JPH09221494A - Ｗｓ７２５４５物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 この発明の課題は、免疫抑制作用を有する新
規化合物の提供。 【解決手段】 ストレプトマイセス エスピーＮｏ．７
２５４５を栄養培地中で培養し、免疫抑制作用を有する
ＷＳ７２５４５物質類を得た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫抑制作用を有
する新規な化合物に関するものであり、医療の分野で利
用される。

【０００２】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、免疫抑制作用を有する新規な化合物を提供
することにある。

【０００３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意検討した結果、免疫抑制作用を有
する新規な化合物を見出し、本発明を完成するに至っ
た。より詳しくは、本発明は、免疫抑制作用を有する新
規化合物ＷＳ７２５４５物質類、それらの製造法、それ
らを含有する免疫抑制剤として有用な医薬組成物および
それらの医薬としての用途に関する。従って、この発明
の一目的は、移植による拒絶反応、骨髄移植による移植
片宿主相関病、自己免疫疾患、乾癬などの治療および予
防に有用な新規化合物ＷＳ７２５４５物質類を提供する
ことである。この発明の他の一目的は、ストレプトマイ
セスに属するＷＳ７２５４５物質類生産性菌株の栄養培
地中での発酵によるＷＳ７２５４５物質類の製造法を提
供することである。この発明のさらなる目的は、ＷＳ７
２５４５物質を活性成分として含有する医薬組成物を提
供することである。この発明のさらに一つの目的は、移
植による拒絶反応、骨髄移植による移植片宿主相関病、
自己免疫疾患、乾癬などの治療および予防のためのＷＳ
７２５４５物質類の用途を提供することである。ＷＳ７
２５４５物質類は２成分を包含し、それらをそれぞれＷ
Ｓ７２５４５Ａ２物質およびＷＳ７２５４５Ｃ物質と呼
び、この明細書において「ＷＳ７２５４５物質」と表現
するときは、それらＷＳ７２５４５物質類の一つを指す
ものとする。ＷＳ７２５４５物質類は、ストレプトマイ
セス エスピーＮｏ．７２５４５などのストレプトマイ
セスに属するＷＳ７２５４５物質類生産性菌株の栄養培
地中での発酵により製造できる。ＷＳ７２５４５物質類
の製造は、説明の目的でのみ示した本明細書記載の特定
の微生物の使用に限定されるものではないことを、了解
されたい。この発明は、自然変異株ならびに記載の微生
物からＸ線照射、紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、２−アミノプリンなどに
よる処理などの常法により生産できる人工変異株を含め
て、ＷＳ７２５４５物質類を生産しうる任意の変異株の
使用をも包含するものである。

【０００４】ストレプトマイセス エスピーＮｏ．７２
５４５の分類学的特性 材料および方法 菌株Ｎｏ．７２５４５は、日本国沖縄県で採取された土
壌試料から単離されたものである。菌株Ｎｏ．７２５４
５の分類学的研究のために、シャーリング（Ｓｈｉｒｌ
ｉｎｇ）とゴットリープ（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）（１）な
らびにワックスマン（Ｗａｋｓｍａｎ）（２）が記載し
ている方法および培地を採用した。３０℃で２１日間培
養後に観察を行った。酵母エキス−麦芽エキス寒天、オ
ートミール寒天ならびに無機塩類−デンプン寒天上で生
育させた培養について、光学顕微鏡および走査型電子顕
微鏡を用いて、形態観察を行った。この研究で使用した
色名は、メチューエン（Ｍｅｔｈｕｅｎ）ハンドブック
・オブ・カラー（３）からとったものである。生育温度
範囲は、酵母エキス−麦芽エキス寒天で求めた。細胞の
調製およびジアミノピメリン酸異性体の検出は、ベッカ
ー（Ｂｅｃｋｅｒ）ら（４）の手順に従って実施した。 結果および考察 （１）形態学的特性 基底菌糸はよく発育し、不規則に分枝した。この菌株
は、真っ直ぐでしなやかなル−プ状またはゆるいらせん
状胞子鎖をもつ気生菌糸を生じ、それら胞子鎖は鎖１本
当たり１０個以上の胞子を含んでいた。胞子の形態は卵
形ないし円柱状（０．５〜０．８×１．０〜１．２μ
ｍ）であった。それらの表面は滑らかであった。菌核顆
粒、胞子嚢および移動性の胞子は認められなかった。 （２）培養特性および生理学的特性 培養特性および生理学的特性はそれぞれ表１および表２
に示す通りである。気中体の色は、酵母エキス−麦芽エ
キス寒天およびオートミール寒天上では灰色がかった赤
であった。培養の裏面の色は褐色および暗褐色であっ
た。トリプトン−酵母エキスブロス、ペプトン−酵母エ
キス−鉄寒天およびチロシン寒天中では、メラノイド色
素は産生されなかった。酵母エキス−麦芽エキス寒天、
オートミール寒天および無機塩類−デンプン寒天中で、
赤色がかった可溶性色素が産生されたが、その程度は弱
かった。これらの可溶性色素はｐＨ感受性で、０．０５
Ｎ塩酸の添加により赤色から淡黄色に変化した。 （３）化学分類学的特性 この菌株の全細胞加水分解物中に、ＬＬ−ジアミノピメ
リン酸が検出された。 （４）分類 上述の形態学的特性および化学的特性に基づいて、菌株
Ｎｏ．７２５４５はストレプトマイセス属（５，６）に
属するものと考えられる。それゆえ、この菌株をストレ
プトマイセス エスピーＮｏ．７２５４５と命名した。

