ES2824838T3

ES2824838T3 - Producción de butanodiol por fermentación microbiana anaerobia

Info

Publication number: ES2824838T3
Application number: ES09762723T
Authority: ES
Inventors: Sean Simpson; Phuong Tran; Christophe Mihalcea; Jennifer Fung; Fungmin Liew
Original assignee: Lanzatech New Zealand Ltd
Current assignee: Lanzatech NZ Inc
Priority date: 2008-06-09
Filing date: 2009-06-05
Publication date: 2021-05-13
Anticipated expiration: 2029-06-05
Also published as: CA2727549A1; EP2307556B1; PT2307556T; EA201071379A1; JP2011522563A; KR101643429B1; CN102317463A; AU2009258344B2; AU2009258344A1; KR20110033193A; ZA201008795B; JP5618995B2; US8658408B2; EP2307556A4; CN102317463B; CA2727549C; EP2307556A1; WO2009151342A1; EA018720B1; US20130177955A1

Abstract

Un método para producir 2,3-butanodiol por fermentación microbiana de un sustrato gaseoso que comprende CO, comprendiendo el método: a. proporcionar el sustrato gaseoso que comprende CO a un biorreactor; y b. fermentar anaerobiamente el sustrato que comprende CO en el biorreactor, comprendiendo el biorreactor un cultivo de Clostridium autoethanogenum para producir 2,3-butanodiol; en donde el sustrato gaseoso que comprende CO se proporciona de manera que el cultivo mantenga una tasa específica de absorción de CO de al menos 0,4 mmol de CO/gramo de peso de células secas de bacterias/minuto, y el 2,3-butanodiol se produzca a una productividad mayor que 0,5 g/l/por día.

Description

DESCRIPCIÓN

Producción de butanodiol por fermentación microbiana anaerobia

Campo

La presente invención se refiere a la producción de butanodiol por fermentación microbiana, particularmente a la producción de 2,3-butanodiol por fermentación microbiana de sustratos que comprenden CO.

Antecedentes

Los biocombustibles para transporte son sustitutos atractivos de la gasolina y se están introduciendo rápidamente en los mercados de combustibles como mezclas de baja concentración. Los biocombustibles, derivados de fuentes vegetales naturales, son más ecológicamente sostenibles que los derivados de los recursos fósiles (tales como gasolina), su uso permite una reducción en los niveles del denominado gas de dióxido de carbono (CO2) fósil, que se libera a la atmósfera como resultado de la combustión del combustible. Además, los biocombustibles se pueden producir localmente en muchas zonas geográficas y pueden actuar para reducir la dependencia de los recursos energéticos fósiles importados. Los alcoholes adecuados para su uso como biocombustibles incluyen etanol, butanol y 2,3-butanodiol.

El etanol se está convirtiendo rápidamente en un importante combustible de transporte líquido rico en hidrógeno en todo el mundo. El consumo mundial de etanol en 2002 fue de aproximadamente 40,9 millones de metros cúbicos (10,8 mil millones de galones). También se espera que el mercado global de la industria del etanol como combustible crezca considerablemente en el futuro, debido a un mayor interés en el etanol en Europa, Japón, Estados Unidos y diversas naciones en desarrollo.

Los butanodioles, incluido 1,2-butanodiol, 1,3-butanodiol, 1,4-butanodiol y el 2,3-butanodiol se puede considerar que tienen una diversidad de ventajas sobre el etanol. Al igual que el etanol, los butanodioles pueden usarse directamente como un aditivo de combustible para automóviles. También pueden transformarse con relativa facilidad en diversos otros productos de valor posiblemente más alto y/o de mayor energía. Por ejemplo, el 2,3-butanodiol puede convertirse fácilmente, mediante un proceso de dos etapas, en un dímero de ocho carbonos que puede utilizarse como combustible de aviación.

La versatilidad del 2,3-butanodiol proviene de su estructura principal difuncional, es decir, 2 grupos hidroxilo se encuentran en átomos de C adyacentes permitiendo que la molécula se transforme muy fácilmente en sustancias tales como butadieno, butadiona, acetoína, metiletil cetona etc. Estos compuestos químicos se utilizan como moléculas base para fabricar una amplia gama de productos químicos producidos industrialmente.

Además, el 2,3-butanodiol puede usarse como combustible en un motor de combustión interna. En muchos sentidos, es más similar a la gasolina que al etanol. Como el interés en la producción y aplicación de combustibles ecológicamente sostenibles se ha fortalecido, ha aumentado el interés en los procesos biológicos para producir 2,3-butanodiol (a menudo denominado biobutanol).

El 2,3-butanodiol se puede producir mediante fermentación microbiana de materia prima que contiene carbohidratos (Syu MJ, Appl Microbiol Biotechnol 55: 10-18 (2001), Qjn et al., Chinese J Chem Eng 14(1): 132-136 (2006)). El 2,3-butanodiol también puede producirse por fermentación microbiana de biomasa de cultivos tales como remolacha azucarera, maíz, trigo y caña de azúcar. Sin embargo, el coste de estas materias primas de carbohidratos depende de su valor como alimento humano o animal y el cultivo de plantas productoras de almidón o sacarosa para la producción de 2,3-butanodiol no es económicamente sostenible en todas las zonas geográficas. Por tanto, es interesante desarrollar tecnologías para convertir los recursos de carbono de bajo coste y/o más abundantes en 2,3-butanodiol.

El monóxido de carbono (CO) es un subproducto importante de la combustión incompleta de materiales orgánicos tales como carbón o petróleo y productos derivados del petróleo. Aunque la combustión completa de precursores que contienen carbono produce CO²y agua como únicos productos finales, algunos procesos industriales necesitan temperaturas elevadas que favorezcan la acumulación de monóxido de carbono sobre CO². Un ejemplo es la industria del acero, donde se necesitan altas temperaturas para generar las calidades de acero deseadas. Por ejemplo, se informa que la industria del acero en Australia produce y libera a la atmósfera más de 500.000 toneladas de CO anualmente.

Adicionalmente, el CO también es un componente principal del gas de síntesis, donde se generan cantidades variables de CO y H²por gasificación de un combustible que contiene carbono. Por ejemplo, el gas de síntesis puede producirse mediante el craqueo de la biomasa orgánica de maderas de desecho y de madera para generar precursores para la producción de combustibles y productos químicos más complejos.

La liberación de CO a la atmósfera puede tener un impacto medioambiental significativo. Además, se puede exigir el pago de impuestos sobre las emisiones, lo que aumenta los costes para las plantas industriales. Dado que el CO es una molécula rica en energía reactiva, se puede utilizar como compuesto precursor para la producción de una diversidad de productos químicos. Sin embargo, esta valiosa materia prima no se ha utilizado para producir 2,3-butanodiol.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un sistema de proceso y fermentación que sirva, al menos de alguna manera, para superar las desventajas anteriores, o al menos proporcionar al público una opción útil.

Declaración de invención

En un aspecto, la invención proporciona un método para producir 2,3-butanodiol por fermentación microbiana de un sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono, comprendiendo el método:

a. proporcionar el sustrato gaseoso que comprende CO a un biorreactor; y

b. fermentar anaerobiamente el sustrato que comprende CO en el biorreactor, comprendiendo el biorreactor un cultivo de Clostridium autoethanogenum para producir 2,3-butanodiol;

en donde el sustrato gaseoso que comprende CO se proporciona de manera que el cultivo mantenga una tasa específica de absorción de CO de al menos 0,4 mmol de CO/gramo de peso de células secas de bacterias/minuto, y el 2,3-butanodiol se produzca a una productividad mayor que 0,5 g/l/por día.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para producir 2,3-butanodiol por fermentación microbiana de un sustrato gaseoso que comprende CO, comprendiendo el método:

a. proporcionar un sustrato gaseoso que comprende CO a un biorreactor,

b. fermentar anaerobiamente el sustrato gaseoso que comprende CO en el biorreactor, comprendiendo el biorreactor un cultivo de uno o más microorganismos, en donde el uno o más microorganismos incluye uno o más genes de 2,3-butanodiol deshidrogenasa; y

c. regular al alza el gen o genes de la 2,3-butanodiol deshidrogenasa proporcionando el sustrato gaseoso que comprende CO de manera que el cultivo mantenga una tasa específica de absorción de CO de al menos 0,4 mmol de CO/gramo de peso de células secas de bacterias/minuto, y el 2,3-butanodiol se produzca a una productividad mayor que 0,5 g/l/día.

