。(この目的のために、De Mey et al.著者は、Fw−ppc−qPCR及びRv−ppc−qPCRプライマー、ならびに対照ハウスキーピング遺伝子 rpoB由来のFw−rpoB−qPCR及びRv−rpoB−qPCRプライマーを使用した。)SYBR GreenER qPCRスーパーミックス(supermix)(Life Technologies,Grand Island,New York)を使用して、簡潔にUDG(ウラシルDNAグリコシラーゼ)インキュベーション(50℃で2分間)を行い、すぐにPCR増幅(95℃で8.5分、95℃で15秒、及び60℃で1分の40サイクル)及び融解曲線分析(95℃で1分、55℃で1分、及び10秒の55℃+0.5℃/サイクルの80サイクル)を続け、プライマー二量体の存在を確認し、反応の特異性を分析する。PCRサイクル前のこのUDGインキュベーション工程は、前の反応由来のあらゆる混入dU含有産物を破壊する。その後、UDGをPCRサイクル中の高温により不活化することで、真の標的配列の増幅を可能にする。各サンプルは、3通りで行われる。相対的な発現の比を、PE Applied Biosystems(PerkinElmer,Forster City,California)の「デルタデルタCT法(Delta−delta ct method)」を用いて計算する。
これらの実験は、Khlebnikov et al.の方法を用いて行う(”Regulatable arabinose−inducible gene expression system with consistent control in all cells of a culture”,J Bacteriol 2000 Dec;182(24):7029−7034)。誘導性プロモーターの誘導を測定する実験は、炭素源として3.4%グリセロールを補充したC培地で行う(Helmstetter,“DNA synthesis during the division cycle of rapidly growing Escherichia coli B/r”,J Mol Biol 1968 Feb 14;31(3):507−518)。蛍光レポーター遺伝子の発現を制御する少なくとも1つの誘導性プロモーターを含む発現コンストラクトを含む大腸菌株を、0.6〜0.8の600nm(OD600)での光学的密度に対する抗生物質選択下で37℃で増殖する。細胞を遠心分離(15,000×g)により収集し、炭素源のないC培地で洗浄し、抗生物質、グリセロール、及び/または誘導物質(遺伝子発現誘導用)を含む新鮮なC培地で0.1〜0.2のOD600に再懸濁し、6時間インキュベートする。分析のため、サンプルを増殖中定期的に採取する。培養の蛍光を、360/40nmの波長の励起及び520/10nmの波長のエミッションフィルタで、Versafluor Fluorometer(Bio−Rad Inc.,Hercules,California)において測定する。誘導での誘導性プロモーター由来の発現の強度は、誘導された細胞の最大個体群の平均化された蛍光(蛍光/ODの比)の対照(例えば、非誘導)細胞のそれに対する比として表す。細胞の個体群内の誘導の均質性を測定するために、アルゴンレーザー(15mW及び488nmの波長で放射)及び525nmの波長バンドパスフィルタを備えるBeckman−Coulter EPICS XLフローサイトメーター(Beckman Instruments Inc.,Palo Alto,California)においフローサイトメトリーを行う。分析前に、サンプリングした細胞を、濾過した(フィルタ孔径0.22マイクロメートル)リン酸緩衝食塩水で洗浄し、希釈して0.05のOD600にし、氷上に置く。各サンプルについて、500〜1,000事象/秒の速度で30,000事象を収集する。各サンプルにおける誘導された(蛍光)細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリーデータから計算することができる。
抗体の精製
溶解した宿主細胞を10分間10,000×gで遠心分離することによって、本発明の誘導性共発現系により産生された抗体を精製し、あらゆる細胞及び破片を取り除く。上清を、0.45マイクロメートルのフィルタを通して濾過する。1mLの組換えタンパク質G‐Sepharose(登録商標)カラム(Life Technologies,Grand Island,New York)を、1ml/分の流量に達するように設定し、結合緩衝液(pH7.0の0.02Mリン酸ナトリウム)、溶出緩衝液(pH2.7の0.1Mグリシン−HCl)、及び中和緩衝液(pH9.0の1Mトリス−HCl)とともに使用する。カラムを5カラム体積(5ml)の結合緩衝液で平衡化した後、サンプルをカラムに適用する。カラムを5〜10カラム体積の結合緩衝液で洗浄して不純物及び非結合材料を取り除き、タンパク質が溶出液に検出されなくなるまで継続する(280nmのUV吸光度により決定)。その後、カラムを5カラム体積の溶出緩衝液で溶出し、カラムを5〜10カラム体積の結合緩衝液ですぐに再平衡化する。
抗体結合親和性の測定
「Kd」または「Kd値」として表される抗体結合親和性を、以下のアッセイに記載のように関心の抗体及びその抗原のFabバージョンを用いて行う放射標識抗原結合分析(RIA)により測定する。完全長抗体Fabバージョンの産生は、当該技術分野で周知である。抗原についてのFabの溶液結合親和性を、非標識抗原の滴定シリーズの存在下で最小濃度の(125I)標識された抗原でFabを平衡化することにより測定した後、抗Fab抗体をコーティングしたプレートと結合した抗原を捕捉する(例えば、Chen et al.,“Selection and analysis of an optimized anti−VEGF antibody:crystal structure of an affinity−matured Fab in complex with antigen”,J Mol Biol 1999 Nov 5;293(4):865−881参照)。