【０００５】

【表１】

【０００６】

【表２】

【０００７】引用文献： １）Ｅ．Ｂ．シャーリングとＤ．ゴットリープ：ストレ
プトマイセス種の同定法。インターナショナル・ジャー
ナル・オブ・システマティック・バクテオロジー第１６
巻、３１３〜３４０ページ，１９６６年 ２）Ｓ．Ａ．ワックスマン：放線菌類（Ｔｈｅ Ａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）第２巻：属および種の分類、同
定および記述：ザ・ウィリアムズ・アンド・ウィルキン
ス社、バルチモア、１９６１年 ３）Ａ．コーネラップとＪ．Ｈ．ワンシャー：メチュー
エン・ハンドブック・オブ・カラー、メチューエン、ロ
ンドン、１９７８年 ４）Ｂ．ベッカー、Ｍ．Ｐ．ルシュヴァリエ、Ｒ．Ｅ．
ゴードンおよびＨ．Ａ．ルシュヴァリア：全細胞加水分
解物のペーパークロマトグラフィーによるノカルディア
とストレプトマイセスとの迅速識別：アプライド・マイ
クロバイオロジー第１２巻、４２１〜４２３ページ、１
９６４年 ５）Ｒ．Ｅ．ブキャナンとＮ．Ｅ．ギボンズ：バージー
ズ・マニュアル・オブ・ディタミネイティヴ・バクテリ
オロジー、第８版：ザ・ウィリアムズ・アンド・ウィル
キンス社、バルチモア、１９７４年 ６）Ｓ．Ｔ．ウィリアムズ：バージーズ・マニュアル・
オブ・システマティック・バクテオロジー、第４巻：ウ
ィリアムズ・アンド・ウィルキンス、バルチモア、１９
８９年

【０００８】この菌株は、工業技術院生命工学工業技術
研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１−３）に寄託
番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５３３８として寄託されている
（寄託日：１９９５年１２月１５日）。 ＷＳ７２５４５物質類の生産 ＷＳ７２５４５物質類は、同化性炭素源および同化性窒
素源を含有する栄養培地中、好気性条件下で（たとえば
振盪培養、液内培養など）、ストレプトマイセスに属す
るＷＳ７２５４５物質類生産性菌株を培養するとき、生
産される。栄養培地中の好ましい炭素源は、グルコー
ス、スクロース、デンプン、フルクトース、グリセリン
などの炭水化物などである。好ましい窒素源は、落花生
粉、酵母エキス、ペプトン、グルテン粉、綿実粉、大豆
粉、大豆荒挽き粉、コーンスチープリカー、乾燥酵母、
麦芽など、ならびにアンモニウム塩類（たとえば硝酸ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、燐酸アンモニウムな
ど）、尿素、アミノ酸などの無機および有機窒素化合物
である。それら炭素源および窒素源は、組み合わせて使
用するのが有利であるが、微量の成長因子および相当量
の無機栄養素を含有する純度の低い物質も使用に適して
いるので、それらの純粋な形態で使用する必要はない。
所望により、炭酸ナトリウムもしくはカルシウム、燐酸
ナトリウムもしくはカリウム、塩化ナトリウムもしくは
カリウム、沃化ナトリウムもしくはカリウム、マグネシ
ウム塩類、銅塩類、亜鉛塩類、鉄塩類、コバルト塩類な
どの無機塩類を培地に添加してもよい。必要ならば、と
くに培地が強度に泡立つ場合には、流動パラフィン、脂
肪油、植物油、鉱油、シリコーンなどの消泡剤などを添
加することもできる。培養混合物の攪拌および通気は、
プロペラまたは類似の機械的攪拌装置による攪拌、発酵
槽（ファーメンター）の回転または振盪による攪拌など
の種々の方法により達成できる。発酵は、通常、約１０
℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の温度で、約５
０時間〜１５０時間にわたり実施するが、これらは、発
酵条件および規模に応じて変更できる。発酵が完了する
と、ＷＳ７２５４５物質類の回収のため、培養液を、生
物活性物質の回収、精製のための種々の慣用的操作、た
とえば適当な溶媒または溶媒混合物による溶媒抽出、ク
ロマトグラフィ−、適当な溶媒または溶媒混合物からの
再結晶に付す。

