JPH01503674A - 2,4‐ジクロルフエノキシ酢酸(2,4‐d)‐モノオキシゲナーゼ形成用の微生物及びプラスミド並びにこれらのプラスミド及び菌株の製法 - Google Patents
2,4‐ジクロルフエノキシ酢酸(2,4‐d)‐モノオキシゲナーゼ形成用の微生物及びプラスミド並びにこれらのプラスミド及び菌株の製法Info
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- JPH01503674A JPH01503674A JP62505314A JP50531487A JPH01503674A JP H01503674 A JPH01503674 A JP H01503674A JP 62505314 A JP62505314 A JP 62505314A JP 50531487 A JP50531487 A JP 50531487A JP H01503674 A JPH01503674 A JP H01503674A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
2.4−ジクロルフェノキク酢酸(2゜4−D)−モノオキシゲナーゼ形成用
の微生物及びプラスミド並びにこれら
のプラスミド及び菌株の製法
本発明は、遺伝子tfdA又は基本的にtlAと同等の遺伝子を、正確に特徴付
けることのできる翅いDNA断片上に含有するプラスミド及び細菌株の遺伝子工
学的製造に関する。この新しいプラスミド及び微生物は、2.4−D−モノオキ
シゲナーゼの製造に並びにこの酵素の2.、i−D分解特性を種々の生物に遺伝
子工学的に転移させるための出発物質として特に好適である(遺伝的に形質転換
された植物ではこれにエリ達成される2、4−r)耐性を含む)。
2.4−D−モノオ午りデナーゼは、2.4−Dを分解する多数の生物中で、2
.4−ジクロルフェノキク酢酸(2,4−D)の物質代謝の第一工程を触媒する
酵素である。2.4−D分解生物には、特に、例えばアキネトバクタ(Ac1n
etobacter ) 、アA/ f21Jデネス(A:Lcallgene
a )、アルトロバクタ(Arthrobacter)、コリネバクテリウA
(Corynebacterium )及びプソイドモナス(Paeulomo
nas )のような土壌細菌が含まれる( G、 R,Ba1l、Can、 J
、 MicrobiOl、 3 : 8’l i(1957) : J、 M、
Bollag及びその他、J、 Agric。
Food Chaz、、 1 6 : 826 (1968) ;R,H,Do
n及びその他、J、 Bactariol、145: 681%(1981)
: W、 C,Rvans及びその他、Proc。
Biochem、Sac、Biochem、J、57巻: 4(1954):W
、 C,Evance及びその他、Biochem、 J、、122:543
(1971) : R,P、 Fisher及びその他、” J、 Bacts
riol、 ”、135ニア98(1978):T、 1.8teensOn及
びその他、J、 G=n、 MierObiOl、、16 : 146 (19
57) : J、 M、 Tiedje及びその他、J、 Agric、 Fo
od Cham、 17 : 1080(1969) : J、 g、 Tyl
er及びその他、Appl。
Microblol、、 28、181(1974):J、M。
Tiedje及びその他、J、 Agric Food Chem、、17:1
021(1969)参照〕。これらの細菌は土壌及そ
び廃水を、農業で使われる殺/7剤及び除草剤で見られる工うなハcxrン化芳
香朕化合物を除去して解毒する際に著しく重要である。
2.4−Dを分解する野性型細菌の計知では菌株アルカリ2ネス・オイトロ7ス
(AlcaligenθBe11trophus ) JMP 134が最も良
く知られておシかり最もその特性が明らかにされている。この菌株は2゜4−r
)の分解に重要な遺伝子全部を含有する大きさ約4 Q kbのプラスミドp、
yp Aを含有する( R,H,Don及びその他の前記文献〕。最近、プラス
ミドpJP4は単離されかつ特徴が解明された( R,H,Don及びその他、
J、 Bacteriol、、161 : 465(1985))。
tlB 、 tfdc 、 tfdD 、 tfaE及びtfdp’として表わ
される2、4−n分解に関与する5個の遺伝子はトランスポゾン突然変異にエリ
局在化されかつE、コリ(coli )中でクローン化された。その際に、R,
H。
non及びその他(J、 Bactarlol、、161:85(1985))
の生化学的研究にニジ4個の遺伝子に酵素機能をもたらすことができた。
しかしながら従来は、遺伝子tfdAをプラスミド1)、TP 4又はそのサブ
フラグメント上に局在化し、単離しかつその構造を解明することに成功していな
い。
ところで不発明にエリ、彷めて遺伝子tfaAk単離し、クローン化しかつ特徴
を明らかにすることができた。それ故、この遺伝子を他の生物上に転移するため
に使用することが可能であり、その目的はtfdAに工りコード化された2、4
−D−モノオキシゲナーゼを他の生物中で発現させるためである。その際に微生
物が該当し、しかしまた例えば植物のような高等生物も該当する。
tfdAを他の微生物に転移することによって、これらの生物によって分解可能
な物質の範囲を拡大することができる。全体的な2.4−n分解の遺伝子の転移
及び発現は細菌に関しては既に記載されている〔J。
Bacteriol、、145 : 681 (1981)及びArch。
)、(icroblol、134:92頁(1983))。しかし単離したtf
dA遺伝子をプソイドモナス又はアルカIJ ’7”ネスの工うなグラム陰性1
中で発現させる研究はまだ行なわれなη為った。このような研究は植物に関して
も知られていなかった。数種の植物による2、4−りの代謝は報告されている(
Weed 5cience ’l 4 :557(197(5)及びZ、 P
flanzenphys+in1.110 :395(1983))。この物質
は、低濃度でオーキシンに似た植物ホルモンとして作用し、それ故細胞培養技術
で使用し、高濃度では植物の細胞並びに植物全体に対して生長抑制物質として作
用し、こnが除草剤としてのその使用の理由である。=チアナ・シルベストリス
(N1cotiana Silvestrig )の−缶体細胞懸濁液培養では
2.4−r)の高まる濃度に合わせてこの合成生長物質に対して、高められた代
謝出に基づく耐性が達成される(M、 H,Zank、1974、Haploi
ds inphysiological and biochθm1cal r
θ5earch、 InHaploids in higher plants
、Advances andpOten1+i& 1.7 Pr O(! e
e (1inga Of th @I F L r a 1− I ntQ r
na t戟h’
onal Symposium 、339頁、カナダ国、0ntariO。
Guelph 〕。
遺伝子tlAが2.4−r)の側鎖の脱離を仲介するので、2.4−D’に失活
化するその能力を細菌から得られた遺伝子を用いて、このLうな遺伝子工学操作
が可能であるすべての植物に転移させることができるはずである。異種遺伝子を
植物及びその子孫に転移する方法は今日まで既に数種の植物について実験され(
M、 De Block 、 L、 Herrera Ea℃rella 、
M、 VanMontagu 、 J、 5cheol及びp、 Z5L社tl
r71iki 、1984、Expression of foreign g
enes in regeneratedplantli and in th
eir ’progeny、 11iiMBOJ、 、3 :1681並びにR
,D、 5hilli℃o 、 M、 W、 5ail、J、 Paezkow
aki、M、 ’MuellAr及びJ、 Potrikue、1985、Hl
gh efficiency direct gone transferto
plantg 5sio / techn010g7 、3 : 1099
)、かつ近いうちに広範な通用可能性を達成することになる。
植物の遺伝的形質転i[flして大きな希望を託すことになり、特に人間にとっ
て重要な新種の有用哨物の開発に関してである(J、 L、Marx、 198
5、Plant gene transfer becomes a fert
ile field。
5cience 230 : 1148 )。遺伝子tfdA K 工り、新し
い遺伝的に転移可能で生体内で選択可能な性質を、従来は僅かな抗生物質−もし
くは除草剤耐性に関してだけ仰られているような、生長抑制物質に対する耐性の
形で適用し得たであろう(R,T、 Fraley及びその他、1983、Ex
pression of bacterial genes 1nplant
cells、 Proc、 Natl Acad、 Sci、 USA 80
:4803及びNature 317 : 741 (198’5 ) )。
初めは本発明は、公知の突然変異法の通用ドに例えばアルカリゲネス・オイトロ
フスJMP 134のような2.4−Dを生長基質として使用し得る細菌株から
2.4−D−モノオキシゲナーゼの撰造遺伝子が失活化されでいる従来公知では
なかった突然変異体を製造することであった。この突然変異体は試験管内でのD
NA組み換え、組み換えDNAによる形質転換及びtfdA又はtfaAとほぼ
同一の遺伝子を含有する組み換えDNAを選択するための傾合的なr1NA転移
という公知方法の通用ドに使用する。
本発明の目的は、遺伝子tfaA又はtfdAと基本的に同等の遺伝子を含有す
るプラスミド、並びにプロモータ領域を含めてこの遺伝子の一部を含有するプラ
スミドである。
本発明によるシラスミドは、2.4−D又は2,4−D類縁化合物の代謝用の遺
伝子を有する野生型細菌からのDNA ’i制限エンドヌクレアーゼで消化し、
かつ生成したDNAフラグメン)”t DNA+)ガーゼを用いて、予め同じ制
限酵素によりその直線型に変換されているプラスミドベクターと連結することに
より製造することができる。
このように生成した組み換えプラスミドでは、本発明によるtfdA含宵プラス
ミドを、該プラスミドを細菌株中に導入し、その菌株から直接tfdAに工り仲
介される話力に基づいてtf+iA含有クローンが選択され得ることに工す同定
することができる。
その工うな細菌株は、生体内での酵素的反応において2.4−D−モノオ卆ノデ
ナーゼにニジ形成された生成物(その基質ではない)を炭素源及びエネルギー源
として使用することができるという性質を有する。
前記の性質を有する菌株の例は、すべての遺伝子が2.4−ザクロルフェノール
の分解に関して活性である本発明によるtfaA突然変異体、更にフェノールの
分解経路を有する菌株アルカリゲネス・オイトロフスJMP 222 、並びに
4−クロルフェノールを利用スルことのできるメンイドモナス(P日8′udo
monaθ) sp、 B13である。槌々の置換基を有するフェノールを分解
することができかつ主にグラム陰性菌群に含まれる他の一連の菌株全クローン化
tlA遺伝子の選択及び同定のための宿主として生成することができる。
クローン化ベクターとしては、E、コリ以外の他の菌株中でも複製増殖する状態
の広範な宿主域のプラスミドを使用すると優れている。
前記の菌株の細胞中にDNAを導入する方法として、1つには、方法が公知であ
る場合にはこれらの菌株の直接的な形質転換が好適である。例えば、シンイドモ
ナス菌及び類縁のグラム陰性菌の形質転換法がある( A、 A、 Meree
r及びJ、 S、 Loutit 、 1979、Trarsformatio
n and transfeclJoHof Paeudomonasaeru
glnoea : effects of toetal 1ons 、J。
Bacteriol、 140 : 37−42 ; A、M、 Chakra
bartylJ、 R,MylrOlJ 、 D、 A、 Fr1ello及び
J、 G、 Vacca 。
i 9 75 、 Transformation of Peeudomon
aa putida+irug −resistancs factor r)
NA、Proc、Natl+Acad。
8ci、 USA 72 : 3647−3651 )。これに対して、文献公
知の方法にL#)E、コリ菌株の形質転換はすべてのグラム陰性菌に関して適用
可能でありかつ極めて効果的であり、引続いてプラスミドを該当する菌株中に接
合に工す転移する。クローン化rlNAの接合性転移には可動性プラスミドベク
ターを使用すると優れている。その際に、転移のために必要な遺伝子は、所謂介
助シラスミドあるいハ特別にそのために偶成された運動性菌株から得られる。
直接好適な生長基質上での選択にニジ得られる前記の菌株か又は前記の方法又は
他の公知の試験系にニジtlAの発現に関して同定されるE、コリのクローンか
ら、tfdA含有プラスミドを公知方法により明瞭に規定し得る化学物質を単離
し得る。
とりわけ、tfdA菌株を生長試験により直接選択するという利点は、すべてが
相対的に経費のかかる酵素試験をベースとする従来公知の方法に比べて、tfa
A含有プラスミドの同定を、殊に遺伝子銀行の製造の際に、即ちrツムDNAの
DNA断片の任意のクローン化の際に生じる非常に多数の種々のプラスミドでも
可能にするという点である。それ故、利点はこの方法を広範に通用し得ることで
ある。それというのもtfdA遺伝子のクローン化が、遺伝子tfdAを良好に
単離し得るプラスミド上に有する野性型株に限定されるばかシでなく、はぼすべ
ての野性型株からも、また該遺伝子を入手し難いプラスミド又は染色体上に含有
するものでも可能だからである。
本発明によるプラスミドは、例えばアルカリゲネス・オイトロフスJMP 13
4から由来し、2.4−Dの分解用遺伝子を含有するシラスミドp、TP 4
’に制限エンドヌクレアーゼH1na Iで切断し、生成したrlNAフラグメ
ントを電気泳動により分離し、かつそれぞれの単離した7ラグメントtw Hi
HdIで切断しかつ脱リン酸化したベクターpVK 101と連結する。可動性
E、コIJ S 17−1 ’t−該組み換えDNAで形質転換しかつプラスミ
ド含有菌株をテトラサイクリン含有培地上で選択する。制限分析にエリ同定され
た組み換えプラスミドを含有する菌株ρλらそのプラスミドr)NA i接合に
より前記のtfdA突然変異体、yh(p 134 : Tn 5−2上に転移
させ、2111つクローン化tfdA遺伝子の発現全2.4−D含有最少培地上
での野性菌株の生長にニジ検出する。このようにして、pJP4から由来する2
1kbのHlnd [フラグメント上に遺伝子tfdA ’i金含有るプラスミ
ドpVJH21t−同定することができる。プラスミドの単離および引続く制限
分析によりクローン化フラグメントの同一性が確認される。
更に、本発明によるプラスミドは、遺伝子tfaAk含有する組み換えプラスミ
ドからサブクローン化(Sub −kloniθren)に工り製造することが
できる。
そのために、リプラスミドを制限エンドヌクレアーゼ1種又は数種で消化し、た
つ生成した断片をr)NA IJが一ゼを用いて、同じ制限エンドヌクレアーゼ
でその直線形に変換さルているベクタープラスミドと連結する。
生成したプラスミドからtfaA含有分を前記のようにして選択することができ
る。
