CN116987649A - 一株高效生产依克多因的基因工程菌及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一株高效生产依克多因的基因工程菌及其制备和应用，其特征在于，所述基因工程菌以大肠杆菌MG1655，编号为ATCC 47076为宿主，其包含如下改造：基于丙酮酸响应转录因子PdhR，在T7启动子的下游通过融合PCR的方法插入PdhR结合位点PdhR Box，使其转录受到丙酮酸响应转录因子PdhR抑制，利用试剂盒ClonExpress通过无缝克隆的方法构建得到受丙酮酸调控的Ppr启动子；外源引入T7RNAP，在PxylF下表达；外源引入密码子优化的ectABC基因簇，一个拷贝在T7启动子下，另一个拷贝在构建的受丙酮酸调控的强启动子Ppr启动子下；在Ppr控制下增量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc和天冬氨酸激酶基因lysC；通过反义转录抑制thrA、lysA、iclR和zwf基因的表达。本申请工程菌能够生产依克多因，并具有较高的产量。

Description

一株高效生产依克多因的基因工程菌及其制备和应用
技术领域
本发明涉及一株高效生产依克多因的基因工程菌及其制备和应用。
背景技术
依克多因(1, 4, 5, 6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrim-idinecarboxylic acid,ectoine)，又名四氢嘧啶，1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，是一种嘧啶类衍生物，也是一种环化的氨基酸衍生物，具有高度水溶性、生理pH范围内不带电荷的特点。1985年Galinski等人首次在一株极端嗜盐菌光养型紫色硫细菌（Halorhodospira halochloris）中发现依克多因，并通过核磁共振、质谱和红外光谱鉴定并分离出依克多因。目前已发现依克多因可在耐盐或嗜盐细菌、古菌、放线菌以及真菌等微生物细胞内积聚。依克多因类相容性溶质在外界极端环境（冷冻、干旱、高盐碱、高温、射线等）对细胞进行保护。主要在高盐浓度下，作为渗透压补偿溶质在某些嗜盐或耐盐的细菌、古菌等微生物细胞内大量的累积，以抵抗外界环境高渗透压的改变。作为生物大分子保护剂，依克多因对酶、核酸、蛋白质的结构起到保护作用。因此，依克多因被广泛应用于化妆品、医药、酶工业、生物技术等领域。
目前，依克多因的生产方法主要有化学合成法和生物合成法。化学合成法具有环境污染，反应条件苛刻，成本高等缺点。生物合成法分为酶催化法和生物发酵法。酶催化法由于需要添加诱导剂和操作工艺复杂，传统的生物发酵法常用嗜盐或耐盐细菌，主要生产工艺为“细菌挤奶”法，即通过渗透压的循环控制，高盐、高渗的外界环境诱导细胞合成依克多因，低盐、低渗环境刺激促进释放。该方法使用的高盐环境造成设备腐蚀、细胞生长受抑制、后提取难度增加等问题，进而增大依克多因的生产成本，制约依克多因规模化生产和应用。
经研究表明，产依克多因的嗜盐或耐盐菌中存在一条以天冬氨酸为前体的依克多因合成途径，主要由三个关键基因（ectA、ectB、ectC）编码的三个酶（EctA、EctB、EctC）参与，并且三个基因通常是以ectABC的形式组成一个操纵子单元。天冬氨酸在天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶作用下生成L-天冬氨酸-4-半醛后，二氨基丁酸转氨酶(EctB)催化L-天冬氨酸-4-半醛转化为L-2，4-二氨基丁酸（DABA），该产物随后被L-二氨基丁酸转移酶(EctA)催化生成N-乙酰基-2，4-二氨基丁酸（ADABA），最后ADABA在四氢嘧啶合酶(EctC)的催化作用下生成反应终产物依克多因。将嗜盐菌中依克多因合成途径的三个关键基因ectA、ectB、ectC转入非嗜盐菌株，进行依克多因合成途径的重构，利用异源表达的大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母菌等进行依克多因的生产，可以有效地避免“细菌挤奶法”存在的问题，是工业生产中越来越普遍应用的方法。大肠杆菌作为微生物发酵工业中最广泛应用的菌株，具有遗传背景清晰、发酵周期短、成本低和易于基因改造等优点，被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物，是发酵合成依克多因的优势平台。
糖酵解途径是维持细胞生长的关键中心代谢途径，为细胞生长和产物合成提供碳骨架，过高的糖酵解途径代谢流会导致代谢溢流，使更多的碳骨架流向细胞生长并生成副产物，而过低的糖酵解途径代谢流会影响细胞生长，导致产物合成效率下降。因此，合理、精准地控制糖酵解途径的代谢通量是实现目标产物高效合成的关键要素之一。丙酮酸是连接糖酵解途径与TCA循环的关键碳中心代谢物，碳源的两条利用途径PTS途径和NPTS途径都会流入糖酵解途径生成丙酮酸，为细胞提供碳骨架，或继续进入TCA循环转换成为氮源、ATP或者还原力。丙酮酸响应转录因子PdhR 在大肠杆菌中是一种多效型的转录因子，能够响应胞内丙酮酸浓度，调控多个代谢节点，从而维持胞内中心代谢的稳态。当胞内丙酮酸浓度较低时，丙酮酸响应转录因子PdhR 会与靶基因的启动子区结合，阻碍RNA 聚合酶与启动子结合，从而抑制基因的转录；当胞内丙酮酸浓度达到一定阈值时，丙酮酸会与丙酮酸响应转录因子 PdhR 结合，使其从靶基因的启动子区脱落，解除丙酮酸响应转录因子 PdhR 的抑制效果基于丙酮酸响应转录因子PdhR。本发明在T7启动子的下游插入PdhR结合位点PdhR Box（ATTGGTATGACCAAT），使其转录受到丙酮酸响应转录因子PdhR抑制，从而获得受丙酮酸调控的Ppr启动子，进而在该Ppr启动子控制下进行外源基因的表达，同时Ppr启动子控制下进行糖代谢和氨基酸代谢调控基因表达的增强和抑制，可以实现根据细胞中丙酮酸的浓度水平，对糖代谢流进行精准、合理地调控，动态增加氨基酸和糖代谢支流，在不影响宿主菌正常生长和能量供应的情况下将代谢流导向产品依克多因，提高依克多因的产量。
反义转录是一种普遍存在与多种生物中的调节系统,其主要作用方式可分为两种类型：产生反义RNA（ asRNA）或转录干扰。其中asRNA可以与目的基因的mRNA结合，降低其稳定性和翻译效率，从而抑制目的基因的表达；而转录干扰则发生在RNA聚合酶（RNAP）之间，当两个RNAP的延伸方向相反时，二者会发生物理碰撞，导致其从DNA链上脱落，从而干扰mRNA的有效合成。本发明分别在thrA、lysA、iclR和zwf基因下游插入反向的Ppr启动子，通过反义转录抑制基因的表达，减少氨基酸和糖代谢支流的通量。
谢希贤等（CN106754603B）公布了利用木糖诱导产生依克多因的基因工程菌及其应用，该基因工程菌为具有特定基因型的大肠杆菌，包含T7启动子控制的来源于伸长盐单胞菌的ectABC基因；thrA，iclR两个基因缺陷型；具有T7启动子控制来自谷氨酸棒状杆菌的lysC基因；trc启动子控制的ppc基因；木糖启动子PxylF控制的来源于T7噬菌体的RNA聚合酶；摇瓶发酵20-28h后依克多因的产量达到了12-16g/L，5L发酵罐发酵24-40h后依克多因的产量达到了35-50g/L的效果。但是，该菌在进行外源引入、过表达和敲除基因的改造后，未对氨基酸和糖代谢流进行精准、合理地调控，一定程度上会影响菌体生长和能量供应，给菌体造成一定的压力，进而影响依克多因的生产；同时该菌未对异源基因簇ectABC优化，在一定程度上限制了依克多因产量的进一步提高。
发明内容
本发明提供一株高效生产依克多因的基因工程菌及其制备和应用，解决技术问题是菌能够有效生产依克多因，并具有较高的产量。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一株高效生产依克多因的基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌MG1655，编号为ATCC 47076为宿主， A）基于丙酮酸响应转录因子PdhR，在T7启动子的下游通过融合PCR的方法插入PdhR结合位点PdhR Box，使其转录受到丙酮酸响应转录因子PdhR抑制，利用试剂盒ClonExpress通过无缝克隆的方法构建得到受丙酮酸调控的Ppr启动子；
B）外源引入T7RNAP，在PxylF下表达；
C）外源引入密码子优化的ectABC基因簇，一个拷贝在T7启动子下，另一个拷贝在构建的受丙酮酸调控的强启动子Ppr启动子下；在Ppr控制下增量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc和天冬氨酸激酶基因lysC；
D）通过反义转录抑制thrA和lysA的表达，减少苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸代谢支路的流量并减少其反馈抑制；通过反义转录抑制iclR基因的表达，激活乙醛酸途径，提高重要的前体草酰乙酸的积累；通过反义转录抑制zwf基因的表达，减少6-磷酸葡萄糖到HMP途径的代谢流量；
所述密码子优化的ectABC基因簇将原始外源基因ectABC基因簇序列通过成型的规则修改部分密码子，使其适合大肠杆菌表达的方法，最终人工合成出密码子的DNA片段ectOPT。
所述密码子优化的ectABC基因簇为ectOPT，其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1所示。
所述T7启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.2所示；
所述T7终止子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.3所示
所述PxylF基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.5所示
所述RNAP基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.6所示
所述thrA基因的GeneID为945803，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.11所示
所述lysA基因的GeneID为947313，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.12所示
所述iclR基因的GeneID为948524，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.13所示
所述zwf基因的GeneID为946370，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.14所示
所述ppc基因的GeneID为948457，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.15所示
所述lysC基因的GeneID为948531，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.16所示
所述pdhR基因的GeneID为 944827，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.17所示
所述Ppr启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.18所示。
一株高效生产依克多因的基因工程菌的制备方法，按照以下步骤进行：
a)基于转录因子PdhR，在T7启动子的下游通过融合PCR的方法插入丙酮酸响应转录因子PdhR结合位点PdhR Box（ATTGGTATGACCAAT），使其转录受到丙酮酸响应转录因子PdhR抑制，利用试剂盒ClonExpress通过无缝克隆的方法构建带Ppr启动子的质粒pPRZ，从而获得受丙酮酸调控的Ppr启动子;
b)在基因lacZ位点上，通过Cre/loxP技术插入PxylF下表达的T7 RNA聚合酶基因T7RNAP；
