CN102317463B - 厌氧微生物发酵生产丁二醇 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过厌氧发酵来生产2，3-丁二醇的方法。根据本发明的具体方法，通过厌氧发酵包含碳水化合物和一氧化碳的基质生产2，3-丁二醇。

Description

厌氧微生物发酵生产丁二醇
技术领域
本发明涉及通过微生物发酵来生产丁二醇，尤其涉及通过微生物发酵包含CO的基质来生产2，3-丁二醇。
背景技术
用于运输的生物燃料是具有吸引力的汽油替代品，作为低浓度的混合物正迅速渗透进燃料市场。生物燃料获自天然植物来源，比来自化石资源的(如汽油)的那些更具有环境可持续性，它们的使用使得释放到大气中的由燃料燃烧产生的所谓化石二氧化碳(CO2)气体水平降低。此外，生物燃料可以在许多地理区域当地生产，能够降低对于进口化石能量资源的依赖。适合作为生物燃料使用的醇包括乙醇、丁醇和2，3-丁二醇。
乙醇正迅速成为世界范围内主要的富含氢的液体运输燃料。2002年全球乙醇消耗量估计108亿加仑。由于在欧洲、日本、美国和几个发展中国家对乙醇的兴趣增加，预计燃料乙醇产业的全球市场也将在未来急剧增长。
丁二醇，包括1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇和2，3-丁二醇，可能被认为具有很多超过乙醇的优势。如乙醇一样，丁二醇可直接用作汽车燃料添加剂。它们也可以比较容易地转换成许多其他潜在的更高价值和/或更高能量的产品。例如，2，3-丁二醇可以经两步加工容易地被转换为八碳二聚体，所述二聚体可用作航空燃料。
2，3-丁二醇多功能性来自其双功能的骨架，即2个羟基位于相邻的C-原子使得分子很容易地转化成如丁二烯、丁二酮(butadione)、乙偶姻、甲基乙基酮等物质。这些化合物被用作制造许多工业工艺的化学品的基础分子。
此外，2，3-丁二醇可以作为内燃机燃料。它与汽油和乙醇比较，在一些方面更类似于汽油。由于对于环境可持续燃料的生产和应用的兴趣增长，对生物方法生产2，3-丁二醇(通常被称为生物丁醇)的兴趣也已增加。
2，3-丁二醇可以通过微生物发酵包含碳水化合物的原料生产(Syu MJ，Appl Microbiol Biotechnol(《应用微生物学与生物技术》)55：10-18(2001)，Qin等人，Chinese J Chem Eng(《中国化学工程学报》)14(1)：132-136(2006))。2，3-丁二醇也可以通过微生物发酵来自农作物(如甜菜、玉米、小麦和甘蔗)的生物质生产。然而，这些碳水化合物原料的成本受其作为人类食品或动物饲料的价格影响，并且栽培用于2，3-丁二醇生产的产生淀粉或蔗糖的作物不是在所有地区都是经济可持续的。因此，开发将较低成本和/或较丰富的碳资源转化为2，3-丁二醇的技术受到人们的关注。
一氧化碳(CO)是诸如煤或石油及石油衍生产品之类的有机物不完全燃烧的主要副产物。虽然包含碳的前体完全燃烧产生CO2和水作为仅有的终产物，但是一些工业工艺需要有利于一氧化碳的累积超过CO2的升高的温度。一个例子是钢铁工业，其中需要高温来产生理想的钢材质量。例如，据报道在澳大利亚钢铁工业每年产生和释放到大气中的CO超过500,000吨。
此外，CO也是合成气的主要成分，其中通过对含碳燃料进行气化而产生不同量的CO和H2。例如，可以通过对于废木材和木料的有机生物质进行裂化产生用于生产燃料和更复杂的化学产品的前体来制备合成气。
CO释放到大气中可能存在严重环境影响。此外，可能被要求支付排放税，增加了工厂的成本。由于CO是一种反应能量丰富的分子，它可以被用作生产许多化学产品的前体化合物。然而，该有价值的原料还未被用来生产2，3-丁二醇。
本发明的目的是提供至少在一定程度上克服上述缺点的生产方法或者至少为公众提供有用的选择。
发明内容
一方面，本发明提供了一种通过微生物发酵含一氧化碳的基质生产丁二醇的方法。在具体实施方式中，本发明提供了一种通过微生物发酵来生产丁二醇的方法，所述方法包括：
a.提供包含CO的基质；
b.在包含一种或更多种微生物培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述基质生产丁二醇。
在某些实施方式中，所述丁二醇是2，3-丁二醇。
另一方面，本发明提供了一种提高发酵生产2，3-丁二醇效率的方法，所述方法包括：
a.提供包含CO的基质；
b.在包含一种或更多种微生物培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述基质生产2，3-丁二醇。
本发明的另一方面，提供了一种通过微生物发酵来生产2，3-丁二醇的方法，所述方法包括：
a.提供基质；
b.在包含一种或更多种微生物培养物的生物反应器中厌氧发酵所述基质，其中的一种或更多种微生物包含一种或更多种2，3-丁二醇脱氢酶基因；
c.上调所述2，3-丁二醇脱氢酶基因，使所述微生物生产2，3-丁二醇。
在具体实施方式中，所述基质包含CO。
在各方面的具体实施方式中，所述包含一氧化碳的基质是包含一氧化碳的气态基质。所述包含一氧化碳的气态基质可作为工业工艺的副产物获得。在某些实施方式中，工业工艺选自黑色金属制品制造业、有色金属制品制造业、石油炼制工艺、生物质气化、煤的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭生产组成的组。在一种实施方式中，所述气态基质包含获自钢铁厂的气体。在另一实施方式中，气态基质包含汽车废气。
在具体的实施方式中，含有CO的基质典型地含有一大部分的CO，例如，按体积计至少约20％到约100％的CO，按体积计40％到95％的CO，按体积计40％到60％的CO，以及按体积计45％至55％的CO。在具体实施方式中，所述基质包含按体积计约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％CO，或约55％CO，或者约60％CO。具有较低浓度(如6％)CO的基质可能也合适，尤其是在H2和CO2也存在时。
各方面的具体实施方式中，以充足的水平提供包含CO的基质，使产生2，3-丁二醇。在具体实施方式中，所提供的CO使得比摄取速率保持在至少0.4mmol/g/min；或者至少0.5mmol/g/min；或者至少0.6mmol/g/min；或者至少0.7mmol/g/min；或者至少0.8mmol/g/min；或者至少0.9mmol/g/min；或者至少1.0mmol/g/min；或者至少1.2mmol/g/min；或者至少1.5mmol/g/min。
在各方面的某些实施方式中，所述方法包括利用产醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)进行的微生物发酵。