例えば、Sac Iにより生成したプラスミド])VJH21のDNAフラグメ
ン) k Sac lで切断したベクタープラスミドpG3853と結合するこ
とによυプラスミドpG、Ts3’r製造することができる。若干の新しく組み
換えられたプラスミドから、完全、なtlA遺伝子を含有するものを、初めに組
み候えプラスミドr’lNA ’i可動性菌株E、コU S 17−1中に形質
転換し、その後その菌株から接合によりtfdA突然変異体JMP 134 :
Tn 5− ’l中に転移することにx9選択することができる。2.4−D含
有培地上での選択に工り、制限分析にxg明らかにpVJH21カらの2ikb
のHlnd 1フラグメントに、それ故pJP 4に由来する判別する3 kb
のSac l挿入断片を含有するプラスミドが確認さnる。
tfdA含有DNA断片のサブクローン化により、用途に応じて、使用されるプ
ラスミドベクターのa類という点て異なる工うな本発明によるプラスミドを製造
することもできる。
例えば、pGJs3からの3 wb Sa(! IフラグメントをベクターpK
T 231中に再クローン化することができ、その際にプラスミドpKJs 3
1及びpKJs 32が生成しこれらはpGJS3に比べて、有利な制限地図及
び多くのグラム陰性菌中に良好に発現されるカナマイシン耐性にニジtfdAの
他の特徴付けの利点を提供する。次に記載されているようなpKT 231から
誘導されたプラスミドによるtfdA発現の検出法として、E、コリ817−1
から菌株アルカリrネス・オイトロブスJMP 222への接合転移が優れてお
り、引続いて生長基質としての7二ノキシ酢酸の利用に関して試験する。
このシステムは、tfaA突然変異体に比べて、この受容菌株では接合転移が高
い効率で行なわれかつカナマイシン耐性によって他の選択可能なマーカーを使え
るという利点を提供する。
サブクローン化により、tfdA含有DNA 7ラグメントを発現ベクター中に
組み込むこともでき、該ベクター上でtfdA遺伝子が異種プロモータにJ:#
)発現される。
例えば、2,8 kbのSac I / Sad I 7ラグメント、2.0
kbのBamHX / Sal Iフラグメント及び1,4kbのXbaI /
Sad Iフラグメントを発現ベクターpT 7−5及びpT 7−6中にフ
ァージプロモータに直接組み込むことがでも、このプロモータにより遺伝子発現
がプロモータ特異性ANAポリメラーゼによシ目的通シに開始される。新しく組
換えられたプラスミドpTJss’ 035、pTJs’B 45及びpT、T
s’X 535 (これらの製造は例8.9及び10に記載されている)により
発現されたtfdA遺伝子生成物は放射性メチオニンによる特異的標識及び引続
くrルミ気泳動にニジ同定することができる。更に、このシステムは、E、コリ
菌株中で多量の2.4−D−モノオキシデナーゼを製造するのに使用することが
でき、このことにより遺伝子生成物のnI製及び引続く蛋白質化学的及び酵素的
特徴付けが野性型株からその重刷に比べて簡便になシ、それにより他の生物工学
的な適用可能性が初めて研究し得る。
tfdA含有DNAフラグメントのM13ファージ型のファージベクター中での
サブクローン化に工p一本鎖DNAの製造が可能である。これはサンジャー(S
anger )法による塩基配列の測定に使用することができCF、 Sang
er 、 S、 N1cklen及びA、 R。
coulson s 19771) DNA sequenctng wtth
chatn −terminating 1nhibitora、 Proc
+Nat1. Acad、 Sci。
USA74:5463)、更にオリゴヌクレオチドを用いて各塩基の所望の突然
変異誘発に使用することができ、遺伝子中の制限サイトの形成及びアミノ酸配列
の変化を可能にする1つの公知方法である。遺伝子中への制限サイト導入はその
使用可能性を拡大する。それというのもそのことによって異種プロモータを組み
込むための制限サイト及び融合蛋白質を形成するための遺伝子フラグメントラ連
結するための制限サイトが形成されるからであり、これは例えば原核遺伝子を真
核生物中で発現するのに必要である。
pKJS 32 E−らの2.8 kbのSac I / Sal I 7ラグ
メントのファージベクターM13tg130及びM13tg131中へのサブク
ローン化(例16に記載されている工うに)は、遺伝子tfaAk配列決定に利
用できるようにするための可能性を示す。組換え7ア一ジMJSS’ 050及
びM、TSS’031の二本鎖r)NA O修飾により挿入断片DNAで更に変
化させることができる。
更に、本発明によるプラスミドはtfdA含有プラスミドからの修飾に工り生成
することができる。そのようなシラスミドを制限エンドヌクレアーゼ1種又は数
種で処理することにょシ、場合に工りエキソヌクレアーゼで処理しかつ引続いて
DNA末端を環状分子に再連結することにより、欠失した、即ち特定のDNA断
片だけ短かくなった、更に完全なtfdA遺伝子を含有し得るプラスミドが得ら
れる。
例えば、シラスミドpKJ831及びpKJs 32から一定のl’)NA7ラ
グメントを除去することにより、その中に包含されている3 kbの挿入断片を
一方の側ではXba 1制限サイトまでかつ他方の側ではSal P制限サイト
まで短縮することができ、その際にtlAの活性は失なわれない。この工うに生
成した、例4.5及び7に記載のプラスミドpK、TSB 330、pKJS(
x)630及びpKJS 32 FIR△ダは、tfdA遺伝子活性を発現する
ことができる。このようにしてこの遺伝子の位置を1.4kt)のXbaI /
Sad Xフラグメントに制限することができる。
例16に記載されている↓うに、組換え7ア一ジM、TSS’ 030及びM、
rss’ 051の二本鎖形からエキンヌクレアーゼI″’c用いて種々の長さ
のDNA断片を欠失することにニジ、その都度異なるクローン化DNAの領域が
配列決定のための開始点の最も近くに位置する一連の77−ゾが生成される。2
kbのBarnHI / 8al Xフラグメントの配列をオーバーラツプして
配列された部分領域から組合わせることができる。塩基配列の認識からtfdA
を含有するDNAの他の性質、例えばコード領域の位置と長さ及び制限サイトの
位&’に’誘導することができ、このことはtlAを更に利用するのに極めて有
用なはずである。
r、fdA含有プラスミドからのr)NAフラグメントの欠失にエリもしくはD
NAフラグメントのサブクローン化に工り、tf(LA遺伝子の断片を含有する
他の本発明のプラスミドも得られる。例えば、pKJs32からの1.5kl)
の’EcORI / Bam HIXフラグメントpKT231中でサブクロー
ン化することによりシラスミドpKJEΔB130が生じ、このプラスミドはt
fdAの5′末端、即ちプロモータとN末端をコードする配列とを含有し、かつ
酵素的に活性な遺伝子生成物を発現する能力をもはや持っていない。遺伝子の断
片を、同じ解読わく中のゾロ七−夕を含めてコード付けrlNAの5′末端が他
のコード付けrlNAの6′末端と連結しておりかつそれ故その都度のゾロモー
タを認識する有機体中の所謂融合蛋白質を発現させるプラスミドの構成に使用す
ることができる。
本発明によるプラスミドの他の修飾の可能性は、異種DNAセグメントの挿入で
ある。挿入は新しい機能DNA配列、例えば制限サイト、プロモータ、耐性遺伝
子、翻訳−及び転写終止フグナルの導入に通用することができる。異種遺伝子配
列の一部の挿入により融合蛋白質も形成され得る。
異3DNAの挿入の例は、オメガフラグメントをtftlAのコード付は領域の
真中に位置するプラスミドpTJS’ X 535のBg [制限サイト中に挿
入することである(例11)。このフラグメントに工りすべての解読わく中の翻
訳終止コドン及び転写終止シグナルが選択可能な抗生物質耐性と一緒に組み込ま
れる。遺伝子生成物の特異的な放射性標識により並びに2.4−D−モノオキシ
デナーゼに関する生体内酵素試験にニジ(例15)立証することができるように
、組換えプラスミド1)TJ8’X 535オメガに工り、短縮されたもはや酵
素活性ではない蛋白質の発現かも九らされる。
tfaA又はtfdAの部分を含有するクローン化7ラグメントは相同r)NA
配列の検出に、それ故地の生体中のtfdA遺伝子を見出すのに利用することが
できる。そのために、この7ラグメントを本発明によるプラスミドから好適な制
限酵素を用いて切断し、単離し−Dエク文献公知の方法に工す、例えば放射性核
種の組み込みにより標識する。公知の雑種形成法にエリ、ある有機体の全nNA
中で又はそこから製造した遺伝子銀行において、tlAとの相同性を有するフラ
グメントを同定することができる。この工うにして、種々の生物の集団下でも、
tfdAと相同の配列を含有するものを認識することができる。この方法は、新
しい2.4−D分解生成物を見つけ出し71cシかつ該生物中のtfdA遺伝子
を検出するのに使用することができる0
tfdA遺伝子は、好適であれば直接本発明によるシラスミドを用いであるいは
公知の遺伝子工学法を用いて変化させた後で他の生物に転移させることができる
。
転移に工5、tfaAでコード付けされた2、4−D−モノオキシデナーゼを該
生物中で発現させ、それに工り2.4−D又は2.4−r)Th似動物質分解し
得る性質を生物に付与するという目的を追求することができる。
例えば、広範な宿主域を有するtfdA含有プラスミドを種々のグラム陰性菌中
に例14に記載した工うに接合転移することにより、2.4−D又は2.4−D
類似物質を相応するフェノールに変換する能力をこれらの細菌に付与することが
できる。その都度の菌株に固有の分解能力と関連して、前記のことにニジこの菌
株にニジ分解可能な化付物の範囲の拡大がもたらされる。例えば、菌株アルカリ
ゲネス・オイトロフスJMP222はフェノール代謝の遺伝子を有する。それ故
、tfaAの発現はその菌株にフェノキシ酢酸を生長基質として使用する全く新
しい可能性を介助する。菌株プソイドモナス813はフェノール並びに4−クロ
ルフェノールを代謝することができ、かつtfdAに工り同様にフェノキク酢酸
及び4−クロルフェノキシ酢酸ニ基づく生長性を獲得する。tfdAを含有しか
つ相応するフェノールを変換し得る生物による4−クロル−2−メチルフェノキ
シ酢酸、2,4.5−)リクロルフエノキシ酢酸及び類縁化合物の工うな種々の
置換基を有するフェノキシ酢酸の分解も同様に考えられる。それに工っで達成さ
れる生物の分解能範囲の拡大に工り、従来自然界では実現されな〃)つた新しい
性質の開示がいずれにせよなされなかったとしても、それによって野性桑株に比
べて高い分解能を有する菌株あるいは場合により毒性である基質又は分解経路の
生成物に対する工り高い耐性を有するような菌株が形成されるという点で定性的
な改良がもたらされ得る。特に、その工うな菌株は、自然環境の中ではなく、例
えば工業廃水を浄化する浄化装置のような人工的なシステム中の工うな条件丁で
有用なはずである。従来 /%ロデン化芳香族化合物を微生物分解する分野で新
規に形成された菌株を用いて達成された成果の概要が最近公表された( D、
Ghosal、1.− S、 You、 n、 K、 Chattarjes、
A、 M、 Chakrabart7.1985゜Microbialdegr
adation of hal、agented compounds、 Sc
1θnce228: 135−1423゜
遺伝子tfdAの他の使用可能性は、植物へのその転移でちる。異種rlNAに
:り植物を形質転換する方法は文献公知であり〃)つ試験されている。従来は、
主に2つの15f:が類別される:1つはアグロバクテリウム・ツメファチェン
ス(AgrobBct、erium tucoefaciJna )からのT1
プラスミドの機能ヲ利用し、もう1つはエレクトロポレーション(Elektr
oporatlon )、ヒートショック(H1℃z8θchock ) 、塩
化カルシウム処理又はポリエチレングリコール処理の工うな物理的及び化学的手
段の通用FKI物のプロトプラス)k形質転換することをペースとする。植物細
胞t@記の一方か又は他方の方法にエリ形質転換するのは原則的に常に可能であ
るが、いずれにせ工各細胞又は細胞組織〃・ら植物全体9を再生することはでき
ない。現在このことが単子葉植物の遺伝子工学操作に関する主9な障害となって
いる。
植物i tfdAで形質転換することの優れた目的は、遺伝子特性、即ち形質転
換された植物中で2.4−D−モノオ千7デナーゼ活性の発現である。これに工
つて植物は、低濃度でオーキシル類縁植物ホルモンとして作用しかつ高濃度で生
長抑制物質として作用するフェノキシ酢酸誘導体を植物化学的に作用のないフェ
ノールに分解することができるはずである。従って、この特性には、遺伝的に形
質転換さルた植物の選択可能なマー刀−とじての意味がある。
tfdAの工うな原核遺伝子を植物細胞中で発現し得る工うにするために、この
遺伝子を転写及び翻訳に必要な植物特異的シグナル配列と連結しなければならな
い。この連結が、これによって形質転換される植物のゲノム中に遺伝子が偶然的
に組み込まれることにより行なわれるという指摘が知られている。し〃≧しみ核
遺転子は有利に試鱗管内で好適な植物特異性発現シグナルと組み合わさる。例え
ば、一般的に通用可能な方法は、構造遺伝子(これに属する植物のプロモータを
含めて)の5′x端を、植物蛋白のN末端アミノ酸と原核蛋白質の主成分と刀)
ら成りかつ基本特性において原核蛋白と同じである0合蛋白質が形質転換された
植物細胞中で台底される工うに原核遺伝子のコード付は配列と連結することであ
る( R−To Fralθy及びその他、1983゜ExpressioHo
f bactsrial gene81np1ant ce’lls、 Pro
c、 Natl、 Acaa、 Sci、 USA 8Q :4806、J、
paszkoWski、及びM、 W、5aul、1986゜Direct g
one transfer to planl+、 In S。
P、 Colowick F;LびN、 A、 Kaplan (ad )、M
ethods inEnzyllIIolog7118 : 668 )。1つ
の類似方法は、転写されft−m −RNAの翻訳されていない5′領域の一部
を含めて植物プロモータを使用するだけでありかつ植物遺伝子のコード付は領域
の5′末抱放葉する。植物中での発現では、原核遺伝子部分のATGコドンが翻
訳の開始点として有用である。同様にして、植物ウィルスの発現シグナルを使用
することができる(N、 5r1sson。
及びT、 Hohn、 1986、Plant virus vectors
:cauliflower mosaic virus、 In S、 P、
Colowick及びN、 O,Kaplan (sa、)、Methods
in Enzymoxogy i 18:659:)。植物中で原核遺伝子を発
現するためのベクターは文献公知でありかつ一般的に自由に使える。
前記のベクタープラスミドを用いて、植物中で発現可能な原核遺伝子からの遺伝
子を形成するための前提条件は、遺伝子tfdAに関して存在するように塩基配
列を認識することである。これが制限サイトの正確な局在化を可能にし、かつこ
れによって種々のr)NA上セグメント塩基に整合する連結を可能にする。更に
、例えば新しい制限サイトの導入の工うに機能的に重要な新しいDNA配列を展
開するための目的に応じた突然変異生成を初めて可能にする。
