JPH0859681A - ｃ−ＧＭＰ ＰＤＥ阻害物質ＦＲ９０１５２６ - Google Patents
ｃ−ＧＭＰ ＰＤＥ阻害物質ＦＲ９０１５２６Info
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- JPH0859681A JPH0859681A JP6218325A JP21832594A JPH0859681A JP H0859681 A JPH0859681 A JP H0859681A JP 6218325 A JP6218325 A JP 6218325A JP 21832594 A JP21832594 A JP 21832594A JP H0859681 A JPH0859681 A JP H0859681A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
属に属するＮｏ．９０７株を培養して、酸性淡黄色粉末
ＦＲ９０１５２６物質を製造する。 【効果】 この物質は、すぐれたサイクリックＧＭＰホ
スホジエステラーゼ阻害作用を示す。
属に属するＮｏ．９０７株を培養して、酸性淡黄色粉末
ＦＲ９０１５２６物質を製造する。 【効果】 この物質は、すぐれたサイクリックＧＭＰホ
スホジエステラーゼ阻害作用を示す。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＦＲ９０１５２６物
質、その製法及び用途に関するものである。ＦＲ９０１
５２６物質は、シュードモナス属菌の培養物から分離採
取され、すぐれたｃ−ＧＭＰ ＰＤＥ阻害作用を示し、
ヒトや動物用の降圧利尿剤、気管支拡張剤等ｃ−ＧＭＰ
ＰＤＥに起因する各種疾患の予防、治療剤として有効
である。
質、その製法及び用途に関するものである。ＦＲ９０１
５２６物質は、シュードモナス属菌の培養物から分離採
取され、すぐれたｃ−ＧＭＰ ＰＤＥ阻害作用を示し、
ヒトや動物用の降圧利尿剤、気管支拡張剤等ｃ−ＧＭＰ
ＰＤＥに起因する各種疾患の予防、治療剤として有効
である。
【０００２】
【従来の技術】循環器疾患には重篤なものが多く存在
し、その治療法の確立が強く求められている。そして近
年、ｃ−ＧＭＰ ＰＤＥが高血圧、アンギナ、うっ血性
心不全等に関与していることが明らかとなり、該酵素を
阻害すればこれらの疾患の予防、治療に大いに寄与する
ものと期待されている。
し、その治療法の確立が強く求められている。そして近
年、ｃ−ＧＭＰ ＰＤＥが高血圧、アンギナ、うっ血性
心不全等に関与していることが明らかとなり、該酵素を
阻害すればこれらの疾患の予防、治療に大いに寄与する
ものと期待されている。
【０００３】一方、本発明に係る物質は、各種の微生物
の発酵生産物を研究している過程でシュードモナス属菌
の培養物中に発見された新規な物質であって、本物質が
ｃ−ＧＭＰ ＰＤＥ酵素を阻害する作用を有しているこ
とは全く知られていない。
の発酵生産物を研究している過程でシュードモナス属菌
の培養物中に発見された新規な物質であって、本物質が
ｃ−ＧＭＰ ＰＤＥ酵素を阻害する作用を有しているこ
とは全く知られていない。
【０００４】
【発明が解決するべき課題】本発明は、循環器疾病の重
篤性に鑑み、そしてまたその有効な予防治療剤の開発が
強く業界において要望されている点に鑑み、すぐれた予
防治療剤を新規に創製する目的でなされたものである。
篤性に鑑み、そしてまたその有効な予防治療剤の開発が
強く業界において要望されている点に鑑み、すぐれた予
防治療剤を新規に創製する目的でなされたものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記した目的
を達成するためになされたものである。
を達成するためになされたものである。
【０００６】そこで本発明者らは、安全性の面から天然
物に着目し、微生物の発酵生産物に注目するに至り、各
種微生物を検索した結果、熊本県で採取された土壌から
新たに分離した細菌Ｎｏ．９０７株が培養液中に目的物
質を蓄積することを発見した。そして更にこの物質につ
いてその理化学的性質を詳細に研究したところ、従来未
知の新規物質であることを確認し、この物質を新たにＦ
Ｒ９０１５２６物質と命名し、そして更に研究の結果、
その工業的製法を確立し、本発明を完成するに至った。
物に着目し、微生物の発酵生産物に注目するに至り、各
種微生物を検索した結果、熊本県で採取された土壌から
新たに分離した細菌Ｎｏ．９０７株が培養液中に目的物
質を蓄積することを発見した。そして更にこの物質につ
いてその理化学的性質を詳細に研究したところ、従来未
知の新規物質であることを確認し、この物質を新たにＦ
Ｒ９０１５２６物質と命名し、そして更に研究の結果、
その工業的製法を確立し、本発明を完成するに至った。
【０００７】本発明に係るＦＲ９０１５２６物質は、下
記表２、表３、表４に示される理化学的性質を有する。
記表２、表３、表４に示される理化学的性質を有する。
【０００８】
【表２】
【０００９】
【表３】
【００１０】
【表４】
【００１１】本発明に係るＦＲ９０１５２６物質は、例
えば熊本県で採取した土壌サンプルから新たに分離した
Ｎｏ．９０７株によって生産される。以下にＮｏ．９０
７株の菌学的性質を示すが、分類学的研究は、主にＢｅ
ｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉ
ｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌｕｍｅ １）に