c)对伸长盐单胞菌（Halomonas elongataDSM 2581）的ectA、ectB、ectC基因（编码蛋白的GenBank ID：CBV42472、CBV42473、CBV42474）进行密码子优化后分别合成得到基因簇片段ectOPT，在假基因lfhA位点上，通过Cre/loxP技术引入密码子优化后的外源基因ectOPT并在T7启动子下表达；在假基因ycgH位点上，通过Cre/loxP技术外源引入密码子优化后的第二个拷贝的外源基因ectOPT并在Ppr启动子下表达；
d)在假基因yneO位点上，通过Cre/loxP技术引入在P pr 控制下的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，实现ppc基因受控的增量表达；在假基因ilvG位点上，通过Cre/loxP技术引入在P pr 控制下的天冬氨酸激酶基因lysC，实现lysC基因受控增量表达；
e)通过反义转录抑制thrA和lysA的表达，减少苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸代谢支路的流量并减少其反馈抑制。通过反义转录抑制iclR基因的表达，激活乙醛酸途径，提高重要的前体草酰乙酸的积累。通过反义转录抑制zwf基因的表达，减少6-磷酸葡萄糖到HMP途径的代谢流量;
所述密码子优化的ectABC基因簇将原始外源基因ectABC基因簇序列通过成型的规则修改部分密码子，使其适合大肠杆菌表达的方法，最终人工合成出密码子的DNA片段ectOPT。
所述密码子优化的ectABC基因簇为ectOPT，其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1所示。
所述T7启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.2所示；
所述T7终止子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.3所示
所述lacZ基因的GeneID为945006，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.4所示
所述PxylF基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.5所示
所述RNAP基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.6所示
所述lfhA基因的GeneID为944908，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.7所示
所述ycgH基因的GeneID为2847703，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.8所示
所述yneO基因的GeneID为7751623，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.9所示
所述ilvG基因的GeneID为948279，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.10所示
所述thrA基因的GeneID为945803，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.11所示
所述lysA基因的GeneID为947313，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.12所示
所述iclR基因的GeneID为948524，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.13所示
所述zwf基因的GeneID为946370，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.14所示
所述ppc基因的GeneID为948457，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.15所示
所述lysC基因的GeneID为948531，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.16所示
所述pdhR基因的GeneID为 944827，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.17所示
所述Ppr启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.18所示。
一株高效生产依克多因的基因工程菌的应用，其特征在于，摇瓶发酵培养步骤：
斜面活化：用接种环蘸取-80℃冰箱保存高效生产依克多因的基因工程菌接种至固体试管斜面培养基，33℃-37℃培养14-16h，接种环刮取一环斜面菌苔转接2代试管斜面培养基培养14-16h；
种瓶培养：斜面菌种刮取一环转接至种瓶培养基，33℃-37℃，200-220rpm培养6-9h；
摇瓶发酵培养：按照5-12%接种量接种摇瓶发酵培养基，33℃-37℃，200-220rpm培养22-26h；利用氨水通过苯酚红显色剂控制pH在6.8-7.2，过程中用50%-70%葡萄糖进行补料；3-12h添加木糖，使木糖终浓度为5-20g/L；
活化斜面培养基组成：葡萄糖1-2g/L，蛋白胨5-10g/L，酵母提取物3-6g/L，氯化钠5-10g/L，琼脂条15-25g/L，其余为水，调节pH为7.0-7.2；
种瓶培养基组成为：葡萄糖20-30g/L，蛋白胨2-4g/L，酵母粉4-6g/L，玉米浆5-15g/L，柠檬酸0.3-2g/L，KH2PO40.5-3g/L，K2HPO40.5-3g/L，MgSO40.1-2g/L，FeSO45-15mg/L，其余为水，调节pH为7.0-7.2；
摇瓶发酵培养基组成为：葡萄糖20-30g/L，蛋白胨1-2g/L，酵母粉2-4g/L，玉米浆10-20g/L，柠檬酸2-5g/L，KH2PO42-5g/L，K2HPO42-5g/L，MgSO41-5g/L，FeSO410-50mg/L，MnSO410-50mg/L，其余为水，调节pH为7.0-7.2。
应用，其特征在于，发酵罐发酵培养步骤：
斜面活化：用接种环蘸取-80℃冰箱保存高效生产依克多因的基因工程菌接种至固体试管斜面培养基，33℃-37℃培养14-
16h，接种环刮取一环斜面菌苔转接2代茄瓶斜面培养基培养14-16h；
菌悬液制备：将斜面菌种用无菌生理盐水洗下，制作成菌悬液；
种子培养：将菌悬液接种于种子培养基，控制pH7.0-7.2，33℃-37℃，溶氧20%-40%，培养6-9h；
发酵培养：按照5-12%接种量接种发酵培养基，氨水控制pH7.0-7.2，33℃-37℃，溶氧20%-40%，培养至糖浓度为0.5g/L以下，用50%-70%葡萄糖进行补料，维持糖浓度为0.5-1.5g/L，5-20h添加木糖，使木糖终浓度为5-20g/L，发酵周期为40-48h；
斜面活化培养基组成：葡萄糖1-2g/L，蛋白胨5-10g/L，酵母提取物3-6g/L，氯化钠5-10g/L，琼脂条15-25g/L，其余为水，调节pH为7.0-7.2；
种子培养基组成为：葡萄糖20-30g/L，蛋白胨2-4g/L，酵母粉5-10g/L，玉米浆10-15g/L，木糖5-20g/L，柠檬酸1-5g/L，KH2PO40.5-3g/L，K2HPO40.5-3g/L，MgSO40.1-2g/L，FeSO45-15mg/L，其余为水，调节pH为7.0-7.2；
发酵培养基组成为：葡萄糖20-30g/L，酵母粉2-6g/L，玉米浆15-20g/L，柠檬酸2-6g/L，KH2PO42-5g/L，K2HPO42-5g/L，MgSO41-5g/L，FeSO410-50mg/L，MnSO410-50mg/L，维生素B10.5-5mg/L，其余为水，调节pH为7.0-7.2；
所述溶氧以空气中溶氧校正为100%。
发明具有以下有益技术效果：
1）本发明首次构建了基于T7启动子和丙酮酸响应转录因子RdhR的组成型受控启动子Ppr，在Ppr启动子下整合密码子优化的异源基因簇ectABC，根据细胞中丙酮酸的浓度水平，对糖代谢流进行精准、合理地调控，在不影响宿主菌正常生长和能量供应的情况下将代谢流导向产品依克多因，提高依克多因的产量；该基因工程菌在T7启动子和Ppr启动子的双启动子表达系统下整合表达密码子优化的异源基因簇ectABC，在加强依克多因产生效率的同时不对细胞造成过重的负担；在Ppr控制下增量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc和天冬氨酸激酶基因lysC，根据细胞中丙酮酸的浓度水平，动态增加氨基酸和糖代谢支流，从而增加依克多因的产量；建立在Ppr控制下通过反义转录抑制的调控系统，在削弱氨基酸和糖代谢支流的同时不影响细胞正常的生长，大幅度提升了依克多因的产量。
2）本发明首次通过反义转录抑制zwf基因的表达，减少6-磷酸葡萄糖到HMP途径的代谢流量,显著提高依克多因的产量，为开发依克多因高产菌株提供了新思路。
附图说明
图1是菌株代谢途径改造示意图；
图2是Ppr启动子示意图；
图3是pPRZ载体示意图；
图4是pJM1载体示意图；
图5是pET-Pprx-lacZ载体示意图；
图6是pPRZ载体示意图；
图7是pECT1载体示意图；
图8是pECT2载体示意图。
具体实施方式
下面结合具体实例进一步说明本发明。
实施例1
构建密码子优化的ectABC基因簇的单启动子表达系统
（1）构建带Ppr启动子的质粒pPRZ
基于丙酮酸响应转录因子PdhR，我们在T7启动子的下游通过融合PCR的方法插入PdhR结合位点PdhR Box（ATTGGTATGACCAAT），使其转录受到丙酮酸响应转录因子PdhR抑制，从而获得受丙酮酸调控的Ppr启动子。
设计反向PCR引物Ppr.F和Ppr.R，以质粒p7Z6为模板，PCR扩增并利用试剂盒ClonExpress重组连接得到在博来抗性基因后插入Ppr启动子的质粒pPRZ；
（2）引入T7RNAP基因
在基因lacZ位点上，通过Cre/loxP技术插入T7 RNA聚合酶基因T7RNAP；
以大肠杆菌MG1655（ATCC 47076）基因组为模板，根据木糖编码基因xylF基因启动子区序列设计一对引物（PxylF.F,PxylF.R），PCR扩增获得木糖启动子片段PxylF；
以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，根据T7RNAP基因序列设计一对引物(T7RNAP.F、 T7RNAP.R)， PCR扩增获得T7RNAP片段；
以质粒p7Z6为模版设计引物(T7RNAP-zeo.F, T7RNAP-zeo.R)，扩增获得博来霉素抗性基因片段（该片段两端分别含有lox71/lox66识别位点）；
以大肠杆菌MG1655（ATCC 47076）基因组为模板，根据lacZ基因(GeneID:945006)序列设计上游同源臂引物(lacZ-L.F, lacZ-L.R)和下游同源臂引物(lacZ-R.F,lacZ-R.R)，通过PCR扩增得到lacZ上、下游同源臂片段，上游同源臂位于lacZ基因上游，下游同源臂位于lacZ基因内部；
以上述步骤扩增片段为模板，通过重叠融合PCR获得PxylF-T7RNAP整合片段，包含lacZ基因上游同源臂约520bp、lacZ基因下游同源臂约512bp、带博来霉素抗性基因片段约538bp、PxylF启动子片段约268bp、T7RNAP基因片段约2652bp，重叠融合后的PxylF-T7RNAP整合片段约4490bp，原细菌基因组片段大小约3660bp，删除抗性标记后约4030bp；
用化学转化法将上述整合片段转化进入大肠杆菌MG1655（ATCC 47076）感受态细胞中，在含有博来霉素的LB平板上进行筛选，获得阳性转化子，经过PCR鉴定和测序验证正确后，再将质粒pJM1转化进入菌株中。pJM1是一个温敏型质粒，在高温条件下培养时会丢失。pJM1质粒中含有一个在甘露糖启动子下表达的Cre重组酶基因，受甘露糖诱导表达产生的Cre重组酶能够特异性的识别lox71/lox66位点进行DNA重组，消除掉两个识别位点之间的DNA片段，可用于消除抗性标记。将转入了pJM1的菌株在含卡那霉素的LB上筛选，PCR验证正确后，将转化子接种至含有甘露糖的LB培养基中诱导表达Cre重组酶，开启位点特异性重组消除博来霉素抗性基因。随后，将菌株转接至LB无抗性培养基中，42℃培养12小时后涂布到LB无抗性固体培养基上，消除温敏型质粒pJM1，验证抗性后获得lacZ基因替换为PxylF启动子控制的T7RNAP基因的菌株HEC1。