以F1本発明を図面及び実施例に基づき詳説する。
実施例では当業界で一般に公知のかつ行なわれている遺伝子工学の方法t−使用
した。遺伝子のクローン化及び遺伝子構造の分析は、既にg、 L、ヴイ/ナツ
カーCL L、 Winnacker %gone ana KIOne 、V
arlagchemla 、 Wainhaim 、 1985 ”l及びR,
W、 、d−−ル)’−(oxa )及びS、 B、プリAH−ズ(Primr
ose )(Pr1nciplQ8 of gene manipulatio
n 、 Blackwθ11Scientific Publ、、0xford
、 1985 )の教科書に記載されている遺伝子工学の像画的方法に工り実施
した。例えば、1. K、セトロウ(5atlOW )及びA、Iレンダ(Ho
1lander ) (GeHetic englneerlng :Pr1n
C1pH1lli and methoaa、pleaum Publ C0r
p8、N、 Y、 )では方法及び技術をそれぞれ最新の水醜までもっていって
いる。特別な刊行物と共に、しばしば実験ハンドブックの形の一般的な操作規定
も利用した( R,’W、 Davia及びその他、Aavancsa bac
tarialgeHeti(!θ: a manual for geneti
c engineering :T、 Maniatig及びその他、Mo1e
cular atoning :T、 J、 5ilhavy及びその他、Ex
psrlmeHts withgone fusions、全部Co1aSpr
ing Harbour I、51bから、N、 Y、 ; A、 Puehl
er ana K、 N、 Timm1s 、 Advancedmolecu
lar genetics 、Springer 5Berlin 。
19’84 ; D、 M、 Glover %DNA craning :
apractical approach 、 JRL Press 、0xf
ord 。
Washington 、 n、 c、、1985]。
1.986年8月28日に、ドイツ微生物保存機関西ドイツ国、デツチンデル在
)に次の微生物が寄託されfc(寄託番号):
E、コ リ (g、coli))!’L4S 174(pT7−5) (DSM
3829)9、y リ (E、coll))Is 174(pT7−6) (
DsM 3830)E、コ リ (E、coll) JA 221(pGss3
3) (DsM 3831)E、コ リ (E、eoxt)Lg 392(pT
Jss’ 035) (DSM 3832)’fi、コ リ (R,(!01i
))!B 101(])VK101) (DSM 383!l)E、コ リ (
E、colt)SK 1592(pKT231) (DSM 3834)E、コ
リ(g、coll)817−1 (pKJs 31) (DSM 3835)E
、:l IJ (E、coli)817−1 (pK、Ts32 FtI(、と
Sヨ’ ) (DSM 3836)Lコ +) (E、coll)317−1(
pKJs(X)650) (DSM 3837)E、コリ(g、coli)SB
C10107(pR1) CD5M 3838)E、コ リ (E、coll)
K2S(poTl−2/pTJs’X535) (DsM 3839)アルカリ
ゲネス・オイトロフス(Alcali3eHeseutrophus) JMP
134(pJP 4) (DSM 3840)アルカリゲネス・オイトロフス
(Alcaligenesautrophue ) JMP 222 (DSM
3841)アルカリゲネス・オイトロフス(、f’−1caligeHθBa
utrophus )、Ty、P134:Tn5−2(pJP4:Tn5−2)
(DSM 3842)アルカリゲネス・オイトロ7ス(Alcaligene
sautrophue)JMP134:Tn5−4 (pJP4:Tn5−4)
(DSM 3843)■面の説明
略 語:
Ap アンビアリン耐性
Km カナマイシン耐性
ko キロベース
M 分子量マーカー
kD キロダルトン
図 面 :
第1図は、pJP 4 E’らクローン化した21kbのHlnd lフラグメ
ント(例1)及びこれから誘導されたサブフラグメント(例3〜7)の由来及び
制限地図、並びに広範な宿主域を有するシラスミドによるアルカリゲネス・オイ
トロフスJMP 222中でのフェノキシ酢酸分解の発現(例14)を示す。矢
印はプラスミドp、yp4中のtfaAの正確な位mt−表示する。
第2□□□、第3図、第4図は、pKT 231から誘導された、EfdA又は
tfdAの一部を含有するプラスミド(例3〜7)を示す。細線はベクタープラ
スミドから由来する部分を表わし、太線はDJP 4から由来する挿入断片を表
わす。
第5図、第6図、第7図は、Ty−ゾロモータゾラスミドpT 7−5及びpT
7−6がら誘導された、tfdA含有挿入フラグメントを有するプラスミド(
例8〜11)を示す。細線はベクタープラスミドから由来する部分を表わし、太
線はpJP 4 v−ら由来する挿入断片を表わす。
第7b図、はプラスミドpTJ8’X 535中へのオメガフラグメントの挿入
を示す(例11)。
第8図は、ポリアクリルアミドデルのオートラジオグラム上の、特異的に放射性
標識し丸缶白質を示し、これらの蛋白質はtfaA’に含有するプラス゛ミドか
らTy−プロモータによp高収率で発現される(例15)。
1 : pTJss’ 035.2 : pTJs’B 435.3 : pT
Js’x535.4 : pTJss’ 036.5 : pTJs’B 43
6.6 : pTJs’X 536゜aは完全標識した全細胞蛋白質を表わし、
btiT7−プロモータの誘導後に特異的に標識した蛋白質を表わす。
第9図、はプラスミドpTJs’X 5 !+ 5(’lカラT 7−プロモー
タに工り発現された短縮されたtfdA遺伝子生成物(2b)’1−pTJs’
X535から発現さt’Lり短縮されていない蛋白質(3b)及び挿入断片を含
まないベクタープラスミドpT7−5(1b)と比較して示す。aは完全に標識
した全細胞蛋白質を表わし、bはTy−プロモータの誘導後に特異的に標識した
蛋白質を表わす。
第10図は、塩基2058個のBam HI / Sal I 7ラグメントの
塩基配列を示し、このフラグメント上で遺伝子tfdAは5′末端から6′末端
に転写される。矢印はtfdAのコード付領域の開始と終止を表わす(例16)
。
例1ニブラスミドpVJH21の製造
a)プラスミドpJp4及びpVK 101の単離アルカリゲネス・オイトロ7
ス、TMP 134 ’i PYF培地Cプトン511/l、酵母エキス31/
/l、フラクトース211/J)250d中で60℃16時間培養する。遠心分
離した細胞からプラスミドpJP4’i単難する(J。
BaeteriOl、135: 227(197B)Pらの方法に工り〕。プラ
スミドpVK 101 (v、 c、 Knauf及びその他、Plasmid
8 : 45 (19B 2 ) :lは、E、コ17 HB 1012))
ら一般に公知のT、マニアチス(Maniatifl )及びその他によるアル
カリ性溶菌法(Mo1ecular cloning : a 1aborat
10ry manual。
C01118pring Harbour Laboratory 5co1a
SpringHarbour、 New York、 i 98.2]に工り
単離fる。
b) pJP 4 ’7j’ら21 kb Hlnd lフラグメントのクロー
ニング
pJP、4 20#j (5QO#)、TAS緩衝液(0,33Mトリス−アセ
テ−)、0.65M酢酸カリウム、0.1M酢酸マグネシウム、51mHvIジ
チオトレイトール(DTT )、3 Q 、nMスペルミジン、p)l 7.9
) 2.5μE及び稀H1nd II 溶液2.5 pg (1単位)を37
℃で120分間恒温保持する。pVl 101 50 μl (t4 pi)、
TAS緩衝液5.5pl及び未稀釈のHlnd [溶液i pg(20単位)L
D成る他の反応混合物を37℃で90分間恒温保持し、その後、子牛の腸内アル
カリ性ホスファターゼ(Ca1f Intestinal AlcalinsP
hogphatass : n工p、 Boshringer Mannhei
m ) 1 ttl(60単位)全添加しかつ更に6o分間恒温株持すム両方の
反応混合物のそれぞれ90μlを0.7%ロウ・メルティング・アがロース・デ
ル(Low −Molting−AgarOsθ−Gel )上で電気泳動lC
Lり分離する。引続いてこのデルを臭化エチジウム溶液(5μg/Wit)中1
5分間で着色し〃1つUv300’nmのDNAバンドを可視化する。pVK
101制限のそれぞれの20 k’bバンド及びpJP 4 制限の2番目に大
きいバンド(21kb)をデルρ)ら切断し、それら両方を合し、〃)つr)N
AをT、マニアチス(Maniatig )及びその他の方法(Mo1ecul
ar cloning : a 1aboratory mannal、、 c
olaSpring Harbour Laboratory 、 Co1d
SpringHarbour 、 New York 、1982 )にエリア
がロースから単離する。エタノールで沈殿させたDNAを連結緩衝fi(66m
M)リスー皿、(5,t5 mM MgCl2.10 mMDT’:l’ 1m
M ATP、 pH7,5) 10μe中に取り、稀T4−DNAリガーゼ1μ
J (0,1単位)を加え、〃≧つ14°Cで16時間恒温林持する(=連結バ
ッチ)。E、コリS 17−1 CBio℃echnolog71 : 784
(1983) )のコンビテン)fl胞’iT、、T、シルヘイビー(5il
havy )及びその他の方法(ExpermeHta wi℃hgane f
ugiona、 C01a Spring Harbour Laborato
ry 。
Co1d Spring Harbour、 New York、 1984
)に工り製造する。このようにして祷られたコンピテント細胞0.21d”e連
結バッチ5μlと混合し、氷上に40分間放置し、その後42℃に6分間加熱し
く=形質転換)弓ト続いてT、マニアチス及びその他によるLB培地(@記診照
)2!!Ltで稀釈しかつ50°Cで60分間恒温保持する(=表現型発現)。
その後、テトラサイクリン10μl/1rrtf含有するLB−寒天プレート上
にそれぞれ0.21tf:塗布する。プレートを37°Cで16時間培養する。
数回のテトラサイクリン耐性コロニーが認められる。
c)pVJH21の同定
この工うしてして得られたテトラサイクリン耐性のコロニーからアルカリ性溶菌
法によりプラスミドDNAの迅速詞製を、T、マニアチス及びその他により記載
されている工うに実施する。前記のアルカリ性ホスファターゼを用いる処理法に
より、それぞれのテトラサイクリン耐性クローンが所望の挿入断片を含有するこ
とが保証される。Eco RIによる制限酵素消化及び引続いてT、マニアチス
及びその他(前記参照)に工90.7%アガロースデル中でDNAフラグメント
を電気泳動にニジ分離することに工り組換えDNAが同定される。
得られたEco RIフラグメントの大きさf 、pJP 4及び1)VK 1
01のEco RI及びHlnd Iに関して文献から公知である大きさく R
,H,non、 J、 Bacteriol、 i61:466(1985)及
び”? C−Knauf及びその他、plasnoia 8 : 45 (19
82) ]と比較することによりベクタープラスミドpVK 101中の挿入D
NA並びにその配列の正確な同定が達成される。
a)pVJH2i中のHlnd *挿入断片の制限地図この工うにして祷られた
、プラスミドpVJH21を含有する菌株をテトラサイクリン20μ9 / r
at、 f含有するLB培地40011Lt中37°Cで16時間培養する。
遠心分離した細胞から、プラスミドnNA i T、マニアチス及びその他(@
記参照)のアルカリ性溶菌法に工り単離する。単離したpVJH21のプラスミ
ドDNA iそれぞれ酵素Eco RI、Bam HI及びSac I並びに次
に挙げる数個の酵素の組合せ9個: Eco RI / Bam HI(1)、
Eco RI / Sac I (2)、Bam HI / Sac I(3)
、Hlnd [/ Eco RI (4)、HlncL [/ Bato HI
(5)、Hlnd I / Sac I (6)、Hlnd I[/ EcO
RI / Bam HI(7)、Hln(1@ / gco RI / Sac
I (8)及びHlnd [/Ba■H,I / Sac I (9) を含
有する種々のバッチで消化させる。nNAフラグメントヲT、マニアチス及びそ
の他(前記参照)により0.7%アガロースデル中で分離しかつフラグメントの
大きさ@ Hlnd Iで切断したラムダr)NAと比較して確定する。このよ
うにして得られたデータを用いてシラスミドp、Tp 4 (R,H,Don
。
J、 Bacterol 161 : 466 (1985)及びpVKlQ
i (V、 C,Knauf at al、 Plastoid 3 : 45
(1982))についてEco RI 、Ram HI及びHlndIに関して
公知の大きさの比土と一緒に制限地図を作成する。
例2ニブラスミドp()JS 3の製造a)プラスミドpVJH21及びp()
8833 Oi離例1で製造したプラスミドpVJH21を含有する組換え菌株
E、コIJ S 17−1及びベクタープラスミドpGs833を含有するE、
コリJA221(o、s。
5harpe oana 29 : 93 (1984) ) kテトラサイク
リン20μ9/Ilt′t−含有するLB培地各6001L!、中37℃で16
時間培養する。遠心分離した細胞から両方のデラスミドヲT、マニアチス2及び
その他(@記参照)のアルカリ性溶菌法により単離する。
b)SacIフラグメントをpVJH21からクローン化pVJH2110tr
l (5tt9 )、1)GSS 33 10μJ(1μg)、TAS Wt
面94 μm s水16ttl及びSac l005μt、<1os位)より成
る反応混合物を67℃で90分間恒温株持する。引続いて、制限酵素41−68
°Cに15分間加熱することにニジ失活化する。DNA ’iT、マニアチス及
びその他の方法(@記診照)によりエタノールで沈殿させ、かつ乾燥した沈殿を
連結緩衝液40μl中に取る。T 4− DNAリガーゼ1μl(1単位)のふ
加後、14℃で16時間恒温保持する。E、1コリLE 392(N、 B、
Murray及びその他、Mol。
G−en、Gonet、150:53(1977))t=T、J、シル5イビー
及びその他の方法(ExperimQlnts Withgone fusio
ns、 Co1d Spring )(arbour Laboratory。
Co1d Spring Harbour 、iew York 、。
1984)17mよりDNAの摩り込みに対してコンビテントであるように処理
し、コンピテント細胞0.21Ltt連結バツチ5μEと混合し、氷上に40分
間放置し、かつ42℃に6分間加熱することにより形質転換する。
LB培地21Itで稀釈しかつ30℃で恒温保持した後で、50μjから20μ
lまでの部分量を、クロラムフェニコール204 / ratを含有するLB−
Q天プレート上に塗布する。プレートを37°Gで16時間恒温保持する。
C)組み換えシラスミドの同定
このようにして得られたクロラムフェニコール耐性クローンを平行して2つのL
B−寒天プレート上に塗布し、そのうちの一方はストレプトマイシン25μg/
