KR20220140619A - 가스성 기질로부터의 2-페닐에탄올의 발효 제조 - Google Patents

가스성 기질로부터의 2-페닐에탄올의 발효 제조 Download PDF

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미카엘 쾨프케
실파 나가라주
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Abstract

본원에 개시된 것은 일산화탄소 및/또는 이산화탄소를 포함하는 기질의 미생물 발효에 의한 2-페닐에탄올의 제조 방법이고, 추가로 개시된 것은 상기 방법에서 사용하기 위한 유전자 변형된 미생물이다. 부가적으로, 본원에 개시된 방법은 천연 및 석유화학 공정에 대한 의존성을 경감시키는 개선된 2-PE 제조 방법이다.

Description

가스성 기질로부터의 2-페닐에탄올의 발효 제조
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2020년 3월 18일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/991,428호의 이익을 주장하며, 이의 전문은 참조에 의해 본원에 포함된다.
정부 지원
본 발명은 미국 에너지국(Department of Energy)이 부여한 협력 조약 DE-EE0007728 하에 정부 지원으로 이루어졌다.
기술분야
본 출원은 이산화탄소(CO2), 일산화탄소(CO), 및/또는 수소(H2)를 포함하는 기질의 미생물 발효에 의한 2-페닐에탄올의 제조 방법, 및 상기 방법에서 사용하기 위한 유전자 변형된 미생물에 관한 것이다.
임박한 기후 변화를 완화하려면 석탄 및 석유와 같은 화석 연료를 태울 때 발생하는 것과 같은 온실 가스(GHG) 배출량을 크게 줄여야 한다. 화학 물질 및 운송 연료의 지속 가능한 공급원은 현재 화석 탄소에 대한 의존도를 크게 대체하기에 충분하지 않지만 가스 발효는 최근 CO2, CO, 및/또는 H2와 같은 가스의 지속 가능한 연료 및 화학 물질로의 생물학적 고정을 위한 대안 플랫폼으로 등장했다. 특히, 가스 발효 기술은 기체화된 유기물(예를 들어, 도시 고형 폐기물 또는 농업 폐기물) 또는 공업 폐가스(예를 들어, 제철소 또는 정유 공장)를 비롯한 광범위한 공급원료를 이용하여 에탄올, 제트 연료 및 기타 다양한 제품을 생성할 수 있다. 가스 발효만으로도 원유 사용의 30%를 대체하고, 전 세계 CO2 배출량을 10% 줄일 수 있지만, 임의의 파괴적인 기술과 마찬가지로, 이러한 잠재력이 완전히 달성되기 전에 많은 기술적 문제들이 극복되어야 한다.
2-페닐에탄올(2-PE)은 식품, 프레이그런스 및 향미 산업에서 "장미 같은" 향에 대한 시장이 6010 mt/년이고, 화학 산업에서 에스테르 중간체로서 그리고, 이론적으로, 스티렌 제조에서, 900 mt/년의 시장을 이루는 상품 화학물질이다. 현재, 2-PE는 식품, 프레이그런스, 및 향미 산업에 적용하기 위해 천연 공급원에서 조달되거나, 다른 적용에 대해서는 화학적 수단에 의해 합성된다. 따라서, 천연 및 석유화학 공정에 대한 의존성을 경감시키는 개선된 2-PE 제조 방법에 대한 요구가 존재한다.
일 양태에서, 본 개시물은 2-페닐에탄올을 제조할 수 있는 미생물을 제공하고, 여기서 상기 미생물은 페닐피루베이트를 페닐아세트알데히드로 전환하는 이종 효소 및 페닐아세트알데히드를 2-페닐에탄올로 전환하는 이종 효소를 포함한다.
일부 실시형태에서, 페닐피루베이트를 페닐아세트알데히드로 전환하는 이종 효소는 데카르복실라아제이고, 페닐아세트알데히드를 2-페닐에탄올로 전환하는 이종 효소는 페닐아세트알데히드 환원효소이다. 특히, 데카르복실라아제는 페닐피루베이트-특이적 데카르복실라아제일 수 있다.