（3）引入密码子优化的ectABC基因簇并在T7启动子下表达
在假基因lfhA位点上，通过Cre/loxP技术引入密码子优化后的外源基因ectABC并在T7启动子下表达；
对伸长盐单胞菌（Halomonas elongataDSM 2581）的ectA、ectB、ectC基因（编码蛋白的GenBank ID：CBV42472、CBV42473、CBV42474）进行密码子优化后分别合成得到基因簇片段ectOPT，在其前后加上T7启动子、T7终止子序列得到基因簇表达框架片段T7-ectOPT，将该片段插入到质粒pET28得到质粒pECT1；
根据pECT1序列设计一对引物ect.F和ect.R，以质粒pECT1为模板扩增得到T7-ectOPT基因簇片段；
以质粒p7Z6为模版设计引物(lfhA-zeo.F, lfhA-zeo.R)，扩增博来霉素抗性基因片段；
以大肠杆菌MG1655（ATCC 47076）为模板，根据假基因lfhA(GeneID:944908)设计上游同源臂引物（lfhA-L.F, lfhA-L.R）和下游同源臂引物(lfhA-R.F, lfhA-R.R)，通过PCR扩增得到lfhA上、下游同源臂片段，上游同源臂位于lfhA基因上游，下游同源臂位于lfhA基因内部；
以上述步骤扩增片段为模板，通过重叠延伸PCR获得T7-ectOPT整合片段，包含lfhA基因上游同源臂约645bp、lfhA基因下游同源臂约686bp、博来霉素抗性基因片段约538bp、T7-ectOPT基因簇片段约2625bp，重叠融合后的整合片段约4494bp，原细菌基因组片段大小约2220bp，删除抗性标记后约4000bp；
将上述整合片段导入大肠杆菌HEC1中，获得阳性转化子，再导入质粒pJM1消除转化子中的博来霉素抗性基因，通过42℃培养消除温敏型质粒pJM1，获得受T7启动子控制的ectOPT基因簇的大肠杆菌HEC2A。
（4）引入密码子优化的ectABC基因簇并在Ppr启动子下表达
在假基因ycgH位点上，通过Cre/loxP技术外源引入密码子优化后的ectABC基因簇并在Ppr启动子下表达；
将质粒pECT1中的T7启动子替换为Ppr启动子得到pECT2；
以质粒pECT2为模板，ect.F和ect.R为引物扩增得到Ppr-ectOPT基因簇片段；
以质粒p7Z6为模版设计引物(ycgH-zeo.F, ycgH-zeo.R)， 扩增得到博来霉素抗性基因片段；
以大肠杆菌MG1655（ATCC 47076）为模板，根据假基因ycgH(GeneID: 2847703)设计上游同源臂引物（ycgH-L.F,ycgH-L.R）和下游同源臂引物(ycgH-R.F,ycgH-R.R)，通过PCR扩增得到ycgH上、下游同源臂片段，上、下游同源臂均位于ycgH内部；
以上述步骤扩增片段为模板，通过重叠延伸PCR获得Ppr-ectOPT整合片段，包含ycgH基因上游同源臂约757bp、ycgH基因下游同源臂约685bp、博来霉素抗性基因片段约538bp、Ppr-ectOPT基因簇片段2640bp，重叠融合后的整合片段约4620bp，原细菌基因组片段大小约2544bp，删除抗性标记后约4120bp；
将上述整合片段导入大肠杆菌HEC1中，获得阳性转化子，再导入质粒pJM1，消除转化子中的博来霉素抗性基因后，通过42℃培养消除温敏型质粒pJM1，获得受Ppr启动子控制的ectOPT基因簇的大肠杆菌HEC2B。
将上述含有依克多因合成基因的大肠杆菌HEC2A和HEC2B，按照实施例6进行依克多因摇瓶发酵培养24h，经液相色谱检测，大肠杆菌HEC2A依克多因的产量为1.82g/L，大肠杆菌HEC2B依克多因的产量为3.76g/L，大肠杆菌HEC2B摇瓶发酵依克多因的产量是大肠杆菌HEC2A的2.07倍。说明对于密码子优化的异源基因簇ectABC在Ppr启动子控制下更有优势，依克多因的产量更高。
本部分所用引物列表
引物名称 序列5’→3‘
pdhR-L.F GTATTACGGAGGCGCTACCC
pdhR-L.R GTACCTTGGTTGGCGGATTTTGCTG
pdhR-zeo.F AAATCCGCCAACCAAGGTACCCGGGGATCCTCTAGA
pdhR-zeo.R TAAAGGCCAGATGGCGAGCAGGTCGACGATTCTACCG
pdhR-R.F TGCTCGCCATCTGGCCTTTATCG
pdhR-R.R TTGCGGAAGACTGGAAGGAC
Ppr.F GGCCTCATTGGTATGACCAATTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATCGTGACTGGGAAAACCCTG
Ppr.R TTGGTCATACCAATGAGGCCTATAGTGAGTCGTATTAGCAGGTCGACGATTCTACCG
lacZ-L.F AGTGCCATGTCCGGTTTTCA
lacZ-L.R TACCTCCGCTCACAATTCCACACA
T7RNAP-zeo.F TGGAATTGTGAGCGGAGGTACCCGGGGATCCTCTAGA
T7RNAP-zeo.R GAATTATCTCGCAGGTCGACGATTCTACCG
PxylF.F GTCGACCTGCGAGATAATTCACAAGTGTGCGCTC
PxylF.R CGTGTTCATCATGGTGTAGGGCCTTCTGTAGT
T7RNAP.F CCTACACCATGATGAACACGATTAACATCGCTAAGA
T7RNAP.R ACATCAACGGTTACGCGAACGCGAAGTCC
lacZ-R.F GTTCGCGTAACCGTTGATGTTGAAGTGGCG
lacZ-R.R TACGCGAAATACGGGCAGAC
lfhA-L.F CGTATCGGACGCACTTTTGG
lfhA-L.R GGGTACCCGTGAAAGCATTATCGCCGC
lfhA-zeo.F TAATGCTTTCACGGGTACCCGGGGATCCTCTAGA
lfhA-zeo.R ATTAATTTCGCGGGCAGGTCGACGATTCTACCG
ect.F GACCTGCCCGCGAAATTAATACGACTCAC
ect.R AATGGCGCAAAAAACCCCTCAAGACCCG
lfhA-R.F GAGGGGTTTTTTGCGCCATTTTCATCAACGGCA
lfhA-R.R TCTGCTCTTTCACCTGTGGC
ycgH-L.F CTCCCCGGGTTTAGTTTGGG
ycgH-L.R GTACCCAGCCACAGTTTCAAGTGCC
ycgH-zeo.F TTGAAACTGTGGCTGGGTACCCGGGGATCCTCTAGA
ycgH-zeo.R ATTAATTTCGCGGGCAGGTCGACGATTCTACCG
ycgH-R.F GGTTTTTTGCTACGTCTCGCAGTTAGGGGG
ycgH-R.R CGCTGGATTCAGGTTGCCAT
实施例2 构建密码子优化的ectABC基因簇的双启动子表达系统
在假基因ycgH位点上，通过Cre/loxP技术外源引入密码子优化后的ectABC基因簇并在Ppr启动子下表达；
将质粒pECT1中的T7启动子替换为Ppr启动子得到pECT2；
以质粒pECT2为模板，ect.F和ect.R为引物扩增得到Ppr-ectOPT基因簇片段；
以质粒p7Z6为模版设计引物(ycgH-zeo.F, ycgH-zeo.R)， 扩增得到博来霉素抗性基因片段；
以大肠杆菌MG1655（ATCC 47076）为模板，根据假基因ycgH(GeneID: 2847703)设计上游同源臂引物（ycgH-L.F,ycgH-L.R）和下游同源臂引物(ycgH-R.F,ycgH-R.R)，通过PCR扩增得到ycgH上、下游同源臂片段，上、下游同源臂均位于ycgH内部；
以上述步骤扩增片段为模板，通过重叠延伸PCR获得Ppr-ectOPT整合片段，包含ycgH基因上游同源臂约757bp、ycgH基因下游同源臂约685bp、博来霉素抗性基因片段约538bp、Ppr-ectOPT基因簇片段2640bp，重叠融合后的整合片段约4620bp，原细菌基因组片段大小约2544bp，删除抗性标记后约4120bp；
将上述整合片段导入实施例1的大肠杆菌HEC2A中，获得阳性转化子，再导入质粒pJM1，消除转化子中的博来霉素抗性基因后，通过42℃培养消除温敏型质粒pJM1，获得受Ppr启动子控制的ectOPT基因簇的大肠杆菌HEC3。
将上述含有依克多因合成基因的大肠杆菌HEC2A和HEC3，按照实施例6进行依克多因摇瓶发酵培养24h，经液相色谱检测，大肠杆菌HEC2A依克多因的产量为1.82g/L，大肠杆菌HEC3依克多因的产量为7.43g/L，大肠杆菌HEC3摇瓶发酵依克多因的产量是大肠杆菌HEC2A的4.08倍。说明对于密码子优化的异源基因簇ectABC在双启动子控制下，依克多因的表达效率更高。
本部分所用引物列表
引物名称 序列5’→3‘
ect.F GACCTGCCCGCGAAATTAATACGACTCAC
ect.R AATGGCGCAAAAAACCCCTCAAGACCCG
ycgH-L.F CTCCCCGGGTTTAGTTTGGG
ycgH-L.R GTACCCAGCCACAGTTTCAAGTGCC
ycgH-zeo.F TTGAAACTGTGGCTGGGTACCCGGGGATCCTCTAGA
ycgH-zeo.R ATTAATTTCGCGGGCAGGTCGACGATTCTACCG
ycgH-R.F GGTTTTTTGCTACGTCTCGCAGTTAGGGGG
ycgH-R.R CGCTGGATTCAGGTTGCCAT
实施例3P pr 控制下增量表达ppc基因
在假基因yneO位点上，通过Cre/loxP技术引入在P pr 控制下的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，实现ppc基因受控的增量表达；
（1）以大肠杆菌MG1655（ATCC 47076）为模板，根据基因ppc(GeneID: 948457)的序列设计一对引物（ppc.F,ppc.R），通过PCR扩增得到ppc基因片段；
（2）以质粒pPRZ为模版设计引物(ppc-zeo.F, ppc-zeo.R)，扩增带Ppr启动子的博来霉素抗性基因片段；
（3）以大肠杆菌MG1655（ATCC 47076）为模板，根据假基因yneO(GeneID: 7751623)设计上游同源臂引物（yneO-L.F,yneO-L.R）和下游同源臂引物(yneO-R.F,yneO-R.R)，通过PCR扩增得到yneO上、下游同源臂片段，上、下游同源臂均位于yneO基因内部；
（4）以上述步骤扩增片段为模板，通过重叠延伸PCR获得增量表达ppc基因的整合片段,包含yneO基因上游同源臂约710bp、yneO基因下游同源臂约642bp、带Ppr启动子的博来霉素抗性基因片段约607bp、ppc基因片段约2652bp，重叠融合后的整合片段约4660bp，原细菌基因组片段大小约2920bp，删除抗性标记后约4160bp；
（5）将上述整合片段导入实施例2的大肠杆菌HEC3中，获得阳性转化子，再导入质粒pJM1，消除转化子中的博来霉素抗性基因后，通过42℃培养消除温敏型质粒pJM1，获得增量表达受Ppr启动子控制的ppc基因的大肠杆菌HEC4；
将上述含有依克多因合成基因的大肠杆菌HEC3和HEC4，按照实施例6进行依克多因摇瓶发酵培养24h，经液相色谱检测，大肠杆菌HEC3依克多因的产量为7.43g/L，大肠杆菌HEC4依克多因的产量为9.37g/L，大肠杆菌HEC4摇瓶发酵依克多因的产量是大肠杆菌HEC3的1.26倍。说明在Ppr控制下增量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，根据细胞中丙酮酸的浓度水平，动态增加糖代谢支流，使依克多因的产量增加。
