JP2020000072A

JP2020000072A - グルタチオンの製造方法

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Publication number: JP2020000072A
Application number: JP2018122027A
Authority: JP
Inventors: 岳希志賀; Takeki Shiga; 誠井村; Makoto Imura; 亮岩切; Akira Iwakiri; 孝祐本田; Takahiro Honda
Original assignee: Osaka University NUC; Kohjin Life Sciences Co Ltd
Current assignee: Osaka University NUC; Kohjin Life Sciences Co Ltd
Priority date: 2018-06-27
Filing date: 2018-06-27
Publication date: 2020-01-09
Anticipated expiration: 2038-06-27
Also published as: JP7181712B2

Abstract

【課題】本願は、耐熱性を有するγ—グルタミルシステイン合成酵素やグルタチオン合成酵素を見出し、新規なグルタチオンの製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】好熱性ラン藻類であるThermosynechococcus elongatusより、グルタチオン合成酵素を同定した。さらに、機能未知の遺伝子より、γ—グルタミルシステイン合成酵素活性を有する遺伝子も同定した。【選択図】なし

Description

本発明は、グルタチオンの製造方法に関する。

グルタチオン（γ―グルタミル―Ｌ―システイニルグリシン）は、Ｌ―システイン、Ｌ―グルタミン酸、及びグリシンからなるトリペプチドであり、ヒトだけでなく、広く動植物、微生物などに存在し、解毒作用、抗酸化作用など生体にとって重要な化合物となっている。

グルタチオンの製造方法として、酵母を用いた発酵により、酵母にグルタチオンを産生させる方法（特許文献１）、Ｌ―システイン、Ｌ―グルタミン酸、及びグリシンをグルタチオン産生能を有する微生物が産生するγ ― グルタミルシステイン合成酵素やグルタチオン合成酵素を用いて合成する酵素法などが知られている（特許文献２）。

また、微生物を合成反応の反応系として用い、目的とする有機化合物を微生物が備えている代謝経路を利用して製造する方法ある。この方法をより効率よく有機化合物を合成するために、生きた微生物の代謝経路を改変するのではなく、複数の代謝酵素を予めモジュ―ル化し、これらを任意に組み合わせることによって物質生産に特化した合成経路を人工的に構築する人工代謝システムも知られている（特許文献３）。この人工代謝システムでは、複数の酵素を用いるため、酵素の安定性が重要である。そのため、耐熱性酵素を用いることが行われている。また、複数の酵素を使うため、酵素の精製にコストがかかるといった問題もあるが、耐熱性酵素を使用することで、精製コストを下げることができる。

耐熱性のγ―グルタミルシステイン合成酵素やグルタチオン合成酵素としては、４５℃での反応による活性を有する酵素は知られている（非特許文献１）。また、超好熱性アーキアSulfolobus solfataricusの細胞抽出液より酸化型グルタチオンが検出されたとの報告（非特許文献２）があったが、本発明者らが分析したところ、本菌、その類縁種であるS. achidolacdarius、及び、好熱性細菌Thermus thermophilusの細胞抽出液からは培地成分からの持ち込み量を上回るグルタチオンは検出されなかった。

特開平８―７０８８４号公報特開昭６０―２７３９６号公報ＷＯ２０１６／１３６６２０

Zhang et al., 2017, J. Biotech Heinemann J et al., 2014, Biochim Biophys Acta.

人工代謝システムを利用することで、有機合成では、製造が困難であった有機化合物を製造することができる可能性があり、耐熱性を有するγ―グルタミルシステイン合成酵素やグルタチオン合成酵素を用いることで、効率よく、グルタチオンを製造することができる。したがって、本願は、耐熱性を有するγ―グルタミルシステイン合成酵素やグルタチオン合成酵素を見出し、新規なグルタチオンの製造方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、新規の耐熱性を有するγ―グルタミルシステイン合成酵素及びグルタチオン合成酵素を提供し、それら酵素を使用したグルタチオンの製造方法を提供する。

好熱性ラン藻類であるThermosynechococcus elongatusより、グルタチオン合成酵素を同定した。さらに、機能未知の遺伝子より、γ―グルタミルシステイン合成酵素活性を有する遺伝子も同定した。