記載された方法に従った。
えば熊本県で採取した土壌サンプルから新たに分離した
Ｎｏ．９０７株によって生産される。以下にＮｏ．９０
７株の菌学的性質を示すが、分類学的研究は、主にＢｅ
ｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉ
ｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌｕｍｅ １）に
記載された方法に従った。
【００１２】（１）形態的特徴 本菌をニュートリエント寒天培地上において３０℃、２
４時間生育せしめた後、光学顕微鏡及び電子顕微鏡下で
形態の観察を行なった。その結果を下記の表５に示す。
その結果から明らかなように、本菌株は、グラム陰性、
運動性の桿菌である。細胞は、０．４〜０．４５×１．
１〜１．３μｍの大きさである。
４時間生育せしめた後、光学顕微鏡及び電子顕微鏡下で
形態の観察を行なった。その結果を下記の表５に示す。
その結果から明らかなように、本菌株は、グラム陰性、
運動性の桿菌である。細胞は、０．４〜０．４５×１．
１〜１．３μｍの大きさである。
【００１３】
【表５】
【００１４】（２）生理的特徴 本菌の生理的特徴を、下記表６、表７、表８に示す。
【００１５】
【表６】
【００１６】
【表７】
【００１７】
【表８】
【００１８】上記したように、本菌の生育温度範囲は、
３℃から３６℃であった。オキシダーゼ、カタラーゼ
は、陽性であり、Ｏ−Ｆ試験は、酸化的であった。ゼラ
チン、カゼイン、Ｔｗｅｅｎ ８０の分解は、陽性であ
った。ピオベルジン生成は陽性であった。デンプンの分
解は陰性であった。アルギニンジハイドラーゼは陽性で
あった。Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラク
トース、Ｄ−ガラクトースから酸を産生した。Ｄ−グル
コース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｎ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミン、グルコン酸、カプリン酸、ア
ジピン酸、リンゴ酸、クエン酸、酢酸フェニル、グリセ
ロール、トレハロースを資化した。本菌のＧ＋Ｃ含量は
６３．４ｍｏｌ％であった。
３℃から３６℃であった。オキシダーゼ、カタラーゼ
は、陽性であり、Ｏ−Ｆ試験は、酸化的であった。ゼラ
チン、カゼイン、Ｔｗｅｅｎ ８０の分解は、陽性であ
った。ピオベルジン生成は陽性であった。デンプンの分
解は陰性であった。アルギニンジハイドラーゼは陽性で
あった。Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラク
トース、Ｄ−ガラクトースから酸を産生した。Ｄ−グル
コース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｎ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミン、グルコン酸、カプリン酸、ア
ジピン酸、リンゴ酸、クエン酸、酢酸フェニル、グリセ
ロール、トレハロースを資化した。本菌のＧ＋Ｃ含量は
６３．４ｍｏｌ％であった。
【００１９】（３）同定 以上の特徴をＢｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏ
ｌｕｍｅ １）より検索した結果、Ｎｏ．９０７株は、
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属するも
のと考え、本菌株を、シュードモナス エスピー（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｎｏ．９０７として、通
産省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ
−１３７１４（寄託日：１９９３年６月３０日）として
寄託した。
ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏ
ｌｕｍｅ １）より検索した結果、Ｎｏ．９０７株は、
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属するも
のと考え、本菌株を、シュードモナス エスピー（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｎｏ．９０７として、通
産省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ
−１３７１４（寄託日：１９９３年６月３０日）として
寄託した。
【００２０】ＦＲ９０１５２６物質の生産は、単に説明
を目的として挙げただけの本明細書記載の特定の微生物
の使用に限定されるものではないことを理解するべきで
ある。この発明は、記載の微生物からＸ線照射、紫外線
照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン、２−アミノプリン等の変異処理により取得できる
人工変異株並びに自然変異株を含めてＦＲ９０１５２６
物質を生産しうる全ての変異株の使用をも包含するもの
である。
を目的として挙げただけの本明細書記載の特定の微生物
の使用に限定されるものではないことを理解するべきで
ある。この発明は、記載の微生物からＸ線照射、紫外線