本部分所用引物列表
引物名称 序列5’→3‘
yneO-L.F TTCAGCGTCTGGTGCAAGTC
yneO-L.R TCTAGAGGATCCCAGAGTCTGCGTACCGTGATG
ppc-zeo.F AGACTCTGGGATCCTCTAGAGATTCTACCGTT
ppc-zeo.R GTTCGTTCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGT
ppc.F GAGATATACCATGAACGAACAATATTCCGCA
ppc.R ACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTAGCCGGTATTACGCAT
yneO-R.F TGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCGCTTACTCACGCGATGTTG
yneO-R.R GTCGCACCGTATTGATTGCC
实施例4P pr 控制下增量表达lysC基因
在假基因ilvG位点上，通过Cre/loxP技术引入在P pr 控制下的天冬氨酸激酶基因lysC，实现lysC基因受控增量表达；
（1）以大肠杆菌MG1655（ATCC 47076）为模板，根据基因lysC(GeneID: 948531)的序列设计一对引物（lysC.F, lysC.R），通过PCR扩增得到lysC基因片段；
（2）以质粒pPRZ为模版设计引物(lysC-zeo.F, lysC-zeo.R)，扩增带Ppr启动子的博来霉素抗性基因片段；
（3）以大肠杆菌MG1655（ATCC 47076）为模板，根据假基因ilvG(GeneID: 7751623)设计上游同源臂引物（ilvG-L.F, ilvG-L.R）和下游同源臂引物(ilvG-R.F, ilvG-R.R)，通过PCR扩增得到ilvG上、下游同源臂片段，上游同源臂位于ilvG基因上游，下游同源臂位于ilvG基因内部；
（4）以上述步骤扩增片段为模板，通过重叠延伸PCR获得增量表达lysC基因的整合片段，包含ilvG基因上游同源臂约698bp、ilvG基因下游同源臂约678bp、带Ppr启动子的博来霉素抗性基因片段约607bp、lysC基因片段约1400bp，重叠融合后的整合片段约3430bp，原细菌组片段大小约1960bp，删除抗性标记后约2970bp；
（5）将上述整合片段导入实施例3的大肠杆菌HEC4中，获得阳性转化子，再导入质粒pJM1消除转化子中的博来霉素抗性基因后，通过42℃培养消除温敏型质粒pJM1，获得增量表达受Ppr启动子控制的lysC基因的大肠杆菌HEC5；
将上述含有依克多因合成基因的大肠杆菌HEC4和HEC5，按照实施例6进行依克多因摇瓶发酵培养24h，经液相色谱检测，大肠杆菌HEC4依克多因的产量为9.37g/L，大肠杆菌HEC5依克多因的产量为11.92g/L，大肠杆菌HEC5摇瓶发酵依克多因的产量是大肠杆菌HEC4的1.27倍。说明在Ppr控制下增量表达天冬氨酸激酶基因lysC，根据细胞中丙酮酸的浓度水平，动态增加氨基酸代谢支流，使依克多因的产量增加。
本部分所用引物列表
引物名称 序列5’→3‘
ilvG-L.F ATGCAGCGGACAAAGGATGA
ilvG-L.R ATCTCTAGAGGATCCCAAGCCCGGTTATCAGGTTGG
lysC-zeo.F GCTTGGGATCCTCTAGAGATTCTACC
lysC-zeo.R TTCAGACATGGTATATCTCCTTCTTAAAGT
lysC.F GGAGATATACCATGTCTGAAATTGTTGTCTC
lysC.R ACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGGACAAGAAAATCAATACGGC
ilvG-R.F TGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGGTGACCGGCAAACTGAACAC
ilvG-R.R TGGTCTTTCCGGGTGATGTG
实施例5 通过反义转录抑制支路代谢、激活乙醛酸途径
通过反义转录抑制thrA和lysA的表达，减少苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸代谢支路的流量并减少其反馈抑制。通过反义转录抑制iclR基因的表达，激活乙醛酸途径，提高重要的前体草酰乙酸的积累。通过反义转录抑制zwf基因的表达，减少6-磷酸葡萄糖到HMP途径的代谢流量。反义转录是一种普遍存在与多种生物中的调节系统,其主要作用方式可分为两种类型：产生反义RNA（ asRNA）或转录干扰。其中asRNA可以与目的基因的mRNA结合，降低其稳定性和翻译效率，从而抑制目的基因的表达；而转录干扰则发生在RNA聚合酶（RNAP）之间，当两个RNAP的延伸方向相反时，二者会发生物理碰撞，导致其从DNA链上脱落，从而干扰mRNA的有效合成。（若背景技术有这里可以删除）
（1）抑制thrA基因的表达
在thrA基因下游插入反向的Ppr启动子，通过反义转录抑制thrA的表达，减少代谢支流苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸的通量。
以质粒pPRZ为模版设计引物(thrA-zeo.F, thrA-zeo.R)，扩增带Ppr启动子的博来霉素抗性基因片段；
以大肠杆菌MG1655（ATCC 47076）为模板，根据基因thrA(GeneID: 945803)下游序列设计反义启动子左侧同源臂引物（thrA-L.F, thrA-L.R）和右侧同源臂引物(thrA-R.F, thrA-R.R)，通过PCR扩增得到thrA反义启动子两侧同源臂片段，左侧同源臂位于thrA基因下游，右侧同源臂位于thrA基因内部；
以上述步骤扩增片段为模板，通过重叠延伸PCR获得反义转录抑制thrA基因表达的整合片段，包含thrA基因下游左侧同源臂约525bp、thrA基因下游右侧同源臂约566bp、带Ppr启动子的博来霉素抗性基因片段约607bp，重叠融合后的整合片段约1700 bp，原细菌组片段大小约1090bp，删除抗性标记后约1240bp；
将上述整合片段导入实施例4的大肠杆菌HEC5中，获得阳性转化子，再导入质粒pJM1消除转化子中的博来霉素抗性基因后，通过42℃培养消除温敏型质粒pJM1，获得反义转录抑制thrA基因表达的大肠杆菌HEC6；
（2）抑制lysA基因的表达
在lysA基因的下游插入反向的Ppr启动子，通过反义转录抑制lysA的表达，减少代谢支流赖氨酸的通量
以质粒pPRZ为模版设计引物(lysA-zeo.F, lysA-zeo.R)， 扩增带Ppr启动子的博来霉素抗性基因片段；
以大肠杆菌MG1655（ATCC 47076）为模板，根据基因lysA(GeneID: 947313)下游序列设计反义启动子左侧同源臂引物（lysA-L.F, lysA-L.R）和右侧同源臂引物(lysA-R.F, lysA-R.R)，通过PCR扩增得到lysA反义启动子两侧同源臂片段，左侧同源臂位于lysA基因下游，右侧同源臂位于lysA基因内部；
以上述步骤扩增片段为模板，通过重叠延伸PCR获得反义转录抑制lysA基因表达的整合片段，包含lysA基因下游左侧同源臂约518bp、lysA基因下游右侧同源臂约657bp、带Ppr启动子的博来霉素抗性基因片段约607bp，重叠融合后的整合片段约1780 bp，原细菌组片段大小约1180bp，删除抗性标记后约1320bp；
将上述整合片段导入大肠杆菌HEC6中，获得阳性转化子，再导入质粒pJM1消除转化子中的博来霉素抗性基因后，通过42℃培养消除温敏型质粒pJM1，获得反义转录抑制lysA基因表达的大肠杆菌HEC7；
（3）抑制iclR基因的表达，激活乙醛酸途径
在iclR基因的下游插入反向的Ppr启动子，通过反义转录抑制iclR基因的表达，激活乙醛酸途径，提高重要的前体草酰乙酸的积累
以质粒pPRZ为模版设计引物(iclR-zeo.F, iclR-zeo.R)， 扩增带Ppr启动子的博来霉素抗性基因片段；/>
以大肠杆菌MG1655（ATCC 47076）为模板，根据基因iclR(GeneID: 948524)下游序列设计反义启动子左侧同源臂引物（iclR-L.F, iclR-L.R）和右侧同源臂引物(iclR-R.F, iclR-R.R)，通过PCR扩增得到iclR反义启动子两侧同源臂片段，左侧同源臂位于iclR基因下游，右侧同源臂位于iclR基因内部；
以上述步骤扩增片段为模板，通过重叠延伸PCR获得反义转录抑制iclR基因表达的整合片段，包含iclR基因下游左侧同源臂约544bp、iclR基因下游右侧同源臂约576bp、带Ppr启动子的博来霉素抗性基因片段约607bp，重叠融合后的整合片段约1730 bp，原细菌组片段大小约1120bp，删除抗性标记后约1260bp;
将上述整合片段导入大肠杆菌HEC7中，获得阳性转化子，再导入质粒pJM1消除转化子中的博来霉素抗性基因后，通过42℃培养消除温敏型质粒pJM1，获得反义转录抑制iclR基因表达的大肠杆菌HEC8；
（4）抑制zwf基因的表达
在zwf基因的下游插入反向的Ppr启动子，通过反义转录抑制zwf基因的表达，减少6-磷酸葡萄糖到HMP途径的代谢流量。
以质粒pPRZ为模版设计引物(zwf-zeo.F, zwf-zeo.R)，扩增带Ppr启动子的博来霉素抗性基因片段；
以大肠杆菌MG1655（ATCC 47076）为模板，根据基因zwf(GeneID:946370)下游序列设计反义启动子左侧同源臂引物（zwf-L.F, zwf-L.R）和右侧同源臂引物(zwf-R.F,zwf-R.R)，通过PCR扩增得到zwf反义启动子两侧同源臂片段，左侧同源臂位于zwf基因下游，右侧同源臂位于zwf基因内部；
以上述步骤扩增片段为模板，通过重叠延伸PCR获得反义转录抑制zwf基因表达的整合片段，包含zwf基因下游左侧同源臂约591bp、zwf基因下游右侧同源臂约535bp、带Ppr启动子的博来霉素抗性基因片段约607bp，重叠融合后的整合片段约1730 bp，原细菌组片段大小约1130bp，删除抗性标记后约1270bp;
将上述整合片段导入大肠杆菌HEC8中，获得阳性转化子，再导入质粒pJM1消除转化子中的博来霉素抗性基因后，通过42℃培养消除温敏型质粒pJM1，获得反义转录抑制zwf基因表达的大肠杆菌HEC9。
将上述含有依克多因合成基因的大肠杆菌HEC8和HEC9，按照实施例6进行依克多因摇瓶发酵培养24h，经液相色谱检测，大肠杆菌HEC8依克多因的产量为13.44g/L，大肠杆菌HEC9依克多因的产量为16.31g/L，大肠杆菌HEC9摇瓶发酵依克多因的产量是大肠杆菌HEC8的1.21倍。说明通过反义转录抑制zwf基因的表达，减少6-磷酸葡萄糖到HMP途径的代谢流量,显著提高依克多因的产量。
实施例6依克多因生产菌种的摇瓶培养
上述产生依克多因的基因工程菌进行摇瓶培养及检测，具体步骤如下：
（1）斜面活化：用接种环蘸取-80℃冰箱保存上述产生依克多因的基因工程菌接种至固体试管斜面培养基，37℃培养14-16h，接种环刮取一环斜面菌苔转接2代试管斜面培养基培养14-16h。
（2）种瓶培养：斜面菌种刮取一环转接至种瓶培养基，37℃，220rpm培养6-9h。
（3）摇瓶发酵培养：按照10%接种量接种摇瓶发酵培养基，37℃，220rpm培养24h；利用氨水通过苯酚红显色剂控制pH在6.8-7.2，过程中用60%葡萄糖进行补料；4h添加木糖，使木糖终浓度为10g/L。
活化斜面培养基组成：葡萄糖1g/L，蛋白胨5g/L，酵母提取物3g/L，氯化钠5g/L，琼脂条20g/L，其余为水，调节pH为7.0-7.2。
种瓶培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，酵母粉4g/L，玉米浆5g/L，柠檬酸0.3g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO40.1g/L，FeSO45mg/L，其余为水，调节pH为7.0-7.2。