일부 실시형태에서, 미생물은 C1-고정 미생물, 우드-륭달(Wood-Ljungdahl) 미생물, 및/또는 박테리아이다. .일부 실시형태에서, 미생물은 속 아세토박테리움(Acetobacterium), 알칼리바쿨룸(Alkalibaculum), 블라우티아(Blautia), 부티리박테리움(Butyribacterium), 클로스트리디움(Clostridium), 유박테리움(Eubacterium), 무렐라(Moorella), 옥소박테르(Oxobacte), 스포로무사(Sporomusa), 또는 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter)의 구성원이다.
일부 실시형태에서, 미생물은 자연적으로 페닐피루베이트를 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 미생물은 CO, CO2, 및/또는 H2를 아세틸-CoA로 전환하는 우드-륭달 경로를 포함한다.
일부 실시형태에서, 미생물은 하기 중 하나 이상을 포함한다: 아세틸-CoA를 피루베이트로 전환하는 천연 효소; 피루베이트를 포스포에놀피루베이트로 전환하는 천연 효소; 포스포에놀피루베이트 및 에리트로오스-4-포스페이트를 2-데히드로3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트로 전환하는 천연 효소; 2-데히드로3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트를 3-데히드로퀴네이트로 전환하는 천연 효소; 3-데히드로퀴네이트를 3-데히드로시키메이트로 전환하는 천연 효소; 3-데히드로시키메이트를 시키메이트로 전환하는 천연 효소; 시키메이트를 시키메이트 3-포스페이트로 전환하는 천연 효소; 시키메이트 3-포스페이트를 5-O-(1-카르복시비닐)-시키메이트 3-포스페이트로 전환하는 천연 효소; 5-O-(1-카르복시비닐)-시키메이트 3-포스페이트를 코리스메이트로 전환하는 천연 효소; 또는 코리스메이트를 페닐피루베이트로 전환하는 천연 효소.
일부 실시형태에서, 아세틸-CoA를 피루베이트로 전환하는 천연 효소는 피루베이트:페레독신 옥시도환원효소(PFOR; E.C. 1.2.7.1)이고; 피루베이트를 포스포에놀피루베이트로 전환하는 천연 효소는 피루베이트 포스페이트 디키나아제(PPDK; E.C.2.7.9.1)이고; 포스포에놀피루베이트 및 에리트로오스-4-포스페이트를 2-데히드로3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트로 전환하는 천연 효소는 2-데히드로-3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트 합성효소(DAHPS 또는 DAHP 합성효소; E.C.2.5.1.54)이고; 2-데히드로3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트를 3-데히드로퀴네이트로 전환하는 천연 효소는 3-데히드로퀴네이트 합성효소(DHQS; E.C. 4.2.3.4)이고; 3-데히드로퀴네이트를 3-데히드로시키메이트로 전환하는 천연 효소는 3-데히드로퀴네이트 탈수효소(DHQ; E.C. 4.2.1.10)이고; 3-데히드로시키메이트를 시키메이트로 전환하는 천연 효소는 시키메이트 탈수소효소(SDH; E.C. 1.1.1.25)이고; 시키메이트를 시키메이트 3-포스페이트로 전환하는 천연 효소는 시키메이트 키나아제(SK; E.C. 2.7.1.71)이고; 시키메이트 3-포스페이트를 5-O-(1-카르복시비닐)-시키메이트 3-포스페이트로 전환하는 천연 효소는 5-에놀피루빌시키메이트 3-포스페이트 합성효소(EPSPS 또는 EPSP 합성효소; E.C. 2.5.1.19)이고; 5-O-(1-카르복시비닐)-시키메이트 3-포스페이트를 코리스메이트로 전환하는 천연 효소는 코리스메이트 합성효소(CS; E.C. 4.2.3.5)이거나; 또는 코리스메이트를 페닐피루베이트로 전환하는 천연 효소는 이관능성 코리스메이트 뮤타아제(E.C. 5.4.99.5)/프레페네이트 탈수효소(E.C.4.2.1.51)이다.
일부 실시형태에서, 미생물은 하기 중 하나 이상을 추가로 포함한다: 포스포에놀피루베이트 및 에리트로오스-4-포스페이트를 2-데히드로-3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트로 전환하는 이종 효소; 3-데히드로시키메이트를 시키메이트로 전환하는 이종 효소; 또는 코리스메이트를 페닐피루베이트로 전환하는 이종 효소.
