CN102666870A - 用于改善的抑制剂特征的生物质的氨预处理 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于处理生物质以释放具有改善的抑制剂特征的可发酵糖的方法。具体地讲，通过糖化在适宜反应条件下用氨预处理生物质而获得的反应产物来获得包含可发酵糖的水解产物，所述可发酵糖具有改善的抑制剂特征。预处理的生物质反应产物具有大于约1的乙酰胺/乙酸根的摩尔比以及大于60％的乙酰基转化率。乙酰胺/乙酸根的摩尔比在整个糖化期间被保持大于约1。可将水解产物发酵成目标化合物。

Description

用于改善的抑制剂特征的生物质的氨预处理
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2009年10月12日提交的美国临时专利申请No.61/250598的优先权，所述文献全文以引用方式并入本文中。
发明领域
本发明提供了用于处理生物质以获得可发酵糖的方法。具体地讲，本发明描述了用氨处理生物质以释放出具有改善的抑制剂特征的可发酵糖的方法。还描述了将糖发酵成目标产物的改进的方法。
发明背景
通过微生物生产乙醇可提供替代化石燃料的可供选择的能量源并且是当前研究的重要领域。期望纤维质水解产物作为用于通过微生物制备乙醇的发酵培养基的糖的可再生来源。纤维质水解产物一般由生物质通过预处理和糖化而产生。已知存在多种预处理方法，包括生物质的氨预处理。
例如，具有至少60％干物质含量的麦秆以及包含木质纤维素的其它植物物质的氨化方法公开于美国专利4,064,276中。使用无水氨并且使浸泡氨的材料在环境温度下放置至少10天。
美国专利5,037,663公开了用液氨处理包含纤维素和/或半纤维素的饲料物质的方法，其中氨与干纤维的重量比可如下变化，为约0.5至约10份氨比约1份物质。一般来讲，最佳的含水量按干燥基计为约10至约40％的总水分并且可采用约150至约500psi的处理压力。处理后，压力随后快速降至大气压。
已公布的专利申请US 2007/0031918公开了在高浓度固体和低浓度氨条件下预处理生物质的方法。所用的氨浓度是足以保持生物质-氨水混合物的pH为碱性的最小浓度并且相对于生物质的干重计最大值小于约12重量％。生物质干重的初始浓度为生物质-氨水混合物重量的至少约15％至最多约80％。
已公布的专利申请US 2008/0008783公开了处理植物生物质以提高包含半纤维素和纤维素的植物聚合物反应性的方法，所述方法包括：使已经被磨碎并且包含不同含水量的植物生物质接触液态或蒸汽态的无水氨和/或液态或蒸汽态的浓缩的氨∶水混合物以获得如下混合物，其中氨与干燥生物质的比率介于约0.2∶1和1.2∶1之间，并且水与干燥生物质的比率介于约0.2∶1.0和1.5∶1之间。温度被保持介于约50℃与140℃之间并且通过从容器中释放氨而快速释压以形成处理的生物质。
纤维质水解产物通常包含对生物催化剂生长和产量可能有害的物质。例如，乙酸根是存在于纤维质水解产物中的常见产物，已显示出其在水解产物中通常存在的浓度下抑制运动发酵单胞菌(Ranatunga等人(1997)，“Applied Biochemistry and Biotechnology”67：185-198)。
需要用氨预处理生物质的方法，所述方法在糖化后提供具有改善的抑制剂特征的水解产物。具有改善的抑制剂特征的水解产物将有利地用于将糖发酵成目标产物并且可提供经济上的有益效果。
发明概述
本发明提供了用于处理生物质以释放具有改善的抑制剂特征的可发酵糖的方法。所述方法包括在适宜的反应条件下用一定量的氨处理生物质以提供预处理的生物质反应产物，所述产物具有大于约1的乙酰胺/乙酸根的摩尔比以及大于60％的乙酰基转化率，并且用至少一种糖化酶来糖化所述反应产物同时使乙酰胺/乙酸根的摩尔比在整个糖化步骤期间保持大于约1。适宜的反应条件包括约低于大气压至小于10个大气压的压力，小于约20∶1的水与氨的质量比，约4℃至约200℃的温度，30天或更短的反应时间以及大于约60％的系统固体负载。
在本发明的一个实施方案中，提供一种方法，所述方法包括：
a)在适宜的反应条件下用一定量的氨处理生物质，其中所述条件提供预处理的生物质反应产物，所述产物具有大于约1的乙酰胺/乙酸根的摩尔比以及大于60％的乙酰基转化率，其中所述适宜的反应条件包括约低于大气压至小于10个大气压的压力；
b)用酶聚生体来糖化预处理的生物质反应产物，其中制得包含可发酵糖的水解产物，并且其中与使乙酰胺/乙酸根的摩尔比小于约1的预处理的生物质反应产物糖化相比，所述水解产物具有改善的抑制剂特征；以及
c)使乙酰胺/乙酸根的摩尔比在整个步骤(b)的糖化期间保持大于约1。
在一些实施方案中，所述方法还可包括通过加入能够使糖发酵成目标产物的种子细胞的种菌而发酵水解产物以制得目标产物。在一些实施方案中，乙酰基转化率大于70％。在一些实施方案中，与乙酰胺/乙酸根的摩尔比小于约1并且乙酰基转化率大于60％的预处理的生物质反应产物相比，经过糖化的木糖总收率得到改善。在一些实施方案中，步骤(a)中所述生物质具有至少约60重量％的干物质含量。在一些实施方案中，所述生物质在步骤(a)之前经受预加工。在一些实施方案中，温度为约20℃至约121℃并且反应时间为约100小时或更短。
本发明提供了将糖发酵成目标产物的方法。所述方法包括提供乙酰胺/乙酸根的摩尔比大于约1的水解产物，将适宜的种子细胞的种菌加入到所述水解产物中，并且发酵所述水解产物以提供包含目标产物的发酵混合物。可通过糖化如上所述的预处理的生物质反应产物来获得水解产物。在本发明的一个实施方案中，提供了将糖发酵成目标产物的改进的方法，所述方法包括：
a)提供水解产物，所述水解产物具有大于约1的乙酰胺/乙酸根的摩尔比；
b)将能够使糖发酵成目标产物的种子细胞的种菌加入到所述水解产物中，其中所述种菌为所述水解产物的约0.1％至约10％；以及
c)发酵所述水解产物以提供包含目标产物的发酵混合物。
在一些实施方案中，与乙酰胺/乙酸根的摩尔比小于1的水解产物相比，所述水解产物为所述种菌提供改善的细胞生长速率。在一些实施方案中，与发酵乙酰胺/乙酸根的摩尔比小于1的水解产物相比，用较少的种子细胞的种菌来引发所述水解产物的发酵。在一些实施方案中，目标产物选自乙醇、丁醇和1，3-丙二醇。
发明详述
本发明提供了用于处理生物质以释放具有改善的抑制剂特征的可发酵糖的方法。所述方法包括在适宜的反应条件下用一定量的氨处理生物质以提供预处理的生物质反应产物，所述产物具有大于约1的乙酰胺/乙酸根的摩尔比以及大于60％的乙酰基转化率，并且用酶聚生体来糖化所述反应产物同时使乙酰胺/乙酸根的摩尔比在整个糖化期间保持大于约1。
此外，本发明提供了将糖发酵成目标产物的方法。所述方法包括提供乙酰胺/乙酸根的摩尔比大于约1的水解产物，将种子细胞的种菌加入到所述水解产物中，并且发酵所述水解产物以提供包含目标产物的发酵混合物。通过糖化预处理的生物质而制得水解产物，同时经过糖化保持了乙酰胺/乙酸根的摩尔比。种菌为所述水解产物的约0.1％至约10％。
本发明申请人特别地将所有引用的参考文献的完整内容引入本公开内容中。此外，当数量、浓度或其它数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应被理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。除非另行指出，凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均旨在包含其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数。当定义一个范围时，不旨在将本发明的范围限定于所列举的具体值。
定义
在本公开中使用了以下定义：
