JP4280829B2 - 耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼおよびその製造法 - Google Patents
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Description
本発明は、耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換した形質転換体、および該形質転換体を用いた耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼの製造法に関する。
Ｌ‐アラビノースは細胞壁の構成糖であり、Ｌ‐アラビノースを主要成分とし、１，２‐α、１，３‐α、１，５‐α結合した多糖類がＬ‐アラビナンであり、ガラクトースやキシロースと結合した多糖類が、アラビノガラクタン（１，３‐α、１，６‐α結合）、アラビノキシラン（１，２‐α、１，３‐α結合）であり、植物の細胞壁多糖として広く存在する。これらアラビノースを含む多糖は、非常に分解が困難で、天然資源として有効に利用できないことが大きな問題点となっている。特にアラビノキシランを主成分とするヘミセルロースは、天然界において２番目に多量に存在する多糖であるにもかかわらず、有効な分解方法が開発されておらず、資源活用の必要性が望まれているバイオマスである。
これらのＬ‐アラビノース含有多糖の分解酵素には、エンド型分解酵素のエンドアラビナーゼとエキソ型分解酵素のα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼがある。中でもα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼはアラビノースと他の糖類との結合であるアラビノフラノシル基の結合を切断するため、Ｌ‐アラビノースを含有する複合多糖の分解に有効であると考えられている。実際にヘミセルロースの主成分であるアラビノキシランはキシラナーゼにより、βキシラン主鎖を分解することが可能であるが、アラビノフラノシル基側鎖を分解するα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼを共存させないと効率的な分解ができない。
また、アラビノガラクタンやペクチンなどにもアラビノフラノシル基側鎖が存在し、同様に効率的な分解にはα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼが必要である。
このように、α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼは、Ｌ‐アラビノース含有多糖の分解に有効であることから、ヘミセルロース資源の燃料への変換、パルプの非木質化、植物資源の飼料への利用、ワイン発酵中におけるブドウのモノテルペングリコシドの加水分解、アラビノースの製造、ヘミセルロース含有廃水の処理など、様々な利用方法が期待されている。
このように、α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼは、Ｌ‐アラビノース含有多糖の分解に有効であることから、ヘミセルロース資源の燃料への変換、パルプの非木質化、植物資源の飼料への利用、ワイン発酵中におけるブドウのモノテルペングリコシドの加水分解、アラビノースの製造、ヘミセルロース含有廃水の処理など、様々な利用方法が期待されている。
以上のように、ヘミセルロースなどの植物多糖を有効に資源活用するためには、酵素の弱点の一つである耐熱性の高いα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼの探索、開発が非常に重要となっている。さらに耐熱性の高い酵素が簡便に生産されることが望まれる。
上記に鑑み、本発明の目的は、耐熱性の高いアラビノフラノシダーゼを新たに見いだすとともに、該新規アラビノフラノシダーゼを遺伝子組換え技術を用いて大量生産するため、その製造手段となる、該アラビノフラノシダーゼをコードするＤＮＡ、該遺伝子ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換した形質転換体を提供し、さらに該形質転換体を用いて耐熱性アラビノフラノシダーゼを大量生産することにある。
本発明者は、以上のような課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、好熱菌サーモトガ
マリティマ（Thermotoga maritima）より、耐熱性が高く、高温条件下で効率的に反応するα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子を単離・構造決定するとともに、遺伝子工学的手法によりα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼの組換え酵素の大量生産、簡便な精製により効率的に生産することに成功し、さらに該組み換酵素が高い耐熱性と高温での効率的な反応を行うことを確認し、本発明を完成するに至った。
マリティマ（Thermotoga maritima）より、耐熱性が高く、高温条件下で効率的に反応するα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子を単離・構造決定するとともに、遺伝子工学的手法によりα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼの組換え酵素の大量生産、簡便な精製により効率的に生産することに成功し、さらに該組み換酵素が高い耐熱性と高温での効率的な反応を行うことを確認し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下（１）〜（７）に示すとおりである。
（１） 下記の性質を有するα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ。