El sustrato que comprende monóxido de carbono es un sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono. El sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono se puede obtener como subproducto de un proceso industrial. En ciertas realizaciones, el proceso industrial se selecciona del grupo que consiste en la fabricación de productos de metales ferrosos, fabricación de productos no ferrosos, procesos de refinado de petróleo, gasificación de biomasa, gasificación de carbón, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbono, producción de amoniaco, producción de metanol y fabricación de coque. En una realización, el sustrato gaseoso comprende un gas obtenido de una acería. En otra realización, el sustrato gaseoso comprende humos de escape de automóviles. En realizaciones particulares, el sustrato que contiene CO normalmente contendrá una proporción importante de CO, tal como de al menos 20 % a 100 % de CO en volumen, de 40 % a 95 % de CO en volumen, de 40 % a 60 % de CO en volumen y de 45 % a 55 % de CO en volumen. En realizaciones particulares, el sustrato comprende aproximadamente el 25 %, o aproximadamente el 30 %, o aproximadamente el 35 %, o aproximadamente el 40 %, o aproximadamente el 45 %, o aproximadamente el 50 % de CO, o aproximadamente el 55 % de CO o aproximadamente el 60 % de CO en volumen. Los sustratos que tienen concentraciones más bajas de CO, tales como el 6 %, también pueden ser apropiados, particularmente cuando también están presentes H2 y CO2.

El sustrato gaseoso que comprende CO se proporciona a un nivel suficiente, de manera que se produzca 2,3-butanodiol. En particular, el CO se proporciona de manera que se mantenga una tasa de absorción específica de al menos 0,4 mmol/g/min; o al menos 0,5 mmol/g/min; o al menos 0,6 mmol/g/min; o al menos 0,7 mmol/g/min; o al menos 0,8 mmol/g/min; o al menos 0,9 mmol/g/min; o al menos 1,0 mmol/g/min; o al menos 1,2 mmol/g/min; o al menos 1,5 mmol/g/min.

El método comprende la fermentación microbiana usando Clostridium autoethanogenum.

En un aspecto, el método de la invención implica producir 2,3-butanodiol por fermentación microbiana de un primer sustrato y un segundo sustrato gaseoso que comprende CO. En realizaciones particulares, el primer sustrato es un carbohidrato. En ciertas realizaciones, el primer sustrato es fructosa. En estas realizaciones, el segundo sustrato es un sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono, como se ha descrito anteriormente en el presente documento. En realizaciones particulares, el método incluye las etapas de:

(a) fermentación microbiana del primer sustrato en un biorreactor para producir 2,3-butanodiol

(b) fermentación microbiana del segundo sustrato en un biorreactor que comprende CO para producir 2,3-butanodiol.

En ciertas realizaciones, las etapas (a) y (b) pueden realizarse al mismo tiempo. Como alternativa, la etapa (a) puede preceder o seguir sustancialmente a la etapa (b). En realizaciones particulares, el método puede alternar entre la etapa (a) y la etapa (b).

El butanodiol, típicamente 2,3-butanodiol, producido por un método de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, puede ser capturado o recuperado.

Descripción detallada de la invención

La siguiente es una descripción de la presente invención, que incluye realizaciones preferidas de la misma, dada en términos generales. La invención se ejemplifica adicionalmente en la divulgación dada bajo el título "Ejemplos" a continuación en el presente documento, que proporciona datos experimentales que respaldan la invención, ejemplos específicos de aspectos de la invención y medios para realizar la invención.

Como se usa en el presente documento, "butanodiol" se refiere a todos los isómeros estructurales del diol, incluyendo 1,2-butanodiol, 1,3-butanodiol, 1,4-butanodiol y 2,3-butanodiol y estereoisómeros de los mismos. Debe interpretarse que la expresión "2,3-butanodiol" incluye todas las formas enantioméricas y diastereoméricas del compuesto, incluyendo formas (R,R), (S,S) y meso, en formas racémicas, parcialmente estereoisoméricamente puras y/o sustancialmente estereoisoméricamente puras.

El término "biorreactor" incluye un dispositivo de fermentación que consiste en uno o más recipientes y/o torres o tuberías, que incluye el reactor de tanque agitado de flujo continuo (CSTR, Continuous Stirred Tank Reactor), el reactor de células inmovilizadas (ICR, Immobilized Cell Reactor), el reactor de lecho percolador (TBR, Trickle Bed Reactor), la columna de burbujeo, el fermentador de elevación de gases, el mezclador estático u otro recipiente u otro dispositivo adecuado para el contacto gas-líquido. Como se describe más adelante en el presente documento, en algunas realizaciones el biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento y un segundo reactor de fermentación. Como tal, cuando se hace referencia a la adición de un sustrato, por ejemplo, un sustrato que comprende monóxido de carbono, al biorreactor o a la reacción de fermentación, debe entenderse que incluye la adición a uno o a ambos de estos reactores cuando sea apropiado.

Debe entenderse que la expresión "sustrato que comprende monóxido de carbono" y expresiones similares, incluyen cualquier sustrato en el que una o más cepas de bacterias disponen de monóxido de carbono para su crecimiento y/o fermentación, por ejemplo.

Los "sustratos gaseosos que comprenden monóxido de carbono" incluyen cualquier gas que contenga un nivel de monóxido de carbono. El sustrato gaseoso contendrá normalmente una proporción importante de CO, preferentemente, un porcentaje de al menos 15 % a 95 % de CO en volumen.

A menos que el contexto requiera lo contrario, las frases "fermentando", "proceso de fermentación" o "reacción de fermentación" y similares, como se usa en el presente documento, pretenden abarcar tanto la fase de crecimiento como la fase de biosíntesis de producto del proceso.

Los inventores han demostrado, sorprendentemente, que el 2,3-butanodiol se puede producir mediante fermentación microbiana utilizando Clostridium autoethanogenum. Han descubierto que los productos de fermentación incluyen una diversidad de alcoholes, por lo que el etanol y el 2,3-butanodiol son sustituyentes significativos. El 2,3-butanodiol no se ha identificado previamente como un producto de fermentación utilizando Clostridium autoethanogenum. En particular, los inventores han determinado que se puede usar Clostridium autoethanogenum para producir 2,3-butanodiol y otros productos a partir de un sustrato que comprende carbohidratos. En particular, la fructosa se puede convertir en productos que incluyen acetato, etanol y 2,3-butanodiol. También se ha demostrado sorprendentemente que el 2,3-butanodiol puede ser producido por Clostridium autoethanogenum a partir de sustratos que comprenden C^o, particularmente sustratos gaseosos que comprenden CO. El uso de una fuente de carbono gaseoso, particularmente una fuente que incluye CO, en los procesos de fermentación no ha dado lugar previamente a la producción de 2,3-butanodiol.

La eficacia de la producción de 2,3-butanodiol puede aumentarse proporcionando el sustrato a un nivel suficiente para que se produzca 2,3-butanodiol. Se ha reconocido que aumentar la cantidad de sustrato proporcionado a un cultivo microbiano, aumenta la cantidad de 2,3-butanodiol producido por el cultivo.

El sustrato que comprende CO se proporciona a un nivel suficiente para que se produzca 2,3-butanodiol. Se ha demostrado que un cultivo microbiano que comprende C.autoethanogenum puede absorber CO a una tasa de hasta aproximadamente 1,5 a 2 mmol/gramo de células microbianas de peso seco/minuto (absorción específica de CO). Se proporciona un sustrato que comprende CO al cultivo microbiano que comprende C.autoethanogenum de manera que se mantenga una absorción específica sustancialmente a o al menos 0,4 mmol/g/min; o al menos 0,5 mmol/g/min; o al menos 0,6 mmol/g/min; o al menos 0,7 mmol/g/min; o al menos 0,8 mmol/g/min; o al menos 0,9 mmol/g/min; o al menos 1,0 mmol/g/min; o al menos 1,2 mmol/g/min; o al menos 1,5 mmol/g/min. El 2,3 butanodiol es un producto de fermentación importante de al menos 0,5 g/l; o al menos 1 g/l; o al menos 2 g/l; o al menos 5 g/l. En particular, el 2,3-butanodiol se produce a una velocidad de al menos 0,5 g/l/día; o al menos 1 g/l/día. En realizaciones particulares de la invención, los aparatos utilizados para realizar los métodos de la invención permiten la medición y/o el control de parámetros tales como suministro de CO, absorción de CO, nivel de biomasa, producción de 2,3-butanodiol. Por ejemplo, se pueden tomar muestras de un biorreactor para determinar uno o más de los parámetros anteriores y las condiciones del biorreactor se pueden ajustar opcionalmente para mejorar la producción de 2,3-butanodioi. Por ejemplo, en un biorreactor, en donde el cultivo microbiano no produce o produce cantidades insignificantes de 2,3-butanodiol, el suministro de CO puede aumentarse de modo que se produzca 2,3-butanodiol.