如本文所用，术语“包含”、“由组成”、“包括”、“涵盖”、“具有”、“含有”、“包容”或“容纳”或其任何其它变型旨在包括非排他的包含。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下任何一种情况均满足条件A或B：A是真实的(或存在的)且B是虚假的(或不存在的)，A是虚假的(或不存在的)且B是真实的(或存在的)，以及A和B都是真实的(或存在的)。
同样，涉及元素或组分实例(即次数)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
当涉及温度时，“室温”和“环境”是指约15℃至约25℃的任何温度。
“可发酵糖”是指包括单糖和多糖的糖，在生产目标产物的发酵过程中微生物可利用它们作为碳源。
“单体糖类”或“单糖”由单一的戊糖或己糖单元构成，例如葡萄糖。
“木质纤维质”是指既包含木质素又包含纤维素的材料。木质纤维质的材料也可包含半纤维素。
“纤维质”是指包含纤维素的组合物。
“乙酰基转化”是指生物质乙酰酯基水解或氨解产生与乙酸铵(来自水解)或乙酰胺(来自氨解)平衡的乙酸。
“目标产物”指发酵产生的化学制品、燃料、或化学结构物。产物按广义使用并且包括分子例如蛋白质，包括例如肽、酶和抗体。预期乙醇和丁醇也包括在目标产物的定义之内。
“生物质的干重”是指移除全部的或基本上全部的水分后的生物质的重量。干重通常依照美国材料与试验协会(ASTM)标准E1756-01(Standard Test Method for Determination of Total Solids in Biomass)或纸浆与造纸工业技术协会，Inc.(TAPPI)标准T-412om-02(Moisture in Pulp，Paper and Paperboard)进行测量。生物质干重与生物质的干物质含量同义。
“系统固体负载”是指系统内的生物质干重除以系统总质量，其中系统总质量包括水、氨和生物质，包括加入到预处理过程中的其它添加剂。
如本文所用，“生物质”和“木质纤维质的生物质”指任何木质纤维质的材料，包括纤维质的和半纤维质的材料，例如生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、庭院垃圾、木材、林业垃圾以及它们的组合，下文进一步进行描述。生物质具有包括多糖和低聚糖的碳水化合物成分并且还可包含附加组分，例如蛋白质和/或脂质。
“改善的抑制剂特征”是指任何已知的发酵抑制剂含量降低的抑制剂特征。发酵抑制剂实例是乙酸盐和乙酸。
“细胞生长速率”是指发酵期间微生物的最大指数生长速率。这以通过微生物生长培养物ln(OD)对时间曲线图上的直线的比降测得并且具有单位hr-1。
“OD”是测得的微生物培养物光密度并且与每单位体积内细胞总数成比例。
“初始生长滞后”是指微生物生长培养物在接种到生长介质中后达到其最大指数生长速率所需的时间。这通过测量ln(OD)对时间曲线图比降的直线与时间零点时ln(OD)值处水平线之间的截距测得。
如本文所用，“预加工”是指在预处理之前对木质纤维质的生物质的加工。预加工是对生物质准备进行预处理的任何处理，例如机械破碎和/或干燥至适宜的含水量。
“糖化作用”和“糖化”是指通过酸、碱或水解酶的作用而由多糖形成可发酵糖。由预处理的生物质生产可发酵糖，这通过由纤维素分解酶和半纤维素分解酶的作用的酶解糖化而实现。
如本文所用，“预处理生物质”或“生物质预处理”指使得天然的或经受预加工的生物质经受化学作用、物理作用或生物作用、或它们的任何组合，从而使得所述生物质在糖化之前较易于受酶解糖化或其它水解方法的作用。例如，本文所主张的方法可被称为有助于使得生物质对用于糖化的水解酶更加敏感的预处理方法。
如本文所用，“经过预处理的生物质”是指在糖化之前已受过化学作用、物理作用或生物作用、或者它们的任何组合的作用，从而使得所述生物质对酶解糖化或其它的水解方法更加敏感的天然的或经受预加工的生物质。
“水解产物”指与木质纤维素生物质接触的液体，它包含作用于生物质的水解反应的产物(酶解或非酶解)，在这种情况下包括单体糖和低聚糖。
如本文所用，“酶聚生体”或“糖化酶聚生体”是指酶的集合，通常由微生物分泌，在本发明的情况下，其将通常包含一种或多种纤维素酶、木聚糖酶、糖苷酶、木素酶和阿魏酸酯酶。
“滴度”是指每单位体积介质中的目标产物总量，例如每升发酵培养基中通过发酵产生的乙醇。
木质纤维质的生物质：
本文中预处理的木质纤维质的生物质包括但不限于，生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭园垃圾、木材和林业垃圾。生物质的实例包括但不限于玉米芯、作物残余例如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、蔗渣、高粱、大豆、获取自下列研磨物的组分：谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及矮树丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥。
在一个实施方案中，用于本发明的生物质包括具有相对高碳水化合物含量的生物质，它们相对密集，和/或相对易于收集、运输、贮存和/或处理。
在本发明的一个实施方案中，可用的生物质包括玉米芯、玉米秸秆和蔗渣。
在另一个实施方案中，木质纤维质的生物质包括农业残余物如玉米秸秆、小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦秸秆、稻秆、卡诺拉秸秆和大豆秸秆；草例如柳枝稷、芒草、米草和草芦；纤维加工残余例如玉米纤维、甜菜浆、纸浆厂残渣和废弃物以及蔗渣；高粱；林业垃圾例如白杨木、其它硬木、软木和锯屑；和消费者用过的纸制品垃圾；以及其它作物或足够丰富的木质纤维质的材料。
木质纤维质的生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物，或茎或杆和叶的混合物。
生物质可按得自来源的原样直接使用，或可经受一些预加工，例如可向生物质施加能量以减少尺寸，增加暴露的表面积和/或增加氨处理与糖化酶对存在于生物质中的木质素以及纤维素、半纤维素和/或低聚糖的可达性。可用于减少尺寸、增加暴露的表面积和/或增加氨处理与糖化酶对存在于生物质中的木质素以及纤维素、半纤维素和/或低聚糖的可达性的预加工方法包括但不限于粉碎、压碎、碾磨、撕碎、切剁、盘磨、超声和微波。能量的这种施用可发生在氨处理步骤之前或期间，糖化之前或期间，或它们的任何组合。
在本发明的一个实施方案中，在用氨处理之前，生物质具有至少约60重量％的干物质含量，例如至少约65重量％，或至少约70重量％，或至少约75重量％，或至少约80重量％，或至少约85重量％，或至少约90重量％的干物质含量。如果需要，在预处理之前可通过常规装置例如通过使用旋转烘干机、闪蒸干燥机、或过热蒸汽干燥机对生物质进行干燥。
氨：
如本文所用，“氨”是指使用无水氨气(NH3)、含水介质中的氨气、包含铵离子(NH4 +)的化合物例如氢氧化铵或硫酸铵、降解时释放氨的化合物例如脲、以及它们的组合，任选地在含水介质中使用。
本发明方法中所用氨的量按摩尔计大于生物质中包含的乙酰酯基的量。例如，相对于生物质干重，氨量可大于约3重量％、5重量％、10重量％、15重量％、或20重量％。根据所用的生物质，氨量可为生物质中所含乙酰基量的四倍至六倍(按重量计)。
用于本发明方法中时，氨提供比其它碱更好的优点。氨分成液相和蒸汽相。气态氨能够比液态碱更容易地扩散通过生物质，从而使得在较低浓度下进行更有效的预处理。氨的使用还降低了对氮源发酵期间使用的补充剂生长介质的需求。此外，氨是低成本材料，因此提供了经济的方法。氨还可在预处理期间或预处理后被回收到预处理反应器中，因此能够提供更加经济的方法。例如在预处理后，当温度降低至适于糖化时，可任选地在真空下释放氨气并且可将其回收。在连续方法中，可连续地回收氨。