일부 실시형태에서, 포스포에놀피루베이트 및 에리트로오스-4-포스페이트를 2-데히드로-3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트로 전환하는 이종 효소는 2-데히드로-3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트 합성효소이고; 3-데히드로시키메이트를 시키메이트로 전환하는 이종 효소는 시키메이트 탈수소효소이거나; 또는 코리스메이트를 페닐피루베이트로 전환하는 이종 효소는 이관능성 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 탈수효소이다.
일부 실시형태에서, 미생물은 하기를 포함한다.
(1) ecAroE, kivD, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(2) ecAroE, abPPDC, ecPAR, pheA1, 및 aroG;
(3) cgAroE, abPPDC, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(4) ecAroE, abPPDC, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(5) cgAroE, kivD, rrPAR, pheA2, 및 aroG;
(6) ecAroE, abPPDC, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(7) pheA1, aroG, abPPDC, 및 ecPAR;
(8) egAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
(9) ecAroE, abPPDC, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
(10) cgAroE, aro10, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
(11) cgAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
(12) cgAroE, aro10, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(13) ecAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
(14) ecAroE, aro10, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
(15) ecAroE, aro10, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(16) cgAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
(17) cgAroE, aro10, rsPAR, pheA2, 및 aroG;
(18) cgAroE, abPPDC, blPAR, pheA2, 및 aroG;
(19) ecAroE, kivD, blPAR, pheA2, 및 aroG;
(20) cgAroE, aro10, blPAR, pheA2, 및 aroG;
(21) ecAroE, abPPDC, blPAR, pheA2, 및 aroG;
(22) ecAroE, abPPDC, adh6, pheA1, 및 aroG;
(23) cgAroE, abPPDC, adh6, pheA2, 및 aroG;
(24) cgAroE, abPPDC, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
(25) ecAroE, aro10, rsPAR, pheA2, 및 aroG;
(26) ecAroE, aro10, adh6, pheA2, 및 aroG; 또는
(27) ecAroE, abPPDC, ecPAR, pheA2, 및 aroG.
일부 실시형태에서, 미생물은 조합 균주 2C03, 1C10, 2C54, 2C09, 2C47, 2C55, 2C53, H57, 1C47, 2C10, 2A18, 1C54, 2C01, 1C31, 2B17, 2C52, 1C09, H18, H58, 2C27, 2D22, 2D07, 2D24, 2D03, 1C29, 2B26, 2C38, 2A27, 2C12, 또는 2B27의 이종 유전자 및 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 미생물은 2-페닐에탄올을 제조하기 위해 CO, CO2, 및/또는 H2를 포함하는 가스성 기질을 발효시킨다. 일부 실시형태에서, 가스성 기질은 신가스(syngas) 또는 산업 폐기 가스를 포함한다.
일부 실시형태에서, 미생물은 임의의 다른 C3+ 알코올을 생성하지 않는다. 일부 실시형태에서, 미생물은 임의의 다른 C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, 또는 C10 알코올을 생성하지 않는다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 가스성 기질의 존재 하에서 미생물을 배양하는 것을 포함하는 2-페닐에탄올의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 가스성 기질은 CO, CO2, 및/또는 H2를 포함하는 C1-탄소원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가스성 기질은 신가스 또는 산업 폐기 가스를 포함한다.
본 개시내용의 특정 실시형태는 특정 실시형태 및 청구범위에 대한 하기의 보다 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 가스 발효로부터 클로스트리디움 오노에타노게눔(Clostridium autoethanogenum)에 의한 2-페닐에탄올의 생합성을 유도하는 대사 경로를 보여준다. 이종 발현을 요구하는 효소적 단계는 데카르복실라아제 및 페닐아세트알데히드 환원효소(PAR: phenylacetaldehyde reductase) 단계이다. 점선 화살표는 C.오토에타노게눔에서의 다중-효소적 핵심 대사 경로를 도시한다. 탄소와 수소는 우드-륭달 경로에 의해 아세틸-CoA로 동화된 후, 피루베이트:페레독신 옥시도환원효소에 의해 피루베이트로 전환된다. 방향족 아미노산 생합성은 포스포에놀피루베이트 및 에리트로오스-4-포스페이트로 개시되고, 이는 포도당 신생합성과 같은 필수적인 대사 경로 및 펜토오스 포스페이트 경로로부터 생합성된다. 2-페닐피루베이트는 시키메이트 경로로부터 그리고 페닐알라닌과 케토산 사이의 아미노트랜스페라아제 반응에 의해 유래될 수 있다. 본원에 개시된 실시예에서 이종 발현되거나 과발현된 효소는 체크 표시되어 있다. NAD(P)H는 NADPH 및 NADH를 포함한다.