Se acepta que productos tales como acetato y etanol se producen a partir de CO mediante una combinación del ciclo acetil-CoA y el ciclo THF como se describe en Phillips, J. R, et al, 1994, Applied Biochemistry and Biotechnology, 45/46: 145. Sin embargo, de conformidad con el procedimiento de la presente invención, se ha demostrado sorprendentemente que se puede producir 2,3-butanodiol cuando se proporciona CO de manera que se mantengan tasas específicas de absorción de CO de al menos 0,4 mmol/g/min; o al menos 0,5 mmol/g/min; o al menos 0,6 mmol/g/min; o al menos 0,7 mmol/g/min; o al menos 0,8 mmol/g/min; o al menos 0,9 mmol/g/min; o al menos 1,0 mmol/g/min; o al menos 1,2 mmol/g/min; o al menos 1,5 mmol/g/min. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se considera que al proporcionar niveles suficientes o elevados de CO, se pueden producir productos de mayor energía, tales como 2,3-butanodiol, durante la fermentación. Se considera que los precursores de productos, tales como 2,3-butanodiol actúan como aceptores de electrones para aliviar a la célula microbiana del exceso de poder reductor, en forma de NAD(P)H, restaurando así un equilibrio favorable NAD(P):NAD(P)H. Además, se considera que los carbohidratos fermentados por el cultivo también se pueden convertir en 2,3-butanodiol de manera similar.

Los siguientes genes han sido supuestamente identificados en C.autoethanogenum: a-acetolactato sintasa (ALS), aacetolactato descarboxilasa (ALDC) y 2,3-butanodiol deshidrogenasa (2,3BDH). El supuesto gen de la 2,3-butanodiol deshidrogenasa (ORF 1283) de C.autoethanogenum (cepa depositada en DSMZ con el número de acceso 19630) muestra una fuerte homología con el 2,3BDH de Clostridium novyi (IMT01CX_0344) con identidades de aminoácidos del 73 % (262/357) y positivos del 84 % (300/357). ORF 1283 también muestra una homología significativa con el gen YdjL (bdhA) de Bacillus subtilis (47 % de identidades de aminoácidos, 63 % de positivos y valor E de 3e-89. Evidencia adicional de que el ORF 1283 de LZ1560 es 2,3BDH proviene de la homología con 2,3BDH (YAL060W) de Saccharomyces cerevisiae (E = 2e-53).

Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se considera que el 2,3-butanodiol se produce a partir del piruvato (un intermedio en el anabolismo producido a partir de acetil CoA) de la siguiente manera:

Piruvato -> a-acetolactato -> acetoína -> 2,3-butanodiol

ALS ALDC 2,3BDH

Estudios de PCR en tiempo real de 2,3-butanodiol deshidrogenasa en C.autoethanogenum, indican que está sustancialmente regulado al alza en cultivos donde se producen cantidades significativas de 2,3-butanodiol. Por lo tanto, la 2,3-butanodiol deshidrogenasa puede regularse al alza de conformidad con los métodos de la invención. Por ejemplo, donde se suministra CO a niveles suficientes, la 2,3-butanodiol deshidrogenasa está regulada al alza. En particular, donde se suministra CO de manera que la absorción específica de CO por el cultivo microbiano sea al menos 0,4 mmol/g/min; o al menos 0,5 mmol/g/min; o al menos 0,6 mmol/g/min; o al menos 0,7 mmol/g/min; o al menos 0,8 mmol/g/min; o al menos 0,9 mmol/g/min; o al menos 1,0 mmol/g/min; o al menos 1,2 mmol/g/min; o al menos 1,5 mmol/g/min; la 2,3-butanodiol deshidrogenasa está regulada al alza. Como tal, la invención proporciona un método para producir 2,3-butanodiol por fermentación microbiana de un sustrato por regulación al alza de 2,3-butanodiol deshidrogenasa.

Los inventores han demostrado además que diferentes sustratos, tales como un sustrato de carbohidratos y un sustrato gaseoso que comprende CO, se pueden intercambiar durante la producción microbiana de 2,3-butanodiol, sin efecto deletéreo. Además, contemplan que se podrían alternar sustratos, por ejemplo, cuando un sustrato no está disponible y se continuaría produciendo 2,3-butanodiol.

De conformidad con los resultados obtenidos, en una realización de la invención, el 2,3-butanodiol se produce por fermentación microbiana de un sustrato que comprende carbohidrato. En otra realización de la invención, un sustrato gaseoso que comprende CO, se convierte en diversos productos, incluido el 2,3-butanodiol, mediante Clostridium autoethanogenum.

En una realización adicional de la invención, se puede usar un primer sustrato que comprende carbohidrato (preferentemente fructosa) en las etapas iniciales de la reacción de fermentación y después del consumo completo del sustrato, el sustrato se puede cambiar a un segundo sustrato gaseoso que comprende CO. De nuevo, los inventores han determinado sorprendentemente que el 2,3-butanodiol se produce en las etapas iniciales donde el primer sustrato que comprende carbohidrato es la única fuente de carbono y también se produce en las últimas etapas donde el sustrato gaseoso que comprende CO es la única fuente de carbono.

Los inventores han demostrado que el 2,3-butanodiol se produce en diversas condiciones, incluyendo medios que contienen soluciones tampón alternativas como tampón acetato y tampón citrato. Los inventores también afirman que en las realizaciones en las que el pH no está controlado y puede ser variable, todavía se produce 2,3-butanodiol. En la sección de ejemplos a continuación en el presente documento se describen ejemplos de medios adecuados para realizar la fermentación deseada.

Los inventores contemplan que el 2,3-butanodiol producido en tales procesos se puede recuperar fácilmente usando técnicas de separación conocidas en la técnica. Adicionalmente, el 2,3-butanodiol se puede convertir fácilmente en sustancias tales como butadieno, butadiona, acetoína, metiletilcetona y similares. Tales compuestos químicos son moléculas de base valiosas que se utilizan para fabricar un porcentaje significativo de todos los productos de la industria química. Por tanto, los inventores contemplan que el 2,3-butanodiol producido en los procesos divulgados en el presente documento se puede usar en la fabricación de una amplia gama de productos industriales bien conocidos.

Método

La invención proporciona un método para la producción de 2,3-butanodiol por fermentación microbiana. En una realización, el método comprende al menos la etapa de fermentar anaerobiamente un sustrato gaseoso que comprende CO, para obtener 2,3-butanodiol.

En una realización particular de la invención, el método comprende las etapas de:

(a) proporcionar el sustrato gaseoso que comprende CO a un biorreactor; y

(b) fermentar anaerobiamente el sustrato que comprende CO en el biorreactor, comprendiendo el biorreactor un cultivo de Clostridium autoethanogenum para producir 2,3-butanodiol;

en donde el sustrato gaseoso que comprende CO se proporciona de manera que el cultivo mantenga una tasa específica de absorción de CO de al menos 0,4 mmol de CO/gramo de peso de células secas de bacterias/minuto, y el 2,3-butanodiol se produzca a una productividad mayor que 0,5 g/l/por día. También se divulga en el presente documento un método para aumentar la eficiencia de la producción de 2,3-butanodiol por fermentación, comprendiendo el método:

(a) proporcionar un sustrato que comprende CO;

(b) en un biorreactor que contiene un cultivo de uno o más microorganismos, fermentar anaerobiamente el sustrato para producir 2,3-butanodiol.

En realizaciones particulares, el sustrato que comprende CO se proporciona a un nivel suficiente para producir cantidades significativas de 2,3-butanodiol, tales como al menos 0,5 g/l de medio de fermentación, o al menos 1 g/l, o al menos 2 g/l, o al menos 5 g/l. Se proporciona CO a un nivel suficiente para producir 2,3-butanodiol a una velocidad de al menos 0,5 g/l/día; o al menos 1 g/l/día. el CO se proporciona de manera que se mantenga una tasa de absorción específica de al menos 0,4 mmol/g/min; o al menos 0,5 mmol/g/min; o al menos 0,6 mmol/g/min; o al menos 0,7 mmol/g/min; o al menos 0,8 mmol/g/min; o al menos 0,9 mmol/g/min; o al menos 1,0 mmol/g/min; o al menos 1,2 mmol/g/min; o al menos 1,5 mmol/g/min. Los expertos en la materia apreciarán los métodos de suministro de CO, particularmente CO gaseoso, de manera que se logre la tasa de absorción requerida. Sin embargo, a modo de ejemplo, factores tales como el aumento de la retención de gas en un medio de fermentación aumentarán la cantidad de CO disponible para la conversión en productos mediante el cultivo microbiano. La retención de gas normalmente se puede aumentar por medios mecánicos, tal como aumentar la agitación en un CSTR. Adicionalmente, el suministro de CO a una velocidad más rápida o una presión parcial más alta también aumentará la disponibilidad de CO en un caldo de fermentación.