−を含有し、他方はクロラムフェニコール20μg/lを含有する。この試験で
ストレプトマイシン感受性が明らかであるクローンからプラスミドDNA ’i
T 、マニアチス及びその他のアルカリ性溶菌迅速法(前記参11[@)によ
り単離する。単離したプラスミド’zsaeIで制限し、DNAフラグメン)t
(1,7%アガロースデル上で電気泳動にエフ分離したつTJV 3 Q Q
nmで観察し得るバンドをラムダファージDNAのHlnd I制限の公知フラ
グメントと比較することにエリベクター〇VK101中に含まれる挿入断片の大
きさを確定する。プラスミドpGJs 3はp()8833と3 kbのDNA
7ラグメントとからの組み換えプラスミドである。プラスミドpVK101は
Sac Iの郁」限すイトヲ有していないので、明らかにクローン化DNA 7
ラグメントはpJP 4の21kbの、Hlnd [フラグメントカら由来する
。
例3=プラスミドpKJ831及びpK、TS 32の製造a)プラスミドp(
)JS 3及びpKT 231の単離例2にニジ製造した、組換えシラスミドp
GJs 3を含有するE、コリI、E392菌株を、クロラムフエニコ−に20
μg/rntktA加しりLB培地400戯中、67°Cで16時間培養する
。ベクタープラスミドpKT 231を含有するE、コリSK i 592 (
M、 Bagdasarian及びその他、Current Topics i
a MicrobiO10g7 andIのmunolog796 : 47
(1982) ]を、カナマイシン50μ97N’を添加したLB培地400m
1中で同じ条件ドに培養する。遠心分離した細胞から両方のプラスミドヲT、マ
ニアチス及びその他のアルカリ性溶菌法(@記参照)に工9単離する。
b)pKT231中のpGJs 3からのSac Iフラグメントの再クローン
化
po、rs340μ1(400■)、pKT 231 4μ!(100η)、T
AS緩衝液6μE1水9μ!及び稀Sac I溶液1μJ(1単位)工り成る反
応混合物を37℃で120分間恒温株持する。引続いて反応混合物を68°Cに
15分間加熱することに工り、制限酵素を失活化する。このバッチに水69μ1
110倍濃縮した連結緩衝液10μl及びT 4− r)NA Uガーゼ1μl
(0,1単位)を加え、かつこの連結バッチを14℃で16時間恒温保持する。
T、 J、シルヘイビー及びその他の方法(Experiments with
gone fuIIIions、 ColdSpring Harbour
Laboratory s coxa SpringHarbour 、New
YOrk 、i 984 )に工り製造したE。
コリIJ 592コンピテント紬胞0.2鱈を連結バッチ10μeと混合し、氷
上で40分間放置し、42°Cで3 分間加Ph L、、LB培地211ILと
混合し、37°C?60分間恒温株持する。50μl〜200μlの部分量を、
カナマイク750μg/ rnA全含有する訪−寒天−プレート上に塗布する。
プレートを37°Cで16時間恒温保持する。
C)組み換えプラスミドの同定
この工うにして得られたカナマイシン耐性クローンを、1つはストレプトマイシ
ン25μg/” 、2つ目はクロラムフェニコール20μ97m1.及び6つ目
はカナマイシン50μg/Ltt含有する6つの異なる団−寒天プレート上に平
行して塗布する。一般に、この試験でストレプトマイシン及びクロラムフェニコ
ールに感受性だがカナマイシン耐性であることが明らかなりローンがベクターp
KT 231 (カナマイクン耐性)とpGJs 3からの3 kbの5ac7
ラグメン) 21−らの組み換えプラスミドを含有する。このプラスミドDNA
t T −マニアチス及びその他の公知の迅速法(前記参照)により単離し、
r)NAをSac I″?l’?l’制限引続いてフラグメン) t 0.7%
アガロースrデルで電気泳動で分析することに工り、単離したDNAの大きさを
測定する。
同じ工うにEco RIを用いて行なった制限分析に工り、ベクタープラスミド
に対する挿入断片の向きが異なっているプラスミドが同定される。プラスミドp
KJs32では、挿入断片のEco RI部位がベクター分のEco RIの直
近に存在する、両方の可能性の形が該当する。このシラスミドはQ、91cb及
びi、5 kbの2つのE(!ORI 7ラグメントを生成する。プラスミドp
K、Ts 31は挿入断片の反対向きの嘴造を有し、2.3kb及び13.5
kbの2つのgco RIフラグメントを供給する。
例4ニブラスミドpKJ88330の製造a)プラスミドpKJs 31の単離
例6で得られた、新規の組み換えプラスミドpKJ S31を含有するE、コリ
LE392のクローンを、カナマイシン5014/Idを添加したLB培地40
0鮮中679Cで16時間培養し、かつ遠心分離した細胞がらT、マニアチス及
びその他のアルカリ性溶菌(前記参照)によりシラスミドnNA i単離する。
b)pKJs31からエリ小さいBan HIフラグメントの欠失
pKJs31 10μ1(500#)、水7μJ、TAs緩衝液2 ttl及び
稀Bam HI溶液1μJ(1単位)工り成る反応混合物を37℃で60分間恒
温保持し、引続いて酵素反応を68℃に15分間加熱することに工り停止する。
この制限バッチに水50μj110倍に濃縮した連結緩衝液8 μm及CuT
4− DNA −IJ if−セ2 ttl(2単位)を加えかつ14°Cで1
6時間恒温ff1Mする。
T、J、ゾルヘイビー及びその他の公知方法(Experiments wit
h gene fugionθ、 Co1d SpringHarbour L
aboratory 、 Co1+i Spring Harbour 、 N
ewYork、1984 )にエリ製造し九E、コリ517−1のコンピテント
細胞Q、2mjを連結バンチ10μlと混合し、氷上で40分間放置し、42°
Cに6分間加熱し、」培地2戯と混合しかつ37°Cで60分間恒温保持する。
50μe〜200μeの部分量をカナマイシン504/mtk含有する」−寒天
−プレート上に塗布する。このプレートを376Cで16時間恒温保持する。
C)小さくなったシラスミドの同定
このようにして得られたカナマイシン耐性クローンから、T、マニアチス及びそ
の他の公知のアルカリ性溶菌の迅速法(前記参照)にニジ単離する。プラスミド
fBg、1■で制限し−D)つr’lNAフラグメントヲ0.7%アガロースr
デルで電気泳動で分離することに工す小さなりam HIフラグメントがpKJ
s 31 E−ら消失したシラスミドが同定される。該プラスミドは唯一のBg
l II 制限サイトラ有し、それ故13.2kbのBgIIf f供給する。
それ故、元のプラスミドpKJs 31とは明ら〃・に異なっておりかつpK、
TSB 330と表わされる。
例5ニブラスミドpKJ832 RH△S′の製造a)プラスミドpKJS 3
2及びpRME 1の単離例3で得られた、新規組み換えプラスミドpKJs3
2ヲ含有するE、コリLE392のクローン並びにE、コリSBC107(pR
MEl)を、カナマイシン50μ9/鯰を砒加したLB培地それぞれ4ooIR
z中、37°Cで16時間培養する。遠心分離した細胞からプラスミドヲT、マ
ニアチス及びその他のアルカリ性溶菌(前記参照)にエリ単離する。
b ) DKJS 321にらの)(ind i / Sal I −7ラグメ
ントの欠失及び引続< pRME iからのHlnd [/Sad I−7ラグ
メントの挿入
pKJs3210μA(500■)、pRME110μI(1μ9 )、水is
μg、’rAsg衝m4ttl、稀H1nd I溶液0.5μl(1単位)及び
稀Sεユニ溶液0.5μl(1単位)エリ族る反応混合物を37°Cで120分
間恒温株持しかつこの酵素反応を68°Cに15分間加熱することにより停止す
る。引続いてこの電1】限バッチ10μeに水25μ1110倍濃度の連結緩衝
蔽4μe及びT4− r)NA−リガーゼ1 pl (1単位)を加えかつ14
°Cで16時間恒温保持する。T、J、シルヘイビーの公知方法(Experi
m@ntBwith gone fusions、 ColdSpring H
arbour T、aboratory 、 Col+i SpringHar
bour 、 New York 、 1981)にXV受容性にしたE、コ’
JS17−1の細胞を連結バッチ10μlと混会し、40分間氷上に放置し、4
2°Cに6分間加熱し、かつLB培培地2m色60分間混合した後で、カナマイ
クン50μ9 / mA f含有するLB−寒天−プレートに塗布する。このプ
レート’e37°Cで16時間恒温保持する。
C)組み換えプラスミドの同定
このようにして得られたカナマイシン耐性クローンから、シラスミドI’)NA
i公知のT、マニアチス及びその他のアルカリ性溶菌迅速法(前記参照)を用
いて単離する。Ba、m HIで制限しかつ得られたDNAフラグメントを電気
泳動に工9分離することにより、pKJs62から畠発して小さなりNA断片が
ベクタ一部分上のカナマイシン耐性遺伝子の真中に位置するHlnd @制限サ
イトと挿入断片上に位置するSal I 制限サイトとの間で除去されていてか
つカナマイシン耐性遺伝子のコード領域の5末4’に有するpRMB 1 :C
’らのH1n+i [/Sal I−7ラグメントにエリ代えられているプラス
ミドが同定される。該シラスミドは長さ16.6及び2.0 kbの2つのBa
m HIフラグメントヲ供給し、それ放間らかに出発物質及び他の可能な連結副
生成物とは異なる。pK、Ts 32り)らの3.Q kt+の挿入断片の0.
2kbのDNA断片が除去されかつカナマイクン耐性遺伝子の一部が同じ遺伝子
的由来の他の遺伝子フラグメントに代えられた構造1示す。このプラスミドがp
KJs 32冊△6′と表わされる。
例6:プラスミドpK、fE△B130の製造a)シラスミドpKT 251及
びpK、TS 52 Ojl離pKT 231の単離については例3に、pKJ
s 32の単離については例5に記載されている。
b) pKJs 52からのlトさい方のgco RI / Bam HI−フ
ラグメントをpKT 231中でクローン化−71iカpKJs 32 1 C
L pi (5DJrrkg )、水sμg。
TAS緩衝液2 ttl並びに酵素pco RI、Bato HI及びPθtI
の托溶液各1μl(1単位)工り成シ、かつ他方がpKT 231 10μ1(
250■)、水6μ11TAS緩衝液2μl並びに酵素gco RI及び9Hm
HIの稀溶液各1μl(1単位)ニジ成る反応混合物2種を37°Cで120
分間恒温株持し、反応を停止させるために15分間68°Gに加熱する。引続い
て、両方の制限バッチ各10μlを混合し、水50μ1110倍濃度の連結緩衝
液8μe及びT 4− DN八−りが−ゼ2μEC2単位)を加えかつツ4°C
で16時間恒温保持すムT、 J、シルヘイビー及びその他の文献公知の方法(
Experiments with gone fusions、 Co1d
SpringHarbour Laboratory 、 ColdSprin
g Harbour 、 NewYOrk%1984)により製造したE、コリ
LE 592のコンピテント細胞0.2 d を連結バンチと混合し、氷上に4
0分間放置し、42°Cに3分間加熱し、LBB地2−と混合し、〃)つ37°
Cで60分間恒温保持する。
50μl〜200μEの部分量をカナマイ7ノ50μg/dを含有するLB −
寒天−プレート上に塗布する。プレートを37℃で16時間恒温保持する。
C)組み換えプラスミドの同定
このようにして得られたカナマイシン耐性クローンを、一方はストレプトマイク
ン25μg/Ntを、他方はカナマイシン50μ97m?−含有する2つのLB
−寒天−プレート上に平行して塗る。この試験でストレプトマイシン耐性である
ことが明ら〃・であるクローンからプラスミド[)NA’((T、マニアナス及
びその他の迅速法(前記参照)に工り単離する。そのDNAをXho Iで制限
しかつ引続いてDNA断片ヲ0.7%アガロースデル中で電気泳動で分離するこ
とにより、3.Qkb及び9.7 kk+の2個のXhOIフラグメントを与え
る組み換えプラスミドの同定を行なうことができる。同じプラスミドを同時にE
CORI及びRam HIで切断する場合、電気泳動分析に工り1.5kk+及
び11.2 icbの2つの断片が生じる。この工うにして同定されたプラスミ
ドは、pKT231のEco RI / Bam HI−フラグメントとプラス
ミドpKJS 32の挿入r)NAに由来する1、5kk+のEco RI/B
am HI−フラグメントとより成る組み換え体である。これをpK、TE△B
130と表わす。
例7:プラスミドpKJs(X) 630 (D 製ma)プラスミドpKJS
B 530の単離例4で得られた組み換えプラスミド1)KJSB 330 ′
!1l−16時間培養し、かつ遠心分離した細胞ρ1らプラスミドDNA f
T、マニアナス及びその他のアルカリ性浴菌にエリ(前記参照)単離する。
b)プラスミドpK、yss 330 yvhらBam HI / Xba I
−7ラグメントの除去
pKJSB 330 20μl(1μg)、水15μ11TAS緩衝液4μl、
稀Xba I fa O,5ttl (2単位)及びffd Bam )(I浴
液0.5μlC2単位)工す収る反応混合物を37℃で120分間恒温保持する
。引続いて、T。
マニアナス及びその他(前記参照)にエフ緩衝させたファノール20μlを加え
、混合し、クロロホルム:インアミルアルコール(24:1)20μEの冷加後
再度混合しかつ遠心分離する。上方の水相を取りかつ一20℃のエタノール12
0μjと混合する。混合物を一20°Cで60分間株存し、その後で遠心分離す
る。
沈殿r)NA ’i冷い70%エタノールで洗い、真空乾燥しかつフレノウ反応
浴液C20mM ) ’)スーHCz、pl”18.0.7 mM MgfJ
2.10U/atrlNAポリメラーゼ■(=フレノウ酵素)〕20μl中に取
る。379Cで5分間予備恒温保持した後で、4種のすべてのデオキクヌクレオ
チド三り7 U (ATP O,125mM 、CTPo、125mM、()T
PO,125mM、TTPo、125mM。
Pharmacia )の溶液2μlを加え、更に5分間恒温保持する。その後
、このバッチ’i T 4−1’)NA −IJが−ゼ25 U / m/、を
含有する連結緩衝液80μlと混合しかつ室温で6時間放置する。引続いて14
8Cで16時間恒温株持する。T、 J、クルヘイピー及びその他の方法(Ex
pe’rimsnts With geQe fusions、 Co1d S
pringHarbour Laboratory、Co1d Spring
Harbour 、NewYork、1984)により製造したE、コリ817
−1のコンぎテント細胞の懸濁液0.21Ltを連結パッチ10μl、!:混合
し、氷上で40分間恒温抹持持後熱処理(42°C,3分間)に工り形質転換し
、LB培地2j!Aを混合しかつ37°Cで60分間恒温保持する。細胞懸濁液
から50〜200μlの部分量をカナマイシン50μ9/l’fc含有するLB
−寒天−プレート上に塗布する。プレートを37°Cで16時間恒温保持する。
C)小型プラスミドの同定
このようにして祷られたカナマイシン耐性クローンからプラスミドDNA ’i
z公知のT、マニアナス及びその他のアルカリ性溶菌迅速法(前記参照)に工り
単離する。プラスミドf Sma Iで制限しかつ次いでr’lNA断片を0.