【０００９】ＷＳ７２５４５Ａ２物質は、次の物理化学
的性質を有する： 外観： 淡黄色粉末 分子式： Ｃ₁₄Ｈ₁₅Ｎ₃Ｏ₆ 元素分析： Ｃ₁₄Ｈ₁₅Ｎ₃Ｏ₆・Ｈ₂Ｏとして 計算値： Ｃ４９．５６， Ｈ５．０５， Ｎ１２．３
８ 実測値： Ｃ５０．０３， Ｈ４．７１， Ｎ１２．４
０ 分子量： ＥＳＩ−ＭＳ： ｍ／ｚ ３２２ （Ｍ＋
Ｈ）⁺ 融点： ８７−９２℃（分解） 比旋光度： ［α］_D（２３℃）−２３０°（ｃ＝０．
５、ジメチルスルホキシド） 紫外吸収スペクトル： λ_max（メタノール）： ２５５，３２５ｎｍ λ_max（メタノール＋ＨＣｌ）： ２５５，３２５ｎｍ λ_max（メタノール＋ＮａＯＨ）： ３３５ｎｍ 溶解性： 可溶： メタノール、ジメチルスルホキシド、水 僅溶： クロロホルム、酢酸エチル 不溶： ｎ−ヘキサン 呈色反応： 陽性： 硫酸第二セリウム反応、沃素蒸気反応 陰性： ニンヒドリン反応、塩化第二鉄反応、モーリッ
シュ反応 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）：

【数３】 高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）： 条件： 移動相：１０％含水メタノール カラム：ＹＭＣ ＯＤＳ ＡＭ−３０２−３^**（１５０
×４．６ｍｍ内径） 流速： １ｍｌ／分 検出： ＵＶ、３２６ｎｍ 保持時間：１９．４分^** 商標：山村化学研究所製 赤外スペクトル： ν_max（ＫＢｒ）：図１に示す通り；3430, 3270, 2150,
1710, 1630, 1480,1370, 1250, 1190 cm^{-1 1} Ｈ核磁気共鳴スペクトル： (500MHz,DMSO-d₆)δ_H 図２に示す通り；9.94 (1H,幅広s,交換可能), 6.67 (1
H,幅広s,交換可能),5.36 (1H,s,交換可能), 3.74 (1H,
d,J=18Hz), 3.36 (1H,d,J=18Hz), 2.90(1H,q,J=7Hz),
2.04 (3H,s), 1.18 (3H.s), 0.80 (3H,d,J=7Hz)¹³ Ｃ核磁気共鳴スペクトル： (125MHz,DMSO-d₆)δ_C 図３に示す通り；205.2 (s), 188.8 (s), 175.8 (s), 1
75.7 (s), 147.9(s), 115.7 (s), 79.4 (s), 71.3 (s),
70.7 (s), 49.9 (t), 36.5 (d),30.1 (q), 25.2 (q), 1
2.6 (q) 本質： 中性物質 また、ＷＳ７２５４５Ｃ物質は、次の物理化学的性質を
有する： 外観： 黄色粉末 分子式： Ｃ₁₁Ｈ₉Ｎ₃Ｏ₅ 分子量： ＥＳＩ−ＭＳ： ｍ／ｚ ２６４ （Ｍ＋
Ｈ）⁺ 融点： １０３−１０９℃（分解） 比旋光度： ［α］_D（２３℃） −７２°（ｃ＝０．
２５、メタノール） 紫外吸収スペクトル： λ_max（メタノール）： ２９０，４００ｎｍ λ_max（メタノール＋ＨＣｌ）： ２９０，４００ｎｍ λ_max（メタノール＋ＮａＯＨ）： ２１０，２５３，
３２３ｎｍ 溶解性： 可溶： メタノール、ジメチルスルホキシド、水 僅溶： クロロホルム、酢酸エチル 不溶： ｎ−ヘキサン 呈色反応： 陽性： 硫酸第二セリウム反応、沃素蒸気反応 陰性： ニンヒドリン反応、塩化第二鉄反応、モーリッ
シュ反応

【００１０】薄層クロマトグラフィ−（ＴＬＣ）：

【数４】 高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）： 条件： 移動相：１０％含水メタノール カラム：ＹＭＣ ＯＤＳ ＡＭ−３０２−３^**（１５０
×４．６ｍｍ内径） 流速： １ｍｌ／分 検出： ＵＶ、３２６ｎｍ 保持時間：１３．０分^** 商標：山村化学研究所製 赤外スペクトル： ν_max（ＫＢｒ）：図４に示す通り；3480, 3250, 2980,
2150, 1710, 1670,1630, 1470, 1460, 1360, 1320, 12
80, 1250, 1180 cm^{-1 1} Ｈ核磁気共鳴スペクトル： (500MHz,DMSO-d₆)δ_H 図５に示す通り；10.28 (1H,s,交換可能), 5.51 (1H,幅
広s,交換可能),2.96 (1H,q,J=7Hz), 1.23 (3H,s), 0.94
(3H,d,J=7Hz)¹³ Ｃ核磁気共鳴スペクトル： (125MHz,DMSO-d₆)δ_C 図６に示す通り；175.4 (s), 174.2 (s),. 172.1 (s),
170.8 (s), 139.5(s), 124.9 (s), 82.8 (s), 71.2
(s), 37.4 (d), 25.4 (q), 12.7 (q) 本質： 中性物質