分析のための条件を確立するために、マイクロタイタープレート(DYNEX Technologies,Inc.,Chantilly,Virginia)を、50mM炭酸ナトリウム(pH9.6)中5マイクログラム/mlの捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs,West Chester,Pennsylvania)で一晩かけてコーティングした後、室温(約23℃)で2〜5時間、PBS中2%(w/v)のウシ血清アルブミンでブロックする。非吸着プレート(Nunc#269620;Thermo Scientific,Rochester,New York)において、100pMまたは26pMの[125I]抗原を関心のFabの連続希釈物と混合する(例えば、Presta et al.,“Humanization of an anti−vascular endothelial growth factor monoclonal antibody for the therapy of solid tumors and other disorders”,Cancer Res 1997 Oct 15;57(20):4593−4599における、抗VEGF抗体、Fab−12の評価と一致する)。その後、関心のFabを一晩インキュベートするが、このインキュベーションは、平衡化に達していることを確実にするために、より長い期間(例えば、約65時間)継続することとしてもよい。その後、混合物を、室温でのインキュベーション(例えば、約1時間)のために捕捉プレートに移す。続いて、溶液を取り除き、プレートをPBS中0.1%のTWEEN−20(商標)界面活性剤で8回洗浄する。プレートが乾燥したら、150マイクロリットル/ウェルのシンチラント(scintillant)(MICROSCINT−20(商標);PerkinElmer,Waltham,Massachusetts)を添加し、プレートを、10分間、TOPCOUNT(商標)ガンマカウンター(PerkinElmer)上で計数する。最大の結合の20%以下である各Fabの濃度を、競合的結合測定で使用するために選択する。
発現産物に存在するジスルフィド結合の特性評価
タンパク質発現産物におけるジスルフィド結合の数及び位置は、非還元条件下で、トリプシン等のプロテアーゼによるタンパク質の消化、及び結果として得られたペプチドフラグメントを、連続的電子移動解離(sequential electron transfer dissociation)(ETD)と衝突誘起解離(CID)MSステップ(MS2、MS3)とを組み合わせた質量分析(MS)に供することにより測定することができる(Nili et al.,“Defining the disulfide bonds of insulin−like growth factor−binding protein−5 by tandem mass spectrometry with electron transfer dissociation and collision−induced dissociation”,J Biol Chem 2012 Jan 6;287(2):1510−1519;Epub 2011 Nov 22)。
細菌性の細胞ペリプラズム由来、スフェロプラスト由来、細胞全体由来の発現産物の分離
本発明の誘導性発現系は、細胞質またはペリプラズム等の、細胞の異なるコンパートメントに蓄積する遺伝子産物を発現させるために使用することができる。大腸菌またはS.セレビシエ等の宿主細胞は、外側の細胞膜または細胞壁を有し、外膜または壁が取り除かれる場合にスフェロプラストを形成し得る。このような宿主で作製される発現されたタンパク質は、以下の方法を用いて、特に、ペリプラズムから、またはスフェロプラストから、または細胞全体から精製され得る(Schoenfeld,“Convenient,rapid enrichment of periplasmic and spheroplasmic protein fractions using the new PeriPreps(商標)Periplasting Kit”,Epicentre Forum 1998 5(1):5;www.epibio.com/newsletter/f5_1/f5_1pp.asp参照)。PeriPreps(商標)Periplastingキット(Epicentre(登録商標)Biotechnologies,Madison WI;www.epibio.com/pdftechlit/107pl0612.pdfで実行可能な手順)を用いるこの方法は、大腸菌及び他のグラム陰性菌について設計されるが、一般的なアプローチは、S.セレビシエのような他の宿主細胞のために変更することができる。
ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列類似性の測定
ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列同一性のパーセンテージは、並んだ記号、つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸の、並んだ配置両方において同一である数を、ギャップを含む、2つの配列のならびにおける記号の総数で除したものとして定義される。2つの配列間の類似性の程度(同一性のパーセンテージ)は、ウェブサイトのblast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiを通じて利用可能である、Needleman−Wunschグローバル配列アライメントツールにて国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)により実現されるように、Needleman and Wunsch(J.Mol.Biol.48:443,1970)のグローバルな配置法を用いて配列を配置することにより測定されることとしてもよい。一実施形態では、Needleman−Wunschアライメントパラメータをデフォルトの値に設定する(それぞれ2及び−3のマッチ/ミスマッチスコア、ならびにそれぞれ5及び2のExistence及びExtensionのGap Cost)。