En otra realización, el método comprende:

a. proporcionar un sustrato gaseoso que comprende CO a un biorreactor,

El método puede incluir las etapas de:

(a) fermentación microbiana del primer sustrato para producir 2,3-butanodiol

(b) fermentación microbiana del segundo sustrato gaseoso que comprende CO para producir 2,3-butanodiol. En ciertas realizaciones, el primer sustrato es carbohidrato y en algunas realizaciones, el sustrato es fructosa. El segundo sustrato es un sustrato gaseoso que comprende Co . En realizaciones particulares, las etapas (a) y (b) pueden realizarse al mismo tiempo. Como alternativa, la etapa (a) puede preceder o seguir sustancialmente a la etapa (b). Preferentemente, el método puede alternar entre la etapa (a) y la etapa (b).

El método puede incluir además la etapa de capturar o recuperar el 2,3-butanodiol producido.

Microorganismos

En la invención, el uno o más microorganismos utilizados en la fermentación es Clostridium autoethanogenum. En una realización preferida Clostridium autoethanogenum es un Clostridium autoethanogenum que tiene las características de identificación de la cepa depositadas en el Centro Alemán de Recursos para Material Biológico (DSMZ) con el número de depósito de identificación 19630. En otra realización Clostridium autoethanogenum es un Clostridium autoethanogenum que tiene las características de identificación DSMZ con el número de depósito DSMZ 10061.

El cultivo de las bacterias que se utilizan en un método de la invención, puede realizarse utilizando cualquiera de los diversos procesos conocidos en la técnica para cultivar y fermentar sustratos utilizando bacterias anaerobias. Se proporcionan técnicas ejemplares en la sección de "Ejemplos" de este documento. A modo de ejemplo adicional, pueden utilizarse los procesos descritos, en líneas generales, en los siguientes artículos, en los que se utilizan sustratos gaseosos para la fermentación: KT Klasson, MD Ackerson, EC Clausen y J. L Gaddy (1991). Bioreactors for synthesis gas fermentations resources. Conservation and Recycling, 5; 145-165; KT Klasson, MD Ackerson, EC Clausen y JL Gaddy (1991). Bioreactor design for synthesis gas fermentations. Fuel. 70. 605-614; KT Klasson, MD Ackerson, EC Clausen y J. L Gaddy (1992). Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels. Enzyme and Microbial Technology. 14; 602-608; J. L Vega, GM Antorrena, EC Clausen y J. L Gaddy (1989). Study of Gaseous Substrate Fermentation: Carbon Monoxide Conversion to Acetate. 2. Continuous Culture. Biotech. Bioeng. 34. ⁶.

785-793; JL Vega, EC Clausen y J. L Gaddy (1989). Study of gaseous substrate fermentations: Carbon monoxide conversion to acetate. 1. Batch culture. Biotechnology and Bioengineering. 34. ⁶.774-784; y, J. L Vega, EC Clausen y J. L Gaddy (1990). Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations. Resources, Conservation and Recycling. 3. 149-160. Los métodos para cultivar bacterias en sustratos que comprenden carbohidratos también son bien conocidos en la técnica.

Sustratos

En una realización de la invención, el 2,3-butanodiol se produce por fermentación microbiana de un sustrato que comprende tanto CO como carbohidratos usando Clostridium autoethanogenum. Se apreciará que existen muchos ejemplos de carbohidratos adecuados para la fermentación conocidos en la técnica y muchos ejemplos de los tipos de procesos usados para fermentar el sustrato de carbohidratos. A modo de ejemplo, los sustratos adecuados pueden incluir, aunque sin limitación, monosacáridos tales como glucosa y fructosa, oligosacáridos tales como sacarosa o lactosa, polisacáridos, tales como celulosa o almidón. Aunque se contempla que cualquiera de estos sustratos de carbohidrato (y mezclas de los mismos) sea adecuado en la presente invención, los sustratos de carbohidrato preferidos son fructosa y sacarosa (y mezclas de los mismos).

Los expertos en la materia apreciarán que los azúcares fermentables se pueden obtener a partir de biomasa celulósica y lignocelulósica mediante procesos de pretratamiento y sacarificación, como se describe, por ejemplo, en el documento US20070031918. Biomasa se refiere a cualquier material celulósico o lignocelulósico e incluye materiales que comprenden celulosa y, opcionalmente, que comprenden además hemicelulosa, lignina, almidón, oligosacáridos y/o monosacáridos. La biomasa incluye, aunque sin limitación cultivos bioenergéticos, desechos agrícolas, residuos sólidos urbanos, residuos sólidos industriales, lodos de la fabricación de papel, residuos de jardín, residuos madereros y forestales. Sin embargo, en realizaciones ejemplares de la invención, se usa fructosa disponible en el mercado como fuente de carbono y energía para la fermentación.

En los métodos de la invención, se usa un sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono. El sustrato gaseoso puede ser un gas residual obtenido como un subproducto de un proceso industrial, o de alguna otra fuente tal como gases de escape de un motor de combustión (por ejemplo, automóviles). En ciertas realizaciones, el proceso industrial se selecciona del grupo que consiste en la fabricación de productos de metales ferrosos, tal como una acería, fabricación de productos no ferrosos, procesos de refinado de petróleo, gasificación de carbón, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbono, producción de amoniaco, producción de metanol y fabricación de coque. En estas realizaciones, el gas que contiene CO puede ser capturado del proceso industrial antes de ser emitido a la atmósfera, usando cualquier método conveniente. Dependiendo de la composición del sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono, también puede ser deseable tratarlo para retirar cualquier impureza no deseada, tal como partículas de polvo antes de introducirlo en la fermentación. Por ejemplo, el sustrato gaseoso puede filtrarse o lavarse utilizando métodos conocidos.

En otras realizaciones de la invención, el sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono puede obtenerse de la gasificación de biomasa. El proceso de gasificación implica la combustión parcial de biomasa en un suministro restringido de aire u oxígeno. El gas resultante generalmente comprende principalmente CO y H², con volúmenes mínimos de CO², metano, etileno y etano. Por ejemplo, los subproductos de biomasa obtenidos durante la extracción y el procesamiento de productos alimenticios, tales como azúcar de caña de azúcar o el almidón de maíz o granos, o los residuos de biomasa no alimentaria generados por la industria forestal, pueden gasificarse para producir un gas que contiene CO adecuado para su uso en la presente invención.

El sustrato gaseoso que contiene CO normalmente contendrá una proporción importante de CO, tal como de al menos 20 % a 100 % de CO en volumen, de 40 % a 95 % de CO en volumen, de 40 % a 60 % de CO en volumen y de 45 % a 55 % de CO en volumen. En realizaciones particulares, el sustrato comprende aproximadamente el 25 %, o aproximadamente el 30 %, o aproximadamente el 35 %, o aproximadamente el 40 %, o aproximadamente el 45 %, o aproximadamente el 50 % de CO, o aproximadamente el 55 % de CO o aproximadamente el 60 % de CO en volumen. Los sustratos que tienen concentraciones más bajas de CO, tales como el 6 %, también pueden ser apropiados, particularmente cuando también están presentes H²y CO².

El CO se suministra a un nivel suficiente para que se produzca la producción de 2,3-butanodiol. el CO se proporciona de manera que se mantenga una tasa de absorción específica de al menos 0,4 mmol/g/min; o al menos 0,5 mmol/g/min; o al menos 0,6 mmol/g/min; o al menos 0,7 mmol/g/min; o al menos 0,8 mmol/g/min; o al menos 0,9 mmol/g/min; o al menos 1,0 mmol/g/min; o al menos 1,2 mmol/g/min; o al menos 1,5 mmol/g/min. Los expertos en la materia apreciarán los métodos de suministro de CO, particularmente CO gaseoso, de manera que se logre la tasa de absorción requerida. Sin embargo, a modo de ejemplo, factores tales como el aumento de la retención de gas en un medio de fermentación aumentarán la cantidad de CO disponible para la conversión en productos mediante el cultivo microbiano. Los expertos en la materia apreciarán los métodos para aumentar la retención de gas. Sin embargo, a modo de ejemplo no limitante, la retención de gas suele incrementarse por medios mecánicos, tales como aumento de la agitación en un CSTR. Adicionalmente, el suministro de CO a una velocidad más rápida o una presión parcial más alta también aumentará la disponibilidad de CO en un caldo de fermentación.

No es necesario que el sustrato gaseoso contenga hidrógeno, sin embargo, esto no se considera perjudicial para la producción de 2,3-butanodiol. El sustrato gaseoso también puede contener algo de CO²por ejemplo, tal como de aproximadamente 1 % a aproximadamente 80 % en volumen, o de 1 % a aproximadamente 30 % en volumen. En una realización, contiene de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 10 % en volumen. En otra realización, el sustrato gaseoso contiene aproximadamente un 20 % de CO²en volumen.