（ａ）作用：ｐ‐ニトロフェニル‐α‐Ｌ‐アラビノフラノシドを基質として作用させた場合、ｐ‐ニトロフェノールを遊離する。
（ｂ）至適温度：ｐ‐ニトロフェニル‐α‐Ｌ‐アラビノフラノシドを基質としてｐＨ７．０にて１０分間反応させ、遊離するｐ‐ニトロフェノールの量を４００ｎｍの吸光度により測定する方法での反応至適温度は約９０℃である。
（ｃ）熱安定性：ｐＨ７．０にて９０℃で保持したとき、少なくとも２４時間以上酵素の失活が見られない。
（ｄ）阻害剤：エチレンジアミン四酢酸、ジチオスレイトールでは阻害されない。
（ｅ）金属イオンの影響：塩化マグネシウム、塩化カルシウムの添加により活性が促進も阻害もされない。
（ｆ）分子量：質量分析器により測定した分子量は約５５３００ダルトンである。
（２） 配列番号１で表されるアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質。
（３） 上記（２）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４） 配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする、上記（３）記載のＤＮＡ。
（５） 上記（３）または（４）記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（６） 上記（５）記載の組換えベクターで形質転換した形質転換体。
（７） 上記（６）記載の形質転換体を培養して耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼを製造することを特徴とする耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼの製造方法。
（１） 下記の性質を有するα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ。
（ａ）作用：ｐ‐ニトロフェニル‐α‐Ｌ‐アラビノフラノシドを基質として作用させた場合、ｐ‐ニトロフェノールを遊離する。
（ｂ）至適温度：ｐ‐ニトロフェニル‐α‐Ｌ‐アラビノフラノシドを基質としてｐＨ７．０にて１０分間反応させ、遊離するｐ‐ニトロフェノールの量を４００ｎｍの吸光度により測定する方法での反応至適温度は約９０℃である。
（ｃ）熱安定性：ｐＨ７．０にて９０℃で保持したとき、少なくとも２４時間以上酵素の失活が見られない。
（ｄ）阻害剤：エチレンジアミン四酢酸、ジチオスレイトールでは阻害されない。
（ｅ）金属イオンの影響：塩化マグネシウム、塩化カルシウムの添加により活性が促進も阻害もされない。
（ｆ）分子量：質量分析器により測定した分子量は約５５３００ダルトンである。
（２） 配列番号１で表されるアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質。
（３） 上記（２）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４） 配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする、上記（３）記載のＤＮＡ。
（５） 上記（３）または（４）記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（６） 上記（５）記載の組換えベクターで形質転換した形質転換体。
（７） 上記（６）記載の形質転換体を培養して耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼを製造することを特徴とする耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼの製造方法。
本発明によれば、極めて耐熱性が良好で、高温条件下で反応活性が高いα‐Ｌアラビノフラノシダーゼを提供でき、また、該α‐Ｌアラビノフラノシダーゼを効率よく大量生産可能となる。
本発明の耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼは好熱菌サーモトガ マリティマ（Thermotoga maritima）由来のもので、遺伝子工学的手法により得られたものである。本発明のα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ遺伝子は、好熱菌サーモトガ
マリティマ（Thermotoga maritima）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号３及び４に示すプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅することにより得られる。
マリティマ（Thermotoga maritima）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号３及び４に示すプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅することにより得られる。
このα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ遺伝子を用いて、耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼを得るには、該遺伝子を例えば大腸菌発現ベクター等に挿入し、得られた組換えベクターを大腸菌等の適当な宿主に導入し、形質転換体を得、該形質転換体を培地に培養し、菌体あるいは培養物から得ることができる。
本発明の耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼは、上記した酵素学的性質を有し、極めて熱安定性が良好で、かつ、高い温度で酵素活性を発揮しうることが特徴であり、このような耐熱性のα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼは従来みられないものである。例えば、従来公知のジオバチルス
ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）菌由来のα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼの酵素活性は７０℃で１時間後に半分に低下（Applied
and Environmental Microbiology, Vol.61,p170-174,1995）し、またサーモバチルス キシラニリティカス（Thermobacillus
xylanilyticus）由来の酵素活性も９０℃で２時間後に半分に低下する（Applied and Environmental Microbiology,
Vol.66,p1734-1736,2000）が、本発明の耐熱性酵素は９０℃で１日経過後も失活が見られない。また１００℃でも７時間後に１０％以上の酵素活性を維持する。
本発明の耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼは、上記した酵素学的性質を有し、極めて熱安定性が良好で、かつ、高い温度で酵素活性を発揮しうることが特徴であり、このような耐熱性のα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼは従来みられないものである。例えば、従来公知のジオバチルス
ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）菌由来のα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼの酵素活性は７０℃で１時間後に半分に低下（Applied
and Environmental Microbiology, Vol.61,p170-174,1995）し、またサーモバチルス キシラニリティカス（Thermobacillus
xylanilyticus）由来の酵素活性も９０℃で２時間後に半分に低下する（Applied and Environmental Microbiology,
Vol.66,p1734-1736,2000）が、本発明の耐熱性酵素は９０℃で１日経過後も失活が見られない。また１００℃でも７時間後に１０％以上の酵素活性を維持する。
本発明の耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼは、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するが、この配列表の配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものであっても、耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質である限り、本発明に包含される。
また、本発明における耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ遺伝子は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列、あるいはこの配列表の配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば、特に限定されないが、具体的には、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。
また、本発明における耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ遺伝子は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列、あるいはこの配列表の配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば、特に限定されないが、具体的には、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。
なお、上記アミノ酸の付加、欠失又は置換は周知技術である部位特定変異誘発（例えば、Nucleic Acids Research,Vol.10,p6487-6500,1982を参照）やランダム変異（例えば、Technique,Vol.1,p11-15,1989を参照）等それ自体周知の方法により実施することができる。
本発明における上記耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ遺伝子を導入するための宿主としては、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母等が挙げられ、これらにおいて本発明の耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ遺伝子を上記各宿主において発現させるために、発現ベクターに該遺伝子を挿入して上記宿主を形質転換するが、例えば宿主としては大腸菌JM109，BL21(DE3)等を用い、発現ベクターとしては、pUC118、pET28a(+)、pET32a(+)等を用いればよい。
本発明における上記耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ遺伝子を導入するための宿主としては、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母等が挙げられ、これらにおいて本発明の耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ遺伝子を上記各宿主において発現させるために、発現ベクターに該遺伝子を挿入して上記宿主を形質転換するが、例えば宿主としては大腸菌JM109，BL21(DE3)等を用い、発現ベクターとしては、pUC118、pET28a(+)、pET32a(+)等を用いればよい。