氨处理条件：
可在任何适宜的容器中用氨预处理生物质。通常该容器是能耐压的容器，并且具有加热机构和混合内容物的机构。可商购获得的容器包括例如ZIPPERCLAVE
Figure BPA00001542485200081
反应器(Autoclave Engineers，Erie，PA)、Jaygo反应器(Jaygo Manufacturing，Inc.，Mahwah，NJ)和蒸汽喷射反应器(描述于一般方法中，Autoclave Engineers，Erie，PA)。可使用具有相似能力的更大型反应器。作为另外一种选择，生物质和氨可在一个容器中混合，然后转移到另一个反应器中。此外，可在一个容器中预处理生物质，然后在另一个反应器例如蒸汽喷射反应器(描述于一般方法中；Autoclave Engineers，Erie，PA)中进一步处理。
可在任何适宜的容器例如间歇反应器或连续反应器中进行氨处理。适宜的容器可配备装置如用于搅拌生物质-氨水混合物的叶轮。反应器设计由Lin，K.-H.和Van Ness，H.C.论述(Perry，R.H.和Chilton，C.H.(编辑)，“Chemical Engineer’s Handbook”，第5版(1973)第4章，McGraw-Hill，NY)。可以用批量方法或连续方法实施氨处理。
可在具有或不具有搅拌的反应器系统中实施氨处理。
在使生物质接触氨之前，可向包含生物质的容器施加真空。通过从生物质孔中抽出空气，可将氨更好地渗透到生物质中。施加真空的时间和施加到生物质的负压的量将取决于生物质类型并且能根据经验进行测定，以便获得最佳的生物质预处理效果(通过糖化后可发酵糖的产量进行测量)。
可在小于10个大气压的压力下用氨处理生物质。例如，适宜的反应条件可包括小于9个大气压，或小于8个大气压，或小于7个大气压，或小于6个大气压，或小于5个大气压，或小于4个大气压，或小于3个大气压，或小于2个大气压的压力。还可在低于大气压下实施氨处理，前提条件是使用相对于生物质足量的氨以进行有效的预处理。
根据本发明方法，在适宜的反应条件下用氨处理生物质，所述反应条件包括约4℃至约200℃的温度。在另一个实施方案中，在约4℃至约150℃的温度下用氨处理生物质。在另一个实施方案中，在约4℃至约121℃的温度下用氨处理生物质。在另一个实施方案中，在约10℃至约100℃的温度下用氨处理生物质。在另一个实施方案中，在约20℃至约50℃的温度下用氨处理生物质。
用氨处理生物质约20分钟至约200小时。更长的预处理时间例如30天或几个月是可行的，然而就实际经济原因而言，优选较短的时间。较长的时间可提供降低破碎生物质施能需求的有益效果，因此，优选最多约200小时。
在一个实施方案中，可在较高温度下用氨处理较短的时间，例如在约140℃至约160℃下处理约20分钟至约30分钟。在另一个实施方案中，在较低的温度下用氨处理较长的时间，例如在约50℃至约100℃下处理约24小时至约48小时。在一个实施方案中，可在约20℃至约121℃下用氨处理约100小时或更短的反应时间。在另一个实施方案中，可在室温(约22-26℃)下用氨处理约30天或甚至更长的时间。还可采用介于这些之间的其它温度和时间的组合。
根据本发明方法，适宜的反应条件包括小于约20∶1的水与氨的质量比，例如包括小于约18∶1、16∶1、14∶1、12∶1、10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、或约0.5∶1的水与氨的质量比。在一些实施方案中，水与氨的质量比可低于0.5∶1。除了生物质中所含的水分以外，还任选将水加入到所述生物质中。在氨处理步骤中，水可按液态水、气态水(水蒸气)、蒸汽或它们的组合形式存在，并且可按液态水、气态水、蒸汽或它们的组合形式加入到生物质中。水可与氨组合加入，或者水与氨分开加入。水可与氨同时加入，或在氨加入之前或之后加入。
根据本发明方法，适宜的反应条件包括大于约60％的系统固体负载，例如约70％，约80％或更高。
就氨处理步骤而言，压力、温度、处理时间、氨量、水与氨的质量比、生物质类型、生物质干物质含量和生物质粒度是相关的；因此可根据需要调节这些变量以获得将与糖化酶聚生体接触的最佳产物。
为了从生物质获得足量的糖，可用氨将生物质处理一次或多于一次。同样地，糖化反应可进行一次或多次。如果需要，可重复氨处理和糖化过程以获得更好的糖收率。为了分开评定或一起评定氨处理和糖化方法的结果，可确定来源于起始生物质的糖的理论收率并且与测量的收率进行比较。
乙酰胺/乙酸根比率和乙酰基转化：
木质纤维质的生物质中的乙酰酯可与水反应形成乙酸。在含水的氨系统中，乙酸将与乙酸铵平衡。已知氨通过氨解生物质中的乙酰酯生成乙酰胺，与水解进行竞争。如公布的美国专利申请2007/0031918中所示，对于某些发酵生物体例如运动发酵单胞菌，乙酰胺的毒性低于乙酸根。因此将乙酰酯转化成乙酰胺而不是转化成乙酸，这降低了从预处理的生物质反应产物或糖化产物中移除乙酸的需要。
期望生物质摩尔脱乙酰度高，例如大于约60％，因为这能够从生物质中包含的木聚糖获得高收率的木糖(单体和低聚物)。由于生产成本对生物质成本高度敏感，因此成本对糖收率高度敏感。而且，糖收率高可使得发酵中的乙醇浓度更高，这还可降低下游产物回收成本。
另一个考虑因素是发酵中的乙酸浓度。约5g/L以上，乙酸开始减缓运动发酵单胞菌的生长速率。因抑制剂浓度降低(例如乙酸或乙酸根)而产生较高的生长速率，使得能够使用较低体积的种子种菌，从而降低了种子发酵罐成本。而且，较高的生长速率可降低生产规模的发酵罐成本。
糖化：
用氨处理后，预处理的生物质反应产物包含纤维素、半纤维素、多糖、木质素、生物质其它组分残余、以及氨与生物质组分的反应产物(具体地讲为乙酰胺、乙酸和乙酸铵)的混合物。氨处理的生物质反应产物具有大于约1的乙酰胺/乙酸根的摩尔比以及大于60％，例如大于约65％，或大于约70％的乙酰基转化率。由于过滤和洗涤步骤不是获得改善的糖收率所必需的，并且因为与它们相关联的成本可对所述方法的经济性产生不利影响，因此优选省略生物质的过滤和洗涤。可在室温下干燥氨处理的生物质。可使用本领域熟知的分析方法来测定氨处理的生物质中葡聚糖、木聚糖和木质素内容物的浓度。
然后在至少一种糖化酶或酶聚生体的存在下将氨处理的生物质进一步水解或糖化以释放水解产物中的低聚糖和/或单糖。可加入表面活性剂例如聚乙二醇(PEG)以改善糖化过程(美国专利7,354,743B2，将其以引用方式并入本文)。用于生物质处理的糖化酶和方法参见Lynd，L.R.等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.，66：506-577，2002)。糖化酶聚生体可包含一种或多种糖苷酶；所述糖苷酶可选自纤维素水解糖苷酶、半纤维素水解糖苷酶和淀粉水解糖苷酶。糖化酶聚生体中的其它酶可包括肽酶、脂肪酶、木素酶和阿魏酸酯酶。