另一方面，本发明提供了一种通过微生物发酵来生产2，3-丁二醇的方法，所述方法包括：
a.提供基质；
b.在包括产醇梭菌培养物的生物反应器中厌氧发酵所述基质生产2，3-丁二醇。
在具体的实施方式中，所述基质是一种或更多种碳水化合物，例如果糖。可选择地，所述基质是包含一氧化碳的基质，如前文所述，典型地包含一氧化碳的气态基质。
进一步的方面，本发明提供了一种微生物发酵第一基质和包含CO的第二基质生产丁二醇的方法。优选地，所述丁二醇是2，3-丁二醇。
在具体的实施方式中，所述第一基质是碳水化合物。在某些实施方式中，所述第一基质是果糖。在某些实施方式中，如前文所述，所述第二基质是包含一氧化碳的气态基质。
在具体的实施方式中，所述方法包括下述步骤：
(a)微生物发酵所述第一基质生产2，3丁二醇
(b)微生物发酵所述包含CO的第二基质生产2，3-丁二醇
在某些实施方式中，步骤(a)和(b)可同时进行。可选择地，步骤(a)可以实质上在步骤(b)之前或之后进行。在具体的实施方式中，所述方法可以交替进行步骤(a)和步骤(b)。
本发明进一步的方面，提供了一种依据前述任一方面的方法，其中所述发酵在生物反应器中进行。
本发明进一步的方面，提供了一种依据前述任一方面的方法，其中所述方法进一步包括捕获或回收丁二醇的步骤。
进一步的方面，提供了由前述任何方面的方法生产的丁二醇，优选2，3-丁二醇。
本发明还可以广义地单独地包括本申请的说明书中提到或表明的部分、要素和特征，或集合性包括两个或更多所述部分、要素或特征的任意或全部组合。在本文提到含有本发明涉及的技术领域公知的等同物的特定的整体时，这些已知的等同物被视为并入本文中，如同单个陈述一样。
具体实施方式
以下是概括给出的本发明描述，其中包括优选的实施方式。在下文的“实施例”标题下公开的内容中，进一步举例说明本发明。实施例中提供了支持本发明的实验数据、发明方面的特定实例以及实现本发明的手段。
此处所用的“丁二醇”是指所述二醇的所有结构异构体，包括1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇和2，3-丁二醇及它们的立体异构体。术语“2，3-丁二醇”应解释为包括所述化合物所有消旋、部分立体异构纯和/或实质上立体异构纯形式的光学异构体和非对映异构体形式，包括(R，R)、(S，S)和内消旋形式。
术语“生物反应器”包括由一个或更多个容器和/或塔或管道装置组成的发酵设备，该设备包括连续搅拌槽反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、泡罩塔、气升发酵槽、静止混合器、或适于气-液接触的其他容器或其他设备。正如此后描述的，在一些实施方式中，生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。由此，应当理解，当提及添加基质(例如包含一氧化碳的基质)至生物反应器或发酵反应时，需要时包括添加至这些反应器中的一个或两个。
应当理解，术语“包含一氧化碳的基质”和类似术语包括例如其中一氧化碳可用于一株或更多株细菌生长和/或发酵的任何基质。
“包含一氧化碳的气态基质”包括含有一定水平的一氧化碳的任何气体。气态基质典型地含有一大部分CO，优选地按体积计至少约15％至约95％的CO。
除非上下文需要，否则本文所用的短语“发酵”、“发酵方法”或“发酵反应”以及类似词，意在包括工艺的生长阶段以及产物生物合成阶段。
发明人令人惊讶地证实，可以通过利用产醇梭菌的微生物发酵来生产2，3-丁二醇。他们发现，发酵产物包括许多醇，借此，乙醇和2，3-丁二醇是重要的替代物。2，3-丁二醇过去并未被确定为使用产醇梭菌的发酵产物。具体地，发明人已经确定，产醇梭菌可以用来由包含碳水化合物的基质生产2，3-丁二醇和其他产品。特别是，果糖可以转化成包括乙酸盐、乙醇以及2，3-丁二醇在内的产品。2，3-丁二醇可以通过产醇梭菌由包含CO的基质、特别是包含CO的气态基质生产也得到令人惊讶的证明。在发酵过程中利用气态碳源、特别是包含CO的碳源过去并未曾导致2，3-丁二醇的产生。
在本发明具体的实施方式中，可以通过提供使得生产2，3-丁二醇的充足水平的所述基质来提高2，3-丁二醇生产的效率。已经认识到，提高提供给微生物培养物的基质的量，增加了培养物产生的2，3-丁二醇的量。
在本发明具体的实施方式中，提供使得生产2，3-丁二醇的充足水平的包含CO的基质。已经表明，包含产醇梭菌(C.autoethanogenum)的微生物培养物能够以高达约1.5至2mmol/g干重微生物细胞/min(比CO摄取速率)的速率摄取CO。在本发明具体的实施方式中，提供给包含产醇梭菌的微生物培养物包含CO的基质，使比摄取速率实质维持在或者至少0.4mmol/g/min；或至少0.5mmol/g/min；或至少0.6mmol/g/min；或至少0.7mmol/g/min；或至少0.8mmol/g/min；或至少0.9mmol/g/min；或至少1.0mmol/g/min；或至少1.2mmol/g/min；或至少1.5mmol/g/min。在这些实施方式中，2，3-丁二醇是重要的发酵产品，至少0.5g/L；或至少1g/L；或至少2g/L；或至少5g/L。在具体的实施方式中，以至少0.5g/L/天或至少1g/L/天的速率生产2，3-丁二醇。
在本发明具体的实施方式中，用于实施本发明的方法的装置能够测量和/或控制诸如CO供应、CO摄取、生物质水平、2，3-丁二醇产量之类的参数。例如，可以从生物反应器中取样品来测定一个或更多个上述参数，且任选地调整生物反应器条件以提高2，3-丁二醇产量。比如，在生物反应器中，其中微生物培养物不生产或生产微不足道量的2，3-丁二醇，可以增加CO供应使生产2，3-丁二醇。
一般认为，诸如乙酸盐和乙醇之类的产品是由CO经过乙酰辅酶A循环和THF循环的组合[如Phillips，J.R，等人，1994，Applied Biochemistry andBiotechnology(《应用生物化学和生物技术》)，45/46：145描述]来生产的。然而，令人惊讶地，2，3-丁二醇可以根据本发明所述的方法生产，特别是其中提供CO使得比CO摄取速率保持在至少0.4mmol/g/min；或者至少0.5mmol/g/min；或者至少0.6mmol/g/min；或者至少0.7mmol/g/min；或者至少0.8mmol/g/min；或者至少0.9mmol/g/min；或者至少1.0mmol/g/min；或者至少1.2mmol/g/min；或者至少1.5mmol/g/min。不希望被理论约束，认为通过提供足够的或升高的水平的CO，在发酵过程中能产生较高的能量产品，如2，3-丁二醇。认为，诸如2，3-丁二醇之类的产物前体用作电子受体，减轻微生物细胞NAD(P)H形式的过剩的还原能力，由此恢复有利的NAD(P)：NAD(P)H平衡。进一步认为，培养物发酵的碳水化合物也可以通过相似的方式转化为2，3-丁二醇。