【００１１】ＷＳ７２５４５物質類の生物学的性質 ＷＳ７２５４５物質類は、免疫抑制作用などの薬理活性
を有し、従って、心、腎、肝、骨髄、皮膚、角膜、肺、
膵、小腸、四肢、筋、神経などの器官または組織の移植
による拒絶反応；骨髄移植による移植片宿主関連病；慢
性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺
腫、多発性硬化症、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、乾癬な
どの自己免疫疾患などの免疫介在性疾患の治療および予
防に有用である。また、ＷＳ７２５４５物質類は、乾
癬、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、さらには湿疹性皮
膚炎、脂漏性皮膚炎、偏平苔癬、天疱瘡、水疱性類天疱
瘡、表皮水疱症、蕁麻疹、血管性水腫、血管炎、紅斑、
皮膚好酸球増加症、全身性エリテマトーデス、座瘡、円
形脱毛症などの炎症性および増殖過剰性皮膚疾患ならび
に免疫介在性疾患の皮膚発現；自己免疫性疾患などの種
々の眼疾患（たとえば角結膜炎、春季結膜炎、ベーチェ
ット病関連ぶどう膜炎、角膜炎、ヘルペス性角膜炎、円
錐角膜、角膜上皮ジストロフィー、角膜白斑、眼天疱
瘡、モーレン潰瘍、強膜炎、グレーヴス眼病、フォーク
ト・小柳・原田症候群、サルコイドーシスなど）；喘息
（たとえば気管支喘息、アレルギー喘息、内因性喘息、
外因性喘息、塵埃喘息）、とくに慢性または難治性喘息
（たとえば遅発型喘息、気道反応亢進）、気管支炎など
の可逆性閉塞性気道疾患；胃潰瘍、虚血性疾患よおび血
栓症に起因する血管傷害、虚血性腸疾患、炎症性腸疾
患、壊死性小腸結腸炎、熱傷に関連した腸傷害、ロイコ
トリエンＢ₄ 介在性疾患などの粘膜および血管の炎症；
脂肪便症、直腸炎、好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、クロ
ーン病、潰瘍性大腸炎などの腸の炎症／アレルギー；胃
腸管から遠位で症状発現を呈する食品関連アレルギー疾
患、たとえば偏頭痛、鼻炎、湿疹；間質性腎炎、グッド
パスチャー症候群、溶血性尿毒症性症候群、糖尿病ネフ
ロパシーなどの腎疾患；多発性筋炎、ギラン・バレ症候
群、メニエール病、多発神経炎、単神経炎、神経根傷害
などの神経疾患；甲状腺機能亢進、バセドウ病などの内
分泌腺疾患；真性赤血球性貧血、無形成貧血、再生不良
性貧血、特発性血小板減少性紫斑、自己免疫性溶血性貧
血、顆粒球減少、悪性貧血、巨赤芽球性貧血、赤血球形
成不全などの血液疾患；骨粗鬆症などの骨疾患；サルコ
イドーシス、肺線維症、特発性間質性肺炎などの呼吸器
疾患；皮膚筋炎、尋常性白斑、尋常性魚鱗癬、光アレル
ギー感受性、皮膚Ｔ細胞リンパ腫などの皮膚疾患；動脈
硬化、アテローム性動脈硬化、大動脈炎症候群、結節性
多発動脈炎、心筋症（たとえば自己免疫性心筋炎、ウイ
ルス性心筋炎）などの循環器疾患；強皮症、ウェゲナー
肉芽腫、シェーグレン症候群などの膠原病；脂肪過多；
好酸球性筋膜炎；歯肉、歯周組織、歯槽骨、セメント質
の損傷などの歯周疾患；糸球体腎炎などの腎疾患；男性
型脱毛または老人性脱毛；筋ジストロフィー；膿皮症お
よびセザリー症候群；アジソン病；活性酸素介在性疾
患、たとえば、保存、移植または虚血性疾患（たとえば
血栓症、心筋梗塞）の際に起こる臓器（たとえば心、
肝、腎、消化管）の虚血−再懽流損傷による臓器損傷；
エンドトキシンショック、偽膜性結腸炎、薬物または放
射線により惹起された結腸炎などの腸疾患；虚血性急性
腎不全、慢性腎不全などの腎疾患；肺酸素または薬物
（たとえばパラコート、ブレオマイシン）により惹起さ
れた中毒症、肺癌、肺気腫などの肺疾患；白内障、シデ
ローシス、色素性網膜炎、老人性黄斑変性、硝子体瘢痕
形成、角膜のアルカリ熱傷などの眼疾患；多形紅斑、線
状ＩｇＡ水疱性皮膚炎、セメント皮膚炎などの皮膚疾
患；歯肉炎、歯周病、敗血症、膵炎、環境汚染（たとえ
ば空気汚染）により惹起される疾患、老化、発癌、癌の
転移、高山病などのその他の疾患；ヒスタミンもしくは
ロイコトリエンＣ₄ の放出により惹起される疾患；腸、
血管または神経ベーチェット病などのベーチェット病、
また口腔、皮膚、眼、外陰部、関節、精巣上体、肺、腎
などを侵すベーチェット病；などの治療および予防にも
有用である。また、ＷＳ７２５４５物質類は、肝再生作
用および／または肝細胞の肥大および増殖を刺激する作
用をも有しうる。それゆえ、それらは、免疫原性疾患
（たとえば自己免疫肝炎、原発性胆汁性肝硬変および硬
化性胆管炎からなる群などの慢性自己免疫肝疾患）、部
分的肝切除、急性肝壊死（たとえば毒素、ウイルス性肝
炎、ショックまたは酸素欠乏により惹起された壊死）、
Ｂ型ウイルス性肝炎、非Ａ／非Ｂ型肝炎、硬変、劇症肝
疾患、晩発性肝不全、「慢性期急性」肝不全（慢性肝疾
患の場合の急性肝不全）などの肝疾患の治療および予防
に有用である。さらに、ＷＳ７２５４５物質類は、化学
療法剤の作用の増強、サイトメガロウイルス感染の処理
作用の抑制、抗炎症作用などのそれらの有用な薬学的活
性のために、種々の疾患に対して有用でありうる。ＷＳ
７２５４５物質類の生物活性を示すための例として、以
下に、若干の生物学的データを説明する。