照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン、２−アミノプリン等の変異処理により取得できる
人工変異株並びに自然変異株を含めてＦＲ９０１５２６
物質を生産しうる全ての変異株の使用をも包含するもの
である。
【００２１】本発明に係るＦＲ９０１５２６物質は、細
菌に属する該物質生産菌（例えばＮｏ．９０７株）を資
化しうる炭素及び窒素源を含む栄養培地中に接種し、好
気条件下で培養することにより（例えば、振とう培養、
通気攪拌培養等）、生産せしめることができる。
菌に属する該物質生産菌（例えばＮｏ．９０７株）を資
化しうる炭素及び窒素源を含む栄養培地中に接種し、好
気条件下で培養することにより（例えば、振とう培養、
通気攪拌培養等）、生産せしめることができる。
【００２２】炭素源としては、グルコース、シュークロ
ース、澱粉、変性澱粉、フラクトース、グリセリンその
他の炭水化物を使用するのが好ましい。
ース、澱粉、変性澱粉、フラクトース、グリセリンその
他の炭水化物を使用するのが好ましい。
【００２３】窒素源としては、オートミール、酵母エキ
ス、ペプトン、グルテンミール、綿実粉、綿実油粕、大
豆粉、コーンスティープリカー、乾燥酵母、小麦胚芽、
落花生粉、チキン骨肉ミール等を使用するのが好ましい
が、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等）、尿素、アミノ
酸等の無機及び有機の窒素化合物も有利に使用すること
ができる。
ス、ペプトン、グルテンミール、綿実粉、綿実油粕、大
豆粉、コーンスティープリカー、乾燥酵母、小麦胚芽、
落花生粉、チキン骨肉ミール等を使用するのが好ましい
が、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等）、尿素、アミノ
酸等の無機及び有機の窒素化合物も有利に使用すること
ができる。
【００２４】これらの炭素源及び窒素源は、併用するの
が有利であるが、純粋なものを必らずしも使用する必要
はない。不純なものには生長因子や微量要素が含まれて
いる場合などもあり、有利な場合があるからである。
が有利であるが、純粋なものを必らずしも使用する必要
はない。不純なものには生長因子や微量要素が含まれて
いる場合などもあり、有利な場合があるからである。
【００２５】必要ある場合には、例えば次のような無機
塩類を培地に添加してもよい：炭酸ナトリウム、炭酸カ
リウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナト
リウム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリ
ウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等。
塩類を培地に添加してもよい：炭酸ナトリウム、炭酸カ
リウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナト
リウム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリ
ウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等。
【００２６】特に、培地が強く発泡するのであれば、必
要あるときに、液体パラフィン、動物油、植物油、鉱物
油、シリコン等を添加してもよい。
要あるときに、液体パラフィン、動物油、植物油、鉱物
油、シリコン等を添加してもよい。
【００２７】目的物質を大量に工業生産するには、他の
発酵生産物の場合と同様に、通気攪拌培養するのが好ま
しい。少量生産の場合は、フラスコを用いる振とう培養
が好適である。
発酵生産物の場合と同様に、通気攪拌培養するのが好ま
しい。少量生産の場合は、フラスコを用いる振とう培養
が好適である。
【００２８】また、培養を大きなタンクで行う場合、Ｆ
Ｒ９０１５２６物質の生産工程において菌の生育遅延を
防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接
種培養した後、次に培養物を大きな生産タンクに移して
そこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に
使用する培地及び生産培養に使用する培地の組成は、両
者ともに同一であってもよいし必要あれば両者を変えて
もよい。
Ｒ９０１５２６物質の生産工程において菌の生育遅延を
防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接
種培養した後、次に培養物を大きな生産タンクに移して
そこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に
使用する培地及び生産培養に使用する培地の組成は、両
者ともに同一であってもよいし必要あれば両者を変えて
もよい。
【００２９】培養は通気攪拌条件で行うのが好ましく、
例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファーメンタ
ーの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹込み等既
知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌したも
のを用いる。