本発明は、以下のような発明である。
（１）Ｌ―グルタミン酸とＬ―システインに、配列番号１のアミノ酸配列からなるγ―グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチド、又は配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の配列同一性を有しγ―グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチドを作用させて、γ―グルタミルシステインを生成させる工程を含む、γ―グルタミルシステインの製造方法、
（２）Ｌ―グルタミン酸とＬ―システインに、配列番号１のアミノ酸配列からなるγ―グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチド、又は配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の配列同一性を有しγ―グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチドを作用させて、γ―グルタミルシステインを生成させる工程、次いで、グリシンとγ―グルタミルシステインに、配列番号２又は３のアミノ酸配列からなるグルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチド、又は配列番号２又は３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の配列同一性を有しグルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチドを作用させて、グルタチオンを生成させる工程を含む、グルタチオンの製造方法。
（３）グリシンとγ―グルタミルシステインに、配列番号２又は３のアミノ酸配列からなるグルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチド、又は配列番号２又は３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の配列同一性を有しグルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチドを作用させて、グルタチオンを生成させる工程を含む、グルタチオンの製造方法。

６５℃という高温域に最適温度を持つ耐熱性酵素により、Ｌ―グルタミン酸、Ｌ―システインからのγ−ＧＣ製造ならびにグリシンとγ−ＧＣからのグルタチオン製造、更にはＬ―グルタミン酸、Ｌ―システインおよびグリシンからのグルタチオン製造を、過去の事例（４５℃）を遥かに上回る高温で行うことが可能である。

生成されたγ−ＧＣの量を基に比活性を算出した結果（温度）生成されたγ−ＧＣの量を基に比活性を算出した結果（ｐＨ）生成したγ−ＧＣと残存Ｌ‐システインの量生成されたグルタチオンの量を基に比活性を算出した結果（温度）生成されたグルタチオンの量を基に比活性を算出した結果（ｐＨ）生成したグルタチオンとγ−ＧＣ、残存Ｌ‐システインの量

本発明は、Ｌ―グルタミン酸とＬ―システイン、グリシンを基質とし、好熱菌由来のγ―グルタミルシステイン合成酵素、好熱菌由来のグルタチオン合成酵素により、グルタチオン生成させる、グルタチオンの製造方法に関する。

本願では、γ―グルタミルシステイン合成酵素をγ―ＧＣＬ、グルタチオン合成酵素をＧＳＨＳ、グルタチオンをＧＳＨ、酸化型グルタチオンをＧＳＳＧと略して記載する場合がある。

本発明のγ―ＧＣＬは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）存在下で、Ｌ―システインを基質とし、Ｌ―グルタミン酸と結合させ、γ―グルタミルシステイン（γ―Ｇｌｕ―Ｃｙｓ）を生成する反応を触媒する活性を有する酵素である。

本発明のＧＳＨＳは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）存在下でγ―グルタミルシステインを基質とし、グリシンと結合させ、γ―グルタミル―Ｌ―システイニルグリシン（γ―Ｇｌｕ―Ｃｙｓ―Ｇｌｙ：グルタチオン）を生成する反応を触媒する活性を有する酵素である。

本発明の好熱菌とは、５０℃以上、特に６０〜１１０℃において、変性することなく、活性を保持できる酵素を発現する菌である。また、本発明でのγ―ＧＣＬ及びＧＳＨＳでは、好熱菌由来のものでも良いが、５０℃以上で酵素が変性しなければ、好熱菌由来の酵素でなくても良い。

本発明のγ―ＧＣＬは、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び配列番号１に対して少なくとも９０％以上、又は少なくとも９５％以上配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、γ―ＧＣＬ活性を有するポリペプチドである。

本発明のＧＳＨＳは、配列番号２又は３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び配列番号２又は３に対して少なくとも９０％以上、又は少なくとも９５％以上配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＧＳＨＳ活性を有するポリペプチドである。

本発明のγ―ＧＣＬ及びＧＳＨＳは、前段までのアミノ酸配列を有し、さらに、好熱性ラン藻類であるThermosynechococcus elongatusを由来とするものを用いることができる。