用酶聚生体糖化包括使生物质或预处理的生物质反应产物接触一种或多种酶，所述酶主要选自但不限于：“糖苷酶”类，所述酶水解二糖、低聚糖和多糖的醚键，并且存在于广义“水解酶”(EC 3.)的酶分类EC 3.2.1.x中(“Enzyme Nomenclature”，1992，Academic Press(San Diego，CA)，以及增补1(1993)、增补2(1994)、增补3(1995)、增补4(1997)和增补5[分别在“Eur.J.Biochem.”，223：1-5，1994；“Eur.J.Biochem.”，232：1-6，1995；“Eur.J.Biochem.”，237：1-5，1996；“Eur.J.Biochem.”，250：1-6，1997；和“Eur.J.Biochem.”，264：610-650 1999中])。本发明的方法中可用的糖苷酶能根据它们水解的生物质组分进行分类。可用于本发明方法中的糖苷酶包括纤维素水解糖苷酶(例如，纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶)、半纤维素水解糖苷酶(例如木聚糖酶、内木聚糖酶、外木聚糖酶、β-木聚糖苷酶、阿拉伯糖基木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡糖苷酸酶)和淀粉水解糖苷酶(例如淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、异淀粉酶)。此外，它可用于将其它活性加入到糖化酶聚生体中，例如肽酶(EC 3.4.x.y)、脂肪酶(EC 3.1.1.x和3.1.4.x)、木素酶(EC 1.11.1.x)和阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)以有助于从生物质的其它组分中释放多糖。本领域熟知的生产多糖水解酶的微生物常常表现出某种活性，例如纤维素降解，该活性由若干种酶或一组具有不同底物特异性的酶催化。因此，来自微生物的“纤维素酶”可包括一组酶，所有酶可有助于纤维素降解活性。取决于获取酶时利用的纯化方案，商业或非商业的酶制剂(例如纤维素酶)可包括多种酶。因此，本发明方法的糖化酶聚生体可包括酶活性，如“纤维素酶”，然而人们认识到该活性可被一种以上的酶催化。
糖化酶可按分离形式商购获得，例如SPEZYME
Figure BPA00001542485200121
CP纤维素酶(Genencor International，Rochester，NY)和MULTIFECT
Figure BPA00001542485200122
木聚糖酶(Genencor)。此外，糖化酶可在生物燃料植物的宿主生物中表达，包括使用重组微生物。
本领域的技术人员将懂得如何测定在复合酶中使用的酶的有效量以及如何调节条件以获得最佳酶活性。本领域的技术人员也将懂得如何优化在复合酶中的此类酶的所需活性以在选择条件下获得给定预处理产物的最佳糖化效果。
优选地，糖化反应在糖化酶的最佳温度和pH下或接近此最佳pH和温度的条件下进行。本发明方法中与糖化酶聚生体一起使用的最佳温度在约15℃至约100℃的范围内。在另一个实施方案中，最佳温度在约20℃至约80℃的范围内并且最典型地在45-50℃的范围。最佳pH可在约2至约11的范围内。另一个实施方案中，在本发明的方法中糖化酶聚生体使用的最佳pH在约4至约6.5的范围内。
糖化可进行约几分钟至约200小时，并且优选约24小时至约72小时。反应时间将取决于酶浓度和比活性，以及使用的底物和环境条件例如温度和pH。本领域的技术人员能够容易地决定特定底物和糖化酶聚生体使用的温度、pH和时间的最佳条件。
可间歇地、分批补料式地或以连续方法进行糖化。糖化也能够一步进行或多步进行。例如，糖化所需的不同酶可表现出不同的最佳pH或温度。可用酶在某个温度和pH下进行首次处理，随后使用不同酶在不同温度和/或pH下进行第二次或第三次(或更多次)处理。此外，用不同酶在连续步骤中进行的处理可以在相同pH和/或温度下进行，或在不同pH和温度下进行，例如使用在较高pH和温度下稳定的和活性更高的半纤维素酶处理，随后用在较低pH和温度下使用活性的纤维素酶处理。
只要温度和pH保持在上述范围内，乙酰胺/乙酸根的摩尔比保持不变和/或经过糖化而保持不变。
糖化后来自生物质的糖的溶解度能够通过测量释放的单糖和低聚糖进行监控。测量单糖和低聚糖的方法是本领域熟知的。例如，还原糖的浓度可使用1，3-二硝基水杨酸(DNS)检测分析法(Miller，G.L.，Anal.Chem.，31：426-428，1959)进行测定。作为另外一种选择，可使用适宜的柱，通过HPLC测定糖，如下文所述。
进一步加工：
发酵成目标产物：
可使由本发明方法制得的包含可发酵糖并且具有改善的抑制剂特征的水解产物经受发酵，其中使水解产物接触种子细胞的种菌，所述种菌能够使糖发酵以生成包含一种或多种目标产物的发酵混合物。“发酵”是指任何发酵方法或包括发酵步骤的任何方法。目标产物包括但不限于醇(例如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3-丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有机酸(例如乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2，5-二酮-D-葡萄糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木质酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；气体(例如甲烷、氢(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。发酵混合物还可包含联产物、副产物、酶和其它材料。
发酵方法还包括在酒精消费品工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业中所使用的方法。
除上文所述之外，如本文所述的糖化预处理的生物质而制备的糖一般来讲可用于制备有机产品、化学制品、燃料、商品和特定化学制品如木糖、丙酮、乙酸、甘氨酸、赖氨酸、有机酸(例如乳酸)、1，3-丙二醇、丁二醇、甘油、乙二醇、糠醛、聚羟基链烷酸、顺式，顺式-粘康酸和动物饲料(Lynd，L.R.，Wyman，C.E.，和Gerngross，T.U.，BiocommodityEngineering，Biotechnol.Prog.，15：777-793，1999；和Philippidis，G.P.，Cellulose bioconversion technology，in Handbook on Bioethanol：Production andUtilization，Wyman，C.E.，编辑，Taylor&Francis，Washington，D.C.，179-212，1996；以及Ryu，D.D.Y.和Mandels，M.，Cellulases：biosynthesisand applications，Enz.Microb.Technol.，2：91-102，1980)。
也可制备潜在的协同产品，例如来自可发酵的碳水化合物的多种有机产品。预处理和发酵之后剩余的富含木质素的残余物可被转化为源自木质素的化学品、化学品基础材料或被用于产能。
发酵和/或糖化的常规方法是本领域已知的，包括但不限于糖化、发酵、分步水解和发酵(SHF)、同步糖化和发酵(SSF)、同步糖化和共发酵(SSCF)、混合糖化和发酵(HHF)、以及直接微生物转化(DMC)。
SHF采用单独的工序来首先将纤维素酶解为糖类如葡萄糖和木糖，然后将所述糖类发酵成乙醇。在SSF中，纤维素的酶水解和葡萄糖向乙醇的发酵被合并为一个步骤(Philippidis，G.P.，in Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.，ed.，Taylor&Francis，Washington，D.C.，179-212，1996)。SSCF包括多糖的共发酵(Sheehan，J.和Himmel，M.，Bioethanol，Biotechnol.Prog.15：817-827，1999)。HHF包括在同一反应器但在不同温度进行的两个单独的步骤，即在高温下进行酶解糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC将全部三个过程(纤维素酶生产、纤维素水解和发酵)合并为一个步骤(Lynd，L.R.，Weimer，P.J.，van Zyl，W.H.，和Pretorius，I.S.，Microbiol.Mol.Biol.Reviews，66：506-577，2002)。