已经推断性鉴定了产醇梭菌中的下述基因：[α]-乙酰乳酸合成酶(ALS)，[α]-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)和2，3-丁二醇脱氢酶(2，3BDH)。推测的产醇梭菌(菌株保藏在DSMZ，保藏编号为19630)2，3-丁二醇脱氢酶基因(ORF 1283)显示出与诺维氏梭菌(Clostridium novyi)(NT01CX 0344)2，3BDH的高度同源性，73％的氨基酸同一性(262/357)，84％阳性(300/357)。ORF 1283还显示出与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YdjL(bdhA)基因显著的同源性(47％氨基酸同一性，63％阳性且3e-89的E-值。LZ1560的ORF 1283是2，3BDH的进一步证据来自与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)2，3BDH(YAL060W)的同源性(E＝2e-53)。
不希望被理论约束，认为2，3-丁二醇以如下方式产生自丙酮酸(产生自乙酰辅酶A的合成代谢中间产物)：
丙酮酸-→[α]-乙酰乳酸-→乙偶姻-→2，3-丁二醇
ALS    ALDC    2，3BDH
对产醇梭菌中2，3-丁二醇脱氢酶的实时PCR研究表明，在产生大量2，3-丁二醇的培养物中该酶实质上上调。因此，2，3-丁二醇脱氢酶可按照本发明的方法上调。例如，当以足够水平提供CO时，2，3-丁二醇脱氢酶上调。特别地，当提供CO使得微生物培养物的比CO摄取速率至少0.4mmol/g/min；或者至少0.5mmol/g/min；或者至少0.6mmol/g/min；或者至少0.7mmol/g/min；或者至少0.8mmol/g/min；或者至少0.9mmol/g/min；或者至少1.0mmol/g/min；或者至少1.2mmol/g/min；或者至少1.5mmol/g/min；2，3-丁二醇脱氢酶上调。因此，本发明提供了一种通过上调2，3-丁二醇脱氢酶而微生物发酵基质生产2，3-丁二醇的方法。
发明人进一步证明不同基质，例如碳水化合物基质和包含CO的气态基质，在微生物生产2，3-丁二醇过程中能够被切换，而无有害的影响。此外，他们预计基质能够被更替(例如，一种基质不可用时)，并能够继续生产2，3-丁二醇。
根据得到的结果，在本发明的一种实施方式中，通过微生物发酵包含碳水化合物的基质生产2，3-丁二醇。在本发明的另一实施方式中，包含一氧化碳的基质，优选包含CO的气态基质，被产醇梭菌转化为包括2，3-丁二醇在内的多种产品。
本发明进一步的实施方式中，包含碳水化合物(优选果糖)的第一基质可以被用在发酵反应的起始阶段，所述基质被完全耗尽后，基质能够被切换成包含CO的第二基质。另外，发明人惊讶地确定，在包含碳水化合物的第一基质作为唯一碳源的起始阶段产生2，3-丁二醇，并且在包含CO的基质作为唯一碳源的后期也产生2，3-丁二醇。
发明人证实2，3-丁二醇在许多条件下生产，包括培养基中含有可选择的缓冲液，如乙酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。发明人还提出，在pH不加控制且可以变化的实施方式中，仍然生产2，3-丁二醇。适于进行理想的发酵的培养基实例描述在此后的实施例部分。
发明人预期这些方法生产的2，3-丁二醇可以利用本领域已知的分离技术容易地回收。此外，2，3-丁二醇可以容易地转化成诸如丁二烯、丁二酮、乙偶姻、甲基乙基酮等之类的物质。这些化合物是用于制造大部分化工产品的有价值的基础分子。因此，发明人预计，本文所披露的方法中生产的2，3-丁二醇可以用于制造许多众所周知的工业产品。
在此，就本发明利用产醇梭菌和/或生产2，3-丁二醇的优选实施方式，概括地描述本发明。但是，应该明白，可选的微生物可以取代产醇梭菌。类似地，所述方法可用于生产和回收除了2，3-丁二醇外的丁二醇。相应地，除非上下文需要，提及“2，3-丁二醇”可被一般术语“丁二醇”取代。
方法
一种实施方式中，本发明提供了一种通过微生物发酵来生产丁二醇的方法。在一种优选的实施方式中，所述方法至少包括厌氧发酵包含CO的基质、优选包含CO的气态基质而获得2，3-丁二醇的步骤。
在本发明的一种具体实施方式中，所述方法包括下述步骤：
(a)提供包含CO的基质，优选包含CO的气态基质；
(b)在包含一种或更多种微生物培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述基质生产2，3-丁二醇。
在另一实施方式中，本发明提供了一种提高通过发酵生产2，3-丁二醇的效率的方法，所述方法包括：
(a)提供包含CO的基质；
(b)在包含一种或更多种微生物培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述基质生产2，3-丁二醇。
在具体的实施方式中，以足够生产大量2，3-丁二醇的水平提供所述包含CO的基质，例如至少0.5g/L发酵培养基，或至少1g/L，或至少2g/L，或至少5g/L。某些实施方式中，以足够产生2，3-丁二醇的水平以至少0.5g/L/天或至少1g/L/天的速率提供CO。在具体的实施方式中，提供CO使得比摄取速率保持在至少0.4mmol/g/min；或者至少0.5mmol/g/min；或者至少0.6mmol/g/min；或者至少0.7mmol/g/min；或者至少0.8mmol/g/min；或者至少0.9mmol/g/min；或者至少1.0mmol/g/min；或者至少1.2mmol/g/min；或者至少1.5mmol/g/min。本领域技术人员应该知晓提供CO、特别是气态CO的方法，以达到需要的摄取率。然而，通过举例的方式，诸如增加发酵培养基中气体滞留量之类的因素将增加被微生物培养物转化为产物的可利用的CO量。气体滞留量能够典型地通过机械手段提高，如提高CSTR中的搅拌速度。此外，以较快的速率或较高的分压提供CO也将增加发酵液中CO的可用性。
在另一实施方式中，所述方法包括通过产醇梭菌发酵包含碳水化合物的基质生产丁二醇，优选地，2，3-丁二醇。
在另一实施方式中，所述方法包括下述步骤：
(a)微生物发酵所述第一基质生产2，3-丁二醇；
(b)微生物发酵所述包含CO的第二基质生产2，3-丁二醇。