摇瓶发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨1g/L，酵母粉2g/L，玉米浆10g/L，柠檬酸2g/L，KH2PO42g/L，K2HPO42g/L，MgSO41g/L，FeSO410mg/L，MnSO410mg/L，其余为水，调节pH为7.0-7.2。
摇瓶发酵24h，经液相色谱检测高效生产依克多因的基因工程菌大肠杆菌HEC9依克多因的产量为16.31g/L。
摇瓶培养不同菌株的依克多因产量（g/L）
菌株 基因变化 来源菌株 依克多因产量（g/L）
HEC1 lacZ::PxylF-T7RNAP MG1655 /
HEC2A lfhA::T7-ectOPT HEC1 1.82
HEC2B ycgH::Ppr-ectOPT HEC1 3.76
HEC3 ycgH::Ppr-ectOPT HEC2A 7.43
HEC4 yneO::Ppr-ppc HEC3 9.37
HEC5 ilvG::Ppr-lysC HEC4 11.92
HEC6 thrA::revPpr HEC5 /
HEC7 lysA::revPpr HEC6 /
HEC8 iclR::revPpr HEC7 13.44
HEC9 zwf::revPpr HEC8 16.31
实施例7依克多因生产菌种的50L发酵罐培养
上述高效生产依克多因的基因工程菌进行50L发酵罐培养及检测，具体步骤如下：
（1）斜面活化：用接种环蘸取-80℃冰箱保存高效生产依克多因的基因工程菌接种至固体试管斜面培养基，37℃培养14-16h，接种环刮取一环斜面菌苔转接2代茄瓶斜面培养基培养14-16h。
（2）菌悬液制备：将斜面菌种用无菌生理盐水洗下，制作成菌悬液。
（3）种子培养：将菌悬液接种于种子培养基，氨水控制pH7.0-7.2，37℃，溶氧20%-40%，培养6-9h。
（4）发酵培养：按照10%接种量接种发酵培养基，氨水控制pH7.0-7.2，37℃，溶氧20%-40%，培养至糖浓度为1.5g/L以下，用60%葡萄糖进行补料，维持糖浓度为0.5-1.5g/L，8h添加木糖，使木糖终浓度为12g/L。发酵周期为46h。
活化斜面培养基组成：葡萄糖1g/L，蛋白胨5g/L，酵母提取物3g/L，氯化钠5g/L，琼脂条20g/L，其余为水，调节pH为7.0-7.2。
种子培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，酵母粉5g/L，玉米浆10g/L，木糖5g/L，柠檬酸1g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO40.1g/L，FeSO45mg/L，其余为水，调节pH为7.0-7.2。
发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，酵母粉2g/L，玉米浆15g/L，柠檬酸2g/L，KH2PO42g/L，K2HPO42g/L，MgSO41g/L，FeSO410mg/L，MnSO410mg/L，维生素B1 0.5mg/L，其余为水，调节pH为7.0-7.2。
所述溶氧以空气中溶氧校正为100%。
50L发酵罐发酵46h，经液相色谱检测高效生产依克多因的基因工程菌大肠杆菌HEC9依克多因产量达到63.26g/L。
本发明实施例1中，大肠杆菌HEC2B摇瓶发酵依克多因的产量是大肠杆菌HEC2A的2.07倍，说明对于密码子优化的异源基因簇ectABC在Ppr启动子控制下更有优势，依克多因的产量更高。
本发明实施例2中，大肠杆菌HEC3摇瓶发酵依克多因的产量是大肠杆菌HEC2A的4.08倍，说明密码子优化的异源基因簇ectABC在双启动子控制下，依克多因的表达效率更高。
本发明实施例3中，大肠杆菌HEC4摇瓶发酵依克多因的产量是大肠杆菌HEC3的1.26倍，说明在Ppr控制下增量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，根据细胞中丙酮酸的浓度水平，动态增加糖代谢支流，使依克多因的产量增加。
本发明实施例4中，大肠杆菌HEC5摇瓶发酵依克多因的产量是大肠杆菌HEC4的1.27倍，说明在Ppr控制下增量表达天冬氨酸激酶基因lysC，根据细胞中丙酮酸的浓度水平，动态增加氨基酸代谢支流，使依克多因的产量增加。
本发明实施例5中，大肠杆菌HEC9摇瓶发酵依克多因的产量是大肠杆菌HEC8的1.21倍，说明通过反义转录抑制zwf基因的表达，减少6-磷酸葡萄糖到HMP途径的代谢流量,显著提高依克多因的产量。
本发明实施例6中，摇瓶发酵24h，经液相色谱检测高效生产依克多因的基因工程菌大肠杆菌HEC9依克多因的产量为16.31g/L。
本发明实施例7中，50L发酵罐发酵46h，经液相色谱检测高效生产依克多因的基因工程菌大肠杆菌HEC9依克多因产量达到63.26g/L。
序列1
ectOPT
atgaacgcaaccacagagccgtttacaccatccgccgacctggccaagccgagcgtggccgatgcggtagtaggtcatgaagcatccccgctgttcattcgtaaaccgtctcctgatgatggttggggtatctacgaactggttaaatcttgtccgccgctggatgtcaactctgcttatgcgtacctgctgctggctactcagttccgtgattcctgtgcagttgctaccaacgaagaaggcgagatcgtaggcttcgtctccggctacgtgaaaagcaacgccccggatacttatttcctgtggcaggttgcggttggcgaaaaagctcgtggcactggtctggctcgtcgtctggtagaagcggtgatgacccgtccggagatggcggaagttcatcacctggaaactaccatcaccccggacaaccaggcgtcttggggtctgtttcgtcgtctggcagatcgttggcaggcaccgttgaacagccgcgaatacttctccaccgatcaactcggcggtgagcatgacccggaaaacctcgttcgcatcggcccgttccagaccgaccagatctgagccgggacgccgcctggccggcccggtacgggccggcaacccgtcttttcgttttatcactttccccccacaggaggtcgcaatgcagacccagattctcgaacgcatggagtccgacgttcgtacctactcccgctccttcccggtcgtcttcaccaaggcgcgcaatgcccgcctgaccgacgaggaagggcgcgagtacatcgacttcctggccggtgccggcaccctgaactacggccacaacaacccgcacctcaagcaggcgctgctcgactatatcgacagcgacggcatcgtccacggcctggacttctggactgcggccaagcgcgactatctggaaaccctggaagaggtgatcctcaagccgcgcggtctcgactacaaggtgcatctgccaggtcctactggcactaatgcagtcgaagcagctatccgcctggcccgtgttgcaaaaggtcgtcacaacatcgtatccttcaccaacggttttcatggtgtaactatgggcgcactggcaaccaccggcaaccgtaaattccgtgaagccactggtggtgtaccgactcaggcggcttctttcatgccgtttgacggctacctgggtagctccactgacaccctggactacttcgagaaactgctgggcgataaatctggtggtctggatgtaccggctgcggtcatcgtggaaaccgttcagggtgaaggcggtatcaacgtagcaggcctggaatggctgaaacgcctggaaagcatctgccgtgccaatgacatcctgctgatcatcgacgatatccaagctggctgcggccgtaccggtaagttcttctccttcgaacacgcaggcattactccggacatcgttaccaacagcaaaagcctgagcggttatggtctgccgttcgctcacgttctgatgcgcccggaactggataaatggaaaccgggtcagtacaatggcacctttcgtggcttcaacctggcattcgctactgcagcggcagccatgcgtaaatactggagcgacgacaccttcgagcgtgacgtgcagcgcaaggctcgcatcgtcgaggaacgcttcggcaagatcgccgcctggctgagcgagaacggcatcgaggcctccgagcgtggccgcgggctgatgcgtggcatcgacgtgggttccggcgatattgccgacaagatcacccaccaagccttcgagaacgggttgatcatcgaaaccagcggtcaggacggcgaagtggtcaagtgcctgtgcccgctgaccattccggacgaagacctggtcgagggactcgacatcctggagaccagcaccaagcaggcctttagctgatcgcctgaggtgcgccatcgggcctgtccatggcatcctgtatcggtcggccgtgcgcggccggccagtcattgattcactggagaatcgacatgatcgttcgcaatctcgaagaagcgcgccagaccgaccgtctggtcaccgccgaaaacggcaactgggacagcacccgcctgtctctggccgaagatggcggcaactgctctttccacattacccgcatctttgaaggcaccgaaacccacatccactacaaacatcactttgaagcagtttactgtattgagggtgaaggtgaggttgaaactctggctgacggtaaaatttggccgatcaagccgggcgacatctacatcctggatcagcacgacgaacacctgctgcgtgctagcaaaaccatgcacctggcttgcgtatttaccccgggcctgacgggtaacgaagttcaccgtgaagacggttcctacgcacctgccgacgaagccgacgaccagaagccgctgtaa
序列2
T7启动子
taatacgactcactatagg
序列3
T7终止子
ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg
序列4
lacZ
atgaccatgattacggattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggctggagtgcgatcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggcagatgcacggttacgatgcgcccatctacaccaacgtgacctatcccattacggtcaatccgccgtttgttcccacggagaatccgacgggttgttactcgctcacatttaatgttgatgaaagctggctacaggaaggccagacgcgaattatttttgatggcgttaactcggcgtttcatctgtggtgcaacgggcgctgggtcggttacggccaggacagtcgtttgccgtctgaatttgacctgagcgcatttttacgcgccggagaaaaccgcctcgcggtgatggtgctgcgctggagtgacggcagttatctggaagatcaggatatgtggcggatgagcggcattttccgtgacgtctcgttgctgcataaaccgactacacaaatcagcgatttccatgttgccactcgctttaatgatgatttcagccgcgctgtactggaggctgaagttcagatgtgcggcgagttgcgtgactacctacgggtaacagtttctttatggcagggtgaaacgcaggtcgccagcggcaccgcgcctttcggcggtgaaattatcgatgagcgtggtggttatgccgatcgcgtcacactacgtctgaacgtcgaaaacccgaaactgtggagcgccgaaatcccgaatctctatcgtgcggtggttgaactgcacaccgccgacggcacgctgattgaagcagaagcctgcgatgtcggtttccgcgaggtgcggattgaaaatggtctgctgctgctgaacggcaagccgttgctgattcgaggcgttaaccgtcacgagcatcatcctctgcatggtcaggtcatggatgagcagacgatggtgcaggatatcctgctgatgaagcagaacaactttaacgccgtgcgctgttcgcattatccgaaccatccgctgtggtacacgctgtgcgaccgctacggcctgtatgtggtggatgaagccaatattgaaacccacggcatggtgccaatgaatcgtctgaccgatgatccgcgctggctaccggcgatgagcgaacgcgtaacgcgaatggtgcagcgcgatcgtaatcacccgagtgtgatcatctggtcgctggggaatgaatcaggccacggcgctaatcacgacgcgctgtatcgctggatcaaatctgtcgatccttcccgcccggtgcagtatgaaggcggcggagccgacaccacggccaccgatattatttgcccgatgtacgcgcgcgtggatgaagaccagcccttcccggctgtgccgaaatggtccatcaaaaaatggctttcgctacctggagagacgcgcccgctgatcctttgcgaatacgcccacgcgatgggtaacagtcttggcggtttcgctaaatactggcaggcgtttcgtcagtatccccgtttacagggcggcttcgtctgggactgggtggatcagtcgctgattaaatatgatgaaaacggcaacccgtggtcggcttacggcggtgattttggcgatacgccgaacgatcgccagttctgtatgaacggtctggtctttgccgaccgcacgccgcatccagcgctgacggaagcaaaacaccagcagcagtttttccagttccgtttatccgggcaaaccatcgaagtgaccagcgaatacctgttccgtcatagcgataacgagctcctgcactggatggtggcgctggatggtaagccgctggcaagcggtgaagtgcctctggatgtcgctccacaaggtaaacagttgattgaactgcctgaactaccgcagccggagagcgccgggcaactctggctcacagtacgcgtagtgcaaccgaacgcgaccgcatggtcagaagccgggcacatcagcgcctggcagcagtggcgtctggcggaaaacctcagtgtgacgctccccgccgcgtcccacgccatcccgcatctgaccaccagcgaaatggatttttgcatcgagctgggtaataagcgttggcaatttaaccgccagtcaggctttctttcacagatgtggattggcgataaaaaacaactgctgacgccgctgcgcgatcagttcacccgtgcaccgctggataacgacattggcgtaagtgaagcgacccgcattgaccctaacgcctgggtcgaacgctggaaggcggcgggccattaccaggccgaagcagcgttgttgcagtgcacggcagatacacttgctgatgcggtgctgattacgaccgctcacgcgtggcagcatcaggggaaaaccttatttatcagccggaaaacctaccggattgatggtagtggtcaaatggcgattaccgttgatgttgaagtggcgagcgatacaccgcatccggcgcggattggcctgaactgccagctggcgcaggtagcagagcgggtaaactggctcggattagggccgcaagaaaactatcccgaccgccttactgccgcctgttttgaccgctgggatctgccattgtcagacatgtataccccgtacgtcttcccgagcgaaaacggtctgcgctgcgggacgcgcgaattgaattatggcccacaccagtggcgcggcgacttccagttcaacatcagccgctacagtcaacagcaactgatggaaaccagccatcgccatctgctgcacgcggaagaaggcacatggctgaatatcgacggtttccatatggggattggtggcgacgactcctggagcccgtcagtatcggcggaattccagctgagcgccggtcgctaccattaccagttggtctggtgtcaaaaataa
序列5
PxylF
gagataattcacaagtgtgcgctcgctcgcaaaataaaatggaatgatgaaactgggtaattcctcgaagagaaaaatgcaataagtacaattgcgcaacaaaagtaagatctcggtcataaatcaagaaataaaccaaaaatcgtaatcgaaagataaaaatctgtaattgttttcccctgtttagttgctaaaaattggttacgtttatcgcggtgattgttacttattaaaactgtcctctaactacagaaggccctacaccatg
序列6
RNAP
atgaacacgattaacatcgctaagaacgacttctctgacatcgaactggctgctatcccgttcaacactctggctgaccattacggtgagcgtttagctcgcgaacagttggcccttgagcatgagtcttacgagatgggtgaagcacgcttccgcaagatgtttgagcgtcaacttaaagctggtgaggttgcggataacgctgccgccaagcctctcatcactaccctactccctaagatgattgcacgcatcaacgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccttccagttcctgcaagaaatcaagccggaagccgtagcgtacatcaccattaagaccactctggcttgcctaaccagtgctgacaatacaaccgttcaggctgtagcaagcgcaatcggtcgggccattgaggacgaggctcgcttcggtcgtatccgtgaccttgaagctaagcacttcaagaaaaacgttgaggaacaactcaacaagcgcgtagggcacgtctacaagaaagcatttatgcaagttgtcgaggctgacatgctctctaagggtctactcggtggcgaggcgtggtcttcgtggcataaggaagactctattcatgtaggagtacgctgcatcgagatgctcattgagtcaaccggaatggttagcttacaccgccaaaatgctggcgtagtaggtcaagactctgagactatcgaactcgcacctgaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcgctggctggcatctctccgatgttccaaccttgcgtagttcctcctaagccgtggactggcattactggtggtggctattgggctaacggtcgtcgtcctctggcgctggtgcgtactcacagtaagaaagcactgatgcgctacgaagacgtttacatgcctgaggtgtacaaagcgattaacattgcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcggtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcattgtccggtcgaggacatccctgcgattgagcgtgaagaactcccgatgaaaccggaagacatcgacatgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaacgtgctgccgctgctgtgtaccgcaaggacaaggctcgcaagtctcgccgtatcagccttgagttcatgcttgagcaagccaataagtttgctaaccataaggccatctggttcccttacaacatggactggcgcggtcgtgtttacgctgtgtcaatgttcaacccgcaaggtaacgatatgaccaaaggactgcttacgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaaggttactactggctgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgataaggttccgttccctgagcgcatcaagttcattgaggaaaaccacgagaacatcatggcttgcgctaagtctccactggagaacacttggtgggctgagcaagattctccgttctgcttccttgcgttctgctttgagtacgctggggtacagcaccacggcctgagctataactgctcccttccgctggcgtttgacgggtcttgctctggcatccagcacttctccgcgatgctccgagatgaggtaggtggtcgcgcggttaacttgcttcctagtgaaaccgttcaggacatctacgggattgttgctaagaaagtcaacgagattctacaagcagacgcaatcaatgggaccgataacgaagtagttaccgtgaccgatgagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaatggctggcttacggtgttactcgcagtgtgactaagcgttcagtcatgacgctggcttacgggtccaaagagttcggcttccgtcaacaagtgctggaagataccattcagccagctattgattccggcaagggtctgatgttcactcagccgaatcaggctgctggatacatggctaagctgatttgggaatctgtgagcgtgacggtggtagctgcggttgaagcaatgaactggcttaagtctgctgctaagctgctggctgctgaggtcaaagataagaagactggagagattcttcgcaagcgttgcgctgtgcattgggtaactcctgatggtttccctgtgtggcaggaatacaagaagcctattcagacgcgcttgaacctgatgttcctcggtcagttccgcttacagcctaccattaacaccaacaaagatagcgagattgatgcacacaaacaggagtctggtatcgctcctaactttgtacacagccaagacggtagccaccttcgtaagactgtagtgtgggcacacgagaagtacggaatcgaatcttttgcactgattcacgactccttcggtaccattccggctgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgcgaaactatggttgacacatatgagtcttgtgatgtactggctgatttctacgaccagttcgctgaccagttgcacgagtctcaattggacaaaatgccagcacttccggctaaaggtaacttgaacctccgtgacatcttagagtcggacttcgcgttcgcgtaa