7%アガロースデル中で電気泳動により分離することに工り、:0KJSB 3
30の挿入断片上のBam HI制限サイトとXba I制限サイトとの間のD
NA断片を失っているプラスミドが同定される。このプラスミドは制限分析にお
いて2.6 kk+及び9.9kbのSma Iフラグメント2種を生成し、こ
れをpKJs(X) 630と表わす。
それ故、これは明らりλに出発生成物pKJs8330とは区別される。
例 8ニア′ラスミド])TJSS′’ 035及びpTJsダ066の製造
a)プラスミドpT7−5 、 pT7−6及びpKJs 32の単能
一方はプラスミドp’r’7−s l他方はプラスミドp’r7−6を含有する
E、コリHMS 174の2種の菌株をアンビンリン50μ& / ru k
添加してT、マニアナス及びその他(前記参照)によりLB培地それぞれ400
紅中、67°0で16時間培養する。遠心分離しfc細胞からプラスミドDNA
’i全公知T、マニアナスのアルカリ性溶菌法により単能する。pKJs 3
2の単能は例5に記載さルている。
b) pKJs 32からのSac l / 5atl−フラグメン) 、’z
pT7−5及びpT7−6中でクローン化pKJs 32 20μl(1μy
)、水15μJ 、 TAS緩衝液4μl及び酵素Sac l及び5atlそれ
ぞれ0.5μl(2単位)Lり成る反応混合物(lk37℃で120分間恒温保
狩保持。pT7−5 2μl(1μ&)(B)か又VipT7−6 2μJ(1
μ&) (C)、水15μl 、 TAS緩衝液2μl及び酵素Sac l及び
5atlそれぞれ0.5μl(2単位)より成る他の2棟の反応混合物を同じ条
汁下で恒温保持する。3つすべての反応に68°Cに15分間加熱することKj
り停止する。制限バッチA(pKJs 32)各16μlを制限バッチB (p
T7−5)7μlもしくは制限バッチC(pT7−6 ) 7μlと混合する両
方の混合物にそnぞれ水50μl、10倍濃度の連結緩衝液8μl及びT 4−
DNA−リガーゼ2μl(2単位)を加える。両方の連結バッチt−14℃で
16時間恒温保持する。T−、Lシルヘイビー及びその他の方法(Experi
ments with gene fusjons、 Co1d Harbou
rLaboratory 、 Co1d Sprjng Harbour *
Npw York 。
1984)により製造したE、コリt、g392のコンピテントm胞子nぞれ0
.2 JIJ ’に連結バッチそれぞれ10μjと混合し、氷上で40分間放置
し、42℃に6分間加熱し、LB培地2紅と混合しかつ37°Cで60分恒温保
狩する。50〜200μjの部分1°を、アンピシリン50μ、&/uk含有す
るLB−寒天−プレート上に塗る。このグレートt67℃で16時間恒温保持す
る。
C)組み洪えプラスミドの同定
このようにして得られたアンビンリン耐性クローンから、グラスミドDNA k
T−マニアチス及びその他の公知のアルカリ性溶菌迅速法(前記参照)によシ
単能する。グラスミドk Bat II及び86m HIで制限しかつBam
HI及びHina mで二重制限(doppelte Re5trjk−tjo
n ) (、、かつ引吐いて7ラグメントt0.7%アガロースrデルで電気泳
動で分離することにより、両方のベクタープラスミドpT 7−5か又はp’r
7−6の1つとpKJS 32の小型Sac l / Sat I−フラグメ
ントヨり成るプラスミドが同定さnる。該組み換えグラスミドは出発生成物とし
てのp’r 7−5の場合には3−Oxb及2.2 KbのBgtlフラグメン
ト2個、5−2 xbのBanHIフラグメント並ひに3.2 Kb及び2.0
kbのBam HI/Hjnal−フラグメント2個會供給しかつこれをpT
Jss’ 035と表わす。出発生成物がpT 7−6の場合には2−8 kb
及び2.2 kbのBgtIlフラグメント2弧5J] kl)のBam HI
フラグメント及び3−Q lcb及び2−OkbのBamH工/ Hina *
−フラグメント2個が生じ、それk pTJss’ 036と表わす。そn故、
該組み換えグラスミドは明らかに七nらの出発生成物pKJs 32 、 pT
7−5もしくはpT 7−6とは異なっている。
例 9ニゲラスミドpTJs’B 435及びpTJS’B 436の製造
a)プラスミドp’r 7−5 、 p’r 7−6及びpKJsB660の単
離
p’r 7−5及びpT 7−6の単離については既に例8に、pKJsB 3
3 Dの単離については例7に記載されている。
b) pKJsB 330からの小型5atl / Ban HI −7ラグメ
ントkpT 7−5及びp’r 7−6中でクローン化
pKJsB 330 40μ!!(2μg)、TAS緩衝液5μl並ひに#累5
atl及びBam HIの稀溶液それぞれ2.5μl(4単位)よシ成る反応混
合物(Al’に37°Cで120分間恒邑保持する。pT 7−5 (B )
2μl(1μg〕もしくはp’r 7−6 (C) 2μJ(1μg)、水20
μA!、TAS緩衝液3 ttl並びに酵素Sat及びBamHlの稀溶液それ
ぞれ2.5μl(4単位)よシ成る他の2&の反応混合物上回じ条件下に恒温保
持する。これらの反応を68℃に15分間加熱することにより停止する。制限バ
ッチA (pKJsB 330 )全部をアガロースゲル(T、マニアテス及び
その他(前記参照)によりエチジワムブロミド0.5μg/ILtk含有するT
、マニアチス及びその他(前記参照)により TBE緩衝液中の0.7チアガロ
ース〕中で電気泳動で分離する。UV線(300nm )で観察可能な両方のD
NAバンドのうち小型の2.OkbのバンドtDEAE膜溶離法によりグルから
次の工9にして単離する:好適な可法のDEAE膜片(5chlejcber
und 5Chue11S & SNA −45) f溶離すべきバンドの下方
の切欠き1〜21ml甲に配置する。
該当するバンドが全く膜によって吸着されるまで電気泳動紮継続する。引続いて
膜勿グルから取り出しかつNET緩衝液(15Q mM NaCt、 0.1
mM EDTA 、 20 mMトリス−HCt、 PH8−0) 10ILt
で10分間洗う。洗浄した膜’((HNET緩責液(I M NaCL 、 0
.1 mM EDTA 。
20 mM )リス−HCl 、pH8,0) 15Dpl中80℃で3D分間
恒温保持する。この溶液?除いて、膜を更に1′0分間淋ET緩衝液50μlで
恒温保狩する。合しに溶離溶液(200μl)を水200μlで稀釈し、次に(
−20°C)エタノール800μlと混合しかつ一20°Cで30分間保存する
。沈殿したDNA i遠心分離しかつこの沈殿を水90μl中に取る。T、マニ
アチス及びその他(前記参照)によ93M酢酸ナトリウム溶液10μ!の添加後
、冷いエタノール200μ!で再び沈殿させ(−20℃、60分間)、遠心分離
し、沈殿を冷い70チエタノールで洗い、真空乾燥させかつ連結緩衝液80μ!
中に取る。そのうちの各40μjに制限バッチB (pT 7−5 ) 3 t
tl (100ng)もしくは制限バッチC(pT 7−6 ) 3 ttl
(100ng)及びT4− DNA−リガーゼ2μJ(1単位)を加えかつ14
°Gで16時間恒温保持する。T、 J、シルヘイビー及びその他の方法(Ex
perjments with gene fusjons 。
Co1d Sprjng Harbour Laboratory * Co1
d SpringHarbour 、 New York + 1984 )に
より製造したE。
コIJ L E 392のコンピテント細胞0.2’#Ll一連結バッチ15μ
ノと混合し、氷上に40分間放置し、42℃に3分間加熱し、LB培地21iL
と混合しかつ37℃で60分間恒邑保持する。50μl〜200μlの部分量を
、アンピシリン50μ9/g’r含有するLB−寒天−プレート上に塗る。該グ
レー)k37℃で16時間恒温保持する。
C)組み換えプラスミドの同定
このようにして得られたアンピシリン耐性クローンからDNA ’i公知である
T、マニアチス及びその他のアルカリ性溶菌迅速法(前記参照ンにより単離する
。デラスミドf EcoRIで制限しかつ引続いてフラグメントラ0.フチアガ
ロースrル中で電気泳動で分離することにより、pKJsB 330からの小型
5atl / Ban HI −フラグメントラ両方のベクターグラスミドの一
方に含有するプラスミドが同定される。出発生成物としてのpT 7−5との組
み換えプラスミドでは3.Q k’b及び1.5kbの2つのEcoRIフラグ
メントが得られ、かつこれi pTJs’B 435と表わし、出発生成物とし
てのp’r 7−6との−l″ラスミドでは2.8 kb及びi、5 kbの2
つのEcoRI 7ラグメントが生じ、これt−p’r、rs’ Bi12と表
わす。
例10:デラスミド])TJS’X 535及びpTJS′’X 536の製造
a)プラスミドp’r 7−5 、 pT 7−6及びpTJss’ 035の
単離
例8で製造したプラスミドpTJss′035 ’に含有するE、コリLg39
2a”アンピンリン50μg / I”l k TjA加含有するLB培地40
0μ甲67℃で16時間培養する。遠心分離した細胞からプラスミドDNA k
T−マニアラス及びその他(前記参照)により単離する。pT7−5及びp’
r 7−6の#L脂は例8に記載されている。
b) pTJss′035からの小型5atI / Xba 1−フラグメント
をp’r 7−5及びp’r 7−6中でクローン化
pTJss”035 6ttl (3ttE/) 、水15pl 、 TAS緩
衝液3 pl並びに酵素Xba l 、 5atI及びBan HIの稀溶液そ
れぞれ2μJ(5単位)よp成る反応混合物(A)t−37°Cで120分間恒
温保持する。p’r7−s(B)2μl!(1μy)か又はpT 7−6 (C
) 2μ!(1μg)、水23μl 、 TAS緩衝液6μ!並びに酵素Xba
l及び5atlの稀溶液各1μl (2−5単位〕よシ厄る他の2種の反応混
合物を同じように恒温保持する。
反応を68℃に15分間加熱することに停止させる。
2種の異なる連結バッチにおいて、制限バッチA(pT、rss’035 )各
5 μA’ (500n、li’ ) t−制限バッチB (pT 7−5 )
15μl又は制限バッチC(p’r 7−6)15紅、水50μ!、連結緩衝
液8μl及びT 4− DNA−リガーゼ2μl(2単位)と混合し、かつ14
℃で16時間恒温保持する。T、 J、シルヘイビー及びその他の方法(Exp
eriments with gene fusions、 ColdSpri
ng Harbour Laboratory−Co1d Sprjng Ha
rbour+New York * 1984 )により製造したE、コリLE
392のコンピテント細胞0.2117 ’に連結バッチ15μノと混合し、氷
上に40分間放飯し、42℃に6分間加熱し、LB培地2都と混合しかつ37℃
で60分間恒温保持する。部分倉50μl〜200μlをアンピンリン50μi
/rLtk含有するLB−4天−プレート上に塗布する。このプレートを37℃
で16時間恒温保持する。
C)組み換えプラスミドの同定
このようにして得られたアンピシリン耐性クローンから、プラスミドDNA t
−τ、マニアチス及びその他(前記参照ンにより単離する。酵素Sma I及び
EcoRIによる制限並びにEcoRI及び5atIによる二重制限により、p
TJss’ O35からの1.4kbの小型5atl / Xba l −フラ
グメント’t−画方のベクタープラスミドpT 7−5もしくはp’r 7−6
中に含有するプラスミドが同定される。出発生成物としてのp’r 7−5との
組み換えプラスミドは3.Q kb及び0.8kbのgcoRIフラグメント2
個、 2.4 kb及び1.41cbのSma Iフラグメント2個及び2.4