在某些实施方式中，所述第一基质是碳水化合物，在某些实施方式中，所述基质是果糖。优选地，所述第二基质是包含CO的气态基质。在具体实施方式中，步骤(a)和(b)可同时进行。可选择地，步骤(a)可以实质上在步骤(b)之前或之后进行。优选地，所述方法可以交替进行步骤(a)和(b)。
在本发明某些实施方式中，所述方法进一步包括捕获或回收产生的2，3-丁二醇的步骤。
微生物
在本发明的实施方式中，用于发酵的一种或更多种微生物是产醇梭菌。在一种优选的实施方式中，所述产醇梭菌是具有在德国生物材料资源中心(DSMZ)储藏的储藏编号19630菌株的鉴定特征的产醇梭菌。在另一实施方式中，所述产醇梭菌是具有DSMZ储藏编号为DSMZ10061的鉴定特征的产醇梭菌。
培养用在本发明的方法中的细菌可以采用本领域已知的任何用厌氧细菌培养和发酵基质的方法进行。示例性的技术在本申请文件“实施例”部分提供。通过进一步的举例的方式，可以使用在下列文章中概述的那些利用气态基质发酵的方法：K.T.Klasson，M.D.Ackerson，E.C.Clausen以及J.L Gaddy(1991).Bioreactors for synthesis gas fermentations resources(合成气体发酵源用生物反应器).Conservation and Recycling(《转化和循环》)，5；145-165；K.T.Klasson，M.D.Ackerson，E.C.Clausen以及J.L.Gaddy(1991).Bioreactordesign for synthesis gas fermentations(用于合成气体发酵的生物反应器设计).Fuel(《燃料》).70.605-614；K.T.Klasson，M.D.Ackerson，E.C.Clausen以及J.L Gaddy(1992).Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels(合成气体向液体或气体燃料的生物转化).Enzyme and Microbial Technology(《酶和微生物技术》).14；602-608；J.L Vega，G.M.Antorrena，E.C.Clausen以及J.L Gaddy(1989).Study ofGaseous Substrate Fermentation(气态基质发酵研究)：Carbon Monoxide Conversion to Acetate(一氧化碳转化成乙酸盐).2.Continuous Culture(连续培养).Biotech.Bioeng(《生物技术与工程》).34.6.785-793；J.L.Vega，E.C.Clausen以及J.L Gaddy(1989).Study of gaseoussubstrate fermentations(气态基质发酵研究)：Carbon monoxide conversion toacetate(一氧化碳转化为乙酸盐).1.Batch culture(分批培养).Biotechnologyand Bioengineering(《生物技术与工程》).34.6.774-784；和J.L Vega，E.C.Clausen以及J.L Gaddy(1990).Design of Bioreactors for Coal Synthesis GasFermentations(用于煤合成气体发酵的生物反应器设计).Resources，Conservation and Recycling(《资源、转化和再循环》).3.149-160。在包含碳水化合物的基质上培养细菌的方法也是本领域众所周知的。
基质
本发明的一种实施方式中，利用产醇梭菌微生物发酵包含碳水化合物的基质生产2，3-丁二醇。应当理解的是，现有技术中有许多适于发酵的碳水化合物的例子，和许多用于发酵碳水化合物基质的各类型方法的实例。通过举例的方式，合适的基质可包括，但不限于，诸如葡萄糖和果糖之类的单糖，诸如蔗糖或乳糖之类的寡糖，诸如纤维素或淀粉之类的多糖。虽然预计任何这些碳水化合物基质(及其混合物)适用于本发明，优选的碳水化合物基质是果糖和蔗糖(及其混合物)。
本领域技术人员应当理解，可发酵的糖可以通过例如US20070031918描述的预处理和糖化方法从纤维素的生物质和木质纤维的生物质中获得。生物质指任何纤维素或木质纤维材料，包括包含纤维素的材料和任选地进一步包含半纤维素、木质素、淀粉、寡糖和/或单糖的材料。生物质包括但不限于生物能源作物、农业残余物、市政固体废物、工业固体废物、纸生产的淤泥、庭园废物、木材和森林废物。然而，在本发明示例性的实施方式中，用市场上可获得的果糖作为发酵碳源和能量来源。
在一种具体实施方式中，包含一氧化碳的基质、优选包含一氧化碳的气态基质用于本发明的方法。所述气态基质可以是作为工业工艺的副产物获得的废气，或者获自其他一些来源，如内燃机(如汽车)废气。在某些实施方式中，工业工艺选自黑色金属制品制造业(如钢铁厂)、有色金属制品制造业、石油炼制过程、煤的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭生产组成的组。在这些实施方式中，包含CO的气体可以在其排放到大气之前使用任何方便的方法从工业工艺捕获。根据包含一氧化碳的气态基质的组合物，在将其引入发酵之前进行处理以去除诸如尘埃颗粒之类任何不受欢迎的杂质也是有利的。例如，可利用已知的方法进行过滤或净化气态基质。
在本发明的其他实施方式中，所述包含一氧化碳的气态基质可来自生物质的气化。所述气化方法包括限量供给空气或氧气的条件下生物质的部分燃烧。得到的气体典型地主要包括CO和H2，和很小体积的CO2、甲烷、乙烯和乙烷。例如，在诸如甘蔗的糖、或玉米或谷物的淀粉之类的食品材料的提取和加工过程中获得的生物质副产物，或者由森林产业生成的非食品生物质废物，可被气化以制备适合用于本发明的含CO气体。
所述含CO的基质典型地包含一大部分的CO，例如按体积计至少约20％至约100％的CO，按体积计40％至95％的CO，按体积计40％至60％的CO，和按体积计45％至55％的CO。在具体实施方式中，所述基质包含按体积计约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％、或约55％或约60％的CO。具备较低浓度(如6％)CO的基质可能也合适，尤其是当H2和CO2也存在时。
在具体的实施方式中，以足以进行2，3-丁二醇生产的水平提供CO。在具体的实施方式中，提供CO使得比CO摄取速率保持在至少0.4mmol/g/min；或者至少0.5mmol/g/min；或者至少0.6mmol/g/min；或者至少0.7mmol/g/min；或者至少0.8mmol/g/min；或者至少0.9mmol/g/min；或者至少1.0mmol/g/min；或者至少1.2mmol/g/min；或者至少1.5mmol/g/min。本领域技术人员应该知晓提供CO、特别是气态CO的方法，以达到需要的摄取率。然而，通过举例的方式，诸如提高发酵培养基中气体滞留量之类的因素，将增加被微生物培养物转化为产物的可利用的CO量。本领域技术人员应该知晓提高气体滞留量的方法。然而，通过非限制性举例，气态滞留量典型地通过机械手段提高，如提高CSTR中的搅拌速度。此外，以较快的速率或较高的分压提供CO也将提高发酵液中的CO可利用量。