【００１２】試験１．抗ＣＤ３抗体刺激によるマウス脾
Ｂ細胞でのＣＤ２３の発現の抑制 抗ＣＤ３抗体を加えた、１０％ウシ胎児血清、５０ｍＭ
２−メルカプトエタノール、ペニシリン（１００単位／
ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）
含有ＲＰＭＩ１６４０培地０．１ｍｌ中の２．５×１０
⁵ 個のＢａｌｂ／ｃマウス脾細胞を各々のウエルに入れ
たマイクロタイタープレートを用い、ＣＤ２３発現試験
を実施した。細胞を、湿潤５％ＣＯ₂ 雰囲気中、３７℃
で１６時間インキュベートした。この培養期間後、試験
試料のＣＤ２３発現抑制作用をＥＬＩＳＡにより定量的
に求めた。簡略に述べれば、各ウエルにラット抗マウス
ＣＤ２３を加え、プレートミキサーで混合し、氷の上で
３０分間インキュベートした。３０分後、プレートをＰ
ＢＳで３回洗い、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（Ｏ
ＮＰＤ）（０．４ｍｇ／ｍｌ）およびＨ₂Ｏ₂（４０μｌ
／１００ｍｌ）をクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解
させて加えた。マイクロプレート吸収分光光度計を用
い、４９２ｎｍで、ＣＤ２３の発現を測定した。ＷＳ７
２５４５物質類は、水に溶解させ、さらにＲＰＭＩ１６
４０培地で希釈し、最終濃度５０μｌ／ｍｌ以下となる
ように培養に添加した。結果を表３に示す。

【００１３】ＷＳ７２５４５物質類は、抗ＣＤ３抗体に
より惹起されるＣＤ２３の発現を抑制した。

【表３】

【００１４】試験２．マウスにおけるＩｇＥ産生に対す
るＷＳ７２５４５Ａ２物質の影響 雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスを、水酸化アルミニウムゲル
（アラム）の腹腔内注射により免疫化した。ＷＳ７２５
４５Ａ２物質を水に溶解させ、免疫化の日から始めて連
続７日間経口投与した。免疫化から７日後、血清を採取
し、ＩｇＥ価をＥＬＩＳＡにより求めた。簡略に述べれ
ば、抗マウスＩｇＥ５０μｌをマイクロタイタープレー
トの各ウエルに加え、４℃で１６時間インキュベートし
た。マイクロタイタープレートを０．１％トゥイーン８
０含有ＴＢＳ（Ｔ−ＴＢＳ）で洗ったのち、０．５％ウ
シＢＳＡ−ＰＢＳでブロックした。Ｔ−ＰＢＳで洗浄
後、希釈マウス血清５０μｌを加え、室温で１時間イン
キュベートした。１時間後、抗マウスＩｇＥモノクロ−
ナル抗体−西洋わさびペルオキシダーゼ結合体を加え、
１時間インキュベートした。１時間のインキュベーショ
ン後、プレートをＴ−ＰＢＳで洗い、クエン酸緩衝液
（ｐＨ４．５）に溶解させたＯＮＰＤ（０．４ｍｇ／ｍ
ｌ）およびＨ₂Ｏ₂（４０μｌ／ｍｌ）を加えた。マイク
ロプレート吸収分光光度計を用い、４９２ｎｍで抗体価
を測定した。表４に示したように、ＷＳ２７５４５Ａ２
物質の投与によりＩｇＥ産生が顕著に抑制されたが、体
重減少はなかった。

【００１５】

【表４】

【００１６】試験３．マウスのＨＶＧ反応に及ぼすＷＳ
７２５４５Ａ２物質の影響 マウスのＨＶＧ反応に及ぼすＷＳ７２５４５Ａ２物質の
影響を試験した。簡略に述べると、Ｃ５７ＢＬ／６マウ
ス（雌性、６週齢）の脾細胞（１×１０⁷ ）をＢａｌｂ
／ｃマウス（雌性、６週齢）の後足趾に注射した。ＷＳ
７２５４５Ａ２物質を水に溶解させ、免疫化の日から始
めて連続３日間経口投与した。免疫化の３日後、膝窩の
リンパ節を採取し、リンパ節細胞数をシスメックス（Ｓ
ｙｓｍｅｘ）セルカウンターにより計数した。表５に示
した通り、ＷＳ７２５４５Ａ２物質の投与により、ＨＶ
Ｇ反応が抑制された。