kb 、 0.8 kb及びQ、(5kbのEcoRI / 5at1−フラ
グメント6個を生成し、そ% f pTJs’ X 535と表わす。出発生成
物としてのp’r 7−6との組み換えプラスミドは2.8 kb及びQ、8k
bのEcoRIフラグメント2個、 2.2kb及びi、4kbのSma Iフ
ラグメント2個並びに2.2 kb 、 Q、8kb及び0−(S kbのEc
oRI /5atl−7;yグメ7)3個を供給し、こし’1(pTJs′X5
36と表わす。それ故、組み俟えプラスミドは明らかにその出発生成物とは異な
っている。
例11ニブラスミドpTJs′’X 535 、オメガの製造PL) プラスミ
ドpTJs’ X 535及びpDOc 37の単離
一方が例10で製造したプラスミドp’r、ys’x 535を、他方のプラス
ミドpDOc 37と含有する菌株E、コリLg392 2種をアンピシリン5
0μ97HLk添加 含有するLB培地各400酩中、37℃で16時間培養す
る。遠心分離した細胞からグラスミドラT。
マニアラス及びその他(前記参照)によシ単離する。
プラスミドpDOc 37はEcoRI制限サイト2個の間にオメガフラグメン
トラ含有する。pDOC37の代りにプラスミドpHP 45オメガ(Pren
zki及びKr1sch el 984 、 Gene 、 29 : 103
に記載)を同じようにオフガフ2グメント源として使用することができる。
1)、+ pDoc 37からのオメガ7ラグメントをpTJs’ X 535
のBgL ■サイト中にクローン化
一方がpTJs’X535 2fil (111&) 、水14 t’l*TA
S緩衝液2μl及びBgt n 2μJ(3単位)よシ成シかつ他方がpDOc
37 2μlc2μy)、水14μl。
TAS緩衝液2 μi及び稀Bam HI溶液2μ/<4単位)より成る反応混
合物2種を67°Gで120分間恒温保持する。反応を、68℃に15分間加熱
することによシ停止する。両方の制限バッチ各10μlk合つしかつそれに連結
緩衝液80μl及びT 4− DNA −+)ガーゼ1μl(1単位)k加える
。連結バッチ全14℃で16時間恒温保持する。T、 J、シルヘイビー及びそ
の他(Experiments with gene fusions、 Co
’ld SpringHarbour Laboratory、 Co1d S
pringHarbour * NewYork 、 1984 )によシ製造
したE、=+すLE392のコンピテント細胞0.21Ltt一連結バッチ10
μlと混合し、氷上に40分間放置し、42℃に6分間加熱しLB培地2紅と混
合しかつ37℃で60分間恒温保持する。50〜200μlの部分子rk、アン
ピシリン50μg/ILt及びスペクチノマイシン80μg/jLl含有するL
B−寒天−プレート上に塗布する。スペクチノマインンで選択することによシ、
すべての生長クローンがオメガフラグメントを有するシラスミドを含有すること
が明らかである。それというのもこのフラグメントがスペクチノマインン耐性発
現遺伝子を含有するからでおる。
C)組み換えプラスミドの同定
このようにして得られたアンピンリン−及びスペクチノマイシン耐性のクローン
からプラスミドDNA k T−マニアチス及びその他(前記参照)により単離
する。
Hj、、nd lで制限することにより組み換えプラスミド全同定する。その際
に、0.6 kb 、 2.0 kb及び3−2 kt+のHi、nd mフラ
グメントろ種が生じ、これは前回のBgt■サイトにオメガフラグメント奮起み
込んだpTJs″x535の誘導体である。BgtH−及びBam HIフラグ
メントの適合性l複末端の連結によシ、制限サイトBgt 11及びB(1mH
Iは連結サイトで失なわれる。この組み侠えプラスミドi pTJS’χ565
オメガと表わす。
例12:ファージMJSS’ Qろ0及びMJSS’031の製造
aJ 7″′ラスミドpKJS 32並びに2本鎖形のファージM13tg13
0及びM i 3 tg161の単離
菌株E、コリJ M 101 (J、 Messing及びその他、Nucl
Acjds Res、 9 : 309 (1981) )並びにベクターM1
3tg130及びM 13 tg 131 CM。
P−Kjeny及びその他、 C)ene 26 : 91 (1983))の
二本鎖DNAはアマーンヤム・プフラー(AmerShamBuchler (
)mb H& Co−K O、Braunschvrejg在】から入手し得る
。二本鎖DNAは仄の方法でも得られる:T+J、ンルヘイビー及びその他(E
xperjments wlthgene fusjons、Co1d Spr
jng Harbour Laboratory−Cold SpringHa
rbour 、 New York 、 1984 )により製造したE、コリ
JM101のコンピテント細胞0.2 jljf文献公知の方法によ!11M1
3ベクターの一本鎖一又は二本鎖DNAで形質転換し、溶融(45℃)H−To
p−寒天(10g/l! )リゾトン、 81!/lNaC1、8g / l
寒天)3dと混合し、H−寒天−7’レー ト <109/l ト +) プ
) ン 、89/ ll NaC1、12g1IN天ン上に注ぐ。冷却したプレ
ー)’!I:37°Cで16時間恒温保持する。TY培地<16j9/lト1)
デトン、1 Gg/l酵母エキス、59/1Nacl) 2mにTY培地中のE
、コリJM101の一晩培養物(67℃。
16時間)20μl及びH−寒天−グレートの各溶菌斑會接種する。67°Cで
16時間生長はせた後で、ファージ感染細胞’(E−コ!jJM101の新しい
一晩培養物2μと一緒にTY培地dQQd中に移種し、67°Cで16時間培養
する。遠心分離した細胞から二本鎖DNA 奮T−マニアテス及びその他(前記
参照〕により単離する。プラスミドpKJS 32の単離は例5に既に記載され
ている。
b) pKJS 32からのSac I / 5atI−フラグメントをM13
tg130及びM13tg131中にクローン化
pKJs 32 30μl(1,5μg)、水20μl 、 TAS緩衝液6μ
l及び酵素Sac I及び5atlの稀溶液それぞれ2μJ(4単位)より成る
反応混合物(A)t−37℃で120分間恒温保持する。y13tg130CB
)又はM13tg131(C)の二本銭DNA 10pi (300n& )
、水25 μl 、 TAS緩衝液4 ttl並びに酵素Sa c I及び5a
tlの稀溶液各0.5μl(1単伽より成る他の反応混合物2種を同じように恒
温保持し、かつ反応を停止するために15分間68°Cに加熱する。
全制限バンチAfアがロースグル〔アガロース0.7%。
TBE緩伽液中のエチゾウムブロミド0.5μg/戯、T。
マニアチス及びその他〔前記参照)により〕中で電気泳動により分離する。UV
線で観察さnるDNAバンドのうち2.8 kl)の小型Sac 1 / 5a
tI−バンドを例9で2.0 kbのバンドに関して記載したようにデルからD
RAg膜を用いて単離する。最後に、DNA?水80μ!中に取シ、そのうちの
それぞれ40μlに制限バンチB(M13tg130)もしくはc (M13
tg131)20μ!及び水40μlk加え、緩衝したフェノール/クロロホル
ム100μlとT、マニアテス及びその他(前記#H,)によジ混合し、かつ遠
心処理する。水性上相を取り、T、マニアチス及びその他(前記参PfA)によ
53M酢酸ナトリウム溶液10μlの添加後冷い(−20’CE)エタノールそ
れぞれ200μlと混合する。混合物を一20°Cで60分間放置し、引続いて
遠心処理し、沈殿を冷い70チエタノールで洗い、真空乾燥しかつ連結緩衝液4
0μl中に取る。両方のパンチにT 4− DNA−リガーゼ各1μ!(1単位
)を加えかつ14°Cで16時間恒温保持する。T−J、シルヘイビー及びその
他(Experiments with gene fusjons+Co1d
Sprjng Harbour Laboratory、 Co1d Spr
ingHarbour 、 New York 、 1984 )によシ製造し
たE。
コ!JJM101のコンピテント細胞それぞれ0−211一連結バッチ10μl
と混合し、氷上で40分間放置し、42℃に3分間加熱し、かつ溶融(45°C
) H−Top−寒天それぞれ3鮭と混合する。混合物にそれぞれIPTG 4
Q ttl (10Q mM )及びx −GaA 40 ttl (ジメチ
ルホルムアミド中2%)を加えかつH−寒天−グレート上に注ぐ。冷却したプレ
ート上37°Cで16時間恒温保持する。
C)組み換えファージの同定
このようにして得られた溶菌斑のうち、宵に着色していないものが組み換えファ
ージから由来する。更に同定するために、二本鎖−及び−重鎖DNA ’i無色
の溶菌斑から文献公知の方法(Amer8hamの@M13C1onjngan
d Sequencing Handbookに総括されている)により単離す
る。二本鎖DNA f Egl lで制限しかつ引続いてDNA 7ラグメント
ヲ電気泳動で分離することによシ、pKJS 32からの小型Sac I /
5atl−7ラグメントを含有するM13tg130もしくはM 13 tg1
61の誘導体が同定される。ベクターとしての)116tg130との組み換え
ファージは0.7 kb 、 2.2 kk+及び7−1kbのBgt llフ
ラグメント3個を示し、これ1y、rss’030と表わすa M 13 tg
l 31とのものは[+、6 kb T O,7kb 、 2.2 kb及び6
.6 kbのBgt l[フラグメント4個を示し、これ1(MJSS’ D
31と表わす。
それらは、明らかにその出発生成物とは異なっている。
例i 3 : tfdA−突然変異体アルカリゲネス・オイトロフスJMP 1
34 : Tn 5−2及びJMP134: Tn 5−4
a)アルカリゲネス・オイトロフスJMP134のトランスポゾン突然変異誘発
PYE培地(ペプトン59/1.酵母エキス39/1)10μにアルカリゲネス
・オイトロフスJMP 134(R,H,Don及びその他、 J、Bacte
rjol 145 :681(1981):]の−晩培養物(16時間、30°
C)マニアチス及びその他(前記参照)によるLB培地10紅は、プラスミドp
SVP 2021 ’c金含有ルE。
コ リ S 1 7 − 1 (Bjotechnology 1 : 7 8
4 (1983))の−晩培養物Q、1iAi接種し、かつ37℃で5時間振
盪する。引続いて、両方の培養物について光度計で改良600 nmで光学密度
を測定する。培養物をその光学密度に関連して比1:1で混合しかつ混合物1.
51’i PYE −4天−プレート[R,H,Don及びその他、J。
Bacteriol、 145 : 681 (1981) ]上に分散さぜる
。プレートを30°Cで16時間恒織保持する。
引続いて、細菌全滅M O,7チNaC1溶液1.5μでプレートから洗浄しか
つ細菌懸濁液奮2工程で0.7チNa CL浴液を用いてその都度1 : 10
(0,IIu+0.9mL)に稀釈する。それぞれの稀釈液から部分量50μ
a、iooμ7.200μ!及び400μlを付加的にフラクトース29/l及
びカナマイノン380μム1.69/1.−硫酸二水素カリウムD−49/1.
硫酸アンモニウム1j?/1.meRマグネシウム・7 H2O0、05&/1
.硫酸鉄(■)・7 H2O 0.0 1 f;l/l 。
寒天15E/l)上に塗る。プレートを60℃で3〜7日間恒温保持する。
b)トランス?シン含有菌株による2,4−D分解試験
このようにして得られたカナマイシン耐性クローンは、トランスポゾンTn5’
iそのrツム中に安定的に組み込んだ菌株JMP 1 3 4の子孫である。こ
れを一方は2.4−ジクロルフェノキン酢酸・ナトリウム塩(2.4−D)1m
Mを含有し、他方はフラクトース2171及びカナマイシン380μF / !