本発明で使用されるγ―ＧＣＬ及びＧＳＨＳを取得する方法は特に限定されない。例えば、遺伝子工学の手法を用いて得る場合は、目的の酵素をコードする遺伝子を適当なベクターに挿入し、組換えベクターを構築する。当該組換えベクターを酵素生産可能な宿主細胞に形質転換し、酵素を発現製造することができる。本発明では、複数の酵素を用いるため、簡便に形質転換可能な、DH5α、MG1655株等の大腸菌、Pseudomonas属などのグラム陰性菌、Corynebacterium属やBacillus属、Rhodococcus属などのグラム陽性菌が適している。具体的には、γ―ＧＣＬ及びＧＳＨＳはThermosynechococcus elongatus等のゲノムＤＮＡよりＰＣＲ増幅した当該遺伝子を、例えば、ｐＥＴ２１ａに連結し、Ｔ７プロモーター制御下で発現させる。Thermosynechococcus elongatus等のゲノムＤＮＡは、国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンター、国立環境研究所、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（ＮＢＲＣ）、公益財団法人かずさＤＮＡ研究所などから入手可能である。また、使用するＤＮＡは、配列番号１〜３のアミノ酸配列情報から合成したＤＮＡでも使用可能であり、合成ＤＮＡとはアミノ酸配列を大腸菌のコドン使用頻度に合わせて設計したＤＮＡ配列である。これらのＤＮＡから、当概遺伝子を前述のように調製した発現ベクターをNovagen社製 BL21 (DE3) pLysS等の大腸菌に形質転換する。または、相同組み換えやトランスポゾンによるＤＮＡ断片を挿入してもよい。形質転換方法は、一般的な方法で良い。

本願発明で必要な酵素は、DH5α、MG1655株等の大腸菌、Pseudomonas属などのグラム陰性菌、Corynebacterium属やBacillus属、Rhodococcus属などのグラム陽性菌などから選択した菌類に、γ―ＧＣＬ及びＧＳＨＳに発現させて得ることができる。γ―ＧＣＬ及びＧＳＨＳを同時に得ても良い。本段落で使用する菌類は、後述のように、宿主由来のタンパク質を容易に除去するため、好熱性菌である必要はない。必要な酵素をすべて同時に発現させても良いが、通常は、発現効率等から、実施例記載のように、複数の大腸菌等に分けて、γ―ＧＣＬ及びＧＳＨＳを得ることもできる。本発明では、好熱菌由来の酵素を大腸菌等で発現させて得るため、大腸菌等の宿主由来のタンパク質を容易に除去することができる。例えば、大腸菌で発現後、高温、６０℃〜８０℃で熱処理をすることで、大腸菌由来のタンパク質は変性するが、目的の酵素は、好熱菌由来の酵素であるため、熱変性しない。このように、熱処理で変性したタンパク質を除去することで、必要な粗酵素液を容易に得ることができる。熱処理は、培養後の菌体を直接熱処理しても良い。又は、菌体抽出液を熱処理しても良い。抽出方法は、特に制限なく選択できる。菌体を超音波破砕等により破砕後、抽出した液を熱処理してもよい。具体的には、例えば、組換え大腸菌の湿菌体を２００ｍｇｗｅｔｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように５０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）に懸濁し、懸濁液を超音波破砕処理に供することにより菌体を破砕、無細胞抽出液を得る。無細胞抽出液に対し、７０℃、３０分間の熱処理を施し、宿主由来タンパク質の変性操作を行う。遠心分離により細胞残さと変性タンパク質を取り取り除くことで、上清を粗酵素液として、グルタチオンの製造に用いることができる。

本発明によるグルタチオンの製造方法は、Ｌ−システインとＬ−グルタミン酸とを前述のγ―ＧＣＬにより、ＡＴＰ存在下で作用させて、γ―グルタミルシステインを生成する工程、γ―グルタミルシステインとグリシンとを前述のＧＳＨＳにより、ＡＴＰ存在下でグルタチオンを生成する工程を含むものである。

γ―ＧＣＬ及びＧＳＨＳによる酵素反応は、適当なｐＨに調整された溶媒を含む一般的な反応液中で行うことができる。基質の濃度（Ｌ―システイン、Ｌ―グルタミン酸、グリシンの合計濃度）は、一般的な濃度で反応できる。Ｌ―システインとＬ―グルタミン酸、グリシンの量比は、特に制限がなく選択できる。通常は、Ｌ―システイン、Ｌ―グルタミン酸、及びグリシンは、等量でよい。溶媒としては、HEPES、TAPS、CHESなどの緩衝液を用いることができる。特に好ましい緩衝液は、TAPSバッファーを使用する。反応のｐＨは、ｐＨ６〜１０、より好ましくはｐＨ８〜９である。γ―ＧＣＬ反応温度は、６０℃〜７５℃、より好ましくは６５℃以上とする。反応時間は、適宜調整できるが、１０分〜１２０分とすることができる。