例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファーメンタ
ーの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹込み等既
知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌したも
のを用いる。
【００３０】培養温度はＦＲ９０１５２６物質生産菌が
本物質を生産する範囲内で適宜変更しうるが、通常は１
〜４０℃、好ましくは１８〜３２℃で培養するのがよ
い。培養時間は、培養条件や培養量によっても異なるが
通常は約１日〜１週間である。
本物質を生産する範囲内で適宜変更しうるが、通常は１
〜４０℃、好ましくは１８〜３２℃で培養するのがよ
い。培養時間は、培養条件や培養量によっても異なるが
通常は約１日〜１週間である。
【００３１】発酵終了後、培養物から目的とするＦＲ９
０１５２６物質を回収する。すなわち、菌体は、直接水
及び／又は有機溶媒による抽出、あるいは、これを機械
的に又は超音波等既知の手段を用いて破壊した後、水及
び／又は有機溶媒で抽出した後、常法にしたがって回
収、精製する。培養液の場合は、直接、常法にしたがっ
て回収、精製すればよい。
０１５２６物質を回収する。すなわち、菌体は、直接水
及び／又は有機溶媒による抽出、あるいは、これを機械
的に又は超音波等既知の手段を用いて破壊した後、水及
び／又は有機溶媒で抽出した後、常法にしたがって回
収、精製する。培養液の場合は、直接、常法にしたがっ
て回収、精製すればよい。
【００３２】回収、精製方法としては、例えば、水、有
機溶媒、これらの混合溶媒による溶媒抽出；クロマトグ
ラフィー；単一溶媒又は混合溶媒からの再結晶等常法が
適宜単独であるいは組合わせて使用できる。
機溶媒、これらの混合溶媒による溶媒抽出；クロマトグ
ラフィー；単一溶媒又は混合溶媒からの再結晶等常法が
適宜単独であるいは組合わせて使用できる。
【００３３】ＦＲ９０１５２６物質の回収、精製は上記
のような既知の方法を適宜利用して行うが、例えば次の
ようにしてもよい。培養物をアセトンで抽出し、さらに
クロロホルムにとかした後、クロマトグラフィーで精製
する。ＦＲ９０１５２６物質は酸性物質であり、塩基と
反応して塩を形成することができる。ＦＲ９０１５２６
物質は遊離の状態（ＦＲ９０１５２６物質自体）でも回
収、精製することができるし、またそれらの塩としても
回収、精製できる。また、これは常法により相互に交換
することもできる。ＦＲ９０１５２６物質の塩基との塩
としてはナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属
塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土金属
塩などが挙げられる。
のような既知の方法を適宜利用して行うが、例えば次の
ようにしてもよい。培養物をアセトンで抽出し、さらに
クロロホルムにとかした後、クロマトグラフィーで精製
する。ＦＲ９０１５２６物質は酸性物質であり、塩基と
反応して塩を形成することができる。ＦＲ９０１５２６
物質は遊離の状態（ＦＲ９０１５２６物質自体）でも回
収、精製することができるし、またそれらの塩としても
回収、精製できる。また、これは常法により相互に交換
することもできる。ＦＲ９０１５２６物質の塩基との塩
としてはナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属
塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土金属
塩などが挙げられる。
【００３４】本発明に係る物質は、後記するところから
も明らかなように、すぐれたｃ−ＧＭＰ ＰＤＥ阻害作
用を有することが確認され、また、低毒性で安全性も高
いことが確認され、ｃ−ＧＭＰ ＰＤＥ阻害剤として非
常に有効である。したがって、本発明に係る、ＦＲ９０
１５２６物質を有効成分とする医薬製剤は、ＰＤＥ阻害
剤として、例えば、ヒトあるいは動物用の降圧利尿剤、
気管支拡張剤等、高血圧症、狭心症、うっ血性心疾患、
慢性の可逆性閉塞肺（例えば、喘息や気管支炎）等の予
防、治療に有効な薬剤として使用することができる。
も明らかなように、すぐれたｃ−ＧＭＰ ＰＤＥ阻害作
用を有することが確認され、また、低毒性で安全性も高
いことが確認され、ｃ−ＧＭＰ ＰＤＥ阻害剤として非
常に有効である。したがって、本発明に係る、ＦＲ９０
１５２６物質を有効成分とする医薬製剤は、ＰＤＥ阻害
剤として、例えば、ヒトあるいは動物用の降圧利尿剤、
気管支拡張剤等、高血圧症、狭心症、うっ血性心疾患、
慢性の可逆性閉塞肺（例えば、喘息や気管支炎）等の予
防、治療に有効な薬剤として使用することができる。
【００３５】本発明に係るＦＲ９０１５２６物質を予
防、治療目的に用いるに当っては、経口投与、非経口投
与および外用投与に適した有機もしくは無機固体状もし
くは液状賦形剤のような、医薬として許容される担体と
混合し前記化合物を有効成分として含有する常用の医薬
製剤の形として使用される。医薬製剤は錠剤、顆粒、粉
剤、カプセルのような固体状であってもよく、また溶
液、懸濁液、シロップ、エマルジョン、レモネード等の
ような液状であってもよい。
防、治療目的に用いるに当っては、経口投与、非経口投
与および外用投与に適した有機もしくは無機固体状もし
くは液状賦形剤のような、医薬として許容される担体と
