ES2239061T3 - Gen de tetrahidropirimidina-dioxigenasa, polipeptidos codificados por este gen y metodo para prepararlos. - Google Patents
Gen de tetrahidropirimidina-dioxigenasa, polipeptidos codificados por este gen y metodo para prepararlos.Info
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Abstract
Secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con actividad tetrahidropirimidina-dioxigenasa y que se elige del grupo siguiente de secuencias de ácidos nucleicos: (a) secuencia de ácido nucleico tipo ADN, con la secuencia de nucleótidos representada en SEQ. ID. NO.: 1; (b) secuencia de ácido nucleico tipo ADN, derivada como resultado del código genético degenerado de la secuencia de nucleótidos representada en SEQ. ID. NO.: 1; (c) secuencia de ácido nucleico tipo ADN, que se hibrida con al menos una secuencia de ácido nucleico tipo ADN que presenta una secuencia de ácido nucleico según (a) o (b); (d) secuencia de ácido nucleico tipo ADN que corresponde a fragmentos, alélicos o a otras variaciones de la secuencia de ácido nucleico tipo ADN con la secuencia de nucleótidos representada en SEQ. ID. NO.: 1; (e) secuencia de ácido nucleico tipo ARN, derivada de la secuencia de ácido nucleico tipo ADN según (a) hasta (d); y (f) secuencia de ácido nucleico, que posee un grado de homologíasuperior al 60% con una de las secuencias según (a) hasta (e).
Description
Gen de
tetrahidropirimidina-dioxigenasa, polipéptidos
codificados por este gen y método para prepararlos.
La presente invención se refiere a enzimas con
actividad tetrahidropirimidina-dioxigenasa, a los
genes que los codifican, a la expresión homóloga y heteróloga de
estos genes, a métodos para preparar enzimas con actividad
tetrahidropirimidina-dioxigenasa y al uso de estos
enzimas para la producción in vivo e in vitro de
tetrahidropirimidina hidroxilada. Asimismo, la presente invención se
refiere al empleo biotecnológico de la tetrahidropirimidina
hidroxilada según uno de los métodos de la presente invención.
Como consecuencia de la tensión osmótica los
microorganismos forman compuestos intracelulares de bajo peso
molecular, denominados osmolitos, a los cuales también pertenecen
las tetrahidropirimidinas. Las tetrahidropirimidinas THP (B)
(2-metil-4-carboxi-3,4,5,6-tetrahidropirimidina)
y THP (A)
(2-metil-4-carboxi-5-hidroxi-3,4,5,6-tetrahidropirimidina)
se forman por varios microorganismos como componentes intracelulares
del citoplasma [Ventosa, A. y otros (1998). Biología de bacterias
aeróbicas moderadamente halófilas. Microbiol. Mol. Biol. Rev.
62, 504-544.] (Fig. 1). A estos
microorganismos pertenecen las eubacterias halófilas, los
actinomicetos, especies de bacilos y las brevibacterias. Las THPs se
pueden aislar de estos organismos en forma pura y se pueden emplear
en biotecnología de diversas maneras, p.ej. para estabilizar
proteínas, tanto en forma disuelta como liofilizada [Lippert, K. y
Galinski, E.A. (1992). Estabilización de enzimas mediante solutos
compatibles tipo ectoína: protección contra calentamiento,
congelación y secado. Appl. Microbiol. Biotechnol.
37, 61-65.], para influir en la interacción
entre proteínas y ácidos nucleicos [Lapidot, A. y otros (1995). Los
derivados de las tetrahidropirimidinas inhiben la fijación in
vitro de un péptido tipo Tat que contiene arginina a HIV TAR
ARN. FEBS Lett. 367, 33-38.; Malin, G.
y Lapidot, A. (1996). Inducción de la síntesis de derivados de
tetrahidropirimidinas en cepas de Streptomyces y su efecto en
la Escherichia coli como respuesta a la tensión osmótica y
térmica. J. Bacteriol. 178, 385-395.;
Malin, G. y otros (1999). Efecto de los derivados de
tetrahidropirimidinas sobre la interacción proteína-ácidos
nucleicos. Endonucleasas de restricción tipo II como sistema modelo.