El monóxido de carbono se añade a la reacción de fermentación en estado gaseoso en el método de la invención. Sin embargo, en aspectos de esta divulgación no cubiertos por las reivindicaciones, el monóxido de carbono podría proporcionarse como un líquido. Por ejemplo, un líquido puede saturarse con un gas que contiene monóxido de carbono y después ese líquido puede añadirse a un biorreactor. Esto puede realizarse utilizando metodología convencional. A modo de ejemplo, podría usarse un generador de dispersión de microburbujas (Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology, Volumen 101, Número 3/octubre de 2002).

En una realización de la invención, los inventores han determinado que el 2,3-butanodiol se puede producir por fermentación de un primer sustrato y un segundo sustrato. En una realización particular de la invención, el 2,3-butanodiol se producirá cuando se proporcionan un primer sustrato, por ejemplo un carbohidrato tal como fructosa y un segundo sustrato gaseoso, que comprende CO.

En una realización adicional, los inventores han determinado que el 2,3-butanodiol será producido por un primer sustrato y, tras el consumo completo, el primer sustrato se puede reemplazar con un segundo sustrato y se continúa produciendo el 2,3-butanodiol. En una realización particular, el primer sustrato es la fructosa y, tras el consumo completo de la fructosa, se puede proporcionar un sustrato gaseoso que comprende CO. Los inventores han descubierto sorprendentemente que se sigue produciendo 2,3-butanodiol. Los inventores contemplan además que el primer sustrato y el segundo sustrato se pueden alternar si es necesario. Por ejemplo, si un primer sustrato no está disponible, se puede usar un sustrato alternativo hasta que mejore la disponibilidad del primer sustrato.

Medios

Se apreciará que para que se produzca el crecimiento de las bacterias y el sustrato hasta la fermentación del 2,3-butanodiol, además del sustrato, será necesario suministrar al biorreactor un medio nutritivo líquido adecuado. Un medio nutritivo contendrá componentes, tales como vitaminas y minerales, suficientes como para permitir el crecimiento del microorganismo utilizado. Se conocen en la técnica medios anaerobios adecuados para el crecimiento de Clostridium autoethanogenum, como se describe, por ejemplo, en Abrini et al (Clostridium autoethanogenum, sp. Nov., An Anaerobic Bacterium That Produces Ethanol From Carbón Monoxide; Arch. Microbiol., 161: 345-351 (1994)). Más adelante, la sección de "Ejemplos" del presente documento proporciona ejemplos adicionales de medios adecuados.

Condiciones de fermentación

De manera deseable, la fermentación debería llevarse a cabo en condiciones apropiadas para que se produzca la fermentación del sustrato a 2,3-butanodiol. Las condiciones de reacción que deben tenerse en cuenta incluyen temperatura, caudal de los medios, pH, potencial redox de los medios, velocidad de agitación (en caso de utilizar un reactor de tanque agitado de flujo continuo), nivel de inóculo, concentraciones máximas de sustrato y velocidades de introducción del sustrato en el biorreactor para garantizar que el nivel de sustrato no se vuelva limitante, y concentraciones máximas de producto para impedir la inhibición del producto. En los documentos WO2007/117157, WO2008/115080, WO2009/022925 y WO2009/064200 se detallan ejemplos de condiciones de fermentación adecuadas para la fermentación anaerobia de un sustrato que comprende CO. Se reconoce que las condiciones de fermentación indicadas en dichos documentos pueden modificarse fácilmente de conformidad con los métodos de la presente invención.

Los inventores han determinado que, en una realización en la que no se controla el pH, no parece haber un efecto deletéreo sobre la producción de 2,3-butanodiol.

Biorreactor

Las reacciones de fermentación se pueden llevar a cabo en cualquier biorreactor adecuado como se ha descrito anteriormente en el presente documento. En algunas realizaciones de la invención, el biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento, en el que se cultivan los microorganismos, y un segundo reactor de fermentación, al que puede suministrarse caldo de fermentación desde el reactor de crecimiento y en el que se produce la mayor parte del producto de fermentación (por ejemplo, 2,3-butanodiol).

Recuperación del producto

La fermentación dará como resultado un caldo de fermentación que comprende un producto deseable (2,3-butanodiol) y/o uno o más subproductos (tales como etanol, acetato y butirato) así como células bacterianas, en un medio nutriente. En una realización preferida, los productos de fermentación incluyen 2,3-butanodiol.

El 2,3-butanodiol, o una mezcla de alcohol que contenga 2,3-butanodiol y uno o más de otros alcoholes, puede recuperarse del caldo de fermentación mediante métodos conocidos en la técnica, tales como destilación fraccionada o evaporación, pervaporación y fermentación extractiva. Los subproductos tales como ácidos que incluyen acetato y butirato también pueden recuperarse del caldo de fermentación usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar un sistema de adsorción que incluya un filtro de carbón activado o electrodiálisis.

En ciertas realizaciones de la invención, el 2,3-butanodiol y los subproductos se recuperan del caldo de fermentación eliminando continuamente una parte del caldo del biorreactor, separando las células microbianas del caldo (convenientemente por filtración, por ejemplo) y recuperando el 2,3-butanodiol y opcionalmente otros alcoholes y ácidos del caldo. Los alcoholes pueden recuperarse convenientemente, por ejemplo, por destilación, y los ácidos pueden recuperarse, por ejemplo, por adsorción sobre carbón activado. Las células microbianas separadas se devuelven preferentemente al biorreactor de fermentación. El permeado libre de células que queda después de eliminar el(los) alcohol(es) o el(los) ácido(s) también se devuelve preferentemente al biorreactor de fermentación. Se pueden añadir nutrientes adicionales (tales como vitaminas B) al permeado libre de células para reponer el medio nutritivo antes de que se devuelva al biorreactor.

Además, si el pH del caldo se ajustó durante la recuperación de 2,3-butanodiol y/o subproductos, el pH debe reajustarse a un pH similar al del caldo en el biorreactor de fermentación, antes de ser devuelto al biorreactor.

La invención se describirá a continuación con mayor detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Materiales y métodos

(continuación)

(continuación)

Preparación de Na2Sx

Se cargó un matraz de 500 ml con Na²S (93,7 g, 0,39 mol) y 200 ml de H²O. La solución se agitó hasta que la sal se disolvió y se añadió azufre (25 g, 0,1 mol) bajo un flujo constante de N². Después de 2 horas de agitación a temperatura ambiente, la solución de "Na²Sx" (aproximadamente 4 M con respecto a [Na] y aproximadamente 5 M con respecto al azufre), ahora un líquido claro marrón rojizo, se transfirió a frascos de suero purgados con N², envueltas en papel de aluminio.

Preparación de la solución de Cr (II)

Se equipó un matraz de tres bocas de 1 l con una entrada y salida estancas al gas para permitir el trabajo bajo gas inerte y la posterior transferencia del producto deseado a un matraz de almacenamiento adecuado. El matraz se cargó con CrCl3.6H20 (40 g, 0,15 mol), gránulos de zinc [malla 20] (18,3 g, 0,28 mol), mercurio (13,55 g, 1 ml, 0,0676 mol) y 500 ml de agua destilada. Después de enjuagar con N²durante una hora, la mezcla se calentó a aproximadamente 80 °C para iniciar la reacción. Después de dos horas de agitación bajo un flujo constante de N², la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se agitó continuamente durante otras 48 horas, momento en el que la mezcla de reacción se había convertido en una solución de color azul intenso. La solución se transfirió a frascos de suero purgados con N²y se almacenó en el frigorífico para uso futuro.

Bacterias:

El Clostridium autoethanogenum utilizado es el depositado en el Centro Alemán de Recursos para Material Biológico (DSMZ) y al que se le asignó el número de acceso 19630.

Toma de muestras y procedimientos analíticos

Se tomaron muestras de medio del reactor de fermentación (por ejemplo, CSTR o frasco de suero) a intervalos durante el transcurso de la fermentación. Cada vez que se tomaron muestras del medio, se tuvo cuidado de asegurar que no se permitiera que ningún gas entrara o escapara del reactor.

HPLC:

Sistema HPLC Agilent Serie 1100. Fase móvil: ácido sulfúrico 0,0025 N. Flujo y presión: 0,800 ml/min. Columna: Alltech 10A; N.° de catálogo 9648, 150 x 6,5 mm, tamaño de partícula 5 pm. Temperatura de columna: 60 °C. Detector: Índice de refracción. Temperatura del detector: 45 °C.

Método de preparación de la muestra:

Se cargan 400 pl de muestra y 50 pl de ZnSO40,15 M y 50 pl de Ba(OH) 0,15 M²en un tubo Eppendorf. Los tubos se centrifugan durante 10 min. a 12.000 rpm, 4 °C. Se transfieren 200 pl del sobrenadante a un vial de HPLC y se inyectan 5 pl en el instrumento de HPLC.