混合し前記化合物を有効成分として含有する常用の医薬
製剤の形として使用される。医薬製剤は錠剤、顆粒、粉
剤、カプセルのような固体状であってもよく、また溶
液、懸濁液、シロップ、エマルジョン、レモネード等の
ような液状であってもよい。
【００３６】経口投与のための製剤としては、錠剤、丸
剤、顆粒剤、軟・硬カプセル剤、散剤、細粒剤、粉剤、
乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、ペレット剤、エリキシル
剤等が挙げられる。非経口投与のための製剤としては、
注射剤、点滴剤、輸液、軟膏、ローション、トニック、
スプレー、懸濁剤、油剤、乳剤、坐剤等が挙げられる。
本発明の有効成分を製剤化するには、常法にしたがえば
よく、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、
安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張剤その他常用される佐薬
を適宜使用する。
剤、顆粒剤、軟・硬カプセル剤、散剤、細粒剤、粉剤、
乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、ペレット剤、エリキシル
剤等が挙げられる。非経口投与のための製剤としては、
注射剤、点滴剤、輸液、軟膏、ローション、トニック、
スプレー、懸濁剤、油剤、乳剤、坐剤等が挙げられる。
本発明の有効成分を製剤化するには、常法にしたがえば
よく、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、
安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張剤その他常用される佐薬
を適宜使用する。
【００３７】本発明に係る薬剤組成物の投与量は、その
種類、治療のないし予防対象疾病の種類、投与方法、患
者の年令、患者の症状、処理時間等によって相違する
が、静脈投与の場合は成人ひとり当り１日に有効成分
（ＦＲ９０１５２６または／およびその塩）を０．０１
〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ
／ｋｇ投与し、筋肉投与の場合は同じく０．０１〜１０
００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ
投与し、経口投与の場合も同じく０．５〜２０００ｍｇ
／ｋｇ、好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲内で
投与する。
種類、治療のないし予防対象疾病の種類、投与方法、患
者の年令、患者の症状、処理時間等によって相違する
が、静脈投与の場合は成人ひとり当り１日に有効成分
（ＦＲ９０１５２６または／およびその塩）を０．０１
〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ
／ｋｇ投与し、筋肉投与の場合は同じく０．０１〜１０
００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ
投与し、経口投与の場合も同じく０．５〜２０００ｍｇ
／ｋｇ、好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲内で
投与する。
【００３８】以下、本発明を実施例について更に詳しく
説明する。
説明する。
【００３９】
【実施例１】
【００４０】（１）ＦＲ９０１５２６物質の発酵生産 Ｎｏ．９０７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７１４）の斜面培
養物を、下記の表９に示した前培養培地（培地１６０ｍ
ｌ／５００ｍｌ容コルベン）に、一白金耳ずつ接種し、
３０℃で２４時間、前培養した。
養物を、下記の表９に示した前培養培地（培地１６０ｍ
ｌ／５００ｍｌ容コルベン）に、一白金耳ずつ接種し、
３０℃で２４時間、前培養した。
【００４１】得られた前培養物を表９に示した本培養培
地（培地１２０Ｌ／２００Ｌジャーファーメンター）
に、０．８％接種し、通気量０．８ＶＶＭ、回転数２０
０ｒｐｍ、３０℃で４８時間培養した。発泡を防ぐた
め、培養開始後３０時間に、滅菌したアデカノール０．
２％を添加した。
地（培地１２０Ｌ／２００Ｌジャーファーメンター）
に、０．８％接種し、通気量０．８ＶＶＭ、回転数２０
０ｒｐｍ、３０℃で４８時間培養した。発泡を防ぐた
め、培養開始後３０時間に、滅菌したアデカノール０．
２％を添加した。
【００４２】
【表９】
【００４３】（２）ＦＲ９０１５２６物質の精製 上記の方法で得た発酵ブロス１７０Ｌに等量のアセトン
を加え、攪拌し、一昼夜放置した後、濾過した。濾液に
水を加えて４００Ｌに希釈した後、水で充填した１０Ｌ
のＤｉａｉｏｎ ＳＰ−２０７に付し、７０％アセトン
４０Ｌで溶出した。溶出液に等量の水を加え、再度、水
で充填した１０ＬのＤｉａｉｏｎＳＰ−２０７に付し、
アセトン１６Ｌで活性画分を溶出した。この活性画分を
減圧下で濃縮乾固した後、クロロホルム１Ｌに溶解し
た。
を加え、攪拌し、一昼夜放置した後、濾過した。濾液に
水を加えて４００Ｌに希釈した後、水で充填した１０Ｌ
のＤｉａｉｏｎ ＳＰ−２０７に付し、７０％アセトン
４０Ｌで溶出した。溶出液に等量の水を加え、再度、水
で充填した１０ＬのＤｉａｉｏｎＳＰ−２０７に付し、
アセトン１６Ｌで活性画分を溶出した。この活性画分を