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序列15
ppc
atgaacgaacaatattccgcattgcgtagtaatgtcagtatgctcggcaaagtgctgggagaaaccatcaaggatgcgttgggagaacacattcttgaacgcgtagaaactatccgtaagttgtcgaaatcttcacgcgctggcaatgatgctaaccgccaggagttgctcaccaccttacaaaatttgtcgaacgacgagctgctgcccgttgcgcgtgcgtttagtcagttcctgaacctggccaacaccgccgagcaataccacagcatttcgccgaaaggcgaagctgccagcaacccggaagtgatcgcccgcaccctgcgtaaactgaaaaaccagccggaactgagcgaagacaccatcaaaaaagcagtggaatcgctgtcgctggaactggtcctcacggctcacccaaccgaaattacccgtcgtacactgatccacaaaatggtggaagtgaacgcctgtttaaaacagctcgataacaaagatatcgctgactacgaacacaaccagctgatgcgtcgcctgcgccagttgatcgcccagtcatggcataccgatgaaatccgtaagctgcgtccaagcccggtagatgaagccaaatggggctttgccgtagtggaaaacagcctgtggcaaggcgtaccaaattacctgcgcgaactgaacgaacaactggaagagaacctcggctacaaactgcccgtcgaatttgttccggtccgttttacttcgtggatgggcggcgaccgcgacggcaacccgaacgtcactgccgatatcacccgccacgtcctgctactcagccgctggaaagccaccgatttgttcctgaaagatattcaggtgctggtttctgaactgtcgatggttgaagcgacccctgaactgctggcgctggttggcgaagaaggtgccgcagaaccgtatcgctatctgatgaaaaacctgcgttctcgcctgatggcgacacaggcatggctggaagcgcgcctgaaaggcgaagaactgccaaaaccagaaggcctgctgacacaaaacgaagaactgtgggaaccgctctacgcttgctaccagtcacttcaggcgtgtggcatgggtattatcgccaacggcgatctgctcgacaccctgcgccgcgtgaaatgtttcggcgtaccgctggtccgtattgatatccgtcaggagagcacgcgtcataccgaagcgctgggcgagctgacccgctacctcggtatcggcgactacgaaagctggtcagaggccgacaaacaggcgttcctgatccgcgaactgaactccaaacgtccgcttctgccgcgcaactggcaaccaagcgccgaaacgcgcgaagtgctcgatacctgccaggtgattgccgaagcaccgcaaggctccattgccgcctacgtgatctcgatggcgaaaacgccgtccgacgtactggctgtccacctgctgctgaaagaagcgggtatcgggtttgcgatgccggttgctccgctgtttgaaaccctcgatgatctgaacaacgccaacgatgtcatgacccagctgctcaatattgactggtatcgtggcctgattcagggcaaacagatggtgatgattggctattccgactcagcaaaagatgcgggagtgatggcagcttcctgggcgcaatatcaggcacaggatgcattaatcaaaacctgcgaaaaagcgggtattgagctgacgttgttccacggtcgcggcggttccattggtcgcggcggcgcacctgctcatgcggcgctgctgtcacaaccgccaggaagcctgaaaggcggcctgcgcgtaaccgaacagggcgagatgatccgctttaaatatggtctgccagaaatcaccgtcagcagcctgtcgctttataccggggcgattctggaagccaacctgctgccaccgccggagccgaaagagagctggcgtcgcattatggatgaactgtcagtcatctcctgcgatgtctaccgcggctacgtacgtgaaaacaaagattttgtgccttacttccgctccgctacgccggaacaagaactgggcaaactgccgttgggttcacgtccggcgaaacgtcgcccaaccggcggcgtcgagtcactacgcgccattccgtggatcttcgcctggacgcaaaaccgtctgatgctccccgcctggctgggtgcaggtacggcgctgcaaaaagtggtcgaagacggcaaacagagcgagctggaggctatgtgccgcgattggccattcttctcgacgcgtctcggcatgctggagatggtcttcgccaaagcagacctgtggctggcggaatactatgaccaacgcctggtagacaaagcactgtggccgttaggtaaagagttacgcaacctgcaagaagaagacatcaaagtggtgctggcgattgccaacgattcccatctgatggccgatctgccgtggattgcagagtctattcagctacggaatatttacaccgacccgctgaacgtattgcaggccgagttgctgcaccgctcccgccaggcagaaaaagaaggccaggaaccggatcctcgcgtcgaacaagcgttaatggtcactattgccgggattgcggcaggtatgcgtaataccggctaa
序列16
LysC
atgtctgaaattgttgtctccaaatttggcggtaccagcgtagctgattttgacgccatgaaccgcagcgctgatattgtgctttctgatgccaacgtgcgtttagttgtcctctcggcttctgctggtatcactaatctgctggtcgctttagctgaaggactggaacctggcgagcgattcgaaaaactcgacgctatccgcaacatccagtttgccattctggaacgtctgcgttacccgaacgttatccgtgaagagattgaacgtctgctggagaacattactgttctggcagaagcggcggcgctggcaacgtctccggcgctgacagatgagctggtcagccacggcgagctgatgtcgaccctgctgtttgttgagatcctgcgcgaacgcgatgttcaggcacagtggtttgatgtacgtaaagtgatgcgtaccaacgaccgatttggtcgtgcagagccagatatagccgcgctggcggaactggccgcgctgcagctgctcccacgtctcaatgaaggcttagtgatcacccagggatttatcggtagcgaaaataaaggtcgtacaacgacgcttggccgtggaggcagcgattatacggcagccttgctggcggaggctttacacgcatctcgtgttgatatctggaccgacgtcccgggcatctacaccaccgatccacgcgtagtttccgcagcaaaacgcattgatgaaatcgcgtttgccgaagcggcagagatggcaacttttggtgcaaaagtactgcatccggcaacgttgctacccgcagtacgcagcgatatcccggtctttgtcggctccagcaaagacccacgcgcaggtggtacgctggtgtgcaataaaactgaaaatccgccgctgttccgcgctctggcgcttcgtcgcaatcagactctgctcactttgcacagcctgaatatgctgcattctcgcggtttcctcgcggaagttttcggcatcctcgcgcggcataatatttcggtagacttaatcaccacgtcagaagtgagcgtggcattaacccttgataccaccggttcaacctccactggcgatacgttgctgacgcaatctctgctgatggagctttccgcactgtgtcgggtggaggtggaagaaggtctggcgctggtcgcgttgattggcaatgacctgtcaaaagcctgcggcgttggcaaagaggtattcggcgtactggaaccgttcaacattcgcatgatttgttatggcgcatccagccataacctgtgcttcctggtgcccggcgaagatgccgagcaggtggtgcaaaaactgcatagtaatttgtttgagtaa
序列17
pdhR
atggcctacagcaaaatccgccaaccaaaactctccgatgtgattgagcagcaactggagtttttgatcctcgaaggcactctccgcccgggcgaaaaactcccaccggaacgcgaactggcaaaacagtttgacgtctcccgtccctccttgcgtgaggcgattcaacgtctcgaagcgaagggcttgttgcttcgtcgccagggtggcggcacttttgtccagagcagcctatggcaaagcttcagcgatccgctggtggagctgctctccgaccatcctgagtcacagtatgacttgctcgaaacacgacacgccctggaaggtatcgccgcttattacgccgcgctgcgtagtaccgatgaagacaaggaacgcatccgtgaactccaccacgccatagagctggcgcagcagtctggcgatctggacgcggaatcaaacgccgtactccagtatcagattgccgtcaccgaagcggcccacaatgtggttctgcttcatctgctaaggtgtatggagccgatgttggcccagaatgtccgccagaacttcgaattgctctattcgcgtcgcgagatgctgccgctggtgagtagtcaccgcacccgcatatttgaagcgattatggccggtaagccggaagaagcgcgcgaagcatcgcatcgccatctggcctttatcgaagaaattttgctcgacagaagtcgtgaagagagccgccgtgagcgttctctgcgtcgtctggagcaacgaaagaattag
序列18
Ppr启动子（带下划线的部分为pdhR box）：taatacgactcactataggcctcattggtatg accaattagaaataattttgtttaactttaagaaggaga。

Claims (7)

1.一株高效生产依克多因的基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌MG1655，编号为ATCC 47076为宿主，其特征在于，
A）基于丙酮酸响应转录因子PdhR，在T7启动子的下游通过融合PCR的方法插入PdhR结合位点PdhR Box，使其转录受到丙酮酸响应转录因子PdhR抑制，利用试剂盒ClonExpress通过无缝克隆的方法构建得到受丙酮酸调控的Ppr启动子；
B）外源引入T7RNAP，在PxylF下表达；
C）外源引入密码子优化的ectABC基因簇，一个拷贝在T7启动子下，另一个拷贝在构建的受丙酮酸调控的强启动子Ppr启动子下；在Ppr控制下增量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc和天冬氨酸激酶基因lysC；