Análisis del espacio superior libre:

Las mediciones se realizaron en un micro GC Varian CP-4900 con dos canales instalados. El canal 1 era una columna de tamiz molecular de 10 m que funcionaba a 70 °C, 200 kPa de argón y un tiempo de retrolavado de 4,2 s, mientras que el canal 2 era una columna PPQ de 10 m que funcionaba a 90 °C, 150 kPa de helio y sin retrolavado. La temperatura del inyector para ambos canales era de 70 °C. Los tiempos de ejecución se establecieron en 120 s, pero todos los picos de interés normalmente eluirían antes de los 100 s. La absorción específica de CO se determinó calculando el consumo de CO por gramo de células (peso seco - véase más abajo).

Densidad celular:

La densidad celular se determinó contando las células bacterianas en una alícuota definida de caldo de fermentación. Como alternativa, la absorbancia de las muestras se midió a 600 nm (espectrofotómetro) y el peso seco se determinó mediante cálculo de acuerdo con los procedimientos publicados.

Solución de sulfuro metálico 1:

Se transfirieron aproximadamente 950 ml de solución A a un fermentador de 1 l y se roció con nitrógeno. Se añadió H³PO⁴(solución al 85 %, 1,5 ml) y el pH se ajustó a 5,3 usando NH⁴OH (ac.) concentrado. Se añadió resazurina (1 ml de una solución de 2 g/l) y la solución se roció con N². Se añadió cloruro de cromo (II) hasta que el ORP de la solución disminuyó a aproximadamente -150 mV. Se añadieron 10 x Solución(es) C antes de añadir polisulfuro de sodio (1,44 ml de una solución 4,3 M o 1 ml de una solución 6 M) y la solución se roció con N².

Ejemplo IA: Producción de 2,3-butanodiol por fermentación

La conversión fermentativa de un sustrato, utilizando Clostridium autoethanogenum se llevó a cabo en un reactor CSTR durante un periodo de dos semanas, con seguimiento periódico. Los medios utilizados para los experimentos CSTR se prepararon de conformidad con los componentes enumerados en la Tabla E. La mezcla de sal de fosfato consistía en Na2HPO40,65 mM y NaH2PO415,3 mM. Todos los demás componentes, tales como ácido fosfórico, las sales de amonio y el clorhidrato de cisteína se mezclaron en 800 ml de agua antes de añadir las sales tampón a la solución. Proceder de esta manera aseguró que el pH aumentara por encima de aproximadamente 6,5 evitando la precipitación de los componentes del medio. La solución se diluyó a 1 l y se hizo anaerobia calentando hasta ebullición y dejándola enfriar a temperatura ambiente bajo un flujo constante de N²gaseoso. Una vez enfriada, la solución se ajustó al pH final de 5,3 y se añadieron las vitaminas B. La anaerobicidad se mantuvo durante todo el experimento. Se añadió carbohidrato (5 g/l de fructosa) a la formulación del medio básico. Las soluciones de los medios se introdujeron en los fermentadores y, opcionalmente, se burbujearon con los gases que contienen CO respectivos desde el inicio del experimento o después de un intervalo predeterminado. Durante estos experimentos, se controló el pH para que permaneciera en 5,5 añadiendo una solución acuosa de NaOH. Se inoculó un cultivo de Clostridium autoethanogenum en crecimiento activo en el reactor a un nivel del 5 % (v/v). La temperatura del reactor se mantuvo a 37 °C y la velocidad de agitación fue de 400 rpm.

Resultados:

Inicialmente, la fermentación contenía fructosa como sustrato, que dio como resultado la producción de ácido acético, etanol y 2,3-butanodiol. Con el paso del tiempo, se consumió la fructosa y una corriente de gas que incluía CO (95 % CO, 5 % CO²) se difundió a través del medio. El medio se mantuvo a pH 5,5 (Tabla 1). Cabe señalar que incluso cuando se han consumido los carbohidratos, aumentó la concentración de los productos mencionados anteriormente, demostrando claramente que el CO se utilizaba para producir los productos, incluido el 2,3-butanodiol.

Tabla 1: Seguimiento de la producción de 2,3-butanodiol, etanol y acetato (concentraciones en g/l) a lo largo del tiem o en un reactor CSTR.

Ejemplo IB: Producción de 2,3-butanodiol por fermentación

En un experimento adicional, la conversión de un sustrato por Clostridium autoethanogenum se llevó a cabo en un reactor CSTR durante un periodo de 10 días, con seguimiento periódico. En este caso, el fermentador y el medio se prepararon de conformidad con el Ejemplo IA, sin embargo, el sustrato fue exclusivamente gas de acería simulado (70 % CO, 1 % H², 14 % N², 15 % CO²) que se burbujeó continuamente y el pH del medio se mantuvo constante a 5,5 (Tabla 2). La conversión del sustrato dio nuevamente como resultado ácido acético, etanol y 2,3-butanodiol, demostrando que incluso en ausencia de un sustrato de carbohidrato al comienzo de la fermentación, se producen ácido acético, etanol y butanodiol.

Tabla 2: Seguimiento de la producción de 2,3-butanodiol, etanol y acetato (concentraciones en g/l) a lo largo del tiem o en un reactor discontinuo CSTR.

(continuación)

Ejemplo 2: Producción de 2,3-butanodiol por fermentación

En un experimento adicional, la conversión de un sustrato por Clostridium autoethanogenum se llevó a cabo en un reactor CSTR durante un periodo de 3 días, con seguimiento periódico. En este caso, el fermentador y el medio se prepararon de conformidad con lo descrito en el Ejemplo IA, sin embargo, el sustrato fue gas de acería simulado (70 % de CO, 1 % de H², 14 % de N², 15 % de CO²), que se burbujeó continuamente y fructosa (10 g/l) y el pH del medio se mantuvo constante a 5,5 (Tabla 3). La conversión del sustrato dio nuevamente como resultado ácido acético, etanol y 2,3-butanodiol.

Tabla 3: Seguimiento de la producción de 2,3-butanodiol, etanol y acetato (concentraciones en g/l) a lo largo del tiem o en un reactor discontinuo CSTR.

Las concentraciones finales de acetato, etanol y 2,3-butanodiol también se compararon entre los experimentos de fermentador descritos en los Ejemplos IA, IB y 2, al final de cada experimento (obsérvese que estos resultados se relacionan con las concentraciones finales medidas en las tablas 1-3 y se resumen para su comparación en la Tabla 4).

Tabla 4: Ejemplos de producción de 2,3-butanodiol utilizando sustratos alternativos en un reactor CSTR, medida al n l ir x rim n . L r l x r n n l.

Ejemplo 3: Producción de 2,3-butanodiol por fermentación

Para determinar cómo las condiciones del medio pueden afectar la producción de 2,3-butanodiol, se prepararon frascos de suero que contenían medios que comprendían una selección de tampones y se analizaron los productos de fermentación al final del experimento (Tabla 5). La incubación se realizó en frascos de suero sellados de 234 ml que contenían cada uno 50 ml de los medios descritos anteriormente (Tabla E), opcionalmente tamponados con un tampón acetato (0,02 M) o un tampón citrato (0,02 M) y ajustados a pH 5,3. El espacio superior libre de 184 ml de cada frasco de suero inicialmente era N²y luego se llena a una sobrepresión de 206,8 kPa (30 psi) con 95 % de CO, 5 % de O², o 70 % de CO, 15 % de CO², 14 % de N², 1 % de H². Cada frasco se inoculó con 2 ml de un cultivo de Clostridium autoethanogenum. Se usó una incubadora con agitación y la temperatura de reacción se mantuvo a 37 °C.

Una vez más, está claro que el 2,3-butanodiol se produce independientemente del tampón utilizado en el experimento. Adicionalmente, también cabe señalar que, dado que los frascos de suero no tenían control de pH, el producto también parecía producirse con un control limitado (o nulo) del pH.

Tabla 5: Ejemplos de producción de 2,3-butanodiol en una diversidad de medios. Los medios de los frascos de suero se analizaron después del crecimiento activo, es decir, el aumento de la masa celular se estabilizó después de v ri í 4 7 í . L r l x r n n l.

(continuación)

Ejemplo 4: Fermentación discontinua en CSTR

Se transfirieron aproximadamente 1,3 l de solución A a un fermentador de 2 l y se roció con nitrógeno. Se añadió resazurina (1,35 ml de una solución de 2 g/l). Se añadió H³PO⁴(solución al 85 %, 2,025 ml) y el pH se ajustó a 5,3 usando NH⁴OH (ac.) conc. Se añadió cloruro de cromo (II) hasta que el ORP de la solución disminuyó a aproximadamente -150 mV. Se añadió polisulfuro de sodio (6,07 ml de una solución 4,3 M) y se ajustó el pH a 5,5 usando HCl concentrado. La solución se roció con N²durante 1 hora antes de la adición de la solución de sulfuro metálico 1 (150 ml) y la solución B (15 ml). La solución se roció con N²y después con CO que contiene gas (3 % de H²; 30 % de N²; 47 % de CO; 20 % de CO²), antes de la inoculación con un cultivo de Clostridium autoethanogenum en crecimiento activo a un nivel de aproximadamente el 5 % (v/v). El caudal de gas se ajustó para asegurar que el cultivo microbiano no estuviera limitado en CO con el fin de mantener una alta absorción específica de CO. Los resultados de la fermentación se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6: Productividad de 23-butanodiol en un cultivo discontinuo con diferentes absorciones es ecíficas de CO.