J. Biol. Chem. 274, 6920-6929.] y para
replegar proteínas desnaturalizadas. Además, añadiendo THP(A)
o THP(B) a medios de cultivo de varios procariotas, como
p.ej. E. coli, se puede constatar una mayor tolerancia a la
sal y al calor [Malin, G. y Lapidot, A. (1996). Inducción de la
síntesis de derivados de tetrahidropirimidinas en cepas de
Streptomyces y su efecto en la Escherichia coli como
respuesta a la tensión osmótica y térmica. J. Bacteriol.
178, 385-395.].
La vía identificada de biosíntesis de la
THP(A) que se muestra en la fig. 1 parte del
L-aspartato-\beta-semialdehído.
En la reacción de transaminación siguiente, el ácido
L-2,4-diaminobutírico-transaminasa
cataliza la formación del ácido diaminobutírico (DABA). La posterior
N-acetilación del DABA tiene lugar mediante el ácido
L-2,4-diaminobutírico-acetil-transferasa,
empleando acetilcoenzima A. Como resultado de la reacción de
condensación intramolecular catalizada mediante el ácido
N-acetil-L-2,4-diaminobutírico-ciclasa
se forma la THP(B) [Peters, P. y otros (1990). La biosíntesis
de ectoína. FEMS Microbiol. Lett. 71,
157-162.; Ono, H. y otros (1999). Caracterización de
enzimas biosintéticos de la ectoína como soluto compatible en una
eubacteria moderadamente halófila, Halomonas elongata. J.
Bacteriol. 181, 91-99.]. En cambio los
pasos para la biosíntesis de la THP(A), es decir, el derivado
5-hidroxilado de la THP(B), quedaron sin
aclarar.
La preparación de las THPs según métodos
conocidos del estado técnico está limitada a la difícil extracción
de estos compuestos de las células o de los filtrados de cultivos de
bacterias productoras de THP(A) y/o THP(B). Debido a
las elevadas concentraciones de sal en los medios de cultivo, estos
métodos resultan especialmente costo-
sos.
sos.
Una síntesis química de las THPs también es
factible, pero comprende gran número de pasos y el uso de una
costosa técnica con grupos protectores, de manera que este complejo proceso resulta económicamente inviable, sobre todo, a gran escala. Esto se refiere, concretamente, a la síntesis de la THP(A), ya que los correspondientes pro-
ductos previos no se pueden obtener por vía química, lo cual dificulta aún más la síntesis química de la
THP(A).
costosa técnica con grupos protectores, de manera que este complejo proceso resulta económicamente inviable, sobre todo, a gran escala. Esto se refiere, concretamente, a la síntesis de la THP(A), ya que los correspondientes pro-
ductos previos no se pueden obtener por vía química, lo cual dificulta aún más la síntesis química de la
THP(A).
Por tanto, el objeto de la presente invención
consiste en proporcionar un método mejorado para la preparación de
THPs hidroxiladas, concretamente de THP(A).
Este planteamiento de la presente invención se
resuelve mediante un método basado en el empleo de un polipéptido
con actividad tetrahidropirimidina-dioxigenasa.
Por lo tanto, un aspecto de la presente invención
se refiere a secuencias de ácidos nucleicos codificadoras de los
polipéptidos que manifiestan actividad
tetrahidropirimidina-dioxigenasa. Dichas secuencias
de ácidos nucleicos comprenden tanto secuencias de ácidos nucleicos
de ADN, como secuencias de ácidos nucleicos de ARN, y se seleccionan
de los grupos siguientes de secuencias de ácidos nucleicos:
(a) secuencia de ácido nucleico tipo ADN, con la
secuencia de nucleótidos representada en SEQ. ID. NO.: 1;
(b) secuencia de ácido nucleico tipo ADN,
derivada como resultado del código genético degenerado de la
secuencia de nucleótidos representada en SEQ. ID. NO.: 1;
(c) secuencia de ácido nucleico tipo ADN, que se
hibrida con al menos una secuencia de ácido nucleico tipo ADN que
presenta una secuencia de ácido nucleico según (a) o (b);
(d) secuencia de ácido nucleico tipo ADN que
corresponde a fragmentos, alélicos o a otras variaciones de la
secuencia de ácido nucleico tipo ADN con la secuencia de nucleótidos
representada en SEQ. ID. NO.: 1;
(e) secuencia de ácido nucleico tipo ARN,
derivada de la secuencia de ácido nucleico tipo ADN según (a) hasta
(d); y
(f) secuencia de ácido nucleico, que posee un
grado de homología superior al 60% con una de las secuencias según
(a) hasta (e).