本発明のグルタチオンは、γ―ＧＣＬにより、γ―グルタミルシステイン（γ―ＧＣ）を生成後、ＧＳＨＳにより、γ―ＧＣとグリシンにより、グルタチオンを生成する反応を別々に行っても良いし、γ―ＧＣの生成とグルタチオンの生成を同時に行っても良い。別々に行う場合は、γ―ＧＣＬの反応は、段落番号００２４の条件で行う。ＧＳＨＳの反応も段落００２４の条件で行うこともできるが、温度を５５〜６５℃とすることで、より効率的にグルタチオンを生成することができる。

各酵素の濃度は、粗酵素液の調整により異なり、一般的な方法で適宜調整して良い。γ―ＧＣＬとＧＳＨＳとの濃度比も、適宜調整でき制限はない。

その他、反応に必要なものは、ＡＴＰ、塩化マグネシウム等であり、一般な条件で使用することができる。

以下に本発明をより詳細に説明するが、本発明は、以下の方法に限定されない。

（粗酵素液の調整）
組換え大腸菌の湿菌体を２００ mg wet cells/mlとなるように５０ mM HEPES-NaOH （ｐＨ８．０）に懸濁した。懸濁液を超音波破砕処理に供することにより菌体を破砕、無細胞抽出液を得た。無細胞抽出液に対し、６０℃、３０分間の熱処理を施し、宿主由来タンパク質の変性操作を行った。遠心分離により細胞残さと変性タンパク質を取り除いた上清を粗酵素液として活性測定に用いた。

・使用酵素遺伝子、菌株、培養
Thermosynechococcus elongatus由来のγ-glutamylcystein ligase（γ-GCL）及びglutathione synthetase（GSHS）は配列番号１及び２に対応する合成DNAをpET21aに連結し、T7プロモーター制御下で発現させた。この遺伝子発現ベクターは全てNovagen社製 Rosetta 2 (DE3) pLysSに導入した。Rosetta2 (DE3) pLysSでは１００ mg/lのアンピシリンと３４ mg/lのクロラムフェニコールをLuria-Bertani培地に添加し、３７℃で好気的に培養した。対数増殖後期に培養液に０．２ mM IPTGの添加し、目的酵素遺伝子の誘導を行った。

γ―ＧＣ，グルタチオンの濃度は、Steeleらの報告（Steele et al., 2012, Analytical Biochemistry）に準じた手法で測定した。具体的には以下の通りである。

・誘導体化
酵素反応後のサンプルならびにスタンダード（Ｌ‐システイン、γ−ＧＣ、ＧＳＨ各１００ μＭの混合液）各１６０ μｌに１ mM TCEP（Tris(２-carboxyethyl)phosphine hydrochloride）を加え、３５℃で５分間加温した。続いて２００μｌのBorate buffer（０．１ M Borate buffer（ｐＨ９．３）with １ mM EDTA）と６０μｌのABD-F（１ mg/ml ４-Fluoro-７-aminosulfonylbenzofurazan in Borate buffer）を添加し、３５℃で１０分間加温した。１００μｌの２M HClを加えて反応を停止させた後、遠心分離し、取得した遠心上清をグルタチオンの測定に用いた。

・高速液体クロマトグラフィー（HPLC）測定条件
溶離液：超純水で０．１Ｍに希釈した酢酸を水酸化ナトリウムでｐＨ４．０に調整し、メタノールと８６：１４の容積比で混合した溶液
流速：０．８ ml/min
カラム：COSMOSIL Packed Column ５C１８-AR-ＩＩ４．６ID x ２５０ mm
カラム温度：３５℃
測定波長：UV ３９０ nm （励起波長：３９０ nm、蛍光波長：５１０ nm）

（γ−ＧＣＬの酵素活性評価）
・最適温度検討
表１の組成で酵素液を調製し、それを用いて、ＡＴＰを除く表２の組成で反応液を作製した。４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５℃の各温度で２分間保温した後に、ＡＴＰを加えることで反応を開始させた。１０分間反応させた後、等量のメタノールを加えて反応を停止させ、生成されたγ−ＧＣをＨＰＬＣにて定量した。生成されたγ−ＧＣの量を基に比活性を算出した結果を図１に示す。この結果より、γ−ＧＣＬの最適温度は６５℃であることが明らかとなった。

・最適ｐＨ検討
表１の組成で酵素液を調製し、それを用いて、ＡＴＰを除く表３の組成で反応液を作製した。図１より、γ−ＧＣＬの最適温度が６５℃であったため、６５℃で２分間保温した後、ＡＴＰを加えることで反応を開始させた。１０分間反応させた後、等量のメタノールを加えて反応を停止させ、生成されたγ−ＧＣをHPLCにて定量した。生成されたγ−ＧＣの量を基に比活性を算出した結果を図２に示す。この結果より、γ−ＧＣＬの最適ｐＨは９．０であり、特にTAPSをバッファーに用いると活性が高いことが明らかとなった。