这些方法可用于由水解产物发酵制得目标产物，所述水解产物通过本文所述的氨处理方法制得的生物质的糖化而获得。发酵中生成的目标产物可使用多种本领域已知的方法进行回收。可通过离心、过滤、微量过滤和纳滤从其它发酵组分中分离产品。可通过离子交换、溶剂萃取、或电透析提取产品。可使用絮凝剂以有助于产品分离。一个具体实例是可使用ABE发酵领域已知的方法，从发酵培养基中分离出生物产生的乙醇(参见例如Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.49：639-648(1998)，Groot等人，Process.Biochem.27：61-75(1992)，以及本文参考)。例如，可通过离心、过滤、滗析等方法从发酵培养基中移除固体。然后，可使用例如蒸馏、共沸蒸馏、液液萃取、吸附、汽提、膜蒸发、或全蒸发的方法从发酵培养基中分离乙醇。
本发明方法的优点：
众所周知，生物质半纤维素组分包含显著量的与聚合木聚糖的木糖单元连接的乙酰基。乙酰基阻碍作用于半纤维素的糖化酶作用，从而降低可发酵糖的收率。必须移除乙酰酯以达到最大的可发酵糖收率。然而，当在pH7以下进行发酵时，产物乙酸是潜在的发酵抑制剂。为了获得改善的发酵结果，乙酸必须移除，或改变成无毒的化合物。在该预处理中通过氨的氨解将乙酰酯转化成乙酰胺而提供将乙酰基转化成无毒化合物的方法。
本发明方法的一个优点是改善的糖收率，所述糖是糖化具有大于60％的乙酰基转化率的水解产物所获得的。具体地讲，本发明方法改善了通过糖化而获得的木糖的收率，这是具有经济有益效果的。
本发明方法的另一个优点是改善的水解产物发酵速率，所述水解产物具有大于约1的乙酰胺/乙酸根的摩尔比。本发明方法的另一个优点是在较低pH下实施发酵的可行性，这可通过减少提升pH的碱的使用而节省成本。
此外，具有大于约1的乙酰胺/乙酸根的摩尔比的水解产物不需要与其它水解产物所需一样多的发酵种菌。例如，使用本发明方法，可使用占水解产物约1.3％的种菌来替代占水解产物约10％的典型种菌量。种菌的减少，使得能够使用较小的种子产生槽罐，由于与提供种菌相关的成本降低，这是具有经济有益效果的。
本发明的另一个优点是将氨处理与生物质贮藏相结合的可能性。例如，在收获后，可用氨处理生物质，然后贮藏于筒仓、堆垛或储仓系统中，这还将具有最小化因霉菌或害虫而导致的给料污染的有益效果。作为另外一种选择，在收获后，可用氨处理生物质，然后贮藏于生物炼制给料贮藏系统中，这还将具有降低与使用高压、高温和机械搅拌反应器的替代预处理相关的资本成本的有益效果。
实施例
本发明将在下面的实施例中得到进一步阐述。应当理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选的实施方案，但它们仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的本质特征，并且在不脱离本发明的实质和范围的前提下，可对本发明进行各种变化和修改以使其适应多种用途和条件。
使用以下缩写：
“HPLC”为高效液相色谱法，“C”为摄氏，“kPa”为千帕，“m”为米，“mm”为毫米，“μm”为微米，“μL”为微升，“mL”为毫升，“L”为升，“N”为正，“min”为分钟，“mM”为毫摩尔每升，“cm”为厘米，“g”为克，“kg”为千克，“wt”为重量，“h”或“hr”为小时，“temp”或“T”为温度，“theoret”为理论，“DM”为干物质含量，“DWB”为生物质干重，“ASME”为美国机械工程师协会，“s.s.”为不锈钢，“in”或“”为英寸，“rpm”为每分钟转数，“GUR”为葡萄糖吸收速率，“XUR”为木糖吸收速率，“EtOH”为乙醇，“Max”为最大，“Avg”为平均，“Ex.”为实施例，“Comp.”为比较实施例，并且“OD”为光密度。
硫酸、氢氧化铵、乙酸、乙酰胺、酵母提取物、葡萄糖、木糖、山梨醇、MgSO4·7H2O、磷酸和柠檬酸可商购获得。氢氧化铵溶液得自VWR(West Chester，PA)。酶混合物得自Genencor(Rochester，NY)和Novozyme(Salem，VA)。除非另外指明，所有商业试剂按原样使用。
玉米芯得自University of Wisconsin Farm(Madison，WI)，并且锤磨至3/8″颗粒。玉米芯的组成由如下所示的NREL生物质分析方法(Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass)测定：
表1.所用玉米芯的组成。
  葡聚糖   37.78％
  木聚糖   29.21％
  阿拉伯聚糖   4.63％
  半乳聚糖   1.43％
  甘露聚糖   0.82％
  蔗糖   2.75％
  淀粉   1.17％
  木质素   12.80％
  乙酰基   2.47％
  蛋白质   0.76％
  灰分   1.00％
  糖醛酸   3.94％
  水提取物   3.15％
  乙醇提取物   1.08％
  总计   100％
采用Denver Instruments IR-120水分分析仪，在105℃下进行操作来测定生物质的干物质含量。
为了测定处理的生物质中残余氨的百分比，将约15g处理的生物质与去离子水混合至约100g总重量。在有盖烧杯中，将所得浆液在室温下搅拌15分钟。滗析通过粗过滤介质如Wipeall，将水提取物与大块固体分离。使用0.1N HCl，将约20mL水提取物滴定至pH 5.0。使用自动滴定器(Mettler，Toledo，Rondo 60)完成滴定。将达到pH 5.0所需的酸当量转换成NH3当量。将在氨处理前的生物质样本中干物质含量归一化，报告结果。
测量生物质中的纤维素和半纤维素
生物质组合物通过任何一种本领域熟知的标准方法进行测量，如ASTM E1758-01“Standard method for the determination of carbohydrates byHPLC”。
测量糖、乙酰胺、乙酸和乳酸含量
通过HPLC(Agilent Model 1200，Agilent Technologies，Palo Alto，CA)使用Bio-Rad HPX-87P和Bio-Rad HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)以及合适的保护柱来测量糖化液体中的可溶性糖(葡萄糖、纤维二塘、木糖、木二糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖)乙酰胺、乙酸和乳酸。测定样本中的乙酸根并报告为乙酸。HPLC运行条件如下：
Biorad Aminex HPX-87H(用于碳水化合物、乙酰胺、乙酸和乳酸)
注射体积：5-10μL，其取决于浓度和检测器限
流动相：0.01N硫酸，0.2μm，其被过滤且脱气
流量：0.6mL/min
柱温：55℃
检测器温度：尽可能接近柱温
检测器：折射率
运行时间：25-75分钟数据收集
运行结束后，根据标准曲线来测定每个化合物在样本中的浓度。
单糖在水解产物中直接测量。通过离心机从水解产物中移除不溶性物质。如需要的话，用硫酸将分离液体的pH调节至5-6以用于Bio-Rad HPX-87P柱以及调节至1-3以用于Bio-Rad HPX-87H柱。如需要的话，稀释分离出的液体，然后使其通过0.2微米注射器过滤器直接过滤到HPLC小瓶中。
为了分析所有溶解的糖，将10mL稀释样本置于耐压小瓶中并且加入349μL 75％H2SO4。将小瓶加盖置于高压釜中一小时以将所有糖水解成单糖。冷却样本并用碳酸钠将它们的pH调节至必需pH，然后如上所述将样本过滤到HPLC小瓶中并用HPLC进行分析。HPLC运行条件如下：