Al decir secuencias de ácidos nucleicos tipo ADN
codificadoras de polipéptidos con actividad
tetrahidropirimidina-dioxigenasa, se alude tanto a
secuencias genómicas de ácidos nucleicos tipo ADN como a secuencias
de ácidos nucleicos tipo cADN. El grado de homología de la secuencia
de ácidos nucleicos según (f) con una de las secuencias según (a)
hasta (e) es, como mínimo, del 60%, con preferencia del 80% y con
especial preferencia mayor del
90%.
90%.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a los polipéptidos que muestran una actividad
tetrahidropirimidina-dioxigenasa y que están
codificados preferentemente mediante una de las secuencias de ácidos
nucleicos según (a), (b), (c), (d), (e) o (f). Se prefiere
especialmente un polipéptido (SEQ. ID. NO.: 6) codificado mediante
la secuencia de ácidos nucleicos tipo ADN según SEQ. ID. NO.: 1.
En otro aspecto, son objeto de la presente
invención las secuencias de ácidos nucleicos tipo ADN o ARN según
(a), (b), (c), (d), (e) o (f), aisladas de una arqueobacteria, de un
procariota o de un eucariota. Se prefieren especialmente las
secuencias de ácidos nucleicos aisladas de una eubacteria de tipo
halófilo, de un actinomiceto, de un bacilo o de una
brevibacteria.
También se prefieren las estructuras de ácidos
nucleicos que incluyen una unidad operativa formada por una
secuencia promotora y una secuencia de ácidos nucleicos según (a),
(b), (c), (d), (e) o (f).
También se prefieren las estructuras de ácidos
nucleicos que incluyen una unidad operativa formada por una
secuencia promotora y una secuencia de ácidos nucleicos según (a),
(b), (c), (d), (e) o (f) y que además llevan una secuencia de ácidos
nucleicos que codifica una o más señales secretoras.
En otro aspecto, la presente invención se refiere
a vectores replicativos recombinantes que incluyen una secuencia de
ácidos nucleicos según (a), (b), (c), (d), (e) o (f).
También son objeto de la presente invención las
células que contienen un vector replicante autónomo, el cual incluye
una secuencia de ácidos nucleicos según (a), (b), (c), (d), (e) o
(f). Entre ellas se prefieren las células de bacterias, de levaduras
o de plantas.
Se prefieren las células que presentan una
secuencia de ácidos nucleicos, según (a), (b), (c), (d), (e) o (f),
integrada en el genoma por recombinación no natural. Se prefieren
sobre todo aquellas células, en las cuales la recombinación no
natural se ha producido en el genoma de una célula bacteriana, de
una célula de levadura o de una célula
vegetal.
vegetal.
En un aspecto alternativo, la presente invención
se refiere al empleo de un oligonucleótido, como sonda de ácidos
nucleicos para la identificación de genes, de manera que la
secuencia de nucleótidos del oligonucleótido se ha derivado de
cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos según (a), (b),
(c), (d), (e) o (f) y los oligonucleótidos se usan para identificar
genes cromosómicos o extracromosómicos que se hallan en
arqueobacterias, procariotas o eucariotas y que codifican un
polipéptido con actividad
tetrahidropirimidina-dioxigenasa.
También es objeto de la presente invención una
planta que se transformó con un ADN recombinante que comprende una
secuencia de ADN según una de las reivindicaciones 1 a 4. Una planta
de este tipo se caracteriza por una mayor tolerancia osmótica.