La acumulación total de 2,3-butanodiol durante 7,5 días fue de aproximadamente 7,5 g/l. Se reconoce que el 2,3-butanodiol se produce a niveles bajos con tasas de absorción de CO específicas más bajas. Sin embargo, cuando el gas se suministra de manera que la tasa de absorción de CO pueda mantenerse por encima de 0,4 mmol/g/min, la productividad del 2,3-butanodiol aumenta significativamente. En este caso, la absorción específica de CO se mantiene a una media de 0,8 mmol/g/min durante varios días y se produce 1,3-butanodiol a una velocidad superior a 1 g/l.

Ejemplo 5: Fermentación discontinua en CSTR

Se transfirieron aproximadamente 1,3 l de solución A a un fermentador de 2 l y se roció con nitrógeno. Se añadió H³PO⁴(solución al 85 %, 2,025 ml, 30 mM) y el pH se ajustó a 5,3 usando NH⁴OH (ac.) concentrado. Se añadió la solución B (13,5 ml) y la solución se roció con N². Se añadió cloruro de cromo (II) hasta que el ORP de la solución disminuyó a aproximadamente -150 mV. Se añadió resazurina (1,35 ml de una solución de 2 g/l). Se añadió polisulfuro de sodio (2,85 ml de una solución 6 M) y la solución se roció con N²durante 12 horas antes de cambiar a gas que contiene CO (1 % de H²; 14 % de N²; 70 % de CO; 15 % de CO²). El pH se ajustó a 5,5 con HCl concentrado antes de la adición de la solución 1 de sulfuro metálico (150 ml). La solución se roció con el gas que contiene CO durante 30 minutos más antes de la inoculación con un cultivo de Clostridium autoethanogenum a un nivel de aproximadamente 5 % (v/v). De nuevo, el caudal de gas se ajustó para asegurar que el cultivo microbiano no estuviera limitado en CO con el fin de mantener una alta absorción específica de CO. Los resultados de la fermentación se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7: Productividad de 23-butanodiol en un cultivo discontinuo con diferentes absorciones es ecíficas de CO.

El 2,3-butanodiol total después de aproximadamente 6 días fue de 5 g/l. Una vez más, la absorción de CO específica elevada da como resultado una productividad de 2,3-butanodiol significativamente mayor de al menos 0,5 g/l/día.

Ejemplo 6: Fermentación discontinua en CSTR

Se transfirieron aproximadamente 1,3 l de solución A a un fermentador de 1,5 l y se roció con nitrógeno. Se añadió H³PO⁴(solución al 85 %, 2,25 ml) y el pH se ajustó a 5,3 usando NH⁴OH (ac.) concentrado. Se añadió la solución B (15 ml) y la solución se roció con N². Se añadió cloruro de cromo (II) hasta que el ORP de la solución disminuyó a aproximadamente -150 mV. Se añadió resazurina (1,5 ml de una solución de 2 g/l). Se añadió polisulfuro de sodio (1,5 ml de una solución 3 M) y la solución se roció con N²durante 1 hora. Se añadieron soluciones 0,1 M de FeCb (3,75 ml), CoCl²(1,875 ml), NiCb (1,875 ml), H³BO³(0,375 ml), N/A2MoO4 (0,375 ml), MnCb (0,375 ml), Na2WO4 (0,375 ml) y ZnCb (0,1875 ml), y la solución se roció con gas que contiene CO (50 % de H²; 32 % de CO; 4 % de CO²; 32 % de CH⁴). El pH se ajustó a 5,5 con HCl concentrado antes de la adición de la Solución C (150 ml). La solución se roció con el gas que contiene CO durante 30 minutos más antes de la inoculación con un cultivo de Clostridium autoethanogenum a un nivel de aproximadamente 5 % (v/v). El caudal de gas se ajustó para asegurar que el cultivo microbiano no estuviera limitado en CO con el fin de mantener una alta absorción específica de CO. Los resultados de la fermentación se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8: Productividad de 23-butanodiol en un cultivo discontinuo con diferentes absorciones es ecíficas de CO.

La concentración total de 2,3-butanodiol después de 4 días era de aproximadamente 3 g/l. Si bien las velocidades alcanzadas son menores que en las fermentaciones anteriores (ejemplos 4 y 5), la corriente de sustrato comprende una parte sustancial de hidrógeno. Los resultados muestran que se produce 2,3-butanodiol cuando se utiliza un sustrato mixto de CO/H².

Ejemplo 7: Fermentación continua en reactor de tanque agitado continuo

El medio se preparó a pH 5,5 como sigue. Todos los ingredientes de la Solución D, con la excepción de Cisteína-HCl se mezclaron en 400 ml de agua destilada. Esta solución se hizo anaerobia calentándola hasta ebullición y dejándola enfriar a temperatura ambiente bajo un flujo constante de un gas 95 % de CO, 5 % CO². Una vez enfriada, se añadió la Cisteína-HCl y el pH de la solución se ajustó a 5,5 antes de llevar el volumen hasta 1000 ml; la anaerobicidad se mantuvo a lo largo de los experimentos.

Se cargó un biorreactor de cinco litros con 4,9 litros de medio LM33 preparado como se ha descrito anteriormente. El gas se cambió a gas que contiene CO (1 % de H²; 14 % de N²; 70 % de CO; 15 % de CO²) a presión atmosférica antes de la inoculación con 100 ml de un cultivo de Clostridium autoethanogenum. El biorreactor se mantuvo a 37 °C agitado a 200 rpm al inicio del cultivo. Durante la fase de crecimiento, la agitación se incrementó a 400 rpm. El pH se ajustó a 5,5 y se mantuvo mediante la adición automática de NaOH 5 M. Se añadió continuamente medio anaerobio fresco al biorreactor para mantener un nivel definido de biomasa y acetato en el biorreactor. La productividad del 2,3 butanodiol se destaca en la Tabla 9.

Tabla 9: Productividad de 23-butanodiol en cultivo continuo.

Durante los primeros 89 días de funcionamiento continuo, el fermentador se hizo funcionar en condiciones limitadas de CO y se produjo una cantidad mínima de 2,3-butanodiol. Sin embargo, alrededor del día 88, se incrementó el flujo de gas, de tal manera que aumentó la absorción específica de CO. En esta fase, la productividad del 2,3-butanodiol aumentó significativamente hasta al menos 1,2 g/l/día. Alrededor del día 92, el flujo de gas se redujo de manera que la absorción específica del cultivo disminuyó a alrededor de 0,4 mmol/g/min y la productividad del 2,3-butanodiol también disminuyó. Sin embargo, incluso con una absorción específica media de aproximadamente 0,4 mmol/g/min, la productividad del 2,3-butanodiol se mantuvo al menos en 0,5 g/l/día.

Ejemplo 8: Fermentación discontinua en CSTR

Se transfirieron aproximadamente 1,3 l de solución A a un fermentador de 2 l y se roció con nitrógeno. Se añadió H³PO⁴(solución al 85 %, 1,5 ml) y el pH se ajustó a 5,3 usando NH⁴OH (ac.) conc. Se añadió la solución B (15 ml) y la solución se roció con N². Se añadió cloruro de cromo (II) hasta que el ORP de la solución disminuyó a aproximadamente -150 mV. Se añadió polisulfuro de sodio (1 ml de una solución 3 M) y la solución se roció con N²durante 12 horas. Se añadieron soluciones 0,1 M de FeCb (3,75 ml), CoCb (1,875 ml), NiCb (1,875 ml), H3BO3(0,375 ml), Na2MoO4 (0,375 ml), MnCb (0,375 ml), Na2WO4 (0,375 ml) y ZnCb (0,2 ml), y la solución se roció con gas que contiene CO (1 % de H²; 14 % de N²; 70 % de CO; 15 % de CO²).

Se añadió resazurina (1 ml de una solución de 2 g/l). El pH se ajustó a 5,5 con HCl concentrado y la solución se roció con el gas que contiene CO durante 30 minutos más antes de la inoculación con un cultivo de Clostridium autoethanogenum a un nivel de aproximadamente 5 % (v/v). La Tabla 10 muestra el producto de 2,3-butanodiol acumulado en un fermentador después de aproximadamente 2 semanas de funcionamiento. Las tasas específicas de absorción de CO se han corregido para la viabilidad del cultivo. La viabilidad del cultivo se determinó usando los métodos descritos en el documento WO2009/022925.