Biorad Aminex HPX-87P(用于碳水化合物)：
注射体积：10-50μL，其取决于浓度和检测器限
流动相：HPLC级水，0.2μm，其被过滤并且脱气
流量：0.6mL/min
柱温：80-85℃，保护柱温度＜60℃
检测器温度：尽可能的接近主塔温度
检测器：折射率
运行时间：35分钟数据收集加15分钟后运行(对较晚洗脱化合物进行可能的调节)
运行结束后，根据标准曲线测定每个化合物在样本中的浓度。
用Waters Alliance HPLC系统完成发酵产物的分析。所用的柱为具有BioRad Micro-Guard Cartridge Cation-H(#125-0129，Bio-Rad，Hercules，CA)的Transgenomic ION-300柱(#ICE-99-9850，Transgenomic，Inc.，Omaha，NE)。使用0.01N H2SO4作为溶剂，在75℃和0.4mL/min流量下走柱。采用外标校准曲线，用折射率检测器测定原料糖和产物的浓度。
氨处理设备
采用两套设备进行氨处理实验。一个系统包括改进成在反应器顶部包括1.5″球形阀的5L卧式圆柱体压力容器(Littleford Day，Florence，KY)，所述球形阀可被移去以加入生物质。反应器配备两个位于顶部空间的孔、位于底部的1.5″球形阀、多个热电偶、安全阀、压力计和压力换能器。反应器包含俗称的“热传递”型叶轮，其包含四个叶片以用于垂直和水平混合固体。对于所有实验，使叶轮以约40rpm速率旋转。使用放置在电子天平上的瓶子，使用装配齿轮泵头的Cole-Palmer传动来计量进入反应器的水或氨水溶液。使用加装高温压力换能器并且用弹性密封电加热带包裹的TeledyneISCO高压注射器泵(D500型)来预热氨水溶液。使用连接顶部凸缘的针型阀来控制加压闪蒸和减压闪蒸。闪蒸蒸汽通过使用家用冷水的套管式换热器。然后将蒸汽/冷凝物收集在带湿冰夹套的2L圆柱形容器中。在加压闪蒸之前，将不凝物排出2L圆柱形容器。然后破坏真空并且收集冷凝物。然后使用相同系统来收集减压闪蒸冷凝物。
第二套设备包括连接热水再循环浴的2L带夹套的卧式玻璃反应器。在氨处理实验期间，将浴液温度设定至70℃并且施加真空以移除过量的NH3。如上所述进一步装配玻璃反应器以收集冷凝物。
糖化设备
在搅拌槽反应器中实施糖化实验，其中实验以间歇式或分批补料模式来完成。该系统由带玻璃夹套的圆柱形反应容器组成，所述容器或者为500mL或者为2000mL(LabGlass Number LG-8079C，LabGlass，Vineland，NJ)，并配有四颈反应容器盖(LG-8073)。安装一个搅拌器使其通过中央端口以搅拌反应器内容物。将一个玻璃冷凝器连接到其中的一个颈，并且通过来自冷却器的再循环水使其保持5℃冷却。其它两个端口用于加入反应物以及用于温度及pH测量。通过再循环热水来控制反应器温度，热水通过加热循环器水浴供应。使用具有45度角浆叶的四浆叶玻璃搅拌器作为500mL反应器中的搅拌器。在2L反应器中使用三组四叶片不锈钢搅拌器。
发酵设备
在Wheaton 50mL双臂玻璃CELSTIR
Figure BPA00001542485200201
细胞培养瓶(VWR#62401-902，VWR，West Chester，PA)中实施小规模的控制温度和pH的发酵。通过钻两个孔来改进顶盖，一个孔允许插入塑性毛细管线以加入用于pH调节的碱，而另一个孔连接0.2微米无菌过滤器以允许气体逸散同时保持CELSTIR
Figure BPA00001542485200202
瓶中无菌。还将一个侧壁顶盖钻孔以允许插入12mm直径的pH电极(Cole-Parmer#EW-59001-65，Cole-Parmer，Vernon Hills，IL)以用于连续的pH测量。使用Eutech α-pH200 1/8DIN pH控制器(Cole-Parmer#EW-56700-00)并且通过采用自吸式10μL/冲程微型泵(#120SP1210-5TE，Westem Analytical Products，Wildomar，CA)递送4N NaOH来保持设定点处的pH。使用低端IKA Squid磁力搅拌器(VWR#33994-354)，以约60rpm速率搅拌培养瓶。CELSTIR
Figure BPA00001542485200203
瓶的第二个有盖臂用于发酵期间进入所述瓶取出样品以供分析。为了控制温度，将CELSTIR
Figure BPA00001542485200204
瓶和附属设备放置于VWR Signature培养箱(VWR 1545型，#35823-204)中。
发酵微生物
用称为ZW705的运动发酵单胞菌胁迫适应菌株测试水解产物的可发酵性，所述菌株自身衍生自运动发酵单胞菌菌株ZW801-4。ZW801-4对胁迫条件的适应性描述于共同持有的已公布的专利申请WO 2010/075241中，将所述文献以引用方式并入本文。ZW801-4是重组的利用木糖的运动发酵单胞菌菌株，其描述于共同持有并且共同未决的已公布的专利申请US2008/0286870中，也将所述文献以引用方式并入本文。菌株ZW801-4衍生自菌株ZW800，菌株ZW800衍生自菌株ZW658，它们均描述于已公布的专利申请US 2008/0286870中。ZW658通过经由序贯转座事件将两个操纵子整合到ZW1(ATCC#31821)基因组中，然后通过包含木糖的选择培养基筛选进行构建，所述操纵子是PgapxylAB和Pgaptaltkt，它们包含四个编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的木糖利用基因。ZW658以ATCC#PTA-7858存放。在ZW658中，使用宿主媒介的基因双交换同源重组和作为选择性标记的奇放线菌素抗性使编码葡萄糖-果糖氧化还原酶的基因插入失活以产生ZW800。使用Cre重组酶，通过位点特异性重组移除由loxP位点束缚的奇放线菌素抗性标记以产生ZW801-4。
所有发酵均在33℃下的50mL反应器(描述于方法中)和调节至pH5.8的介质中进行。为了能够跟踪细胞生长，通过离心(Sorvall SS34转子以45,000×g速率离心20分钟)，然后过滤通过无菌0.2微米过滤装置(Nalgene)，使水解产物澄清。用于接种水解产物的种子培养物在酵母提取物介质中生长，所述酵母提取物介质包含20g/L酵母提取物、4g/LKH2PO4、2g/L MgSO4·7H2O、1.8g/L山梨醇和150g/L葡萄糖。通过使用4NNaOH作为碱，将种子培养物和水解产物的pH保持在5.8。测定培养物的OD随时间推移的变化(600nm)，从而校正介质背景吸光度。通过取出的等分试样的HPLC分析，监测葡萄糖和木糖的消耗和乙醇的生成。
为了获得最佳结果，通常使种子反应器达到约10OD，然后将10％的种子种菌加入到水解产物反应器中。为了提供更具挑战性的测试，决定加入更少量的种子培养物。当种子培养物的OD达到14(剩余40g/L葡萄糖)时，将0.67mL种子培养物和4.33mL种子介质转移到四个反应器每一个内的45mL水解产物中。
实施例1-3和比较实施例A
下列实施例展示了用氨处理生物质以释放具有改善的抑制剂特征的可发酵糖的本发明方法。为了定量所得糖的收率并且为了展示改善的抑制剂特征有益效果，将用氨处理的生物质样品糖化，然后使水解产物经受发酵。
包括比较实施例A以用于示出由供选择的替代氨方法预处理的生物质的糖化和发酵结果，所述供选择的替代氨方法产生抑制剂特征，其中乙酰胺/乙酸根的比率小于一。在实施例1-3使用相同发酵条件下，作为另外一种选择糖化预处理的生物质而获得的水解产物的发酵被示出为具有较低的发酵速率。
实施例1的氨处理