También es objeto de la presente invención un
método de preparación de un polipéptido con actividad
tetrahidropirimidina-dioxigenasa, para lo cual se
cultivan células que contengan un fragmento de ácido nucleico con
una secuencia según (a), (b), (c), (d), (e) o (f), o una estructura
de ácido nucleico del tipo arriba indicado, y se aísla el
polipéptido con actividad
tetrahidropirimidina-dioxigenasa.
El método empleado para aislar el polipéptido
depende, como sabe el especialista, de que las células utilizadas en
la preparación contengan un fragmento de ácido nucleico con una
secuencia según (a), (b), (c), (d), (e) o (f), o bien una estructura
de ácido nucleico del tipo arriba indicado. En el primer caso, el
polipéptido preparado solo puede aislarse si previamente se han
desintegrado las células, mientras que en el segundo caso, en que
las células contienen una estructura de ácido nucleico que comprende
una señal secretora, el polipéptido preparado se podría aislar
directamente del medio de cultivo.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de un polipéptido con actividad
tetrahidropirimidina-dioxigenasa para preparar
tetrahidropirimidina hidroxilada.
La preparación se realiza, preferentemente,
mediante un polipéptido con actividad
tetrahidropirimidina-dioxigenasa en una célula viva,
bacteriana, de levadura o vegetal. La célula viva que lleva el
polipéptido con actividad
tetrahidropirimidina-dioxigenasa se puede hallar en
un medio de cultivo que contenga tetrahidropirimidina. En tal caso
hay que permeabilizar la célula viva, antes de la preparación, para
favorecer el contacto entre el polipéptido con actividad
tetrahidropirimidina-dioxigenasa y la
tetrahidropirimidina.
A continuación se describe una forma de ejecución
preferida de la presente invención, sin que deba entenderse como una
limitación del alcance de la protección solicitada por el
inventor.
Para encontrar los genes de la biosíntesis de THP
en el Streptomyces chrysomallus se purificó el ácido
L-2,4-diaminobutírico-acetiltransferasa,
un enzima de biosíntesis de THP procedente del Streptomyces
chrysomallus. A partir de secuencias trípticas de péptidos del
ácido
L-2,4-diaminobutírico-acetiltransferasa
se derivaron secuencias de oligonucleótidos y se usaron para
rastrear un banco de cósmidos. Se secuenció el gen del ácido
L-2,4-diaminobutírico-acetiltransferasa
y las zonas de los flancos. Sobre el fragmento BamHI/EcoRI de 8,7
kb se encontraron, entre otros, cuatro marcos de lectura abiertos.
Estos genes que codifican los enzimas de biosíntesis se denominan en
lo sucesivo como thpA, thpB, thpC y thpD (fig. 2). El
marco de lectura abierto designado thpD codifica un enzima
que presenta una actividad THP(B)-dioxigenasa
y que tiene un peso molecular de 32,7 kDa. Se trata de una
dioxigenasa dependiente de \alpha-cetoglutarato,
que cataliza la hidroxilación irreversible de la THP(B) a
THP(A). El gen thpD se expresó en E. coli y
Streptomyces y la proteína correspondiente (THP(D)) se
purificó según los métodos conocidos del estado
técnico.
técnico.
El empleo de la proteína THP(D) -
expresada homóloga o heterólogamente - permite la producción in
vitro de THP(A). Incubando la proteína THP(D) en
presencia de THP(B), \alpha-cetoglutarato,
ácido ascórbico, sulfato de hierro(II) y catalasa se observa
una hidroxilación completa de la THP(B) a THP(A).
El gen que codifica la
tetrahidropirimidina-dioxigenasa se encuentra en un
fragmento BamHI/EcoRI de 8,7 kb. Mediante la expresión en
microorganismos, de los genes procedentes de Streptomyces
chrysomallus contenidos en dicho fragmento de ADN, se puede
lograr la síntesis de la tetrahidropirimidina hidroxilada.
La expresión del gen thpD en
microorganismos que producen la THP(B) permite la producción
in vivo del derivado 5-hidroxilado de la
tetrahidropirimidina (THP(A)).