減圧下で濃縮乾固した後、クロロホルム１Ｌに溶解し
た。
【００４４】これをクロロホルムで充填した５Ｌのシリ
カゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０、７０〜２３０ｍｅ
ｓｈ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社製）に付し、クロロホルム２６
Ｌ、クロロホルム：メタノール（１００：１）１５Ｌで
順次洗浄した後、活性画分をクロロホルム：メタノール
（５０：１）２７Ｌで溶出した。
カゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０、７０〜２３０ｍｅ
ｓｈ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社製）に付し、クロロホルム２６
Ｌ、クロロホルム：メタノール（１００：１）１５Ｌで
順次洗浄した後、活性画分をクロロホルム：メタノール
（５０：１）２７Ｌで溶出した。
【００４５】この活性画分を減圧濃縮した後、メタノー
ルで充填した活性炭カラム５００ｍｌに付し、塩化メチ
レン１．５Ｌ、アセトン１．５Ｌで順次洗浄後、１Ｎの
アンモニア水を０．５％含むアセトンで溶出した。
ルで充填した活性炭カラム５００ｍｌに付し、塩化メチ
レン１．５Ｌ、アセトン１．５Ｌで順次洗浄後、１Ｎの
アンモニア水を０．５％含むアセトンで溶出した。
【００４６】活性画分を減圧下で濃縮乾固した後、メタ
ノール１００ｍｌに溶解し、このメタノール溶液の一部
（約１／３量）を０．１％リン酸を含む４０％アセトニ
トリルで充填したＹＭＣ ＯＤＳ ＡＭカラム（１Ｌ、
ＹＭＣ（株））に付し、０．１％リン酸を含む４０％ア
セトニトリル溶液２Ｌ、次いで０．１％リン酸を含む５
０％アセトニトリル溶液４Ｌで洗浄した後、０．１％リ
ン酸を含む５５％アセトニトリル溶液で溶出した。残り
のメタノール溶液についても２分して、上記の方法と同
様の操作を行なった。
ノール１００ｍｌに溶解し、このメタノール溶液の一部
（約１／３量）を０．１％リン酸を含む４０％アセトニ
トリルで充填したＹＭＣ ＯＤＳ ＡＭカラム（１Ｌ、
ＹＭＣ（株））に付し、０．１％リン酸を含む４０％ア
セトニトリル溶液２Ｌ、次いで０．１％リン酸を含む５
０％アセトニトリル溶液４Ｌで洗浄した後、０．１％リ
ン酸を含む５５％アセトニトリル溶液で溶出した。残り
のメタノール溶液についても２分して、上記の方法と同
様の操作を行なった。
【００４７】得られた活性画分を集め、１Ｎ ＮａＯＨ
でｐＨ７．０に調整した後、これを減圧濃縮して、アセ
トニトリルを除去し、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ８．０に調
整した後、酢酸エチル１Ｌで抽出した。抽出液を３００
ｍｌに濃縮し、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．０に調整した水
３００ｍｌで洗浄した後、減圧下で濃縮乾固した。これ
にメタノールを加えてメタノール可溶画分を除去した
後、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整した水１Ｌに溶
解し、再び酢酸エチルで抽出した。抽出液を硫酸ナトリ
ウムで脱水後、減圧下で濃縮乾固し、ＦＲ９０１５２６
物質の淡黄色粉末７０１ｍｇを得た。
でｐＨ７．０に調整した後、これを減圧濃縮して、アセ
トニトリルを除去し、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ８．０に調
整した後、酢酸エチル１Ｌで抽出した。抽出液を３００
ｍｌに濃縮し、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．０に調整した水
３００ｍｌで洗浄した後、減圧下で濃縮乾固した。これ
にメタノールを加えてメタノール可溶画分を除去した
後、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整した水１Ｌに溶
解し、再び酢酸エチルで抽出した。抽出液を硫酸ナトリ
ウムで脱水後、減圧下で濃縮乾固し、ＦＲ９０１５２６
物質の淡黄色粉末７０１ｍｇを得た。
【００４８】
【実施例２：ＦＲ９０１５２６物質の生物学的性質】
【００４９】（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃ−ＧＭＰ Ｐ
ＤＥ阻害作用 （方法）ヒト臍帯動脈を０．２５Ｍシュークロース、１
ｍＭエチレンジアミン四酢酸、２ｍＭベンザミジン、
０．２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドを含有
する１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で、
ガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズし、回転数
４０，０００ｒｐｍ、１時間遠心して得られた上澄を、
ＰＤＥ酵素液として使用した。
ＤＥ阻害作用 （方法）ヒト臍帯動脈を０．２５Ｍシュークロース、１
ｍＭエチレンジアミン四酢酸、２ｍＭベンザミジン、
０．２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドを含有