配列比較分野の当業者により使用される他のプログラムを配列アラインメントに使用してもよく、他のプログラムとは、例えば、blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ウェブサイトに記載されるデフォルトのパラメータ設定を用いて、NCBIにより実行されるような、ベーシックなローカルアライメントサーチツールまたはBLAST(登録商標)プログラム(Altschul et al.,“Basic local alignment search tool”,J Mol Biol 1990 Oct 5;215(3):403−410)である。BLASTアルゴリズムは、以下のように使用され得る2つを含む、任意の多重パラメータを有する:(A)低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント、または好ましくは使用されないかもしくは「オフ」に設定される短周期性の内部反復からなるセグメントをマスクするためのフィルタの包含、及び(B)「エクスペクト」またはEスコアと呼ばれる、データベース配列に対するマッチを報告するための統計的有意性閾値(単に偶然に見出されるマッチの期待される確率、マッチに帰される統計学的有意性がこのEスコア閾値よりも大きい場合、マッチは報告されないことになる)。この「エクスペクト」またはEスコア値がデフォルト値(10)から調整される場合、好ましい閾値は0.5、または0.25、0.1、0.05、0.01、0.001、0.0001、0.00001、及び0.000001の順で優先性が増加する。
[態様1]2つ以上の誘導性プロモーターを含む発現コンストラクトであって、
少なくとも1つの誘導性プロモーターがプロピオネート誘導性プロモーターであり、少なくとも1つの他の誘導性プロモーターがL−アラビノース誘導性プロモーターであり、
前記発現コンストラクトが、
(a)配列番号15のヌクレオチド1833〜5304の連続する塩基少なくとも3000個と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(b)配列番号15のヌクレオチド1833〜5304の連続する塩基少なくとも3250個と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(c)配列番号15の連続する塩基少なくとも3000個と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(d)配列番号15の連続する塩基少なくとも3250個と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(e)配列番号15の連続する塩基少なくとも3500個と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(f)配列番号15の連続する塩基少なくとも4000個と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(g)配列番号15の連続する塩基少なくとも5000個と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、発現コンストラクト。
[態様2]2つ以上の誘導性プロモーターを含む発現コンストラクトであって、
少なくとも1つの誘導性プロモーターがプロピオネート誘導性プロモーターであり、少なくとも1つの他の誘導性プロモーターがL−アラビノース誘導性プロモーターであり、
前記発現コンストラクトが、
(a)配列番号15のヌクレオチド2818〜3259と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(b)配列番号15のヌクレオチド4937〜5304と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(c)(a)及び(b)の両方を含むヌクレオチド配列、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、発現コンストラクト。
[態様3]前記発現コンストラクトが、
(a)配列番号15のヌクレオチド2818〜3259の連続する塩基少なくとも425個と少なくとも87%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(b)配列番号15のヌクレオチド2818〜3259の連続する塩基少なくとも400個と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(c)配列番号15のヌクレオチド2818〜3259の連続する塩基少なくとも350個と少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(d)配列番号15のヌクレオチド4937〜5304の連続する塩基少なくとも350個と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(e)配列番号15のヌクレオチド4937〜5304の連続する塩基少なくとも300個と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列、からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、態様1〜2のいずれかに記載の発現コンストラクト。
[態様4]前記発現コンストラクトが、