Este método se puede aplicar con gran número de
microorganismos, como p.ej., actinomicetos, bacilos o bacterias
halófilas, siempre que posean secuencias de ácidos nucleicos
codificadoras de polipéptidos con actividad
THP-dioxigenasa. Con esta condición también puede
llevarse a cabo la expresión en cualquier otro sistema de expresión
procariótico o eucariótico.
A continuación, la presente invención se describe
más detalladamente mediante ejemplos.
Partiendo de una secuencia peptídica interna de
ácido
L-2,4-diaminobutírico-acetiltransferasa
procedente de Streptomyces chrysomallus, previamente
purificada, se derivó una secuencia de nucleótidos (fig. 3). Esta
secuencia de nucleótidos se marcó radiactivamente y se utilizó para
rastrear un banco de cósmidos. Se subclonaron y secuenciaron partes
del correspondiente cósmido. En este caso se encontraron, entre
otros, cuatro marcos de lectura abiertos, de manera que el
thpA codifica el ácido
L-diaminobutírico-acetiltransferasa,
el thpB la
L-aspartato-\beta-semialdehído-transaminasa,
el thpC el ácido
N-acetil-\gamma-L-2,4-diaminobutírico-ciclasa
y el thpD la THP(B)-dioxigenasa (fig.
2). La expresión en otros microorganismos es posible y como ejemplo
sirve el Streptomyces lividans (véase
ejemplo 2).
ejemplo 2).
Para expresar el thpD en el
Streptomyces lividans, el gen thpD se clonó como
fragmento SphI/HindIII en el vector de expresión pSPIJ002
(fig. 5). El plásmido de expresión resultante se designó pSPIJthpD.
Por mutagénesis por PCR se introdujeron los sitios de corte del
enzima de restricción SphI y HindIII (35 ciclos; 1
min. a 95ºC; 90 seg. a 55ºC; 65 seg. a 72ºC; cebador, véase tabla
1). Como molde para la PCR sirvió el plásmido pQE30thpD; se trata un
derivado de pQE30 que contiene el gen thpD como fragmento de
PCR BamHI/HindIII (35 ciclos; 1 min. a 95ºC; 90 seg. a 55ºC;
65 seg. a 72ºC; cebador, véase tabla 1). Los cebadores empleados
figuran en la tabla 1 como SEQ. ID. NO.: 2-5. La
unión y la transformación se realizaron según métodos estándar.
Se sembró medio YEME (340 g/l de sacarosa, 10 g/l
de glucosa, 3 g/l de extracto de levadura, 3 g/l de extracto de
malta, 5 g/l de bacto-peptona y 0,2% de MgCl_{2})
de un cultivo previo de la cepa Streptomyces lividans
(transformada con pSPIJthpD, véase ejemplo 2) hasta un OD_{600}
de 0,05 y se incubó a 28ºC en el agitador. A las 72 horas, las
células se recolectaron, se resuspendieron en un tampón de lisis
(tampón de fosfato 100 mM de pH 8,0, 10% de glicerina, benzamidina
1 mM, PMSF 1 mM, imidazol 10 mM y NaCl 300 mM) y se rompieron
pasándolas dos veces por una prensa de French (16.000 psi, que
corresponde a 1,105 \times 10^{8} mPa). El extracto crudo,
exento de células, se centrifugó en el rotor SS34 durante 30
minutos a 12.000 rpm. El sobrenadante libre de células se
cromatografió en una matriz de Ni-NTA. La proteína
Hexa-His-THPD se eluye en el
intervalo de imidazol 30-100 mM.
La actividad
THP(B)-dioxigenasa se determina mediante el
uso de la siguiente carga de reacción:
\vskip1.000000\baselineskip
| tampón de fosfato potásico de pH 8,0 | 10 mM |
| THP(B) | 5 mM |
| \alpha-cetoglutarato | 5 mM |
| ácido ascórbico | 5 mM |
| sulfato de hierro(II) | 1 mM |
| Hexa-His-THPD variable |
\vskip1.000000\baselineskip
en un volumen total de 100
\mul.
La incubación se lleva a cabo a 30ºC durante una
hora. El producto se analiza por cromatografía HPLC en una columna
de Nucleosil-NH_{2}. La elución se efectuó con
acetonitrilo 70%/ H_{2}O. En la fig. 4 se representa el perfil de
elución. Con el empleo de catalasa (de hígado de bovino, de la
firma Sigma) puede lograrse una hidroxilación completa de
THP(B) a THP(A).