【表５】

【００１７】この発明の医薬組成物は、ＷＳ７２５４５
物質を有効成分とし、これを、外用もしくは経腸または
非経口投与に適した有機または無機担体または賦形剤と
の混合物として含有する固体、半固体または液体形態の
医薬製剤の形で使用できる。該有効成分は、たとえば、
錠剤、ペレット剤、カプセル剤、坐剤、液剤、乳剤、懸
濁剤、注射剤、軟膏剤、リニメント剤（塗布剤）、点眼
液、ロ−ション剤、ゲル剤、クリーム剤、その他使用に
適した任意の形態のための製薬上許容しうる無毒性常用
担体と調合することができる。使用できる担体は、水、
グルコース、ラクトース、アラビアゴム、ゼラチン、マ
ンニトール、デンプンペースト、三珪酸マグネシウム、
タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイドシリカ、
ジャガイモデンプン、尿素、その他の固体、半固体また
は液体形態の製剤の製造に使用するのに適した担体であ
り、これらに加えて、佐剤、安定剤、増粘剤、可溶化
剤、着色剤、香料を添加してもよい。該組成物をヒトに
適用するには、静脈内、筋肉内、局所または経口投与に
よりそれを適用するのが好ましい。ＷＳ７２５４５物質
の治療有効量は処置すべき各個の患者の年齢および状態
により相違もし、それらに依存もするが、処置すべき個
々の患者の場合、通常、静脈内投与の場合は、ヒトの体
重ｋｇ当りＷＳ７２５４５物質０．０１〜１０ｍｇの１
日量を、筋肉内投与の場合は、ヒトの体重ｋｇ当りＷＳ
７２５４５物質０．１〜１０ｍｇの１日量を、経口投与
の場合は、ヒトの体重ｋｇ当りＷＳ７２５４５物質０．
５〜５０ｍｇの１日量を、それぞれ投与して処置する。
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するために示
すものである。