气态基质包含任何的氢气虽然没有必要，但是不认为其对2，3-丁二醇的生产不利。气态基质也可包含一些CO2，例如按体积计约1％至约80％，或按体积计1％至约30％。在一种实施方式中，其包含按体积计约5％至约10％体积。在另一实施方式中，所述气态基质包含按体积计约20％的CO2。
典型地，以气态将一氧化碳加入发酵反应。然而，本发明不应被认为是限于以这种状态加入基质。例如，可以以液体提供一氧化碳。例如，可以使用包含一氧化碳的气体饱和液体，然后将该液体加入生物反应器。这可采用标准方法实现。通过举例的方式，微泡分布发生器(Hensirisak等人，Scale-upofmicrobubble dispersion generator for aerobic fermentation(微泡分布发生器用于需氧发酵的放大试验；Applied Biochemistry and Biotechnology(《应用生物 化学和生物技术》)，第101卷，Number 3/October，2002)可被使用。
在本发明的一种实施方式中，发明人确定2，3-丁二醇可以通过发酵第一基质和第二基质生产。在本发明的一种具体实施方式中，2，3-丁二醇将在提供第一基质(如诸如果糖之类的碳水化合物)以及第二基质(优选包含CO的基质)时生产。
在进一步的实施方式中，发明人确定2，3-丁二醇由第一基质产生，当完全耗尽时，所述第一基质可被第二基质取代，继续产生2，3-丁二醇。在一种具体实施方式中，所述第一基质是果糖，当果糖完全耗尽时，可提供包含CO的基质。发明人惊讶地发现，2，3-丁二醇继续产生。发明人进一步预期，如果需要，所述第一基质和所述第二基质可以被替换。例如，如果第一基质不可用时，可以利用可选择的基质直至所述第一基质的可利用量提高。
培养基
应当理解，为了进行细菌生长和基质到丁二醇的发酵，除基质外，还需将合适的营养培养基加入生物反应器。营养培养基将含有诸如维生素和矿物质之类足以容许所使用的微生物生长的组分。适合产醇梭菌生长的厌氧培养基在本领域是公知的，例如Abrini等人，(Clostridium autoehtanogenum，sp.Nov.，An Anaerobic Bacterium That Produces Ethanol From Carbon Monoxide(产醇梭菌新种---种由一氧化碳产生乙醇的厌氧菌)；Archives ofMicrobiology 161，第345-351页(1994)(《微生物学文献集》，第161期，345-351页(1994))描述的。此后的“实施例”部分提供了合适培养基的进一步实例。
发酵条件
应当在进行基质到丁二醇发酵的合适条件下理想地进行发酵。应当考虑的反应条件包括温度、培养基流速、pH值、培养基氧化还原电位、搅拌速度(如果使用连续搅拌槽反应器)、接种物水平、最大基质浓度，以及确保基质水平不会成为限制的将基质引入生物反应器的速率，和避免产物抑制作用的最高产物浓度。WO2007/117157、WO2008/115080、WO2009/022925和WO2009/064200中详细描述了适合厌氧发酵包含CO的基质的发酵条件的实例，它们公开的内容在此通过引用并入本文。认识到，根据本发明的方法能够容易地改变其中报道的发酵条件。
发明人确定，在一种pH未控制的实施方式中，未看出对2，3-丁二醇生产的有害影响。
生物反应器
发酵反应可以在如本文之前描述的任何合适的生物反应器中进行。在本发明的一些实施方式中，所述生物反应器可以包含在其中培养微生物的第一生长反应器，和第二发酵反应器，来自所述生长反应器的发酵液被供给到该第二发酵反应器，且其中产生大部分的发酵产物(比如2，3-丁二醇)。
产物回收
发酵将得到营养培养基中包含需要的产品(例如丁二醇)和/或一种或更多种副产物(例如乙醇、乙酸盐和丁酸盐)以及细菌细胞的发酵液。在一种优选的实施方式中，发酵产物包括2，3-丁二醇。
2，3-丁二醇，或包含2，3-丁二醇和一种或更多种其他醇的混合醇流，可以通过本领域公知的方法从发酵液中回收，所述方法如分馏或蒸发、渗透汽化、萃取发酵。诸如包括乙酸盐和丁酸盐的酸类副产物也可以用本领域公知的方法从发酵液中回收。例如，可以使用包含活性炭过滤器的吸收体系或电渗析。
在本发明的某些实施方式中，从发酵液回收2，3-丁二醇和副产物通过下述步骤连续进行：从生物反应器中去除部分发酵液、从发酵液(如通过过滤方便地)分离微生物细胞以及从发酵液回收2，3-丁二醇和任选其他醇和酸。醇可以通过例如蒸馏方便地回收，酸可以通过例如活性炭吸附回收。优选地将分离出的微生物细胞返回发酵生物反应器中。还优选将醇和酸去除之后剩下的无细胞渗透液返回发酵生物反应器中。在返回生物反应器之前，可加入另外的营养素(例如维生素B)至无细胞渗透液中，以补充营养培养基。
另外，如果在回收2，3-丁二醇和/或副产物过程中调整发酵液的pH，在返回生物反应器之前，应该将pH重新调整到与发酵生物反应器中的发酵液相似的pH。
在此将结合下列非限制性的实施例更详细地描述本发明。
实施例
材料和方法
Na2Sx的制备
在500ml烧瓶中装入Na2S(93.7g，0.39mol)和200ml水。搅拌溶液直至盐溶解，在恒定N2流下加入硫(25g，0.1mol)。室温搅拌2小时后，将现在的清澈红棕色液体“Na2Sx”溶液(就[Na]来说约4M，就硫来说约5M)转入经N2清洗的血清瓶中，用铝箔包裹。
Cr(II)溶液的制备
将1L的三颈烧瓶配上气密的入口和出口，使在惰性气体下工作和随后转移所需产物到合适的存储烧瓶。将烧瓶装入CrCl3.6H20(40g，0.15mol)、锌粒[20目](18.3g，0.28mol)、汞(13.55g，1mL，0.0676mol)和500mL蒸馏水。在用N2冲扫1小时之后，将混合物加热到约80℃来启动反应。在恒定的N2流下搅拌两小时后，将混合物冷却至室温，再不断搅拌48小时，此时反应混合物变成深蓝溶液。将溶液转入N2清洗的血清瓶中，在冰箱中保存备用。
细菌
所用产醇梭菌是储藏在德国生物材料资源中心(DSMZ)、分派的保藏编号为19630的菌株。
取样和分析过程：
发酵过程中每隔一段时间从发酵反应器(例如CSTR或血清瓶)中采集培养基样品。每次采集培养基样品时小心确保没有气体进入或逸出反应器。
HPLC：