Fig. 1: biosíntesis de THP(B) partiendo de
L-aspartato-\beta-semialdehído.
A: ácido
L-2,4-diaminobutírico-transaminasa,
B: ácido
L-2,4-diaminobutírico-acetiltransferasa,
C: ácido
N-acetil-diaminobutírico-ciclasa.
Fig. 2: mapa de restricción de la zona
secuenciada y situación de los genes de biosíntesis de THP
hallados. Bajo los enzimas de restricción se indica la respectiva
posición de las bases.
Fig. 3: secuencia peptídica tríptica interna del
DABA-acetiltransferasa procedente de
Streptomyces chrysomallus y secuencias de oligonucleótidos
(170498A y 170498B) derivadas del mismo.
Fig. 4: HPLC de THP(A) y de THP(B)
en una columna de Nucleosil-NH_{2}. Se cargó
respectivamente 1/10 de la mezcla de reacción, de la THP(B) 5
mM, del \alpha-cetoglutarato 5 mM, del ácido
ascórbico 5 mM, del FeSO_{4} 1mM y 2 mg/ml de la proteína de
fusión THPD (A) o de tampón D (B). Se eluyó con acetonitrilo al
70%, a una velocidad de flujo de 1 ml/min.
Fig. 5: pSPIJ002: vector lanzadera originado por
unión de pSP72 (BgIII) y plJ702 (BgIII). Este vector de expresión
se puede usar tanto en E. coli como en
Streptomyces.
\newpage
pQE30thpD
FTHPD (30-mero):
5'-GCC TGA GGA TCC ATG ACC ACC
GAA GTA CGC-3'
(SEQ. ID. NO.: 2)
RTHPD (27-mero):
5'-CCC GCC CGT GAA GCT TGC TAC
TTC ACC-3'
(SEQ. ID. NO.: 3)
pSPIJthpD
FSPIJthp (30-mero):
5'-GAG GAG GAA TCC AGC ATG CGA
GGA TCG CAT-3'
(SEQ. ID. NO.: 4)
RSPIJthp (25-mero):
5'-AGT CCA AGC TCA GCT AAT TAA
GCT T-3'
(SEQ. ID. NO.: 5)
<110> Grammel, Nicholas, Dr. Keller,
Ulrich, Dr.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Gen de
tetrahidropirimidina-dioxigenasa, polipéptidos con
actividad tetrahidropirimidina-dioxigenasa, método
para preparar estos polipéptidos y su uso para producir
tetrahidropirimidina hidroxilada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> DE 199 57 470.7
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-11-24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 979
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA.
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces chrysomallus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Empleado como cebador de PCR,
procedente del plásmido pQEthpD. El plásmido pQEthpD es el plásmido
pQE30 que contiene el gen thpD como fragmento de PCR
BamHI/HindIII.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcctgaggat ccatgaccac cgaagtacgc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Empleado como cebador de PCR,
procedente del plásmido pQEthpD. El plásmido pQEthpD es el plásmido
pQE30 que contiene el gen thpD como fragmento de PCR
BamHI/HindIII.
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipcccgcccgtg aagcttgcta cttcacc
\hfill27
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<210> 4
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<211> 30
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Empleado como cebador de PCR,
procedente del plásmido pQEthpD. El plásmido pQEthpD es el plásmido
pQE30 que contiene el gen thpD como fragmento de PCR
BamHI/HindIII.
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipgaggaggaat tcagcatgcg aggatcgcat
\hfill30
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<210> 5
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<211> 25
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Empleado como cebador de PCR,
procedente del plásmido pQEthpD. El plásmido pQEthpD es el plásmido
pQE30 que contiene el gen thpD como fragmento de PCR
BamHI/HindIII.