本発明においては上記形質転換体を宿主に好適な培地で培養し、培地中の菌体あるいは培養物等から、耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼを、粗酵素あるいは精製酵素の形態で得る。本酵素の精製においては、本酵素の耐熱性が極めて高いので、他の精製法と併用して加熱処理をすることが有用かつ便利である。
すなわち、上記培地から得られた菌体あるいは培養物処理液には、該宿主由来の様々なタンパク質等を包含するが、例えば８０℃に加熱処理すれば、これら共雑タンパク質は変性し沈殿する。これに対して、本酵素は、この温度条件下では変性しにくく沈殿しないので、遠心分離等によりたやすく分離できる。また、この後、遠心上澄みを疎水、陰イオン交換、ゲル濾過等のカラムクロマトグラムにかければ、精製度の高い耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼを容易に得ることができる。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
すなわち、上記培地から得られた菌体あるいは培養物処理液には、該宿主由来の様々なタンパク質等を包含するが、例えば８０℃に加熱処理すれば、これら共雑タンパク質は変性し沈殿する。これに対して、本酵素は、この温度条件下では変性しにくく沈殿しないので、遠心分離等によりたやすく分離できる。また、この後、遠心上澄みを疎水、陰イオン交換、ゲル濾過等のカラムクロマトグラムにかければ、精製度の高い耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼを容易に得ることができる。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
本実施例においては、酵素活性の測定において、基質として、人工基質であるｐ‐ニトロフェニルαーＬ‐アラビノフラノシドを使用し、酵素活性の発現により遊離するｐ‐ニトロフェノール由来の４００ｎｍ付近の吸収を測定しているが、このような測定法はα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ酵素活性の測定法として広く知られているものである。
〔実施例１〕
（１）アラビノフラノシダーゼ遺伝子のクローニング
遺伝子のクローニングは、サーモトガ マリティマ（Thermotoga maritima）由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＫＯＤ-ｐｌｕｓ-ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用い、ＰＣＲ増幅により行った。用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、上流：５’-ＣＡＴＡＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＧＡＴＡＧＴＧＧＴＧＧＡＴ-３’（配列番号３）、下流：５’-ＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＣＣＡＡＴＴＣＴＡＣＣＴＣＡＡＴＣＡＣ-３’（配列番号４）である。増幅反応は、９４℃で２分間保温後、９４℃ １５秒、５５℃ ３０秒、６８℃ １分からなる温度サイクルを２５回繰り返すことにより行った。
（１）アラビノフラノシダーゼ遺伝子のクローニング
遺伝子のクローニングは、サーモトガ マリティマ（Thermotoga maritima）由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＫＯＤ-ｐｌｕｓ-ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用い、ＰＣＲ増幅により行った。用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、上流：５’-ＣＡＴＡＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＧＡＴＡＧＴＧＧＴＧＧＡＴ-３’（配列番号３）、下流：５’-ＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＣＣＡＡＴＴＣＴＡＣＣＴＣＡＡＴＣＡＣ-３’（配列番号４）である。増幅反応は、９４℃で２分間保温後、９４℃ １５秒、５５℃ ３０秒、６８℃ １分からなる温度サイクルを２５回繰り返すことにより行った。
（３）塩基配列の決定
次に、上記（２）で得られた組換えプラスミドｐＥＴｍａｂｆ１のインサート領域について塩基配列を決定した。シーケンシング反応は、アプライドバイシステムズ社製ビッグダイ・バージョン３キットを用い、ダイデオキシ法により行った。塩基配列の解析は、アプライドバイシステムズ社製ＤＮＡシーケンサー（プリズム３１０）により行った。決定した塩基配列および推定アミノ酸配列を配列表の配列番号２および１に示した。こうして塩基配列の決定されたｐＥＴｍａｂｆ１は平成１６年３月２６日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ-１９７５２として寄託されている。こうしてα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼの高発現プラスミドが構築された。
次に、上記（２）で得られた組換えプラスミドｐＥＴｍａｂｆ１のインサート領域について塩基配列を決定した。シーケンシング反応は、アプライドバイシステムズ社製ビッグダイ・バージョン３キットを用い、ダイデオキシ法により行った。塩基配列の解析は、アプライドバイシステムズ社製ＤＮＡシーケンサー（プリズム３１０）により行った。決定した塩基配列および推定アミノ酸配列を配列表の配列番号２および１に示した。こうして塩基配列の決定されたｐＥＴｍａｂｆ１は平成１６年３月２６日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ-１９７５２として寄託されている。こうしてα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼの高発現プラスミドが構築された。