A k含有する2つの最少寒天プレート上に平行して塗布する。プレートを30
℃で6日間恒温保持する。2.4−D分解tm発する遺伝子の1つにおいて突然
変異を示す菌株は2.4−In生長基質として使用することはできない(2.4
−D陰性す。それはトランスボ・lン含有カナマイシン耐性クローン全体に対し
て0.1〜1チの頻度で坑われる。
c)2.4−D陰性突然変異体の遺伝子欠失の同定
このようにして得られ7’c2,4−D陰性突然変異体を、一方け3−クロル安
息香酸・ナトリウム塩(6−CB)2 mM k含有し、他方はフラクトース2
9/1及びカナマイシン680μF/jlj’に官有する最少寒天プレート2つ
に平行して塗布する。プレートを60°Gで6日間恒温保持する。2.4−D分
解の遺伝子?,fdC 、 tfd D及びtfd E中に突然変異を有する菌
株JMP164の2.4−D陰性トランスポゾン突然変異体は、トンC Don
)及びその他C J. Bacteriol 1 6 1 :85(1985
))が示すことができたように3−CBを生長基質として使用することはできな
い。これに対して遺伝子tfd A及びtfd Bにおける突然変異体が唯一の
炭素源としての3−CB上で生長し得る(3−CB陽性)。それ故、この試験に
おいて更に3−CB陽性が明らかになるトランスメゾン突然変異体を#素試験に
よシ遺転子t,fd A又はtfd B Kおける欠失について試験する。その
ために菌株をピルビン酸ナトリウム75 mM及び3−CB1mMk添加含有す
る最少培地(前記のような、寒天を含まない)250M中606Cで16時間培
養する。細胞上4°Cの遠心処理によp採取し、冷い(4°C)最少培地(炭素
源含まず)10ム中で3回洗い、再び遠心処理し、かつ最後に4 2 0 nm
で光学密度30’に有するような童の最少培地中に懸濁サセル。2 、4−D−
モノオキシゲナーゼもしくは2、4−ジクロルフェノールヒドロキシラーゼの酵
素試験に関して、細胞懸濁液1容普部を酵素でtl!和した最少培地9容量部と
混合して、4 2 0 nmの光学密度が3であるようにする。市販の酸素電極
を用いて10分間にわたって基質添加せずに酸素吸収全追跡する。
引続いて、2.4−D’に最終濃度imM又a2.4ーゾクロルフェノールを最
終濃度0.2 mMまで添加しかつ酸素濃度の低下′f20分間にわたつ工追跡
する。この試験によシ、t,fdA突然変異体t′jべての他の突然変異型並び
に野性型菌株JMP 1 3 4から区別することができる。七nは2.4−D
の添加後に酸素消費の上昇を示さず、2,4−ジクロルフェノールの添加後に酸
素°吸収の有意な上昇が起る。野性型菌株並びにtfdB突然変異体は基質とし
て2.4−Dの添加後に高まった酸素消費を示し、それ故完全な2.4−D−モ
ノオキシゲナーゼである。両方のトランス?シン突然変異体JMP 136 :
Tn 5−2及びJMP 134 : Tn 5−4では検出可能な2,4−
ジクロルフェノールヒドロキシダーゼを有するが、検出可能な2 、4−D−モ
ノオキシゲナーゼを有していない2.4−D陰性で6−CB陽性突然変異体2種
が該当する。それ故tfd A突然変異体として同定することができる。この整
理の仕方は更に以下の実施例に記載の実際によって確認される。
例14:クローン化されたtfd A遺伝子の、E、コリ以外の他のグラム陰性
菌中での発現
aJtfdA含有プラスミドを接合転移するための供与菌株の製造
pVK 101 Cv、 c、 Knauf及びその他z Plasmld 3
: 45 (1982) ] 、 pGss 33 CO−S、 5harpe
。
()ene 29 : 93 (1984) )及びpKT 231 CM。
Bagdasarj an及びその他* Current Topjcs jn
Micro−biology and Immunology 96 : 4
7 (1982) )のような広範な宿主域を有する可動性ベクターをペースと
して形成されたプラスミド(これらの製造は例1〜7に記載さ扛ている)を、可
動性菌株E、コ!JS17−1 〔Bjot、echnology 1 : 7
84 (1983) )から例えばアルカリゲネス・オイトロ7ス及びプソイド
モナス・プチダのような他のグラム陰性菌への接合により転移させることができ
る。−七のために、プラスミドがE、コリ317−1中でクローン化されていな
い場合には初めに形質転換によりこの菌株中に導入しなければならない。このた
めに、該当するプラスミド?含有するE、コリLE392のクローンからプラス
ミドDNA ’i T、マニアチス及びその他(前記参照ンにより単陥し、T、
J、ンルヘイビー及びその他(F:xperimentswith gene
fusions、Co1d Spring Harbour Laborat
o−ry 、Co’ld SprjngHarbour 、 New Yorl
c 、 1984〕によt)製造したE、コリLg392のコンピテント細胞0
.2 M k年子したプラスミドDNA 1μlと混合し、氷上に40分間放重
し、42°Cに6分間加熱し、LB培地2aと混合し、67°Cで60分間恒温
保持する。
50〜200μjの部分音を、選択に好適な抗生物質を含有するLB−Q天−プ
レート上に塗布する。プレー)’に37℃で16時間恒恒温持する。
b)接合転移
このようにして得られた、例1〜7に記載のプラスミドを含有する菌株E、コy
s 17−1 k選択するのに好適な抗生物/j[?含有するLB培地5紅中
37°Cで16時間培饗する。受容菌として、例13で都嘔したtfd A突然
変異体のいずれか1つ(A)、pJP 4を含まない菌株アルカリゲネス・オイ
トロフス、nAP222[R,H,Don及びその他、 J、 Bacterj
ol、 145 :681 (1981))(B)又はシンイドモナスgpc。
B 13 (E、 Dorn及びその他” Arch、 Mjcrobiol、
99:61 (1974))(C)をPYE培地(ペプトン6&/l 、酵母
エキス3j;l/l )5u中、30℃テ16時間培養する。供与菌株の細胞を
遠心分触しかつ2倍容童のpyE培地中に慇濁させる。供与細胞の懸濁液及び受
容菌の培養物上回鎗部で混合する。混合物100μlypyE−g天−プレート
の表面上に配置した膜フイルタ−(Milljpore HA 0.45μm)
上にピペット装入する。引続いて、プレー)?1″30℃で6時間恒温保持する
。その後で、細胞を〇、7チNa C1溶液1mgでフィルターから洗出し、か
つ細抱懸濁敢を7段階で0.7チNaC1溶液を用いてその都度1:10(0,
1g+0.91J )に稀釈する。各稀釈液のうち100μlを次の生長基質を
含有する最少球入プレート上に塗布する: A (t、fd A突然変異体)で
は2 、4− D 1 mM 、 B(アルカリゲネス・オイトロフス、、TM
P 222 )ではフェノキン酢酸−NB 4 mMあるいはC(プソイドモナ
スB13ンでは4−クロルフェノキシ酢酸−NalllnM0プレートをAでは
14日間、B及びCでは4日間30’Cで恒温保持する。
C)新規に形成した菌株の特性
完全tfd A遺伝子を含有する前記の計知からの、広範な宿主域を有する可動
性プラスミドによシ、それぞれの受容菌株への接合転移後に機能性の2.4−D
−モノオキシゲナーゼ全合成することができる。これはA (tfd A突然変
異体)の場合には突然変異の相補性、それ故2.4−Dの利用に関して野性型特
性の再現をもたらし、りま、jl)2.4−D最少寒天プレート上で2.4−D
陽性菌株が生じる。更に、tfd Aによシコード付けさルた2、4−D−モノ
オキシゲナーゼは、2.4−Dと共に2.4−Dと化学的に類縁の化合物フェノ
キシ酢酸及び4−クロルフェノキシ酢酸會も酵素的に変洪することかでき、その
際に生成物としてフェノールもしく1″114−クロルフェノールが形成される
。
菌株アルカリゲネス・オイトロフスJMP 2221dフ工ノール?完全代謝す
る遺伝子?有するので、Bの場合tfd A含有プラスミドの接合転移後に、フ
ェノキシ酢酸を生長基質として利用するという新しい%性?有する菌株が生じる
。同じように、それと−緒に準備しlcsフェノール及び4−クロルフェノール
の元金分解経路【有するtfd A含有プラスミドのシンイドモナス813が基
質フェノキシ酢酸及び4−クロルフェノキシ酢酸上で生長することができる(C
,l。特に、前記のような一定の基質の利用に閃する試験は、可動性広範な宿主
域ベクター(Broad −Ho5t −Range −Vektoren )
中でクローン化されたDNAフラグメント及びその小型誘導物(それらの製造は
例1〜7に記載)によりtfdA遺伝子の発現を検出するのに好適でおる。その
際に、プラスミドpVJH21、pGJs 3 、 px、rs 31 、 p
KJs32゜pKJsg 330 、 pK、rs 32 RH△g及びpKJ
s(X) 630はすべて完全なtfd A遺伝子音含有するが、プラスミドp
KJ衣130は機能性の遺伝子生成をコードしないことが明らかである。
例15 : E−コリ甲のtfd Aコード付け2.4−D−モノオキシゲナー
ゼの富化
a)高生産性E、コリ菌株の製造
Taborにより構成されたベクターp’r 7−5及びp’r7−6をペース
として製造した組み換えプラスミド(例8.9.10及び11に記載)は、ファ
ージT7の強力なプロモータに続いてクローン化DNAフラグメント?官有する
。完全なtf(i A遺伝子をプロモータに対して正しい向きで含有するこの計
知からのプラスミドは、プラスミドp()P 1−2 CS、 Tabor及び
その他。
Proc、 Natl−ACaa、 Sci、 USA 82 : 1074
(1985):1からの発境T7−RNA−ポリメラーゼの作用下にE。
コリに38中で多蓋の2.4−D−モノオキシゲナーゼr生産し得る。デロモー
クF′i特異的にT7−囲A−,1? IJメラーゼによってのみ認識され、か
つこのポリメラーゼはプラスミドpGP 1−2上に感熱性ラムダリプレッサー
の制御下に位置するので、遺伝子生成物の合成は熱により@発される。更に、リ
ファンビンンの添加により、細菌性RNAポリメラーゼを抑制することが得られ
たプラスミド官有菌株E、コ!j L E 392からプラスミドDNA k
T、マニアチス及びその他(前記参照ンによp単離する。プラスミドpGP 1
−2 k含有するE、コリに38k、pGPl−2の選択のためにカナマイシン
50μ、fi+/
16時間培養する。生長した培養物からコンピテント細胞iT.J.ンルヘイビ
ー及びその他の方法( Expe−rjments with gene fu
sions. Co1d Spring HarbourLaboratory
、 Co1d SpringHarbour 、 New York 。
1984)Kよジ製造する。コンピテント細胞0.2 ILtを単離したDNA
1μノと混合し、氷上に40分間放置し、37℃に5分間加熱し、LB培地2
aと混合しかつ60°Gで60分間恒温保持する。50〜200μlの部分量を
アンピンリン50μg/ll1t及びカナマイシン50μ9/μを含有するLE
−寒天プレート上に塗布する。グレー)’(r30℃で16時間恒温保持する。
b)誘発された製造及びtfd A遺伝子生成物の放射性標識
このようにして得られたアンピンリン−及びカナマイシン耐性クローンはプラス
ミドp()P 1 − 2及び組み換えpT 7誘導体の1つ全含有する。これ
を、アンぎシリン50μ9/酩及びカナマイシン5Dμ& / I’L k 添
加含有するLB培地10μ中、60°Cで培養する。
5 9 0 nmで測定した光学密度0.5で培養物0.2μを遠心分難する。
細胞’tM9培地5紅中でT,マニアチス及びその他(前記βp@)によシ洗浄
し、再び遠心分離し、最後に、チアミン20μm1/ILI=並びにメチオニン
及びシスティン以外のすべてのプロテイノグン( proteinogen )
アミノ酸(全部で18)各C1.0 1 %を含有するM9培地11nt中に懸
濁させる。細胞懸燭液k ’5 0 0Cで60分間振盪し、次に温度上42℃
に高める。15分後に、リファンピンン溶液(メタノール中20■/舵)10μ
lを添加しかつノ(ツチを史に42°Cで10分間放置する。その後、@度?再
び30°Gに低下させ、20分後にパッチはL − ( 35S )メチオニン
( Amersham 、 cell 1abeljng grade ) 1
0 μ Cjt− 加えかつ室温で5分間放置する。引続いて、細胞全遠心分離
し、担′rf緩衝液(トリス−HCl (5 3 mM 、 pH 6.13。
ラウリル硫酸ナトリウム1チ.2−メルカプトエタノール1%,グリセリン10
%.ブロムフェノールブルー0.01 %) 1 20plCPIICM濁し、
かつ95℃に6分間加熱する。
C)%異的に放射性標識したtfd A遺伝子生成物の同定
このようにして得られた試料’aー12.5%ーポリアクリルアミドpy’ル[
U. K. Laemmli 、 Nature 2 2 7 :680(1
970))上に負荷しかつ全細菌性蛋白質を前記の文献公知の方法により電気泳
動により分離する。電気泳動の終結後、グル全セルバ・プラウ( 5ERVAB
lau ) G 2−5 9 pメタノール4 5 4 m 、酢M92ILt
及び水454μからの混合物中で30分間着色させ、引続いてメタノール5ON
,酢散75μ及び水875iLからの混合物中で24時間脱色する。デルを濾紙
( Whatman 3 M M )上で市販のグル乾燥機を用いて乾燥させ、
引続いてT.マニアチス及びその他(前記参照〕によりX線フィルム( Kod
ak IndustrexAX )でオートラジオグラフィを実施しかつフィル
ムを現像する。オートラジオグラム上に個々の標識蛋白質が、pGP i −
2と共にプラスミドpTJss’ 0 3 5 。
pTJs’ B 4 3 5 、 pTJS’X 5 3 5又はpTJS’
X 5 3 5オメガの1つ?含有する菌株で同定される。こnらのすべての相
同シラスミドには、クローン化フラグメントがT 7 − RNA−ポリメラー
ゼにより 5atl末端に転写されることが共通している。逆向きの挿入断片含
有するプラスミド( pTJss’0 3 6 、 pTJS’B 4 3 5
及びpTJs’X 5 3 5 )では特異的に標識された蛋白質は見出でれな
い。公知の犬ぎさの標準蛋白質との比較により、標識蛋白質の分子量が決定され
る。その際に、pTJss’ O 3 5 、 pTJS’ B 4 3 5及
び1)TJS’X 5 3 5 K ヨり発現された遺伝子生成物に関しては分
子量3 2000が明らかであυ、pTJS’ x 5 3 5オメガによ9発
現さd)誘導されfc製造と、酵素活性の検出前記で得られた、pGPi−2並
びにデ2スミドp’r、rss’ 035 、 pTJs’B 435 、 p
’r、rs’x 535又はpTJs’X 535オメガの1つを含有するE、
コリに38の菌株を、アンピシリン50μji / rtt&及びカナマイシン
50μm1/ILtk添加したLB培地中、30℃で培養する。590 nmの
光学密度1.0で温度を42°Cに高めかつ坩養物’t−25分間振盪させる。
その後、リファンピシン溶液(メタノール中20■/m)100μlを添加しか
つ培養物を37℃で2時間振盪する。E。
コリ中の2.4−D−モノオキシグナーゼの#素活性の検出は、アミ−(Amy
)及びその他(App:L、 Env。
Mjcrobjol 49 : 1237 (1985) )により記載された
放射性酵素試験法により次のように変更して行なう:誇導された20u培養物の
細胞を遠心処理により採取し、8M培地10紅で洗浄し、P+度遠心分離し、最
後にEMf@地10地中0紅中させる。この細胞懸濁液を250紅−ワールプル