安捷伦(Agilent)1100系列HPLC系统。流动相：0.0025N硫酸。流量和压力：0.800mL/min。柱：奥特奇(Alltech)IOA；目录#9648，150×6.5mm，粒径5μm。柱温：60℃。检测器：折射率。检测器温度：45℃。
样品制备方法：
将400μL的样品和50μL 0.15M的ZnSO4和50μL的0.15M Ba(OH)2加进Eppendorf管。所述管在12，000rpm、4℃离心10min。转移200μL上清液到HPLC样品瓶，注入5μL到HPLC仪。
顶空分析：
测试在安装双通道的瓦里安(Varian)CP-4900微型气相色谱仪(GC)上进行。通道1是10米分子筛柱，在70℃、200kPa氩气和4.2s反冲时间下运行，而通道2是10米PPQ柱，在90℃、150kPa氦以及无反冲下运行。两个通道进样器温度均为70℃。运行时间设置为120秒，但所有感兴趣的峰通常会在100秒前洗脱。通过计算每克细胞(干重-见下文)的CO消耗，测定比CO摄取速率。
细胞密度：
通过计数限定等份发酵液中的细菌细胞，来测定细胞密度。可选择地，测定样品在600nm(分光光度计)的吸光度并且根据发表的方法计算来确定干重。
金属硫化物溶液1：
将约950mL溶液A转入1L发酵罐，且用氮气喷射。加入H3PO4(85％溶液，1.5ml)，用浓NH4OH(水制)调整pH到5.3。添加刃天青(1ml 2g/L的溶液)，并用N2喷射溶液。加入氯化铬(II)，直到溶液氧化还原电位(ORP)下降到约-150mV。在加入多硫化钠(1.44mL的4.3M溶液或1mL的6M溶液)前，加入10×溶液C，且用N2喷射溶液。
实施例1A：发酵生产2，3-丁二醇
在CSTR反应器中经两周的时间使用产醇梭菌对基质进行发酵转化，并定期监测。用于CSTR实验的培养基根据表E中列出的组分制备。磷酸盐混合物由0.65mM Na2HPO4和15.3mM NaH2PO4组成。将所有其余组分(如磷酸、铵盐和半胱氨酸-盐酸盐)均混合入800ml水中，然后将缓冲盐加入溶液。使用该方法进行确保pH升高到超过约6.5，避免培养基组分沉淀。将溶液稀释至1L，并通过加热至沸腾且在恒定的N2气流下使其冷却至室温，把溶液制成厌氧的。一旦冷却，将溶液调节至最终pH 5.3，加入维生素B。在整个实验中均要保持厌氧性。向基础培养基配方中加入碳水化合物(5g/L果糖)。将培养基溶液引入发酵罐，并从实验开始或在预定的时间间隔之后任选地用相应的包含CO的气体喷射。在这些实验过程中，通过加入NaOH水溶液控制pH值，使其保持在5.5。将正活跃生长的产醇梭菌培养物以5％(v/v)水平接种入反应器。反应器的温度保持在37℃，搅拌速率为400rpm。
结果：
起初，含有果糖作为基质的发酵，产生了乙酸、乙醇和2，3-丁二醇。一段时间后，果糖被耗尽，将包含CO的气流(95％CO、5％CO2)喷射进培养基。使培养基保持pH 5.5(表1)。应当指出，即使碳水化合物已被耗尽，上述产物的浓度仍增加，这清楚地表明，CO用来生产包括2，3-丁二醇在内的产品。表1：在CSTR反应器中，随着时间推移监控2，3-丁二醇、乙醇和乙酸盐(以g/L表示浓度)产量。
时间\小时 果糖 乙酸 乙醇 2，3-丁二醇
0 5 0 0 0
23 5 0.123 0.018 0
45 3.8 0.579 0.167 0.05
110 0 4.753 2.8 1.2
185 0 7.2 3.8 1.9
324 0 6.736 4.9 1.91
实施例1B：发酵生产2，3-丁二醇
在进一步的实验中，在CSTR反应器中经10天时间进行产醇梭菌对基质的转化，并定期监测。在该实例中以实施例1A的方式准备发酵罐和培养基，但是基质只是持续喷射的模拟的钢铁厂气体(70％CO，1％H2，14％N2，15％CO2)，且培养基的pH值保持在5.5不变(表2)。再次转化基质产生乙酸、乙醇和2，3-丁二醇，表明即使在发酵起始时不存在碳水化合物基质的条件下，也产生了乙酸、乙醇和2，3-丁二醇。
表2：在CSTR分批反应器中，随着时间推移监控2，3-丁二醇、乙醇和乙酸盐(以g/L表示浓度)产量。
时间\天 乙酸 乙醇 2，3-丁二醇
0 0 0 0
6 4.5 0.5 0
10 5 4 0.5
实施例2：发酵生产2，3-丁二醇
在进一步的实验中，在CSTR反应器中经3天时间进行产醇梭菌对基质的转化，并定期监测。在该实例中以实施例1A描述的方式准备发酵罐和培养基，但是基质是持续喷射的模拟的钢铁厂气体(70％CO，1％H2，14％N2，15％CO2)和果糖(10g/L)，且培养基的pH值保持在5.5不变(表3)。再次转化基质产生乙酸、乙醇和2，3-丁二醇。
表3：在CSTR分批反应器中，随着时间推移监控2，3-丁二醇、乙醇和乙酸盐(以g/L表示浓度)产量。
时间\小时 果糖 乙酸 乙醇 2，3-丁二醇
0 10 0 0 0
15 9.8 0.8 0.2 0.05
23 8.87 1.7 0.7 0.2
39 5.3 3.7 2.3 0.9
69 1.8 7.3 4 3.1
在每次实验结束时，还比较实施例1A、1B和2概述的发酵罐实验的乙酸盐、乙醇和2，3-丁二醇终浓度(注意，这些结果涉及在表1-3中测定的终浓度，并总结在表4中以比较)。
表4：在CSTR反应器中利用可选择的基质生产2，3-丁二醇的实例，对每个实验总结测定。结果以g/L给出。
实施例3：发酵生产2，3-丁二醇
为了确定培养基条件可以如何影响2，3-丁二醇生产，准备了装有培养基的血清瓶，培养基中包括一选择的缓冲液，并且在实验结束分析发酵产物(表5)。培养在密封的234ml血清瓶中进行，每个血清瓶含有50ml上文描述的培养基(表E)，任选地，使用乙酸盐缓冲液(0.02M)或柠檬酸盐缓冲液(0.02M)缓冲，调节至pH 5.3。每个血清瓶的184ml顶空起初是N2，接着用95％CO、5％CO2或者70％CO、15％CO2、14％N2、1％H2充至30psi超压。每个瓶接种2ml产醇梭菌培养物。使用摇床，并且反应温度保持在37℃。
再次，显然，2，3-丁二醇生产与实验中采用的缓冲液无关。此外，还应当注意，由于未控制血清瓶pH，产物看起来也在有限(或无)控制的pH下产生。
表5：各种培养基中2，3-丁二醇产生的实例。分析活跃生长后，即几天(4至7天)后细胞质量不再增加的血清瓶培养基。结果以g/L给出。
实施例4：CSTR中分批发酵
将约1.3L溶液A转入2L发酵罐，且用氮气喷射。加入刃天青(1.35mL2g/L溶液)。加入H3PO4(85％溶液，2.025ml)，用浓NH4OH(水制)调整pH到5.3。加入氯化铬(II)，直到溶液氧化还原电位下降到约-150mV。加入多硫化钠(6.07ml的4.3M溶液)，用浓HCl调节pH至5.5。该溶液用N2喷射1小时，然后加入金属硫化物溶液1(150ml)和溶液B(15ml)。该溶液用N2、继而含有CO的气体(3％H2；30％N2；47％CO；20％CO2)喷射，然后接种约5％(v/v)水平的活跃生长的产醇梭菌培养物。调整气流速率，确保微生物培养不受CO限制，以保持高的比CO摄取速率。发酵结果表示在表6中。