【００１８】実施例１ （１）発酵 コ−ンスターチ（１％）、グルコース（１％）、落花生
粉（０．５％）、大豆粉（０．５％）、乾燥酵母（０．
５％）およびＣａＣＯ₃（０．２％）を含有する水性種
培地（１６０ｍｌ）を３本の１５０ｍｌ三角フラスコの
各々に注入し、１２０℃で３０分間滅菌した。ストレプ
トマイセス エスピーＮｏ．７２５４５の斜面培養から
１白金耳を種フラスコの各々に接種した。フラスコを回
転振盪機上（２２０ｒｐｍ、行程５．１ｃｍ）３０℃で
３日間振盪した。生じた種培養を、スクロース（２
％）、化工デンプン（２％）、グルコース（１％）、小
麦麦芽（２％）、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．０５％）、
ＣａＣＯ₃（０．２％）、アデカノールＬＧ−１０９
（消泡剤、旭電化工業、０．０５％）およびシリコーン
ＫＭ−７０（消泡剤、信越化学工業、０．０５％）から
なる３０ｌジャーファーメンター中の滅菌生産培地２０
ｌに接種した。２０ｌ／分の通気と２００ｒｐｍでの攪
拌とのもとに、３０℃で３日間、発酵を実施した。ＨＰ
ＬＣ分析により、発酵液中での活性化合物の産生をモニ
ターした。 （２）単離 培養液（５０ｌ）をアセトン５０ｌとの間欠攪拌により
抽出した。珪藻土を用いてアセトン抽出液を濾過し、減
圧下で５０ｌに濃縮した。濃縮物をダウエックス１×２
（Ｃｌ^-型、ダウ・ケミカル社）のカラム（６ｌ）に通
した。カラムを水で洗った。流出液（６８ｌ）をダイヤ
イオンＨＰ−２０（三菱化学）のカラム（７ｌ）に吸着
させた。カラムを水で洗ったのち、５０％含水メタノー
ルで溶出した。この溶出液（２５ｌ）を減圧下で濃縮し
て、水溶液（５．５ｌ）とし、ダイヤイオンＨＰ−２０
のカラム（１ｌ）にかけた。カラムを水で洗い、酢酸エ
チルで溶出した。酢酸エチル溶出液（４．５ｌ）を減圧
下で濃縮して、油状残留物を得た。この油状残留物をシ
リカゲル（Ｅ．メルク社製シリカゲル６０、７０−２３
０メッシュ）５０ｍｌと混合し、この混合物をメタノー
ル中にスラリー化した。溶媒を蒸発させたのち、得られ
た乾燥粉末を、ジクロロメタンを用いて充填した同じシ
リカゲル（５００ｍｌ）を用いてのカラムクロマトグラ
フィーに付した。カラムをジクロロメタン（１．５ｌ）
およびジクロロメタン−メタノール混合物（５０：１、
１．５ｌ；３３：１、２ｌ；２５：１、３ｌ；１０：
１、１ｌ）で展開した。目的化合物含有画分（３３：１
〜２５：１、２ｌ）を集め、減圧下で濃縮して、黄色粉
末を得た。この黄色粉末を水２ｌに溶解させ、ダイヤイ
オンＨＰ−２０ＳＳ（三菱化学）を用いたカラムクロマ
トグラフィー（８ｌ）に付した。カラムを水で洗い、５
％含水アセトンで展開した。目的化合物含有画分（１３
ｌ）を集め、蒸発させてアセトンを除去した。この溶液
をＹＭＣゲル（ＯＤＳ−ＡＭ １２０−Ｓ５０、ＹＭＣ
社）のカラム（２ｌ）にかけた。カラムを水で洗い、１
３％含水メタノールで展開した。活性画分を再度ＹＭＣ
ゲル（２ｌ）によるクロマトグラフィーに付し、同じ溶
媒で展開した。溶出体積が４．９ｌ〜５．９ｌの画分
（第一溶出画分）および６．７ｌ；７．９ｌの画分（第
二溶出画分）をそれぞれ集めた。第一溶出画分（１ｌ）
を減圧下で蒸発させてメタノールを除去し、ダイヤイオ
ンＨＰ−２０のカラム（１００ｍｌ）に通した。カラム
を水で洗い、メタノールで溶出した。溶出液（３００ｍ
ｌ）を減圧下で濃縮乾固して、黄色物質８０ｍｇを得
た。この物質をメタノール１ｍｌに溶解させ、シリカゲ
ル（１００ｍｌ）を用いたカラムクロマトグラフィーに
付した。カラムをクロロホルムで洗い、クロロホルム−
メタノール（１００：１）混合物で溶出した。ＷＳ７２
５４５Ｃ物質含有画分を集め、濃縮乾固し、濃縮物を少
量のジクロロメタンに再溶解させ、ｎ−ヘキサンを加え
た。この混合物を濃縮して、ＷＳ７２５４５Ｃ物質２３
ｍｇを黄色粉末として得た。第二溶出画分（１．２ｌ）
を減圧下で濃縮し、凍結乾燥して、淡黄褐色粉末７５０
ｍｇを得た。この粉末（３９ｍｇ）を水７２０μｌに溶
解させ、ＹＭＣ充填カラム（ＯＤＳ−ＡＭ，ＳＨ−３４
３−５ＡＭ，Ｓ−５、２５０×２０ｍｍ内径）による分
取ＨＰＬＣに付した。移動相としては１０％含水メタノ
ールを用い、流速は９．９ｍｌ／分とした。このクロマ
トグラフィーは２０回にわたって実施した。各々の画分
（４５０ｍｌ）を合わせ、減圧下で濃縮して、水溶液と
した。この溶液をダイヤイオンＨＰ−２０のカラム（１
５ｍｌ）に通した。カラムを水で洗い、酢酸エチルで溶
出した。溶出液（１００ｍｌ）を濃縮乾固し、濃縮物を
水に溶解させたのち、凍結乾燥して、ＷＳ７２５４５Ａ
２物質１９．０ｍｇを淡黄色粉末として得た。 （ＨＰＬＣ条件） カラム：ＯＤＳ−ＡＭ−３０２−３（ＹＭＣ、１５０×
４．６ｍｍ内径） 移動相：１０％含水メタノール 流速： １ｍｌ／分 検出： ＵＶ、３２６ｎｍ 保持時間： ＷＳ７２５４５Ａ２物質 １９．４分 ＷＳ７２５４５Ｃ物質 １３．０分 （ＴＬＣ条件） プレート：シリカゲル６０Ｆ２５４（Ｅ．メルク社製） 溶媒系：ジクロロメタン−メタノール（１０：１） Ｒｆ値： ＷＳ７２５４５Ａ２物質 ０．３５ ＷＳ７２５４５Ｃ物質 ０．５４