ク(warburg )フラスコ中で形質転換緩衝液10IILと混合し、未標
識の2゜4−D200μy及び2,4−ジクロルフェノキシ(2−14()酢酸
(Amersham r 55 m Ci / mmot) 0−1μCjを加
えかつ閉じたフラスコ中21°Cで4時間振盪サセる。引続いて、p−フェニル
エチルアミンQ、5酩をワールブルクフラスコの中央の容器中にピペット装入し
かつ1M−硫酸2紅を細胞懸濁液中に注入する。
21′Gで1時間振盪後、β−フェニルエチルアミンを計数液体(Ziihlf
lussjgkejt 、 rotiszjnt 22 。
Roth ) 512中に採取し、かつ試料の放射能をシンチレーションカウン
タ中で測定する。pGP 1−2と共にプラスミドpTJsG’ 035 、
p’r、ys’ B 435又はpTJs’X535の1つを含有するE、コI
J K 38菌株はこの試験で高い酵素活性を示すが、プラスミドpTJs’
X 535オメガ?含有するものは酵素活性全発現しない。
例16:M13中でクローン化され7(DNAの塩基配列aJ MJSS’ 0
30及びMJ8S’ 031から欠失ファージの製造
組み換えファージの2 kbのBan HI / 5atl−フラグメントをサ
ンシャー(Sanger )法により配列するためにCProc、 Natl
Acad、 Sci、 USA 74 : 5463(1977))、初めに文
献公知の方法[()、 Henjkoff。
Gene 28 : 351 (1984) )による調節欠失によシ、その都
度200〜600の塩基の重複配列により塩基配列全体を確定するのを可能にす
る一連の種々の短いファージを製造する。そのために、例12で製造したファー
ジMJSS’ 030もしくはMJSS’ 031 ’!r含有するE、コIJ
JM101の菌株から、ファージベクターM13tg130及びM13tg13
1に関して記載した方法によシ二重鎖DNAを単離する。ファージMJSS’
030の二本鎖DNA 10μyを#¥累Pst I及び5atIで切断し、フ
ァージMJSS’[]3iの二本@ DNA10μgを酵素Bam HI及びS
ac Iで切断する。制限バッチをフェノールで抽出しかつ切断DNA ’iエ
タノールで沈殿させる。引続いて行なうDNAのエキソヌクレアーゼl及びS1
ヌクレアーゼによる消化、突出したDNA末端のフレノウ充填及び連結は次のよ
うに変更してヘニコク(Henj koff )によシ記載された方法によシ行
なう:81ヌクレアーゼの代りにムング・ビーン・ヌクレアーゼ(MungBe
an Nuclease : Pharma+ja)を使用する。T−J、シル
ヘイビー及びその他の方法(gxperjments with gene f
usions、 Co1d SpringHarbour Laborator
y、 Co1d Sprjng Harbour 、 NewYork 、 1
984 )によ#)製造したE、コリJM101(i Messjng及びその
他、 Nuc’1. Acj、ds Res、 9 :309(1981))の
部分量のコンピテント細胞0.2紅にそれぞれ連結パッチ20μlk加え、氷上
に40分間放置し、42℃に6分間加熱し、溶融(45℃)H−Top −’1
1天(例12)それぞれ6紅と混合しかつH,]]天−プレート例12)上に注
ぐ。プレートを37℃で16時間恒昌保持する。
b)欠失ファージの同定
E、コリJM101kTY培地(例12)2ILL中、37℃で16時間培養す
る。この培養物ia5七TY培地100紅で稀釈しかつ稀釈した細胞懸濁液中2
μ七で5時間振盪させ、その後遠心処理する。遠心処理のM i 3 clon
ing and SequencingHandbook # 1984:]に
よす記載された方法によシ取得する。遠心分難した細胞からは二本鎖DNA ’
l(T、マニアテス及びその他(前記参照ンにより単離する。MJSダ030か
ら由来スル短い7アージの二軍鎖DNA f Bgt lで、MJSS’061
から白米するファージのそれk BcoR工及びSat!で消化する。引続いて
T、マニアテス及びその他(NU記参PN、 )により2チアガロースグル上で
断片を電気泳動にニジ分解することに工ってそれぞれの欠失の大きさを決定する
。
C)−重鎖DNAの配列決定
前記で得らIした短いファージの一本鎖DNA 、!ひに例12で製造LfcM
JSS’ 030及びMJsS′o31の一本鎖DNAについて塩基配列を文献
公知のジデオキシヌクレオチド配列決定法CProc、 Natl、 Acad
、 5cj−USA 74二5463(1977))により決定する。その際に
、アマ−ジャムによる方法(: M B Cloning and Seaue
n−cingHandbook 、 1094 ]で行なう。DNAフラグメン
トを分離するに当り、増加する厚さ0.1〜0.4nの長さ55(1111のデ
ルを使用する。同定さn尺短いファージのDNA配列をコンピュータグログラム
(C,Queen及びその他、 Nucl Acjds Res、 12 :
581 (1984J)によ夕1複領域で、M13tg130もしくはM13t
g 131中でクローン化した押入断片のBam H工!iJ限サイトとBal
l制限サイトとの間に全断片を包含するDNA配列に接合する。このようにし
て得ら扛た両方の相補性DNA鎖の比較により塩基配列が確認さnる。
d)I!Icタリ決定i n fc DNA (7) %性前記のコンピュータ
プログラムによシ、直接塩基配列から明らかであるDNAのすべての性質が確定
する。
その中で最も1女なものとして挙げることができる:制限エンドヌクレアーゼの
認識部位の位置、遺伝子の可能なコード付は領域としての転写解読わくの位置と
長さ、−足の塩基のH度とその分布、及び一定の磯籠的なりNA配列の出椀。D
NA配列の分析は、転写解読わくt示し、その位置、長さ及び転写方向は例14
及び15に記載し7’Ctfd A遺伝子の性質と一致する。解読わくは塩基査
号748のGTGド始コドンで開始しかつTAG終止コドンの前塩基査号160
8で終止し、従って塩基861個の長さを有し、こねはtfd Aでコードし′
fc蛋白質の長で(例15)と一致する。オメガフラグメントのpTJS’ X
535中へのクローン化が示すように(例11 )、E列決定きγしたフラグ
メントの唯一のBgt It fti!I限プイト甲への転換−及び翻訳終止シ
グナルの挿入はこの転写掛肌わくt計算上768個の塩基に短かくし、こ′nは
グラスミド−pTJs’ x 535オメガ(例15)による、目動さILかつ
酵素的に不活性な遺伝子生成物の発埃と一致する。
1270 1280 12’jO13001コ10 1320(:aGCGCG
CACGCGAGCCACCTCGAAGGCCTTCCGGTGGCCGAA
GGCCGGATGCTGCTTGCC145014G01470 1480
14!10 1500CGTAGCCTCGACGGCGACACCTT(:G
CGCAにCGCGTCCTTCG AGCGGCGにGCGGCCTGGCG
H
pKJS(X)630
12.6 kb
Abb、4
ト→
ρTJS’X535Ω
5.8kb
Abb、7b
0フ
補正音の翻訳文提出書(特許法第184条の8)平成1年2月28日
特許庁長官 吉 1) 文 毅 殿
1、国際出願番号
PCT/DE 6710○392
2、発明の名称
3、特許出願人
名 称 シェージング アクチェンゲゼルシャフト4、代理人
住所 〒100東京都千代田区丸の内3丁目3番1号5、補正音の提出年月日
昭和63年8月16日
請 求 の 範 囲
1、tfdA −2、4−D−モノオキシデナーゼ遺転子突然変異体アルカリデ
ネス・オイトロフスJλT134:Tn 5−2゜
2、tfdA −2、4−D−モ);F*’/’fす一セa転子突然変異体アル
カリrネス・オイトロフスJMP 134 :Tn 5−4゜
3、tfdA遺伝子を含有するプラスミドの同定及び単離にtfdA−突然変異
体アルカリゲネス・オイトロフスJMP 134 : Tn 5−2及びJMP
134 : Tn 5−4の使用。
4.2.4−Dを分解する、記載のアミノ酸配列1〜287の蛋白質をコード付
けする塩基配列1〜861又は遺伝コードにより同じアミノ酸配列をコード付け
するそれと等価のものを含有することを特徴とする組み換えDNA。
5、請求の範囲第4項による遺伝子又はそのサブフラグメントを含有するプラス
ミド。
6、 プラスミドpJP4とpVK 101とから製造されたプラスミドpVJ
H21゜
7 ;y’;rXミl’pVJH21とDO8S 33とから製造されたプラス
ミドpGJs 3゜
8、 プラスミドpoJs 3とpK’r 231とから製造されたプラスミド
1:1KJS 31 (寄託、E、コリ817−1中、DSM 3835 )。
9 シラスミドpo、ys3とpKT 231とから製造されたプラスミドpK
JS 32゜
10 プラスミドpKJs 31から製造されたプラスミドpKJSB 330
゜
11、請求の範囲第10項によるプラスミドから製造されたプラスミドpKJ
S (χ)630(寄託、E、コリ817−1中、DSM3837)。
12、プラスミドpKT 231及びpKJs 32とから製造されたプラスミ
ドpKJEΔB130゜13、プラスミドp’r 7−5とpKJSB330と
から製造されたプラスミドI)TJS’ B 435゜14、プラスミドpT
7−6とpKJSB 330とから製造されたシラスミドpTJS’ B 43
6゜、15. プラスミドpKJs 32とpR■1とから製造されたプラスミ
ドpKJs 32RHΔS/ (寄託、E、ニアす517−1中、DSM383
6)。
16、プラスミドpT 7−5とpKJS 32とから製造されたプラスミドn
TJss’D 35 (寄託、E、コリLE392中、DSM3832)。
1Z プラスミドpT 7−6とpK、TS 32とから製造されたシラスミド
pTJss’036゜
18、pT7−5とpT、Tss’ O35とから製造されたプラスミドpTJ
S’ 535 〔寄託、E、コリK 38(pc)T i−2/ 1)TJSX
535 )として、DSM3839)。
19 プラスミドpT 7−6とTITJSS’ O35とがら製造されたプラ
スミドpTJs’X 536゜20、プラスミド1)TJS’X 535とpD
Oc 37とから製造されたプラスミドpTJs’X 535オメガ。
21、ファージM13tg130とプラスミドpK、7832とから製造された
ファージMJSS’ 03 Q。
22.77一ジM13tg131とプラスミドpKJs 32とから製造された
ファージMJSS’ 031゜23、野性型細萌からのDNAフラグメント又は
サブフラグメントとプラスミドベクターとを相互に連結し、かつtfdA遺伝子
を含有するプラスミドを、相応するフェノールを利用し得る菌株中の置換されて
いないフェノキシ酢酸の分解の発現を介して単離することにより得られた。 t
fdA遺伝子を含有するプラスミド。
2、特許請求の範囲第23項によシ得られたプラスミドから、完全なtfdA遺
伝子又はこの遺伝子の断片を含有するす′プ7ラグメントをベクタープラスミド
と連結することを特徴とする、tfdA遺伝子又はこの遺伝子の断片を含有する
シラスミドの製法。
25、請求の範囲第5項及び第23項のシラスミドを含有するE、コリ菌株。
26.4−クロルフェノキシ酢酸を利用し得ることを特徴とする請求の範囲第5
項及び第23項のプラスミドを含有するプソイドモナス菌株。
2Z梢求の範囲第5項及び第26項のプラスミドを含有するアルカリテネス菌株
。
28、該当する菌株を公知方法により請求の範囲第5項又は第23項のシラスミ
ドDNAで形質転換することを特徴とする、tfdA遺伝子又はこの遺伝子の断
片を含有する新規の細菌株の製法。
2、特許請求の範囲第28項によシ得られた菌株からプラスミドを接合によシ他
の菌株に転移させることを特徴とするtfdA遺伝子又はこの遺伝子の断片を含
有する新規の細菌株の製法。
30.2.4−Dの生長抑制作用に対して抵抗性であることを特徴とする2、4
−Dを分解する植物を製造するための出発生成物として、tfdA遺伝子又はこ
の遺伝子の断片を含有するプラスミドの使用。
国際調査報告
−内吻−^−一−+1iL PCT/DE 87100392
Claims (31)
- 1.tfdA−2,4−D−モノオキシゲナーゼ遺伝子突然変異体アルカリゲネ ス・オイトロフスJMP134:Tn5−2。
- 2.tfdA−2,4−D−モノオキシゲナーゼ遺伝子突然変異体アルカリゲネ ス・オイトロフスJMP134:Tn5−4。
- 3.tfdA遺伝子を含有するプラスミドの同定及び単離にtfdA−突然変異 体アルカリゲネス・オイトロフスJMP134:Tn5−2及びJMP134: Tn5−4の使用。
- 4.2,4−D−モノオキシゲナーゼのtfdA遺伝子又はtfdAと基本的に 同等の遺伝子を含有するプラスミド。
- 5.2,4−Dを分解する、記載のアミノ酸配列1〜287の蛋白質をコード付 けする塩基配列1〜861【配列があります】 又は遺伝コードにより同じアミノ酸配列をコード付けするそれと等価のものを含 有することを特徴とする組み換えDNA。
- 6.プラスミド pVJH21。
- 7.プラスミド pGJS3。
- 8.プラスミド pKJS31。
- 9. プラスミド pKJS32。
- 10.プラスミド pKJSB330。
- 11.プラスミド pKJS(X)630。
- 12.プラスミド pKJEΔB130。
- 13.プラスミド pTJS′B435。
- 14.プラスミド pTJS′B436。
- 15.プラスミド pKJS32RHΔS′。
- 16.プラスミド pTJSS′035。
- 17.プラスミド pTJSS′036。
- 18.プラスミド pTJS′X 535。
- 19.プラスミド pTJS′X536。
- 20.プラスミド pTJS′X535オメガ。
- 21.フアージ MJSS′030。
- 22.フアージ MJSS′031。
- 23.野性型細菌からのDNAフラグメントとプラスミドとを相互に連結し、か つtfdA遺伝子を含有するプラスミドを、相応するフエノールを利用し得る菌 株中の置換されたか又は置換されていないフエノキシ酢酸の分解の発現を介して 単離することを特徴とする、tfdA遺伝子含有プラスミドの製法。
- 24.請求の範囲第23項により得られたプラスミドから、完全なtfdA遺伝 子又はこの遺伝子の断片を含有するサブフラグメントをベクタープラスミドと連 結することを特徴とする、tfdA遺伝子又はこの遺伝子の断片を含有するプラ スミドの製法。
- 25.tfdA遺伝子又はこの遺伝子の断片を有するプラスミドを含有するE. コリ菌株。
- 26.tfdA遺伝子又はこの遺伝子の断片を有するプラスミドを含有するプソ イドモナス菌株。
- 27.tfdA遺伝子又はこの遺伝子の断片を有するプラスミドを含有するアル カリゲネス菌株。
- 28.該当する菌株を公知方法により請求の範囲第4項記載のプラスミドDNA で形質転換することを特徴とする、tfdA遺伝子又はこの遺伝子の断片を含有 する新規の細菌株の製法。
- 29.請求の範囲第28項により得られた菌株からプラスミドを接合により他の 菌株に転移させることを特徴とするtfdA遺伝子又はこの遺伝子の断片を含有 する新規の細菌株の製法。
- 30.tfdA遺伝子又はこの遺伝子の断片を含有する細菌株を2,4−D−モ ノオキシゲナーゼの製造に使用。
- 31.2,4−Dを分解する生きた有機体を製造するための出発生成物として、 tfdA遺伝子又はこの遺伝子の断片を含有するプラスミドの使用。
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