表6：分批培养中变化的比CO摄取速率下2，3-丁二醇产率。
7.5天时间的总2，3-丁二醇积累为约7.5g/L。认识到，在较低的比CO摄取速率下，2，3-丁二醇以低水平生产。然而，当提供气体使所述CO摄取率保持超过0.4mmol/g/min时，2，3-丁二醇产率显著提高。在这个例子中，比CO摄取速率在几天时间内保持在平均0.8mmol/g/min，1，3-丁二醇以超过1g/L的速率生产。
实施例5：在CSTR中分批发酵
将约1.3L溶液A转入2L发酵罐，且用氮气喷射。加入H3PO4(85％溶液，2.025ml，30mM)，用浓NH4OH(水制)调整pH到5.3。加入溶液B(13.5ml)，且所述溶液用N2喷射。加入氯化铬(II)，直到溶液的氧化还原电位下降到约-150mV。加入刃天青(1.35mL的2g/L溶液)。加入多硫化钠(2.85ml的6M溶液)，所述溶液用N2喷射12小时，然后切换到含有CO的气体(1％H2；14％N2；70％CO；15％CO2)喷射。用浓HCl调节pH至5.5，然后加入金属硫化物溶液1(150ml)。所述溶液用包含CO的气体再喷射30min，然后接种约5％(v/v)水平的活跃生长的产醇梭菌培养物。再次调整气流速率，确保微生物培养不受CO限制，以保持高的比CO摄取速率。发酵结果表示在表7中。
表7：分批培养中变化的比CO摄取速率下2，3-丁二醇产率。
约6天后，总2，3-丁二醇为5g/L。再一次，升高的比CO摄取速率导致明显较高的至少0.5g/L/天的2，3-丁二醇产率。
实施例6：CSTR中分批发酵
将约1.3L溶液A转入1.5L发酵罐，且用氮气喷射。加入H3PO4(85％溶液，2.25ml)，用浓NH4OH(水制)调节pH至5.3。加入溶液B(15ml)，且所述溶液用N2喷射。加入氯化铬(II)，直到溶液氧化还原电位下降到约-150mV。加入刃天青(1.5mL的2g/L溶液)。加入多硫化钠(1.5ml的3M溶液)，所述溶液用N2喷射1小时。加入0.1M FeCl2(3.75mL)、CoCl2(1.875mL)、NiCl2(1.875mL)、H3BO3(0.375m1)、Na2MoO4(0.375ml)、MnCl2(0.375ml)、Na2WO4(0.375ml)和ZnCl2(0.1875ml)溶液，所述溶液用含有CO的气体(50％H2；32％CO；4％CO2；32％CH4)喷射。用浓HCl调节pH至5.5，然后加入溶液C(150ml)。所述溶液用含有CO的气体再喷射30min，然后接种约5％(v/v)水平的活跃生长的产醇梭菌培养物。调整气流速率，以确保微生物培养不受CO限制，以保持高的比CO摄取速率。发酵结果表示在表8中。
表8：分批培养中变化的比CO摄取速率下2，3-丁二醇产率。
4天后，总2，3-丁二醇浓度约3g/L。尽管达到的速率低于先前的发酵(实施例4和5)，但基质流包括大部分氢气。结果表明，当使用混合的CO/H2基质时，产生2，3-丁二醇。
实施例7：在连续搅拌槽反应器中连续发酵
培养基如下所述在pH 5.5制备。溶液D中除半胱氨酸-HCl之外的所有成分均混合入400ml蒸馏水中。通过加热至沸腾并在95％CO、5％CO2恒定气流下冷却至室温，将所述溶液制成厌氧的。一旦冷却，加入半胱氨酸-HCl，调节溶液的pH至5.5，而后定容至1000ml；在整个实验过程中均要保持厌氧性。
在5L生物反应器内装入4.9L如上所述制备的LM33培养基。在大气压下将气体切换成含CO的气体(1％H2；14％N2；70％CO；15％CO2)，而后接种100ml的产醇梭菌培养物。在培养的初始阶段，生物反应器保持在37℃，在200rpm搅拌。在生长期，将搅拌增加至400rpm。将pH调节至5.5并通过自动添加5M NaOH保持。向生物反应器中不断添加进新鲜的厌氧培养基，以保持生物反应器中限定的生物质和乙酸盐水平。2，3-丁二醇产率特别表示在表9中。
表9：连续培养中2，3-丁二醇的产率。
天 平均CO摄取(mmol/g/min) 平均2，3-丁二醇产生速率
1-87 0.3 ＜0.1g/L/天
90-92 0.6 1.2g/L/天
93-95 0.4 0.87g/L/天
在连续运行的起初89天内，发酵罐是在CO受限的条件下运行，产生很少量的2，3-丁二醇。然而，在第88天左右，气体流量增加，使得比CO摄取速率增加。该阶段，2，3-丁二醇产率显著增加到至少1.2g/L/天。在第92天左右，气体流量减少，使培养物比CO摄取速率降低到0.4mmol/g/min左右，2，3-丁二醇产率也下降。但是，即使在平均比摄取速率约0.4mmol/g/min时，2，3-丁二醇产率至少保持在0.5g/L/天。
实施例8：在CSTR中分批发酵
将约1.3L溶液A转入2L发酵罐，且用氮气喷射。加入H3PO4(85％溶液，1.5ml)，用浓NH4OH(水制)调整pH到5.3。加入溶液B(1.5ml)，且所述溶液用N2喷射。加入氯化铬(II)，直到溶液氧化还原电位下降到约-150mV。加入多硫化钠(1ml的3M溶液)，所述溶液用N2喷射12小时。加入0.1M FeCl2(3.75mL)、CoCl2(1.875mL)、NiCl2(1.875mL)、H3BO3(0.375ml)、Na2MoO4(0.375ml)、MnCl2(0.375ml)、Na2WO4(0.375ml)和ZnCl2(0.2ml)溶液，所述溶液用含有CO的气体(1％H2；14％N2；70％CO；15％CO2)喷射。
加入刃天青(1mL的2g/L溶液)。用浓HCl调节pH至5.5，并且溶液用含有CO的气体再喷射30min，然后接种约5％(v/v)水平的活跃生长的产醇梭菌培养物。表10显示了运行约2周后发酵罐中积累的2，3-丁二醇产量。已对于培养物存活力校正了比CO摄取速率。培养物存活力用WO2009/022925中描述的方法确定，该文献在此通过引用并入本文。
表10：分批发酵14天后2，3-丁二醇积累
经第13-14天24小时的时间，比CO摄取速率保持在约0.5mmol/g/min且2，3-丁二醇产率是0.6g/L/天。
实施例9：LZ1560中2，3-丁二醇生产的基因调节
从三个发酵中取样以确定2，3-丁二醇生产过程中的基因表达量。一个样品取自实施例8描述的分批发酵的第13天，其中正在生产包括乙醇和2，3-丁二醇的产物。所述样品在随后的结果中被记作R12。第二个样品取自生产乙醇和2，3-丁二醇的分批发酵。在结果中该样品被记作R11。第三个样品(R2)取自实施例7描述的类似条件下进行的连续发酵的第1-89天。微生物培养物是CO受限的，且发酵液具有浓度稳定的约13g/L的乙酸盐、浓度少于1g/L的乙醇和微量的2，3-丁二醇。用实时PCR来确定相对于R2，基因是上调还是下调。