(a)配列番号15のヌクレオチド2818〜3259と少なくとも87%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(b)配列番号15のヌクレオチド2818〜3259と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(c)配列番号15のヌクレオチド2818〜3259と少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(d)配列番号15のヌクレオチド4937〜5304と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(e)配列番号15のヌクレオチド4937〜5304と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(f)配列番号15のヌクレオチド4937〜5304と少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列、からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、態様3に記載の発現コンストラクト。
[態様5]前記発現コンストラクトが、配列番号15のヌクレオチド3140〜3151、及び配列番号15のヌクレオチド5172〜5185からなる群から選択される、少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、態様1〜4のいずれかに記載の発現コンストラクト。
[態様6]前記発現コンストラクトが、配列番号15のヌクレオチド2818〜3259、及び配列番号15のヌクレオチド4937〜5304からなる群から選択される、少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、態様1〜5のいずれかに記載の発現コンストラクト。
[態様7]前記発現コンストラクトが、配列番号15のヌクレオチド2818〜3259、及び配列番号15のヌクレオチド4937〜5304を含む、態様6に記載の発現コンストラクト。
[態様8]2つ以上の誘導性プロモーターを含む発現コンストラクトであって、
少なくとも1つの誘導性プロモーターがプロピオネート誘導性プロモーターであり、少なくとも1つの他の誘導性プロモーターがL−アラビノース誘導性プロモーターであり、
前記発現コンストラクトが、
(a)配列番号15のヌクレオチド1833〜5304の連続する塩基少なくとも3000個と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(b)配列番号15のヌクレオチド1833〜5304の連続する塩基少なくとも3250個と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(c)配列番号15のヌクレオチド1833〜5304の連続する塩基少なくとも3250個と少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(d)配列番号15のヌクレオチド1833〜5304の連続する塩基少なくとも3250個と少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、発現コンストラクト。
[態様9]2つ以上の誘導性プロモーターを含む発現コンストラクトであって、
少なくとも1つの誘導性プロモーターがプロピオネート誘導性プロモーターであり、少なくとも1つの他の誘導性プロモーターがL−アラビノース誘導性プロモーターであり、
前記発現コンストラクトが、
(a)配列番号15のヌクレオチド1833〜5304と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(b)配列番号15のヌクレオチド1833〜5304と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列、
(c)配列番号15のヌクレオチド1833〜5304と少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、発現コンストラクト。
[態様10]前記発現コンストラクトが配列番号15を含む、態様8〜9のいずれかに記載の発現コンストラクト。
[態様11]前記発現コンストラクトが染色体外にある、態様1〜10のいずれかに記載の発現コンストラクト。
[態様12]ラムノース誘導性プロモーター、キシロース誘導性プロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、及びリン酸塩欠乏誘導性プロモーターからなる群から選択される、少なくとも1つの誘導性プロモーターをさらに含む、態様1〜11のいずれかに記載の発現コンストラクト。
[態様13]少なくとも1つの誘導性プロモーターが、前記rhaSRプロモーター、前記xlyAプロモーター、前記lacZYAプロモーター、及び前記phoAプロモーターからなる群から選択される、態様12に記載の発現コンストラクト。
[態様14]誘導性プロモーターに結合する転写調節因子をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列をさらに含む、態様1〜13のいずれかに記載の発現コンストラクト。
[態様15]前記転写調節因子が、AraC、PrpR、RhaR、及びXylRからなる群から選択される、態様14に記載の発現コンストラクト。
[態様16]誘導性プロモーターから転写される少なくとも1つの遺伝子産物をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列をさらに含む、態様1〜15のいずれかに記載の発現コンストラクト。
[態様17]態様1〜16のいずれかに記載の発現コンストラクトを含むキット。
[態様18]態様1〜16のいずれかに記載の発現コンストラクトを含む宿主細胞。
[態様19]前記宿主細胞が原核細胞である、態様18に記載の宿主細胞。
[態様20]前記宿主細胞が大腸菌である、態様19の宿主細胞。
[態様21]前記宿主細胞が、少なくとも1つの誘導性プロモーターの誘導物質についての輸送タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子の遺伝子機能の変異を有する、態様18〜20のいずれかに記載の宿主細胞。
[態様22]前記輸送タンパク質をコードする遺伝子が、araE、araF、araG、araH、rhaT、xylF、xylG、及びxylHからなる群から選択される、態様21に記載の宿主細胞。