する１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で、
ガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズし、回転数
４０，０００ｒｐｍ、１時間遠心して得られた上澄を、
ＰＤＥ酵素液として使用した。
【００５０】酵素反応は次に示す組成で行なった。 ０．２μＭ 基質 ４０ｍＭ トリス・塩酸緩衝液 ｐＨ７．５ １ｍＭ 塩化マグネシウム ０．１ｍＭ 塩化カルシウム １０ｕ／ｍｌ カルモジュリン ＰＤＥ酵素液 ０．２ｍｇ／ｍｌ 蛇毒
【００５１】基質として［3Ｈ］−ｃ−ＧＭＰあるいは
［3Ｈ］−ｃ−ＡＭＰを使用した。ＰＤＥ酵素液は、
０．２μＭの基質を１５〜２０％加水分解する濃度を設
定し使用した。
［3Ｈ］−ｃ−ＡＭＰを使用した。ＰＤＥ酵素液は、
０．２μＭの基質を１５〜２０％加水分解する濃度を設
定し使用した。
【００５２】ＰＤＥ阻害活性の測定は、サンプルをジメ
チルスルホキサイドに溶解し、上記組成の反応液に添加
して行なった。３０℃で３０分反応後、未反応の基質を
ＤＯＷＸ １−Ｘ８に吸着し、遠心した後、その上澄の
放射活性をｃｐｍで測定し、下記数１に示す式より阻害
率を算出した。
チルスルホキサイドに溶解し、上記組成の反応液に添加
して行なった。３０℃で３０分反応後、未反応の基質を
ＤＯＷＸ １−Ｘ８に吸着し、遠心した後、その上澄の
放射活性をｃｐｍで測定し、下記数１に示す式より阻害
率を算出した。
【００５３】
【数１】
【００５４】（結果）酵素阻害活性は、酵素活性を５０
％阻害する濃度（ＩＣ50）で示し、ＦＲ９０１５２６物
質のＰＤＥ阻害活性（ＩＣ50）については、下記の表１
０に示した。
％阻害する濃度（ＩＣ50）で示し、ＦＲ９０１５２６物
質のＰＤＥ阻害活性（ＩＣ50）については、下記の表１
０に示した。
【００５５】
【表１０】
【００５６】上記結果から明らかなように、ＦＲ９０１
５２６物質は、ヒト臍帯動脈由来ｃ−ＧＭＰ ＰＤＥに
対して強い阻害作用を示した。また、ｃ−ＡＭＰ ＰＤ
Ｅに対する阻害作用より、ＩＣ50値で約４０倍強かっ
た。
５２６物質は、ヒト臍帯動脈由来ｃ−ＧＭＰ ＰＤＥに
対して強い阻害作用を示した。また、ｃ−ＡＭＰ ＰＤ
Ｅに対する阻害作用より、ＩＣ50値で約４０倍強かっ
た。
【００５７】（２）ｉｎ ｖｉｖｏ 利尿作用 （方法）ラット（ＳＤラット雄性、６〜９週令）に、ウ
レタン（１．２ｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）麻酔した後、左右
大腿静脈にカニュレーションした。採尿のため、腹部よ
り膀胱にカテーテルを挿入した。
レタン（１．２ｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）麻酔した後、左右
大腿静脈にカニュレーションした。採尿のため、腹部よ
り膀胱にカテーテルを挿入した。
【００５８】一方の大腿静脈より生理食塩液を１時間あ
たり２．４ｍｌの割合で注入し、１０分間の尿量を継続
的に測定した。尿量が安定した後、もう一方の大腿静脈
よりＦＲ９０１５２６物質を、３０分間、３０ｍｇ／ｋ
ｇの割合で注入した。ＦＲ９０１５２６物質は、１Ｎ−
水酸化ナトリウムで溶解し、塩酸で中和して使用した。
たり２．４ｍｌの割合で注入し、１０分間の尿量を継続
的に測定した。尿量が安定した後、もう一方の大腿静脈
よりＦＲ９０１５２６物質を、３０分間、３０ｍｇ／ｋ
ｇの割合で注入した。ＦＲ９０１５２６物質は、１Ｎ−
水酸化ナトリウムで溶解し、塩酸で中和して使用した。
【００５９】（結果）ＦＲ９０１５２６物質注入開始
後、３時間まで、１０分間の尿量を継続的に測定したと
ころ、その最大尿量が、ＦＲ９０１５２６物質投与前１
０分間の尿量の４．５倍であった。
後、３時間まで、１０分間の尿量を継続的に測定したと
ころ、その最大尿量が、ＦＲ９０１５２６物質投与前１
０分間の尿量の４．５倍であった。
【００６０】ｃ−ＧＭＰ ＰＤＥに持異的な阻害作用を
有するＦＲ９０１５２６物質が、ｉｎ ｖｉｖｏで利尿
を促進する作用を有することが明らかとなった。
有するＦＲ９０１５２６物質が、ｉｎ ｖｉｖｏで利尿
を促進する作用を有することが明らかとなった。
【００６１】（３）毒性試験 生後５週令のＩＣＲ系雌マウス５匹に、ＦＲ９０１５２
６物質を１００ｍｇ／ｋｇの投与量で毎日１回、３日間
連続腹腔内注射したが死亡例はなく、体重増加も無投与
マウス群と全く同じであり、ＦＲ９０１５２６物質の安
全性の高さが確認された。
６物質を１００ｍｇ／ｋｇの投与量で毎日１回、３日間
連続腹腔内注射したが死亡例はなく、体重増加も無投与
マウス群と全く同じであり、ＦＲ９０１５２６物質の安
全性の高さが確認された。
【００６２】
【発明の効果】本発明に係るＦＲ９０１５２６物質は、
卓越したｃ−ＧＭＰ ＰＤＥ阻害作用を有するので、該
酵素に起因する循環器系その他の疾患の予防、治療薬と
して、非常に有用である。また、本発明によって、微生
物を利用する上記物質の工業的製法も確立された。
卓越したｃ−ＧＭＰ ＰＤＥ阻害作用を有するので、該
酵素に起因する循環器系その他の疾患の予防、治療薬と
して、非常に有用である。また、本発明によって、微生
物を利用する上記物質の工業的製法も確立された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 1/04 Ｚ Ｃ１２Ｒ 1:38）
Claims (5)
- 【請求項１】 下記表１に示される理化学的性質を有す