在大气压和22℃下，向具有5L标称工作体积的卧式圆柱体桨式搅拌器反应器中加入520克玉米芯，所述玉米芯已被锤磨通过1mm尺寸的筛网。锤磨过的玉米芯具有约5重量％的初始含水量(即95％的干物质含量)。为了增加与氨的接触并且为了使反应期间的压力积累最小化，将不凝物排出反应器，至约75mmHg绝对压力，然后将138克29重量％的氢氧化铵溶液泵送到反应器中。将内容物搅拌30分钟，然后关闭搅拌器。将再循环水浴连接至反应器夹套，浴温设定至37℃。所得的氨负载为干物质的8重量％并且初始固体负载为76％。使反应在37℃下进行68小时。然后将常压蒸汽施加到反应器夹套，同时用氮气吹扫反应器顶部空间以移除过量的氨。在100℃下加热1.5小时后，从反应器中取出最终产物。
实施例2的氨处理
向具有2L标称工作体积的卧式圆柱体桨式搅拌器反应器中加入294.1克玉米芯，所述玉米芯已被锤磨通过1mm尺寸的筛网。锤磨过的玉米芯具有约5重量％的初始含水量(即95％的干物质含量)。为了将玉米芯的初始水分调节至15重量％，将35.0g室温水加入到玉米芯中并且将其搅拌约30分钟。然后加入38.3克29重量％的氢氧化铵并且将其搅拌15分钟。然后关闭搅拌器。所得的氨负载为干物质的4重量％并且初始固体负载为77重量％。使37℃的水循环通过反应器夹套。使反应在37℃下进行118小时。然后施加真空以将系统压力降至约25mmHg，并且将再循环批料温度升高至70℃并保持120分钟，以便从系统中移除过量的氨。然后从反应器中取出最终产物。
实施例3的氨处理
采用与实施例2类似的方法完成该实施例。向具有2L标称工作体积的卧式圆柱体桨式搅拌器反应器中加入350.0克玉米芯，所述玉米芯已被锤磨通过1mm尺寸的筛网。锤磨过的玉米芯具有约5重量％的初始含水量(即95％的干物质含量)。为了将玉米芯的初始水分调节至15重量％，将42.9g室温水加入到玉米芯中并且将其搅拌约5分钟。然后加入46.1克29重量％的氢氧化铵并且将其搅拌10分钟。然后关闭搅拌器。所得的氨负载为干物质的4.0重量％，并且初始固体负载为76重量％。使37℃的水循环通过反应器夹套。使反应在37℃下进行118小时。然后施加真空以将系统压力降至约25mmHg，并且将再循环批料温度升高至70℃并保持120分钟，以便从系统中移除过量的氨。然后从反应器中取出最终产物。
比较实施例A的氨处理
比较实施例A基于使用130L标称工作体积的卧式圆柱体预处理反应器实施的预处理实验。实施一系列十个单独的130L预处理反应器实验以制得足量的预处理的材料来实施1000L糖化实验。使用得自1000L实验的水解产物，与上文实施例1至3中所述预处理实验生成的水解产物进行发酵结果的比较。下文叙述描述了每个130L预处理实验所用的平均条件。
将锤磨过的通过3/8″或3/16″筛网的玉米芯加入到反应器中。玉米芯的含水量为约8.5重量％。就每个批料而言，向反应器中加入29.7kg玉米芯。将氢氧化铵和水加入到反应器中，使得初始氨负载为DM的6重量％(6个批料)或DM的8重量％(4个批料)。加入到糖化中的玉米芯的平均氨载量为DM的6.8重量％。初始固体负载平均为55.8重量％。在夹套上使用蒸汽，将反应器预热至75-95℃。将蒸汽直接注入到反应器中以在约四分钟的时间内将反应温度升至约140℃。达到大于140℃的目标温度后，将反应混合物在控制至145℃±2℃的温度下保持20分钟。然后使系统中的压力降至大气压，之后施加真空将过量的含水氨蒸汽移至冷凝器和涤气器系统中。当反应器温度低于约60℃时，从反应器中取出预处理的产物。
下表总结了实施例1-3和比较实施例A的氨处理条件和结果。比较实施例A给出的数值是10次独立预处理的平均值。
表2.实施例1-3和比较实施例A的预处理条件和结果
Figure BPA00001542485200241
实施例1、2和3中氨处理的生物质的糖化
在0.5L反应器中分别糖化实施例1、2和3中氨处理的玉米芯。在这些实验中，在实验开始时，生物质以分批补料模式加入而酶以成批模式加入。将氨处理的玉米芯糖化而不进行进一步的尺寸减小。使用去离子水作为反应底液。将氨处理的玉米芯加入到水中以制备具有约12.5％DWB的浆液。将温度升高至47℃并且使用1N硫酸溶液将pH调至5.3。以下列基于最终水解产物的剂量加入酶：SPEZYME
Figure BPA00001542485200242
CP和Novozyme-188分别为20和5mg蛋白质/g纤维素，并且MULTIFECT
Figure BPA00001542485200243
-CX12L为10mg蛋白质/g半纤维素。在酶加入后4小时内，将剩余的预处理的玉米芯以三个等份加入，使得水解产物中的固体总负载达到DWB的25％。以300至500rpm的速度连续搅拌反应器以在整个实验期间保持颗粒悬浮和充分搅拌。72小时后，根据一般方法中所述的糖测量方案来测定所得糖化液体的糖含量。糖化结果以理论收率百分比形式示于表3中。
比较实施例A预处理的生物质的糖化
在包含约100L水解产物的1450L反应器中进行已如上所述预处理的比较实施例A生物质的糖化。酶以及它们的剂量与实施例1、2和3中的那些相同。生物质的加料与实施例1、2和3中的那些相似，不同的是在初始加料和加入酶后，在九个小时内连续加入剩余的生物质。比较实施例A与实施例1、2和3的主要差异在于，比较实施例A所用的反应器中采用了具有在线磨碎机的再循环回路。在线磨碎机减少了实验期间生物质的粒度分布，从而提高了糖化速率并且提高了糖生成收率。
表3.通过实施例1-3和比较实施例A的糖化，液相中糖的收率。
Figure BPA00001542485200244
Figure BPA00001542485200251
*72小时的收率
**70小时的收率
70小时处乙酰胺/乙酸的摩尔比为1.13，这在整个糖化期间基本保持恒定，从1.13变至1.17。比较实施例A中1.13的乙酰胺/乙酸比率，与实施例1、2和3中分别为4.98、2.78和2.62的比率形成对比。
比较实施例A中葡萄糖和木糖的收率比实施例1、2和3的那些稍高，这主要因为比较实施例A在糖化期间使用了在线磨碎机。在线磨碎机降低了生物质的粒度分布，从而提高了糖生成速率。木糖的形成在所有情况下均相似。所有木糖中的大部分是在前24小时内形成的，之后在剩余的反应持续期间缓慢增加。
实施例1-3和比较实施例A中水解产物的发酵
采用运动发酵单胞菌菌株ZW705的发酵结果，从每次发酵相同的种子培养物开始，以并列的方式，相对于比较实施例A的那些来评定实施例1-3的玉米芯水解产物。菌株ZW705是重组菌株，其包含使发酵单胞菌属能够发酵木糖以及葡萄糖的整合转基因。该菌株的产生描述于上文中并且已经描述于2009年12月22日提交的共同持有并且共同未决的美国专利申请No.61/139,852中。
所有发酵均在33℃下的50mL反应器(上述)和调节至pH 5.8的介质中进行。为了能够跟踪细胞生长，通过离心(Sorvall SS34转子以45,000×g速率离心20分钟)，然后过滤通过无菌0.2微米过滤装置(Nalgene)来使水解产物澄清。用于接种水解产物的种子培养物在酵母提取物介质中生长，所述酵母提取物介质包含20g/L酵母提取物、4g/L KH2PO4、2g/LMgSO4·7H2O、1.8g/L山梨醇和150g/L葡萄糖。通过使用4N NaOH作为碱，将种子培养物和水解产物的pH保持在5.8。测定培养物的光密度(600nm处)随时间推移的变化，从而校正介质的背景吸光度。通过取出的等分试样的HPLC分析，监测葡萄糖和木糖的消耗和乙醇的生成。
为了获得最佳结果，通常使种子反应器达到约10OD，然后将10％的种子种菌加入到水解产物反应器中。为了提供更具挑战性的测试，决定加入更少量的种子培养物。当种子培养物的OD达到14(剩余40g/L葡萄糖)时，将0.67mL种子培养物(按体积计1.3％)和4.33mL种子介质转移到四个反应器每一个内的45mL水解产物中。所得发酵数据示于下表中。