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipagtccaagct cagctaatta agctt
\hfill25
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<210> 6
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<211> 297
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<212> PRT
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<213> Streptomyces chrysomallus
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<400> 6
Claims (19)
1. Secuencia de ácido nucleico que codifica un
polipéptido con actividad
tetrahidropirimidina-dioxigenasa y que se elige del
grupo siguiente de secuencias de ácidos nucleicos:
(a) secuencia de ácido nucleico tipo ADN, con la
secuencia de nucleótidos representada en SEQ. ID. NO.: 1;
(b) secuencia de ácido nucleico tipo ADN,
derivada como resultado del código genético degenerado de la
secuencia de nucleótidos representada en SEQ. ID. NO.: 1;
(c) secuencia de ácido nucleico tipo ADN, que se
hibrida con al menos una secuencia de ácido nucleico tipo ADN que
presenta una secuencia de ácido nucleico según (a) o (b);
(d) secuencia de ácido nucleico tipo ADN que
corresponde a fragmentos, alélicos o a otras variaciones de la
secuencia de ácido nucleico tipo ADN con la secuencia de nucleótidos
representada en SEQ. ID. NO.: 1;
(e) secuencia de ácido nucleico tipo ARN,
derivada de la secuencia de ácido nucleico tipo ADN según (a) hasta
(d); y
(f) secuencia de ácido nucleico, que posee un
grado de homología superior al 60% con una de las secuencias según
(a) hasta (e).
2. Secuencia de ácido nucleico según la
reivindicación 1, que es una secuencia de ADN genómica o una
secuencia de cADN.
3. Secuencia de ácido nucleico según una de las
reivindicaciones 1 o 2, que se aisló de una arqueobacteria, de un
procariota o de un eucariota.
4. Secuencia de ácido nucleico según la
reivindicación 3, que se aisló de una eubacteria halófila, de un
actinomiceto, de un bacilo o de una brevibacteria.
5. Estructura de ácido nucleico que en una unidad
operativa comprende una secuencia promotora y una secuencia de ácido
nucleico según una de las reivindicaciones 1 o 2.
6. Estructura de ácido nucleico según la
reivindicación 5, que además comprende una secuencia de ácido
nucleico codificadora de una o más señales secretoras.
7. Polipéptido con actividad
tetrahidropirimidina-dioxigenasa, codificado por
una secuencia de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1
o 2.
8. Polipéptido según la reivindicación 7, que
tiene la secuencia de aminoácidos SEQ. ID: NO.: 6.
9. Vector replicativo recombinante que lleva una
secuencia de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 o 2,
o una estructura de ácido nucleico según una de las reivindicaciones
5 o 6.
10. Célula que contiene un vector según la
reivindicación 9.
11. Célula que presenta una secuencia de ácido
nucleico según una de las reivindicaciones 1 o 2 integrada en el
genoma por recombinación no natural.
12. Célula según la reivindicación 10 o 11, que
es una célula bacteriana, una célula de levadura o una célula
vegetal.
13. Planta transformada con un ADN recombinante
que incluye una secuencia de ADN según una de las reivindicaciones 1
a 4.
14. Empleo de un oligonucleótido, derivado de una
secuencia de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 o 2,
como sonda de ácido nucleico para identificar genes cromosómicos o
extracromosómicos que se hallan en arqueobacterias, procariotas o
eucariotas y que codifican un polipéptido con actividad
tetrahidropirimidina-dioxigenasa.
15. Empleo de un polipéptido con actividad
tetrahidropirimidina-dioxigenasa para preparar
tetrahidropirimidina hidroxilada, el cual se codifica por medio de
una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1.
16. Empleo según la reivindicación 15, en que el
polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos SEQ. ID: NO.: 6.
17. Empleo de una célula según una de las
reivindicaciones 10-12, para preparar
tetrahidropirimidina hidroxilada.
18. Método para preparar un polipéptido con
actividad tetrahidropirimidina-dioxigenasa,
consistente en
cultivar en un medio células según una de las
reivindicaciones 10-12, las cuales expresan el
polipéptido con actividad
tetrahidropirimidina-dioxigenasa, y
seguidamente aislar el polipéptido con actividad
tetrahidropirimidina-dioxigenasa.
19. Método según la reivindicación 18, en que la
célula viva ha sido permeabilizada y el medio de cultivo contiene
tetrahidropirimidina.
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