（４）組換えアラビノフラノシダーゼ遺伝子の発現
ｐＥＴｍａｂｆ１を東洋紡社製の大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社製）に導入し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ（１％ トリプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ 塩化ナトリウム）寒天プレート上、３７℃で培養した。生育してきた単一コロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で振とう培養した。６００ｎｍにおける吸光度が０．８に達したところで、終濃度０．５ｍＭのイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシドを加え、３７℃でさらに５時間、振とう培養した。
ｐＥＴｍａｂｆ１を東洋紡社製の大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社製）に導入し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ（１％ トリプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ 塩化ナトリウム）寒天プレート上、３７℃で培養した。生育してきた単一コロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で振とう培養した。６００ｎｍにおける吸光度が０．８に達したところで、終濃度０．５ｍＭのイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシドを加え、３７℃でさらに５時間、振とう培養した。
（５）組換えアラビノフラノシダーゼの精製
菌体を遠心分離（５、０００ｇ、１０分）により回収し（湿菌体重量 １７ｇ）、２０ｍＭ トリスー塩酸（ｐＨ８．０）、１μｇ／ｍｌリゾチームおよび１μｇ／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼＩを加えた。ピペッティングにより菌体をよく懸濁し、コンスタントセルディスラプター（セルディスラプションシステムズ社製）により２．３Ｍｐａで菌体を破砕した。沈澱を遠心分離により除去（２００００ｇ、２０分）し、上精を回収後、８０℃で３０分間加熱処理をした。沈澱を遠心分離により除去（２００００ｇ、２０分）し、上精に終濃度１．５％となるように３０％硫酸ストレプトマイシン溶液を加え、４℃で一晩放置した。沈殿物を遠心分離により除去（２００００ｇ、２０分）し、上精を回収し、終濃度１Ｍとなるように硫酸アンモニウムを加えた。本タンパク質溶液を２０ｍＭ トリスー塩酸（ｐＨ８．０）、１Ｍ 硫酸アンモニウムで平衡化したアマシャム社製のＨｉ-Ｔｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ（５ｍｌ）カラムに添加し、硫酸アンモニウムの濃度勾配（１→０Ｍ）により吸着タンパク質を溶出した。アラビノフラノシダーゼの活性を示す画分を回収し、２０ｍＭ トリスー塩酸（ｐＨ８．０）に対して透析した。上精を、２０ｍＭ トリスー塩酸（ｐＨ８．０）で平衡化したアマシャム社製のＨｉ-Ｔｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦ（５ｍｌ）カラムに添加し、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ トリスー塩酸（ｐＨ８．０）で洗浄し、塩化ナトリウムの濃度勾配（０．１Ｍ→０．４Ｍ）により吸着タンパク質を溶出した。アラビノフラノシダーゼの活性を示す画分を回収し、２０ｍＭ トリスー塩酸（ｐＨ７．０）に対して透析した。本方法により、湿菌体重量１ｇあたり２０ｍｇの精製酵素を得ることができた。
菌体を遠心分離（５、０００ｇ、１０分）により回収し（湿菌体重量 １７ｇ）、２０ｍＭ トリスー塩酸（ｐＨ８．０）、１μｇ／ｍｌリゾチームおよび１μｇ／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼＩを加えた。ピペッティングにより菌体をよく懸濁し、コンスタントセルディスラプター（セルディスラプションシステムズ社製）により２．３Ｍｐａで菌体を破砕した。沈澱を遠心分離により除去（２００００ｇ、２０分）し、上精を回収後、８０℃で３０分間加熱処理をした。沈澱を遠心分離により除去（２００００ｇ、２０分）し、上精に終濃度１．５％となるように３０％硫酸ストレプトマイシン溶液を加え、４℃で一晩放置した。沈殿物を遠心分離により除去（２００００ｇ、２０分）し、上精を回収し、終濃度１Ｍとなるように硫酸アンモニウムを加えた。本タンパク質溶液を２０ｍＭ トリスー塩酸（ｐＨ８．０）、１Ｍ 硫酸アンモニウムで平衡化したアマシャム社製のＨｉ-Ｔｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ（５ｍｌ）カラムに添加し、硫酸アンモニウムの濃度勾配（１→０Ｍ）により吸着タンパク質を溶出した。アラビノフラノシダーゼの活性を示す画分を回収し、２０ｍＭ トリスー塩酸（ｐＨ８．０）に対して透析した。上精を、２０ｍＭ トリスー塩酸（ｐＨ８．０）で平衡化したアマシャム社製のＨｉ-Ｔｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦ（５ｍｌ）カラムに添加し、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ トリスー塩酸（ｐＨ８．０）で洗浄し、塩化ナトリウムの濃度勾配（０．１Ｍ→０．４Ｍ）により吸着タンパク質を溶出した。アラビノフラノシダーゼの活性を示す画分を回収し、２０ｍＭ トリスー塩酸（ｐＨ７．０）に対して透析した。本方法により、湿菌体重量１ｇあたり２０ｍｇの精製酵素を得ることができた。