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＷＳ７２５４５Ａ２物質の赤外吸収スペクト
ル図

【図２】 ＷＳ７２５４５Ａ２物質の¹Ｈ核磁気共鳴ス
ペクトル図

【図３】 ＷＳ７２５４５Ａ２物質の¹³Ｃ核磁気共鳴ス
ペクトル図

【図４】 ＷＳ７２５４５Ｃ物質の赤外吸収スペクトル
図

【図５】 ＷＳ７２５４５Ｃ物質の¹Ｈ核磁気共鳴スペ
クトル図

【図６】 ＷＳ７２５４５Ｃ物質の¹³Ｃ核磁気共鳴スペ
クトル図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 1/06 Ｃ１２Ｒ 1:465）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＷＳ７２５４５Ａ２物質およびＷＳ７２
   ５４５Ｃ物質を包含する、次の物理化学的性質のＷＳ７
   ２５４５物質： ＷＳ７２５４５Ａ２物質： 外観： 淡黄色粉末 分子式： Ｃ₁₄Ｈ₁₅Ｎ₃Ｏ₆ 元素分析： Ｃ₁₄Ｈ₁₅Ｎ₃Ｏ₆・Ｈ₂Ｏとして 計算値： Ｃ４９．５６， Ｈ５．０５， Ｎ１２．３
   ８ 実測値： Ｃ５０．０３， Ｈ４．７１， Ｎ１２．４
   ０ 分子量： ＥＳＩ−ＭＳ： ｍ／ｚ ３２２ （Ｍ＋
   Ｈ）⁺ 融点： ８７−９２℃（分解） 比旋光度： ［α］_D（２３℃）−２３０°（ｃ＝０．
   ５、ジメチルスルホキシド） 紫外吸収スペクトル： λ_max（メタノール）： ２５５，３２５ｎｍ λ_max（メタノール＋ＨＣｌ）： ２５５，３２５ｎｍ λ_max（メタノール＋ＮａＯＨ）： ３３５ｎｍ 溶解性： 可溶： メタノール、ジメチルスルホキシド、水 僅溶： クロロホルム、酢酸エチル 不溶： ｎ−ヘキサン 呈色反応： 陽性： 硫酸第二セリウム反応、沃素蒸気反応 陰性： ニンヒドリン反応、塩化第二鉄反応、モーリッ
   シュ反応 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）： 【数１】 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）： 条件： 移動相：１０％含水メタノール カラム：ＹＭＣ ＯＤＳ ＡＭ−３０２−３^**（１５０
   ×４．６ｍｍ内径） 流速： １ｍｌ／分 検出： ＵＶ、３２６ｎｍ 保持時間：１９．４分^** 商標：山村化学研究所製 赤外スペクトル： νmax （ＫＢｒ）：3430, 3270, 2150, 1710, 1630, 14
   80, 1370, 1250,1190 cm^{-1 1} Ｈ核磁気共鳴スペクトル： (500MHz,DMSO-d₆)δ_H 9.91 (1H,幅広s,交換可能), 6.67 (1H,幅広s,交換可
   能), 5.36 (1H,s,交換可能), 3.74 (1H,d,J=18Hz), 3.3
   6 (1H,d,J=18Hz), 2.90 (1H,q,J=7Hz),2.04 (3H,s), 1.
   18 (3H,s), 0.80 (3H,d,J=7Hz)¹³ Ｃ磁気共鳴スペクトル： (125MHz,DMSO-d₆)δ_C 205.2 (s), 188.8 (s), 175.8 (s), 175.7 (s), 147.9
   (s), 115.7 (s),79.4 (s), 71.3 (s), 70.7 (s), 49.9
   (t), 36.5 (d), 30.1 (q), 25.2(q), 12.6 (q) 本質： 中性物質 ＷＳ７２５４５Ｃ物質： 外観： 黄色粉末 分子式： Ｃ₁₁Ｈ₉Ｎ₃Ｏ₅ 分子量： ＥＳＩ−ＭＳ： ｍ／ｚ ２６４ （Ｍ＋
   Ｈ）⁺ 融点： １０３−１０９℃（分解） 比旋光度： ［α］_D（２３℃）−７２°（ｃ＝０．２
   ５、ジメチルスルホキシド） 紫外吸収スペクトル： λ_max（メタノール）： ２９０，４００ｎｍ λ_max（メタノール＋ＨＣｌ）： ２９０，４００ｎｍ λ_max（メタノール＋ＮａＯＨ）： ２１０，２５３，
   ３２３ｎｍ 溶解性： 可溶： メタノール、ジメチルスルホキシド、水 僅溶： クロロホルム、酢酸エチル 不溶： ｎ−ヘキサン 呈色反応： 陽性： 硫酸第二セリウム反応、沃素蒸気反応 陰性： ニンヒドリン反応、塩化第二鉄反応、モーリッ
   シュ反応 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）： 【数２】 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）： 条件： 移動相：１０％含水メタノール カラム：ＹＭＣ ＯＤＳ ＡＭ−３０２−３^**（１５０
   ×４．６ｍｍ内径） 流速： １ｍｌ／分 検出： ＵＶ、３２６ｎｍ 保持時間：１３．０分^** 商標：山村化学研究所製 赤外スペクトル： νmax （ＫＢｒ）：3480, 3250, 2980, 2150, 1710, 16
   70, 1630, 1470,1460, 1360, 1320, 1280, 1250, 1180
   cm^{-1 1} Ｈ核磁気共鳴スペクトル： (500MHz,DMSO-d₆)δ_H 10.28 (1H,s,交換可能), 5.51 (1H,幅広s,交換可能),
   2.96 (1H,q,J=7Hz),1.23 (3H,s), 0.94 (3H,d,J=7Hz)¹³ Ｃ磁気共鳴スペクトル： (125MHz,DMSO-d₆)δ_C 175.4 (s), 174.2 (s), 172.1 (s), 170.8 (s), 139.5
   (s), 124.9 (s),82.8 (s), 71.2 (s), 37.4 (d), 25.4
   (q), 12.7 (q) 本質： 中性物質
2. 【請求項２】 ストレプトマイセス エスピーＮｏ．７
   ２５４５（ＦＥＲＭＢＰ−５３３８）を栄養培地中で培
   養し、ＷＳ７２５４５物質類を回収することを特徴とす
   るＷＳ７２５４５物質類の製造法。
3. 【請求項３】 ストレプトマイセス エスピーＮｏ．７
   ２５４５（ＦＥＲＭＢＰ−５３３８）の生物学的に純粋
   な菌株。
4. 【請求項４】 ＷＳ７２５４５物質を含有する医薬粗製
   物。
5. 【請求項５】 ＷＳ７２５４５物質を有効成分として含
   有する移植による拒絶反応、骨髄移植による移植片宿主
   相関病、自己免疫疾患および乾癬の治療または予防剤。