[態様23]前記遺伝子機能の変異が、構成的プロモーターからのaraEの発現である、態様22に記載の宿主細胞。
[態様24]前記宿主細胞が、少なくとも1つの誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子の遺伝子機能の低減したレベルを有する、態様18〜23のいずれかに記載の宿主細胞。
[態様25]前記少なくとも1つの誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする前記遺伝子が、araA、araB、prpB、prpD、rhaA、rhaB、rhaD、xylA、及びxylBからなる群から選択される、態様24に記載の宿主細胞。
[態様26]前記宿主細胞が、少なくとも1つの誘導性プロモーターの誘導物質の生合成に関与するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子の遺伝子機能の低減したレベルを有する、態様18〜25のいずれかに記載の宿主細胞。
[態様27]前記少なくとも1つの誘導性プロモーターの誘導物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子が、scpA/sbm、argK/ygfD、scpB/ygfG、scpC/ygfH、rmlA、rmlB、rmlC、及びrmlDからなる群から選択される、態様26に記載の宿主細胞。
[態様28]前記宿主細胞が、チオレドキシン還元酵素遺伝子の遺伝子機能の低減したレベルを有する、態様18〜27のいずれか記載の宿主細胞。
[態様29]前記チオレドキシン還元酵素遺伝子がtrxBである、態様28に記載の宿主細胞。
[態様30]前記宿主細胞が、少なくとも1つのグルタチオンシンテターゼ遺伝子の遺伝子機能の低減したレベルを有する、態様18〜29のいずれかに記載の宿主細胞。
[態様31]前記グルタチオンシンテターゼ遺伝子が、gshA及びgshBからなる群から選択される、態様30に記載の宿主細胞。
[態様32]前記宿主細胞が、少なくとも1つのAhpCの突然変異型を発現する、態様18〜31のいずれかに記載の宿主細胞。
[態様33]少なくとも1つのL−アラビノース誘導性プロモーターとAraCをコードするポリヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクトを含み、前記宿主細胞が、少なくとも1つの前記L−アラビノース誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子の低減した遺伝子機能を有し、前記遺伝子が、araA及びaraBからなる群から選択される、態様18〜32のいずれかに記載の宿主細胞。
[態様34]少なくとも1つのプロピオネート誘導性プロモーターとPrpRをコードするポリヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクトを含み、前記宿主細胞が、少なくとも1つの前記プロピオネート誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子の低減した遺伝子機能を有し、前記遺伝子が、prpB及びprpDからなる群から選択される、態様18〜32のいずれかに記載の宿主細胞。
[態様35]前記宿主細胞が、(a)前記araBAD遺伝子の欠失;(b)前記araE遺伝子の変異した遺伝子機能;(c)lacY(A177C)遺伝子;(d)前記prpB遺伝子の低減した遺伝子機能;(e)前記sbm/scpA−ygfD/argK−ygfGH/scpBC遺伝子の低減した遺伝子機能;(f)前記gor及びtrxB遺伝子の低減した遺伝子機能;(g)AhpCの突然変異型をコードするポリヌクレオチド;(h)前記AscG遺伝子の低減した遺伝子機能;(i)シグナルペプチドを欠くDsbCの形態をコードするポリヌクレオチド;(j)Erv1pをコードするポリヌクレオチド;ならびに(k)タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードするポリヌクレオチド、のうちの1つ以上を含む、態様18〜34のいずれかに記載の宿主細胞。
[態様36]態様1〜16のいずれかに記載の発現コンストラクトと、宿主細胞と、を含む、キット。
[態様37]前記宿主細胞が原核細胞である、態様36に記載のキット。
[態様38]前記宿主細胞が大腸菌である、態様37に記載のキット。
[態様39]前記宿主細胞が、少なくとも1つの誘導性プロモーターの誘導物質についての輸送タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子の遺伝子機能の変異を有する、態様36〜38のいずれかに記載のキット。
[態様40]前記輸送タンパク質をコードする遺伝子が、araE、araF、araG、araH、rhaT、xylF、xylG、及びxylHからなる群から選択される、態様39に記載のキット。
[態様41]前記遺伝子機能の変異が、構成的プロモーターからのaraEの発現である、態様40に記載のキット。
[態様42]前記宿主細胞が、少なくとも1つの誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子の遺伝子機能の低減したレベルを有する、態様36〜41のいずれかに記載のキット。
[態様43]少なくとも1つの前記誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする前記遺伝子が、araA、araB、prpB、prpD、rhaA、rhaB、rhaD、xylA、及びxylBからなる群から選択される、態様42に記載のキット。
[態様44]前記宿主細胞が、少なくとも1つの誘導性プロモーターの誘導物質の生合成に関与するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子の遺伝子機能の低減したレベルを有する、態様36〜43のいずれかに記載のキット。