（６）タンパク質の分子量
パーセプティブ社製質量分析器ボイジャーＬＳにより分子量分析を行ったところ、５５２６７ダルトンであった。これは、アミノ酸配列から計算される５５２８４ダルトンとほぼ一致していた。また、アマシャム社製ゲル濾過カラムSuperose 6 10/300ＧＬカラム（１０×３００ｍｍ）を用い、２０ｍＭ トリスー塩酸（ｐＨ７．０）、０．２Ｍ 塩化ナトリウム、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、室温で分析したところ、３３１キロダルトンの位置に溶出され、本酵素が６量体を形成することが判明した。
パーセプティブ社製質量分析器ボイジャーＬＳにより分子量分析を行ったところ、５５２６７ダルトンであった。これは、アミノ酸配列から計算される５５２８４ダルトンとほぼ一致していた。また、アマシャム社製ゲル濾過カラムSuperose 6 10/300ＧＬカラム（１０×３００ｍｍ）を用い、２０ｍＭ トリスー塩酸（ｐＨ７．０）、０．２Ｍ 塩化ナトリウム、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、室温で分析したところ、３３１キロダルトンの位置に溶出され、本酵素が６量体を形成することが判明した。
（７）タンパク質の諸性質
アラビノフラノシダーゼ活性の酵素活性の測定は３０℃で行い、４００ｎｍにおける吸光度の変化をモニターすることにより反応速度を決定した。
アラビノフラノシダーゼ活性の酵素活性の測定は３０℃で行い、４００ｎｍにおける吸光度の変化をモニターすることにより反応速度を決定した。
（ａ）酵素活性
以下の合成基質（すべてシグマ社製）を終濃度１ｍＭとなるように０．１Ｍ トリスー塩酸（ｐＨ７．０）に溶解し、８０℃で活性を測定した。ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノフラノシド、ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノピラノシド、ｐ‐ニトロフェニル β‐Ｄ‐キシロピラノシド、ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐フコピラノシド，α‐Ｌ‐ラムノピラノシド、ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｄ‐キシロピラノシド、ｐ‐ニトロフェニル β‐Ｄ‐グルコピラノシド、ｐ‐ニトロフェニル β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド、ｐ‐ニトロフェニル β‐Ｄ‐フコピラノシド、ｐ‐ニトロフェニル β‐Ｄ‐マンノピラノシド。その結果、ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノフラノシドおよびｐ‐ニトロフェニル β‐Ｄ‐キシロピラノシドに対してのみ活性を示した。速度論的パラメータは、ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノフラノシドに対するミカエリス定数が０．４２ｍＭ、ターンオーバーが２２回毎秒であった。ｐ‐ニトロフェニル β‐Ｄ‐キシロピラノシドに対しては、ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノフラノシドの１０００分の１程度の活性を示したので本酵素の主たる活性はα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼであることが判明した。
以下の合成基質（すべてシグマ社製）を終濃度１ｍＭとなるように０．１Ｍ トリスー塩酸（ｐＨ７．０）に溶解し、８０℃で活性を測定した。ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノフラノシド、ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノピラノシド、ｐ‐ニトロフェニル β‐Ｄ‐キシロピラノシド、ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐フコピラノシド，α‐Ｌ‐ラムノピラノシド、ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｄ‐キシロピラノシド、ｐ‐ニトロフェニル β‐Ｄ‐グルコピラノシド、ｐ‐ニトロフェニル β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド、ｐ‐ニトロフェニル β‐Ｄ‐フコピラノシド、ｐ‐ニトロフェニル β‐Ｄ‐マンノピラノシド。その結果、ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノフラノシドおよびｐ‐ニトロフェニル β‐Ｄ‐キシロピラノシドに対してのみ活性を示した。速度論的パラメータは、ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノフラノシドに対するミカエリス定数が０．４２ｍＭ、ターンオーバーが２２回毎秒であった。ｐ‐ニトロフェニル β‐Ｄ‐キシロピラノシドに対しては、ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノフラノシドの１０００分の１程度の活性を示したので本酵素の主たる活性はα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼであることが判明した。
（ｂ）耐熱性