从数据可以看出，与比较实施例A水解产物的发酵相比，实施例1-3水解产物的发酵显示出较短的滞后和较快的生长速率。总发酵时间也快得多，即使考虑到比较实施例A水解产物中的总糖量多～25％。下表列出了容积发酵速率、滴度和收率。虽然所有四次发酵的收率大致相同，但是与比较实施例A的水解产物相比，实施例1-3水解产物的葡萄糖和木糖最大吸收速率、乙醇平均生产率和最大生长速率均较快。由于比较实施例A的起始糖总含量高，比较实施例A中仅滴度较高。
表4.发酵数据
  实施例1   实施例2   实施例3   比较实施例A
  最大GUR(g/L/h)   7.4   7.2   6.8   5.2
  最大XUR(g/L/h)   3.8   4.0   3.1   2.7
  最大EtOH滴度   45.0*   47.6*   42.0**   58.7***
  平均EtOH生产率   1.6*   1.7*   1.7**   1.0***
  EtOH收率％   89*   88*   89**   89***
  最大生长速率(h-1)   0.25   0.22   0.24   0.13
  初始生长滞后(h)   2.8   2.7   1.5   6.1
  初始葡萄糖(g/L)   63.5   65.8   57.8   78.1
  最终葡萄糖(g/L)   0.0   0.0   0.0   0.0
  初始木糖(g/L)   31.4   36.7   31.4   46.3
  最终木糖(g/L)   1.1   1.1   1.1   4.0
注意：
*27h处的值
**24h处的值
***54h处的值
实施例4-11和比较实施例B-G
下列实施例展示了氨处理生物质以释放具有改善的抑制剂特征的可发酵糖的本发明方法。包括比较实施例B至G以用于比较。
无水氨(4.0级，细压缩气瓶，尺寸2″×13″)可从GT&S Inc.(Allentown，PA)商购获得。玉米芯得自University of Wisconsin Farm(Madison，WI)，并且具有与表1中所列相似的组成，通过在具有1.0mm筛网的微粒粉磨机(型号#1SH，系列#10019；Pulverizing Machinery Divisionof Mikropul Corporation；Summit，NJ)中处理，锤磨至1.0mm。碾磨前将干冰加入到玉米芯中以防止设备过热。采用Denver Instruments IR-120水分分析仪，在105℃下进行操作以测定生物质的干物质含量。
乙酰胺和乙酸的测量方法与上文所述相似，不同的是柱子在65℃而不是55℃下操作。
实施例4-11和比较实施例B-G中所用的氨处理系统包括改进成在一端包括Cole Parmer压力换能器(206型)的75mL不锈钢高压管(Hoke，Inc.，Spartanburg，SC)。管的该端连接螺旋管线，所述螺旋管线连接真空管线并且连接无水氨源。管的另一端用作使用漏斗加入玉米芯的端口。将等同于管14％体积容量的少量玉米芯均匀地分布在管底；玉米芯松散地填装在管内，以便氨能够与玉米芯均匀地相互作用。加入玉米芯后，通过端口放入热电偶并且将管封闭。将管和螺旋管线浸入到设至给定温度的水浴中以用于控制温度。热电偶和压力换能器连接至数据采集箱并连接笔记本电脑，所述笔记本电脑具有用于电子采集管内压力和温度读数的DaqView软件(Measurement Computing Corp.，Norton，MA)。包含37％HCl的涤气器连接真空泵上游以中和从管中排出的任何氨。使用针型阀以缓慢加入每个实验所需量的氨。通过将细压缩氨气瓶放置在电子天平上并且记录氨加入到管中之前和之后的重量来测量所加入氨的量。
采用下列预处理方法。在大气压下，向具有75mL标称体积的卧式压力管中加入3.6g至3.8g具有表5中所示水分百分比的玉米芯。玉米芯中的该水分是实验中水的来源。为了达到期望的水分百分比，将水加入到具有约4.5％初始含水量的锤磨过的玉米芯(即95.5％的干物质含量)。然后使用刮刀将玉米芯混合物搅拌至少5分钟并且在冷藏机中放置过夜以达到平衡。第二天，将玉米芯再搅拌5分钟并且分析该混合物的样品以测定含水量百分比。
加入玉米芯后，将管密封并且放入到水浴中，直至管内达到期望的温度。为了增加与氨的接触，将浸没的管抽空至0.1巴的绝对压力，之后加入无水氨。相对于在70℃下完成的预处理实验而言，使氨与玉米芯在管中保留15分钟，此时将管转移至冰水浴中以降低其温度。然后施加真空以达到0.1巴以移除过量的氨。施加氮气以使管压回至大气压，之后从水浴中取出管并且取出产物以用于分析。
表5总结了实施例4-11和比较实施例B-G所用的反应条件和所得的结果。
表5.实施例4-11和比较实施例B-G的预处理条件和结果。所有实验均 在70℃压力管中进行，预处理时间为15分钟。
Figure BPA00001542485200281
表5中的结果表明，对于给定的预处理时间和温度，可调节生物质、水和氨的百分比率以在乙酰基总转化率和AM/AA比率方面达到最佳的产物规格。
尽管在以上描述中已用具体实施方案描述了本发明，但本领域的技术人员将会理解，在不背离本发明本质属性的精神下能够作出许多修改、替代和重新排列。应参考指明本发明范围的所附权利要求书而不是上述说明书。

Claims (14)

1.用于处理生物质以释放具有改善的抑制剂特征的可发酵糖的方法，所述方法包括：
a)在适宜的反应条件下用一定量的氨处理生物质，其中所述条件提供预处理的生物质反应产物，所述生物质反应产物具有大于约1的乙酰胺/乙酸根的摩尔比以及大于60％的乙酰基转化率，其中所述适宜的反应条件包括约低于大气压至小于10个大气压的压力；
b)用至少一种糖化酶来糖化所述预处理的生物质反应产物，其中制得包含可发酵糖的水解产物，并且其中与使乙酰胺/乙酸根的摩尔比小于约1的预处理的生物质反应产物糖化相比，所述水解产物具有改善的抑制剂特征；以及
c)使所述乙酰胺/乙酸根的摩尔比在整个步骤(b)的糖化期间保持大于约1。
2.权利要求1的方法，还包括通过加入能够将糖发酵成目标产物的种子细胞的种菌来发酵所述水解产物以制得目标产物。
3.用于将糖发酵成目标产物的方法，所述方法包括：
a)提供权利要求1的水解产物，所述水解产物具有大于约1的乙酰胺/乙酸根的摩尔比；
b)将能够使糖发酵成目标产物的种子细胞的种菌加入到所述水解产物中，其中所述种菌为所述水解产物的约0.1％至约10％；以及
c)发酵所述水解产物以提供包含目标产物的发酵混合物。
4.权利要求2或3的方法，其中与乙酰胺/乙酸根的摩尔比小于1的水解产物相比，所述水解产物为所述种菌提供改善的细胞生长速率。
5.权利要求2或3的方法，其中与发酵乙酰胺/乙酸根的摩尔比小于1的水解产物相比，用较少的种子细胞的种菌来引发所述水解产物的发酵。
6.权利要求1的方法，其中所述乙酰基转化率大于70％。
7.权利要求1的方法，其中与乙酰胺/乙酸根的摩尔比小于约1并且乙酰基转化率大于60％的预处理的生物质反应产物相比，经过糖化的木糖总收率得到改善。
8.权利要求1的方法，其中所述生物质在步骤(a)中具有至少约60重量％的干物质含量。
9.权利要求1的方法，其中所述适宜的反应条件包括小于约20∶1的水与氨的质量比。
10.权利要求1的方法，其中所述适宜的反应条件包括大于约60％的系统固体负载。
11.权利要求1的方法，其中所述生物质在步骤(a)之前经受预加工。
12.权利要求1的方法，其中所述适宜的反应条件包括约4℃至约200℃的温度和30天或更短的反应时间。
13.权利要求13的方法，其中所述温度为约20℃至约121℃并且所述反应时间为约100小时或更短。
14.权利要求2或3的方法，其中所述目标产物选自乙醇、丁醇和1，3-丙二醇。
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