ることを特徴とするＦＲ９０１５２６物質。 【表１】 - 【請求項２】 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属に属するＦＲ９０１５２６物質生産菌を培養して
ＦＲ９０１５２６物質を生成せしめ、これを採取するこ
とを特徴とするＦＲ９０１５２６物質の製造方法。 - 【請求項３】 ＦＲ９０１５２６物質生産菌がシュード
モナス エスピーＮｏ．９０７（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｓｐ．Ｎｏ．９０７）であることを特徴とする請求
項２に記載の方法。 - 【請求項４】 ＦＲ９０１５２６物質又は医薬として許
容されるその塩、及び、医薬として許容され且つ実質的
に無毒の担体又は賦形剤を含むものであることを特徴と
する医薬製剤。 - 【請求項５】 ｃ−ＧＭＰ ＰＤＥ（サイクリックＧＭ
Ｐホスホジエステラーゼ）阻害剤として使用されるもの
である請求項４に記載の医薬製剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6218325A JPH0859681A (ja) | 1994-08-22 | 1994-08-22 | ｃ−ＧＭＰ ＰＤＥ阻害物質ＦＲ９０１５２６ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6218325A JPH0859681A (ja) | 1994-08-22 | 1994-08-22 | ｃ−ＧＭＰ ＰＤＥ阻害物質ＦＲ９０１５２６ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0859681A true JPH0859681A (ja) | 1996-03-05 |
Family
ID=16718087
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6218325A Pending JPH0859681A (ja) | 1994-08-22 | 1994-08-22 | ｃ−ＧＭＰ ＰＤＥ阻害物質ＦＲ９０１５２６ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0859681A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7781191B2 (en) | 2005-04-12 | 2010-08-24 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Treatment of biomass to obtain a target chemical |
| US7910338B2 (en) | 2005-04-12 | 2011-03-22 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Integration of alternative feedstreams for biomass treatment and utilization |
| US8512979B2 (en) | 2005-04-12 | 2013-08-20 | E I Du Pont De Nemours And Company | System and process for biomass treatment |
-
1994
- 1994-08-22 JP JP6218325A patent/JPH0859681A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7781191B2 (en) | 2005-04-12 | 2010-08-24 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Treatment of biomass to obtain a target chemical |
| US7910338B2 (en) | 2005-04-12 | 2011-03-22 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Integration of alternative feedstreams for biomass treatment and utilization |
| US7932063B2 (en) | 2005-04-12 | 2011-04-26 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Treatment of biomass to obtain fermentable sugars |
| US7998713B2 (en) | 2005-04-12 | 2011-08-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Treatment of biomass to obtain ethanol |
| US8512979B2 (en) | 2005-04-12 | 2013-08-20 | E I Du Pont De Nemours And Company | System and process for biomass treatment |
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