高温での酵素活性の半減期は、２０ｍＭ トリスー塩酸（ｐＨ７．０）に溶解した０．４μｇ／μｌの酵素液を９０℃で保温し、一定時間ごとに酵素液の一部を分取し、０．１Ｍ トリスー塩酸（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノフラノシドを含む活性測定液中、３０℃で残存活性を測定することにより決定した。その結果、図１に示すように、９０℃において、少なくとも２４時間は酵素の失活が見られなかった（図１、黒丸）。これは、ジオバチルス
ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）由来α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼの７０℃における半減期１時間（Applied
and Environmental Microbiology,Vol.61,p170-174,1995）よりもはるかに耐熱性であり、サーモバチルス キシラニリティカス（Thermobacillus
xylanilyticus）由来α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼの９０℃における半減期２時間（Applied and Environmental
Microbiology,Vol.66,p1734-1736,2000）よりも耐熱性の高いことを示す。同様に、１００℃における失活は図１、白丸に示すように、２０分以内に半分に低下したが、その後はゆるやかに失活した。７時間経過後も約１０％の活性を維持していた。
高温での酵素活性の半減期は、２０ｍＭ トリスー塩酸（ｐＨ７．０）に溶解した０．４μｇ／μｌの酵素液を９０℃で保温し、一定時間ごとに酵素液の一部を分取し、０．１Ｍ トリスー塩酸（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノフラノシドを含む活性測定液中、３０℃で残存活性を測定することにより決定した。その結果、図１に示すように、９０℃において、少なくとも２４時間は酵素の失活が見られなかった（図１、黒丸）。これは、ジオバチルス
ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）由来α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼの７０℃における半減期１時間（Applied
and Environmental Microbiology,Vol.61,p170-174,1995）よりもはるかに耐熱性であり、サーモバチルス キシラニリティカス（Thermobacillus
xylanilyticus）由来α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼの９０℃における半減期２時間（Applied and Environmental
Microbiology,Vol.66,p1734-1736,2000）よりも耐熱性の高いことを示す。同様に、１００℃における失活は図１、白丸に示すように、２０分以内に半分に低下したが、その後はゆるやかに失活した。７時間経過後も約１０％の活性を維持していた。
（ｃ）活性の温度依存性
本酵素の活性の温度依存性を３０℃から９５℃の温度範囲で測定した。０．１Ｍ トリス‐塩酸（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノフラノシドを含む活性測定液中に酵素液を添加し、各温度で１０分間保温し、氷水中で冷却し反応を停止し、直ちに４００ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、図２に示すように、本酵素は９０℃に至適温度を持つことが判明した。また、５０から８５℃の温度範囲でアレニウスプロットは直線を与え、触媒反応の活性化エネルギーは６５ｋＪ／ｍｏｌと算出された。これは、ジオバチルス
ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）由来のα-Ｌ-アラビノフラノシダーゼの触媒反応の活性化エネルギー７０ｋＪ／ｍｏｌ（Applied
and Environmental Microbiology,Vol.61,p170-174,1995）よりも小さかった。以上のことから、本酵素の耐熱性が高く、高温で効率的に反応する酵素であることが判明した。
本酵素の活性の温度依存性を３０℃から９５℃の温度範囲で測定した。０．１Ｍ トリス‐塩酸（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノフラノシドを含む活性測定液中に酵素液を添加し、各温度で１０分間保温し、氷水中で冷却し反応を停止し、直ちに４００ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、図２に示すように、本酵素は９０℃に至適温度を持つことが判明した。また、５０から８５℃の温度範囲でアレニウスプロットは直線を与え、触媒反応の活性化エネルギーは６５ｋＪ／ｍｏｌと算出された。これは、ジオバチルス
ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）由来のα-Ｌ-アラビノフラノシダーゼの触媒反応の活性化エネルギー７０ｋＪ／ｍｏｌ（Applied
and Environmental Microbiology,Vol.61,p170-174,1995）よりも小さかった。以上のことから、本酵素の耐熱性が高く、高温で効率的に反応する酵素であることが判明した。
（ｄ）二価金属の影響
０．１Ｍ トリスー塩酸（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノフラノシド、および１０ｍＭ 塩化マグネシウム、塩化カルシウムのいずれかを加え酵素反応の測定を行った。その結果、これらの二価金属は活性を促進することも阻害することもないことが判明した。