[態様45]前記少なくとも1つの誘導性プロモーターの誘導物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子が、scpA/sbm、argK/ygfD、scpB/ygfG、scpC/ygfH、rmlA、rmlB、rmlC、及びrmlDからなる群から選択される、態様44に記載のキット。
[態様46]前記宿主細胞が、チオレドキシン還元酵素遺伝子の遺伝子機能の低減したレベルを有する、態様36〜45のいずれかに記載のキット。
[態様47]前記チオレドキシン還元酵素遺伝子がtrxBである、態様46に記載のキット。
[態様48]前記宿主細胞が、グルタチオンシンテターゼ遺伝子の遺伝子機能の低減したレベルを有する、態様36〜47のいずれかに記載のキット。
[態様49]前記グルタチオンシンテターゼ遺伝子が、gshA及びgshBからなる群から選択される、態様48に記載のキット。
[態様50]前記宿主細胞が、AhpCの突然変異型を発現する、態様36〜49のいずれかに記載のキット。
[態様51]少なくとも1つのL−アラビノース誘導性プロモーターとAraCをコードするポリヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクトを含み、前記宿主細胞が、少なくとも1つの前記L−アラビノース誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子の低減した遺伝子機能を有し、前記遺伝子が、araA及びaraBからなる群から選択される、態様36〜50のいずれかに記載のキット。
[態様52]少なくとも1つのプロピオネート誘導性プロモーターとPrpRをコードするポリヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクトを含み、前記宿主細胞が、少なくとも1つの前記プロピオネート誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子の低減した遺伝子機能を有し、前記遺伝子が、prpB及びprpDからなる群から選択される、態様36〜50のいずれかに記載のキット。
[態様53]前記宿主細胞が、(a)前記araBAD遺伝子の欠失;(b)前記araE遺伝子の変異した遺伝子機能;(c)lacY(A177C)遺伝子;(d)前記prpB遺伝子の低減した遺伝子機能;(e)前記sbm/scpA−ygfD/argK−ygfGH/scpBC遺伝子の低減した遺伝子機能;(f)前記gor及びtrxB遺伝子の低減した遺伝子機能;(g)AhpCの突然変異型をコードするポリヌクレオチド;(h)前記AscG遺伝子の低減した遺伝子機能;(i)シグナルペプチドを欠くDsbCの形態をコードするポリヌクレオチド;(j)Erv1pをコードするポリヌクレオチド;ならびに(k)タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードするポリヌクレオチド、のうちの1つ以上を含む、態様36〜52のいずれかに記載のキット。
[態様55]遺伝子産物を産生する方法であって、態様18〜35のいずれかに記載の宿主細胞の培養を増殖させることであって、前記宿主細胞が、各誘導性プロモーターから転写される少なくとも1つの遺伝子産物をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの発現コンストラクトを含む、増殖させることと、前記培養に前記誘導性プロモーターの各々のための誘導物質を添加することと、を含む、方法。
[態様56]前記方法が、少なくとも1つの遺伝子産物を前記培養から精製することをさらに含む、態様55に記載の方法。
[態様57]前記遺伝子産物が多量体産物の一部である、態様55〜56のいずれかに記載の方法。
[態様58]前記少なくとも1つの遺伝子産物が、(a)免疫グロブリン重鎖、(b)免疫グロブリン軽鎖、及び(c)(a)〜(b)のいずれかのフラグメントからなる群から選択される、態様55〜57のいずれかに記載の方法。
[態様59]前記多量体産物が抗体である、態様58に記載の方法。
[態様60]前記遺伝子産物がプレプロインスリンである、態様55〜56のいずれかに記載の方法。
[態様61]前記プレプロインスリンが、L−アラビノース誘導性プロモーターから発現される、態様60に記載の方法。
Claims (30)
- 2つ以上の誘導性プロモーターを含む発現コンストラクトであって、
少なくとも1つの誘導性プロモーターが、配列番号15のヌクレオチド4937〜5304と少なくとも90%の同一性を有し、且つプロピオネート誘導性プロモーター活性を有するヌクレオチド配列により提供されるプロピオネート誘導性プロモーターであり、少なくとも1つの他の誘導性プロモーターが、配列番号15のヌクレオチド2818〜3259と少なくとも90%同一性を有し、且つL−アラビノース誘導性プロモーター活性を有するヌクレオチド配列により提供されるL−アラビノース誘導性プロモーターである、
上記発現コンストラクト。 - 前記発現コンストラクトが、
(a)L−アラビノース誘導性プロモーター活性を有し、且つ配列番号15のヌクレオチド2818〜3259と少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列;および
(b)プロピオネート誘導性プロモーター活性を有し、且つ配列番号15のヌクレオチド4937〜5304と少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列;
からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列により提供される誘導性プロモーターを含む、請求項1に記載の発現コンストラクト。 - 前記発現コンストラクトが配列番号15を含む、請求項1又は2に記載の発現コンストラクト。
- 前記発現コンストラクトが染色体外にある、請求項1〜3のいずれか1項に記載の発現コンストラクト。
- ラムノース誘導性プロモーター、キシロース誘導性プロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、及びリン酸塩欠乏誘導性プロモーターからなる群から選択される、少なくとも1つの誘導性プロモーターをさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の発現コンストラクト。