Tabla 10: Acumulación de 23-butanodiol des ués de 14 días de fermentación discontinua.

Durante el periodo de 24 horas del día 13 al 14, la absorción específica de CO se mantuvo en aproximadamente 0,5 mmol/g/min y la productividad del 2,3-butanodiol fue de 0,6 g/l/día.

Ejemplo 9: Regulación genética de la producción de 2,3-butanodiol en LZ1560

Se tomaron muestras de tres fermentaciones para determinar la expresión génica durante la producción de 2,3-butanodiol. Se tomó una muestra de la fermentación discontinua descrita en el Ejemplo 8 el día 13, en donde se producían productos que incluían etanol y 2,3-butanodiol. La muestra se designa como R12 en los resultados a continuación. La segunda muestra se tomó de una fermentación discontinua que produjo tanto etanol como 2,3-butanodiol. La muestra se designa como R11 en los resultados. La tercera muestra (R2) se tomó de la fermentación continua operando en condiciones similares a las del Ejemplo 7 en los días 1-89. El cultivo microbiano estaba limitado en CO y el caldo de fermentación tenía una concentración de acetato estable de aproximadamente 13 g/l; una concentración de etanol inferior a 1 g/l y cantidades insignificantes de 2,3-butanodiol. Se utilizó RealTime PCR para determinar si los genes estaban regulados al alza o a la baja en relación con R2.

Procedimiento de extracción de ARN y síntesis de ADNc:

El ARN total se aisló de aproximadamente 2,5 x 109 células bacterianas utilizando Aurum Total RNA Fatty and Fibrous Tissue Kit (Biorad). La ADNasa en columna se digirió usando el conjunto de ADNasa libre de ARNasa (Biorad). El ARN total se cuantificó mediante espectrofotómetro y su pureza (medida por la razón A²⁶⁰/²⁸⁰) se determinó antes de la síntesis de ADNc usando el kit de síntesis de ADNc iScript Select (Biorad).

Procedimiento de PCR en tiempo real:

Los cebadores para PCR en tiempo real, se diseñaron utilizando el software gratuito Primer3 basado en la secuencia del genoma interna patentada de LanzaTech. Se ensamblaron mezclas de reacción de PCR en tiempo real que contienen 12,5 pl 2x SYBR Green PCR Master Mix (Biorad), 1,5 pl de cada cebador 1 pM hacia adelante y hacia atrás, 5 pl de plantilla de ADNc diluido 10x y agua estéril hasta un volumen total de 25 pl. Las mezclas se calentaron hasta 95 °C durante 3 minutos, seguido de 40 ciclos a 95 °C durante 15 segundos, a 55 °C durante 15 minutos y a 72 °C durante 30 segundos. Para la detección de la dimerización del cebador u otros artefactos de amplificación, se realizó un análisis de la curva de fusión inmediatamente después de completar la PCR en tiempo real (38 ciclos de 58 °C a 95 °C a 1 °C/segundos). Todas las reacciones se realizaron por triplicado. La cuantificación de la expresión génica se realizó utilizando un sistema de detección de PCR en tiempo real de color único MyiQ (Biorad) y los datos en tiempo real se analizaron utilizando el software del sistema óptico iQ5 (Biorad).

Resultados:

Los valores de Ct sin procesar, junto con la expresión génica relativa y los errores típicos, generados a partir del ensayo RealTime PCR se presentan en la Tabla 11. Se seleccionó la cadena beta de la ARN polimerasa (rpoB) como gen de referencia para normalizar la expresión génica. Se utilizó el método de cuantificación relativa usando el ACt comparativo para calcular la expresión génica relativa de 2,3BDH. El cultivo productor de acetato (R2) se seleccionó como calibrador (patrón de referencia) en todos los análisis.

Tabla 11: Obtención de valores de expresión génica relativa a partir de datos de Ct sin procesar. Las expresiones relativas se normalizaron mediante rpoB y se calibraron con el Reactor 2. SE = error típico de la media. (Cualquier ex resión relativa or encima de 1 muestra re ulación al alza

(continuación)

Los datos de PCR en tiempo real presentados en este estudio muestran que la expresión del gen de 2,3-butanodiol es significativamente mayor en cultivos solventogénicos (R11/R12) en comparación con cultivos acetogénicos (R2). El cultivo microbiano de R12, que producía aproximadamente 0,6 g/l/día de 2,3-butanodiol en el momento de la recolección celular, muestra la mayor regulación al alza de genes (7,64 ± 0,8 veces), en relación con R2. A esto le sigue R11 con 4,75 ± 1,8 veces de regulación al alza del gen, que tuvo una producción total de 2,3-butanodiol de 1,53 g/l, cuando se recolectaron las células.

La Figura 1 muestra la expresión génica relativa de 2,3-butanodiol deshidrogenasa (2,3BDH) en tres fermentadores (R11, R12 y R2). El R2 productor de acetato se selecciona como calibrador y la expresión génica se normalizó utilizando rpoB como gen de referencia. Barra de error = error típico de la media. N=3. Claramente, la 2,3-butanodiol deshidrogenasa se regula al alza en cultivos microbianos que producen 2,3-butanodiol. El cultivo microbiano en R2 tiene una absorción específica de CO de aproximadamente 0,3 mmol/g/min, mientras que el cultivo en R12 tiene una absorción específica de aproximadamente 0,6 mmol/g/min. El aumento de la cantidad de CO proporcionada al cultivo da como resultado un aumento en la absorción de CO y un aumento posterior en la expresión del gen 2,3-butanodiol deshidrogenasa. El aumento de la expresión génica de la 2,3-butanodiol deshidrogenasa da como resultado un aumento de la productividad global del 2,3-butanodiol.

En el presente documento se ha descrito la invención con referencia a ciertas realizaciones preferidas, para permitir al lector llevar a la practica la invención sin excesiva experimentación. Los expertos en la materia apreciarán que la invención es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente.

A lo largo de esta memoria descriptiva y de cualquiera de las siguientes reivindicaciones, a menos que el contexto requiera lo contrario, las palabras "comprende", "que comprende" y similares, deben interpretarse en un sentido inclusivo en lugar de exclusivo, es decir, en el sentido de "incluyendo, pero sin limitación".

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir 2,3-butanodiol por fermentación microbiana de un sustrato gaseoso que comprende CO, comprendiendo el método:

a. proporcionar el sustrato gaseoso que comprende CO a un biorreactor; y

2. El método de la reivindicación 1, en donde el sustrato se proporciona de manera que se mantenga una tasa de absorción específica de al menos 0,6 mmol de CO/g/min.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el sustrato se proporciona de manera que se mantenga una tasa de absorción específica de al menos 0,8 mmol de CO/g/min.

4. El método de la reivindicación 2, en donde el sustrato se proporciona de manera que se mantenga una tasa de absorción específica de al menos 1,0 mmol de CO/g/min.

5. Un método para producir 2,3-butanodiol por fermentación microbiana de un sustrato gaseoso que comprende CO, comprendiendo el método:

a. proporcionar un sustrato gaseoso que comprende CO a un biorreactor,

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el sustrato que comprende CO se proporciona de manera que el cultivo mantenga una tasa específica de absorción de CO de al menos 0,8 mmol de CO/gramo de peso de células secas de bacterias/minuto.

7. El método de la reivindicación 5, en donde uno o más microorganismos son Clostridium autoethanogenum.

8. El método de la reivindicación 1, en donde el sustrato que comprende CO es gaseoso y comprende al menos de 15 % a 100 % de CO en volumen.

9. El método de la reivindicación 8, en donde el sustrato que comprende CO comprende el gas obtenido como subproducto de un proceso industrial.

10. El método de la reivindicación 9, en donde el sustrato gaseoso que comprende CO comprende el gas obtenido de una acería.

11. El método de la reivindicación 1, en donde el sustrato comprende además uno o más carbohidratos.

12. El método de la reivindicación 11, en donde el método incluye una etapa adicional de proporcionar un sustrato que comprende CO antes, y/o al mismo tiempo, y/o después, que la etapa de proporcionar un sustrato que comprende uno o más carbohidratos.

13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde uno o más microorganismos tienen al menos algunas de las características definitorias de la cepa Clostridium autoethanogenum depositada en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ) con el número de acceso DSM 19630.

14. Un método de la reivindicación 1 o 5, comprendiendo el método además convertir el 2,3-butanodiol en un compuesto seleccionado del grupo que consiste en butadieno, butadiona, metil etil cetona, acetoína o mezclas de las mismas.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 5, en donde se produce etanol como producto conjunto de la fermentación.