（γ−ＧＣの生成）
表１の組成で酵素液を調製し、それらを用いて、ATPを除く表４の組成で反応液を作製した。６５℃で２分間保温した後、ATPを加えることで反応を開始させた。１、３、５、１０、２０、３０分後にサンプルを取得し、それぞれに等量のメタノールを加えて反応を停止させ、生成したγ−ＧＣをHPLCにて定量した。その結果、反応開始３０分後には１．２１mMのγ−ＧＣを確認できた。生成したγ−ＧＣと残存Ｌ‐システインの量を図３に示す。

（GSHSの酵素活性評価）
・最適温度検討
表５の組成で酵素液を調製し、それを用いて、ATPを除く表６の組成で反応液を作製した。４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５℃の各温度で２分間保温した後に、ATPを加えることで反応を開始させた。１０分間反応させた後、等量のメタノールを加えて反応を停止させ、生成されたグルタチオンをHPLCにて定量した。生成されたグルタチオンの量を基に比活性を算出した結果を図４に示す。この結果より、GSHSの最適温度は５５℃であるが、５５〜６５℃まではほぼ同等の活性を示すことが明らかとなった。

・最適pH検討
表５の組成で酵素液を調製し、それを用いて、ATPを除く表７の組成で反応液を作製した。図４より、GSHSの活性は最適温度の５５℃から６５℃までほぼ同等であったため、６５℃で２分間保温した後、ATPを加えることで反応を開始させた。１０分間反応させた後、等量のメタノールを加えて反応を停止させ、生成されたグルタチオンをHPLCにて定量した。生成されたグルタチオンの量を基に比活性を算出した結果を図５に示す。この結果より、GSHSの最適pHは９．０であり、特にTAPSをバッファーに用いると活性が高いことが明らかとなった。

（グルタチオン（ＧＳＨ）の生成）
表１、表５の組成で酵素液を調製し、それらを用いて、ATPを除く表８の組成で反応液を作製した。６５℃で２分間保温した後、ATPを加えることで反応を開始させた。１、３、５、１０、２０、３０分後にサンプルを取得し、それぞれに等量のメタノールを加えて反応を停止させ、生成したグルタチオンをHPLCにて定量した。その結果、反応開始３０分後には０．５４ mMのグルタチオンを確認できた。生成したグルタチオンとγ−ＧＣ、残存Ｌ‐システインの量を図６に示す。これによると、反応開始１０分後にγ−ＧＣの濃度が最大となり、それ以降低下していた。これは、γ−ＧＣＬによるγ−ＧＣの生産速度が、反応開始１０分まではGSHSによるγ−ＧＣの消費速度を上回った結果と考えられる。実際に、グルタチオンの生産量は一律に増加しており、GSHSによるグルタチオン生産が律速段階であったことが示唆される。

以上から、本発明において、６５℃という高温域に最適温度を持つ耐熱性酵素により、Ｌ‐グルタミン酸、Ｌ‐システインからのγ−ＧＣ製造ならびにグリシンとγ−ＧＣからのグルタチオン製造、更にはＬ‐グルタミン酸、Ｌ‐システインおよびグリシンからのグルタチオン製造を、過去の事例（４５℃）を遥かに上回る高温で行うことが可能である。

Claims

Ｌ―グルタミン酸とＬ―システインに、配列番号１のアミノ酸配列からなるγ―グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチド、又は配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の配列同一性を有しγ―グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチドを作用させて、γ―グルタミルシステインを生成させる工程を含む、γ―グルタミルシステインの製造方法。
Ｌ―グルタミン酸とＬ―システインに、配列番号１のアミノ酸配列からなるγ―グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチド、又は配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の配列同一性を有しγ―グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチドを作用させて、γ―グルタミルシステインを生成させる工程、次いで、グリシンとγ―グルタミルシステインに、配列番号２又は３のアミノ酸配列からなるグルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチド、又は配列番号２又は３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の配列同一性を有しグルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチドを作用させて、グルタチオンを生成させる工程を含む、グルタチオンの製造方法。
グリシンとγ―グルタミルシステインに、配列番号２又は３のアミノ酸配列からなるグルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチド、又は配列番号２又は３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の配列同一性を有しグルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチドを作用させて、グルタチオンを生成させる工程を含む、グルタチオンの製造方法。