- 少なくとも1つの誘導性プロモーターが、rhaSRプロモーター、xlyAプロモーター、lacZYAプロモーター、及びphoAプロモーターからなる群から選択される、請求項5に記載の発現コンストラクト。
- 誘導性プロモーターに結合する転写調節因子をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の発現コンストラクト。
- 前記転写調節因子が、AraC、PrpR、RhaR、及びXylRからなる群から選択される、請求項7に記載の発現コンストラクト。
- 誘導性プロモーターから転写される少なくとも1つの遺伝子産物をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の発現コンストラクト。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の発現コンストラクトを含む、キット。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の発現コンストラクトを含む、宿主細胞。
- 前記宿主細胞が原核細胞である、請求項11に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が大腸菌である、請求項12の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、少なくとも1つの誘導性プロモーターの誘導物質についての輸送タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子の遺伝子機能の変異を有する、請求項11〜13のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記輸送タンパク質をコードする遺伝子が、araE、araF、araG、araH、rhaT、xylF、xylG、及びxylHからなる群から選択される、請求項14に記載の宿主細胞。
- 前記遺伝子機能の変異が、構成的プロモーターからのaraEの発現である、請求項15に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、少なくとも1つの誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子の遺伝子機能の低減したレベルを有する、請求項11〜16のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記少なくとも1つの誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする遺伝子が、araA、araB、prpB、prpD、rhaA、rhaB、rhaD、xylA、及びxylBからなる群から選択される、請求項17に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、少なくとも1つの誘導性プロモーターの誘導物質の生合成に関与するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子の遺伝子機能の低減したレベルを有する、請求項11〜18のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記少なくとも1つの誘導性プロモーターの誘導物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子が、scpA/sbm、argK/ygfD、scpB/ygfG、scpC/ygfH、rmlA、rmlB、rmlC、及びrmlDからなる群から選択される、請求項19に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、チオレドキシン還元酵素遺伝子の遺伝子機能の低減したレベルを有する、請求項11〜20のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記チオレドキシン還元酵素遺伝子がtrxBである、請求項21に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、少なくとも1つのAhpCの突然変異型を発現する、請求項11〜22のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の発現コンストラクトと、宿主細胞と、を含む、キット。
- 前記宿主細胞が、請求項12〜23のいずれか1項に記載の宿主細胞の特性を有する、請求項24に記載のキット。
- 遺伝子産物を産生する方法であって、
請求項11〜23のいずれか1項に記載の宿主細胞の培養物を増殖させること、ここで、該宿主細胞が、各誘導性プロモーターから転写される少なくとも1つの遺伝子産物をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの前記発現コンストラクトを含み、そして、
該培養物に誘導物質を添加すること、
を含む、上記方法。 - 前記方法が、少なくとも1つの遺伝子産物を培養物から精製することをさらに含む、請求項26に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの遺伝子産物が、(a)免疫グロブリン重鎖、(b)免疫グロブリン軽鎖、及び(c)(a)〜(b)のいずれかのフラグメントからなる群から選択される、請求項26又は27に記載の方法。
- 少なくとも1つの遺伝子産物が抗体である、請求項28に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの遺伝子産物がプレプロインスリンである、請求項26又は27に記載の方法。
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