D）通过反义转录抑制thrA和lysA的表达，减少苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸代谢支路的流量并减少其反馈抑制；通过反义转录抑制iclR基因的表达，激活乙醛酸途径，提高重要的前体草酰乙酸的积累；通过反义转录抑制zwf基因的表达，减少6-磷酸葡萄糖到HMP途径的代谢流量；
所述密码子优化的ectABC基因簇将原始外源基因ectABC基因簇序列通过成型的规则修改部分密码子，使其适合大肠杆菌表达的方法，最终人工合成出密码子的DNA片段ectOPT。
2.如权利要求1所述一株高效生产依克多因的基因工程菌，其特征在于，
所述密码子优化的ectABC基因簇为ectOPT，其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1所示；
所述T7启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.2所示；
所述T7终止子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.3所示；
所述PxylF基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.5所示；
所述RNAP基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.6所示；
所述thrA基因的GeneID为945803，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.11所示；
所述lysA基因的GeneID为947313，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.12所示；
所述iclR基因的GeneID为948524，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.13所示；
所述zwf基因的GeneID为946370，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.14所示；
所述ppc基因的GeneID为948457，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.15所示；
所述lysC基因的GeneID为948531，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.16所示；
所述pdhR基因的GeneID为 944827，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.17所示；
所述Ppr启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.18所示。
3.如权利要求1所述一株高效生产依克多因的基因工程菌的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
a)基于转录因子PdhR，在T7启动子的下游通过融合PCR的方法插入丙酮酸响应转录因子PdhR结合位点PdhR Box（ATTGGTATGACCAAT），使其转录受到丙酮酸响应转录因子PdhR抑制，利用试剂盒ClonExpress通过无缝克隆的方法构建带Ppr启动子的质粒pPRZ，从而获得受丙酮酸调控的Ppr启动子;
b)在基因lacZ位点上，通过Cre/loxP技术插入PxylF下表达的T7 RNA聚合酶基因T7RNAP；
c)对伸长盐单胞菌（Halomonas elongata DSM 2581）的ectA、ectB、ectC基因（编码蛋白的GenBank ID：CBV42472、CBV42473、CBV42474）进行密码子优化后分别合成得到基因簇片段ectOPT，在假基因lfhA位点上，通过Cre/loxP技术引入密码子优化后的外源基因ectOPT并在T7启动子下表达；在假基因ycgH位点上，通过Cre/loxP技术外源引入密码子优化后的第二个拷贝的外源基因ectOPT并在Ppr启动子下表达；
d)在假基因yneO位点上，通过Cre/loxP技术引入在P pr 控制下的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，实现ppc基因受控的增量表达；在假基因ilvG位点上，通过Cre/loxP技术引入在P pr 控制下的天冬氨酸激酶基因lysC，实现lysC基因受控增量表达；
e)通过反义转录抑制thrA和lysA的表达，减少苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸代谢支路的流量并减少其反馈抑制。通过反义转录抑制iclR基因的表达，激活乙醛酸途径，提高重要的前体草酰乙酸的积累。通过反义转录抑制zwf基因的表达，减少6-磷酸葡萄糖到HMP途径的代谢流量；
所述密码子优化的ectABC基因簇将原始外源基因ectABC基因簇序列通过成型的规则修改部分密码子，使其适合大肠杆菌表达的方法，最终人工合成出密码子的DNA片段ectOPT。
4.如权利要求3所述一株高效生产依克多因的基因工程菌的制备方法，其特征在于，
所述密码子优化的ectABC基因簇为ectOPT，其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1所示。
5.所述T7启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.2所示；
所述T7终止子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.3所示；
所述lacZ基因的GeneID为945006，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.4所示；
所述PxylF基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.5所示；
所述RNAP基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.6所示；
所述lfhA基因的GeneID为944908，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.7所示；
所述ycgH基因的GeneID为2847703，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.8所示；
所述yneO基因的GeneID为7751623，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.9所示；
所述ilvG基因的GeneID为948279，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.10所示；
所述thrA基因的GeneID为945803，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.11所示；
所述lysA基因的GeneID为947313，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.12所示；
所述iclR基因的GeneID为948524，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.13所示；
所述zwf基因的GeneID为946370，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.14所示；
所述ppc基因的GeneID为948457，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.15所示；
所述lysC基因的GeneID为948531，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.16所示；
所述pdhR基因的GeneID为 944827，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.17所示；
所述Ppr启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.18所示。
6.如权利要求1至4任意一项所述一株高效生产依克多因的基因工程菌的应用，其特征在于，摇瓶发酵培养步骤：
斜面活化：用接种环蘸取-80℃冰箱保存高效生产依克多因的基因工程菌接种至固体试管斜面培养基，33℃-37℃培养14-16h，接种环刮取一环斜面菌苔转接2代试管斜面培养基培养14-16h；
种瓶培养：斜面菌种刮取一环转接至种瓶培养基，33℃-37℃，200-220rpm培养6-9h；
摇瓶发酵培养：按照5-12%接种量接种摇瓶发酵培养基，33℃-37℃，200-220rpm培养22-26h；利用氨水通过苯酚红显色剂控制pH在6.8-7.2，过程中用50%-70%葡萄糖进行补料；3-12h添加木糖，使木糖终浓度为5-20g/L；
活化斜面培养基组成：葡萄糖1-2g/L，蛋白胨5-10g/L，酵母提取物3-6g/L，氯化钠5-10g/L，琼脂条15-25g/L，其余为水，调节pH为7.0-7.2；
种瓶培养基组成为：葡萄糖20-30g/L，蛋白胨2-4g/L，酵母粉4-6g/L，玉米浆5-15g/L，柠檬酸0.3-2g/L，KH2PO40.5-3g/L，K2HPO40.5-3g/L，MgSO40.1-2g/L，FeSO45-15mg/L，其余为水，调节pH为7.0-7.2；
摇瓶发酵培养基组成为：葡萄糖20-30g/L，蛋白胨1-2g/L，酵母粉2-4g/L，玉米浆10-20g/L，柠檬酸2-5g/L，KH2PO42-5g/L，K2HPO42-5g/L，MgSO41-5g/L，FeSO410-50mg/L，MnSO410-50mg/L，其余为水，调节pH为7.0-7.2。
7.如权利要求1至4任意一项所述一株高效生产依克多因的基因工程菌的应用，其特征在于，发酵罐发酵培养步骤：
斜面活化：用接种环蘸取-80℃冰箱保存高效生产依克多因的基因工程菌接种至固体试管斜面培养基，33℃-37℃培养14-
16h，接种环刮取一环斜面菌苔转接2代茄瓶斜面培养基培养14-16h；
菌悬液制备：将斜面菌种用无菌生理盐水洗下，制作成菌悬液；
种子培养：将菌悬液接种于种子培养基，控制pH7.0-7.2，33℃-37℃，溶氧20%-40%，培养6-9h；
发酵培养：按照5-12%接种量接种发酵培养基，氨水控制pH7.0-7.2，33℃-37℃，溶氧20%-40%，培养至糖浓度为0.5g/L以下，用50%-70%葡萄糖进行补料，维持糖浓度为0.5-1.5g/L，5-20h添加木糖，使木糖终浓度为5-20g/L，发酵周期为40-48h；
斜面活化培养基组成：葡萄糖1-2g/L，蛋白胨5-10g/L，酵母提取物3-6g/L，氯化钠5-10g/L，琼脂条15-25g/L，其余为水，调节pH为7.0-7.2；
种子培养基组成为：葡萄糖20-30g/L，蛋白胨2-4g/L，酵母粉5-10g/L，玉米浆10-15g/L，木糖5-20g/L，柠檬酸1-5g/L，KH2PO40.5-3g/L，K2HPO40.5-3g/L，MgSO40.1-2g/L，FeSO45-15mg/L，其余为水，调节pH为7.0-7.2；
发酵培养基组成为：葡萄糖20-30g/L，酵母粉2-6g/L，玉米浆15-20g/L，柠檬酸2-6g/L，KH2PO42-5g/L，K2HPO42-5g/L，MgSO41-5g/L，FeSO410-50mg/L，MnSO410-50mg/L，维生素B1 0.5-5mg/L，其余为水，调节pH为7.0-7.2；
所述溶氧以空气中溶氧校正为100%。
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