RNA提取和cDNA合成过程：
用Aurum总RNA脂肪和纤维组织试剂盒(Biorad)从约2.5×109细菌细胞中分离总RNA。柱上的DNA酶(DNase)用无RNA酶的DNA酶试剂盒(Biorad)消化。使用分光光度计定量总RNA且确定其纯度(通过A260/280比率测定)，然后用iScript选择型cDNA合成试剂盒(Biorad)合成cDNA。
实时PCR过程：
利用免费软件Primer3基于LanzaTech内部所有的基因组序列设计实时PCR引物。实时PCR反应混合物含有12.52×SYBR绿色PCR主混合物(SYBR Green PCR Master Mix，Biorad)、1.5μL各1μM正向和反向引物、5μL10×稀释的cDNA模板，和无菌水，总体积达到25μL。将所述混合物加热至95℃3min，接着40循环的95℃15秒、55℃15秒和72℃30秒。为检测引物的二聚作用或扩增的其他人工产物，实时PCR完成后，立即进行熔解曲线分析(1℃/秒速度下58℃至95℃，38个循环)。所有反应均一式三份进行。基因表达的定量采用MyiQ单色实时PCR检测系统(Biorad)进行，实时数据用iQ5光学系统软件(Biorad)分析。
结果：
实时PCR分析产生的原始Ct值，连同相对基因表达量和标准误差，列于表11。选定RNA聚合酶β链(rpoB)作为规范基因表达量的参照基因。采用借助比较ΔCT法的相对定量来计算2，3BDH相对基因表达量。在所有分析中，产乙酸盐培养物(R2)被选作校准品(参考标准)。
表11：自原始Ct数据推导相对基因表达量值。相对表达量通过rpoB规范且用反应器2校准。SE＝平均值的标准误差。(任何超过1的相对表达量表示上调)
该研究中的实时PCR数据显示，与产乙酸培养物(R2)相比，产溶剂培养物(R11/R12)中2，3-丁二醇基因表达量明显较高。R12的微生物培养物，在细胞收获时约产生0.6g/L/天的2，3-丁二醇，相对于R2，显示出最高的基因上调(7.64±0.8倍)。接着是R11，具有4.75±1.8倍的基因上调，细胞收获时，其具有1.53g/L的2，3-丁二醇总产量。
图1显示了三个发酵罐(R11、R12和R2)中2，3-丁二醇脱氢酶(2，3BDH)的相对基因表达量。选择生产乙酸盐的R2作为校准品，并且将rpoB基因用作参照基因来规范基因表达量。误差条＝平均值的标准误差。N＝3。显然，在产生2，3-丁二醇的微生物培养物中，2，3-丁二醇脱氢酶是上调的。R2中微生物培养物的比CO摄取速率约0.3mmol/g/min，而R12中培养物的比摄取速率约0.6mmol/g/min。增加提供给培养物的CO的量导致CO摄取增加和随之2，3-丁二醇脱氢酶基因表达量增加。2，3-丁二醇脱氢酶基因表达量的增加导致2，3-丁二醇总产率提高。
为了使读者在使用适当的实验法的情况下实施本发明，已就某些优选实施方式描述了本发明。本领域技术人员应当理解，本发明除了具体描述的方式之外，还可以适用于变形和修改。应当理解的是，本发明包括所有这些变形和修改。进一步地，名称、标题等部分是为了加强读者对本文的理解，不应被看作对本发明范围的限定。
上下文引用的所有申请、专利以及出版物的全部公开内容(如果有的话)在此通过引用并入本文。
在说明书中对任何现有技术的引用，并非且也不应当被看做是对于下述内容的承认或任何形式的暗示：即，现有技术组成了美国或世界上任何国家的公知常识的一部分。
纵观整个说明书和权利要求书，除非上下文需要，否则，词语“包含”，“包括”以及类似词，应解释为包含的含义而非排除的含义，也就是说，意思为“包括，但不限于”。

Claims (13)

1.一种通过微生物发酵包含CO的气态基质来生产丁二醇的方法，所述方法包括：
a.提供所述包含CO的气态基质至生物反应器；
b.在包含一种或更多种微生物培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述包含CO的基质来生产丁二醇；其中提供所述包含CO的气态基质使得所述培养物的比CO摄取速率保持在至少0.4mmol CO/克细菌细胞干重/分钟，其中所述一种或更多种微生物是产醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述丁二醇是2,3-丁二醇。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中提供所述基质使比摄取速率保持在至少0.6mmol CO/g/min。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中提供所述基质使比摄取速率保持在至少0.8mmol CO/g/min。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中提供所述基质使比摄取速率保持在至少1.0mmol CO/g/min。
6.一种通过微生物发酵包含CO的基质来生产2,3-丁二醇的方法，所述方法包括：
a.提供包含CO的气态基质至生物反应器；
b.在包含一种或更多种微生物培养物的生物反应器中厌氧发酵所述包含CO的气态基质，其中所述一种或更多种微生物包含一种或更多种2,3-丁二醇脱氢酶基因，并且其中一种或更多种微生物是产醇梭菌；
c.上调所述2,3-丁二醇脱氢酶基因，使所述微生物生产2,3-丁二醇。
7.根据权利要求6所述的方法，其中通过以下方式上调所述2,3-丁二醇脱氢酶基因：提供所述包含CO的基质使所述培养物的比CO摄取速率保持至少0.4mmol CO/克细菌细胞干重/分钟。
8.根据权利要求1或6所述的方法，其中所述包含CO的气态基质包含按体积计至少15％到100％的CO。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述包含CO的基质包含作为副产物获自工业工艺的气体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述包含CO的基质包含获自钢铁厂的气体。
11.根据权利要求1或6所述的方法，其中所述产醇梭菌具有以保藏号DSM19630保藏于德国生物材料资源中心(DSMZ)的产醇梭菌菌株的限定特征。
12.根据权利要求2或6所述的方法，其中2,3-丁二醇是以高于0.2g/L/天的生产率生产。
13.根据权利要求1所述的方法，其中乙醇是作为所述发酵的副产物产生。
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