０．１Ｍ トリスー塩酸（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノフラノシド、および１０ｍＭ 塩化マグネシウム、塩化カルシウムのいずれかを加え酵素反応の測定を行った。その結果、これらの二価金属は活性を促進することも阻害することもないことが判明した。
（ｅ）阻害剤の影響
０．１Ｍ トリスー塩酸（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノフラノシド、および終濃度５０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を加えても活性を促進することも阻害することもないことが判明した。また、０．１Ｍ トリスー塩酸（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノフラノシド、および終濃度１０ｍＭのジチオスレイトールを加えても活性を促進することも阻害することもないことが判明した。
０．１Ｍ トリスー塩酸（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノフラノシド、および終濃度５０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を加えても活性を促進することも阻害することもないことが判明した。また、０．１Ｍ トリスー塩酸（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ｐ‐ニトロフェニル α‐Ｌ‐アラビノフラノシド、および終濃度１０ｍＭのジチオスレイトールを加えても活性を促進することも阻害することもないことが判明した。
（ｆ）分子量
本酵素の分子量をパーセプティブ社の質量分析計ボイジャーにより測定したところ、５５２８４ダルトンを与えた。また、アマシャム社製のスーパーロース 6 10/300 GL カラムを用い、２０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．２Ｍ 塩化ナトリウム溶液中、流速毎分０．５ｍｌでゲル濾過により分子量を測定したところ３３２キロダルトンを与えた。このことから、本酵素が６量体で機能すると推定された。
本酵素の分子量をパーセプティブ社の質量分析計ボイジャーにより測定したところ、５５２８４ダルトンを与えた。また、アマシャム社製のスーパーロース 6 10/300 GL カラムを用い、２０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．２Ｍ 塩化ナトリウム溶液中、流速毎分０．５ｍｌでゲル濾過により分子量を測定したところ３３２キロダルトンを与えた。このことから、本酵素が６量体で機能すると推定された。
Claims (7)
- 下記の性質を有するα‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ。
（１）作用：ｐ‐ニトロフェニル‐α‐Ｌ‐アラビノフラノシドを基質として作用させた場合、ｐ‐ニトロフェノールを遊離する。
（２）至適温度：ｐ‐ニトロフェニル‐α‐Ｌ‐アラビノフラノシドを基質としてｐＨ７．０にて１０分間反応させ、遊離するｐ‐ニトロフェノールの量を４００ｎｍの吸光度により測定する方法での反応至適温度は約９０℃である。
（３）熱安定性：ｐＨ７．０にて９０℃で保持したとき、少なくとも２４時間以上酵素の失活が見られない。
（４）阻害剤：エチレンジアミン四酢酸、ジチオスレイトールでは阻害されない。
（５）金属イオンの影響：塩化マグネシウム、塩化カルシウムの添加により活性が促進も阻害もされない。
（６）分子量：質量分析器により測定した分子量は約５５３００ダルトンである。 - 配列番号１で表されるアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質。
- 請求項２に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする、請求項３記載のＤＮＡ。
- 請求項３または４記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
- 請求項５記載の組換えベクターで形質転換した形質転換体。
- 請求項６記載の形質転換体を培養して耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼを製造することを特徴とする耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼの製造方法。
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| JP2004107477A JP4280829B2 (ja) | 2004-03-31 | 2004-03-31 | 耐熱性α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼおよびその製造法 |
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| JP2005287402A JP2005287402A (ja) | 2005-10-20 |
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| CN116179516B (zh) * | 2022-12-29 | 2024-01-26 | 云南师范大学 | 一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶及其应用 |
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2004
- 2004-03-31 JP JP2004107477A patent/JP4280829B2/ja not_active Expired - Lifetime
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