도 2a 및 도 2b는 쇼트(Schott) 바틀에서 상이한 양의 2-PE의 존재 하에서 클로스트리디움 오토에타노게눔의 자가영양 성장을 보여준다. 도 2a: 성장 프로파일; 도 2b: GC-FID에 의해 측정된 2-PE 농도. Unc=확인되지 않음; N=2; 에러 바=S.D.
도 3a는 성장 프로파일을 보여주고, 도 3b는 3개의 데카르복실라아제 균주: abPPDC, aro10 및 대조군 kivD_la 사이에서 쇼트 바틀에서 150 kPa의 합성 기체 블렌드(50% CO, 10% H2, 30% CO2 및 10% N2)를 사용하는 자가영양 성장 중 엔드-포인트 알코올 제조 타이터를 보여준다. N=3; 에러 바=S.D.
도 4a 내지 도 4c는 2-PE 제조에 대한 클로스트리디움 오토에타노게눔에서 페닐아세트알데히드 환원효소(PAR)의 과발현을 보여준다. 도 4a: 종 기원, 아미노산 길이, 공동인자 특이성, 및 이용된 PAR의 레퍼런스. 도 4b: 아미노산 서열을 사용하는 PAR 변이체의 계통발생 트리. 스캐일 바는 아미노산당 0.2의 변화에 해당한다. 도 4c: 200 kPa 합성 기체 블렌드(50% CO, 10% H2, 30% CO2 및 10% N2)의 존재 하에서, 7일의 인큐베이션 후, 12-웰 플레이트에서 상이한 PAR 변이체를 갖는 균주에 의해 정규화된 2-PE 제조; N= 3 내지 5; 에러 바=S.D.
도 5는 금문법(Golden Gate method)을 사용하는 2-PE 경로 유전자의 조합 어셈블리를 보여준다.
도 6은 실시예 4에 기재된 2개의 2-PE 조합 라이브러리에 이용된 프로모터 변이체와 유전자를 보여준다.
도 7 내지 도 7c는 200 kPa 합성 기체 블렌드(50% CO, 10% H2, 30% CO2, 및 10% N2)를 갖는 12-웰 플레이트에서 162개의 2-PE 조합 균주의 특징화를 보여준다. 도 7a: 대조군 균주 sFA212에 대한 2-PE 타이터; 도 7b: 바이오매스 농도에 의해 정규화된 2-PE 타이터; 도 7c: 바이오매스 농도; 인큐베이션 지속기간=8 내지 10일; N=2; 에러 바=S.D.
도 8a 내지 도 8e는 하기에 따른 조합 균주에서 엔드-포인트 2-PE 타이터의 비교를 보여준다: 플라스미드 개수(도 8a); 이관능성 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 탈수효소 변이체(도 8b); 데카르복실라아제 변이체(도 8c); 시키메이트 탈수소효소 변이체(도 8d); 및 페닐아세트알데히드 환원효소 변이체(도 8e). 인큐베이션 지속기간=8 내지 10일; 에러 바=S.D.
도 9a 및 도 9b는 합성 기체 블렌드(40% CO, 20% H2, 20% CO2, 및 20% N2)를 사용하는 연속 CSTR 발효에서 12개의 조합 균주의 특징화를 보여준다. 기준 균주 sFA212에 비해 2-PE 타이터의 2.9-배 증가가 균주 1C29에서 관찰되었다. 10개의 균주는 기준 균주에 비해 더 높은 2-PE 수율을 달성했다.
도 10a 및 도 10b는 질소 제한이 있는 2회의 연속 CSTR 실행에서 조합 균주 1C29의 2-PE 제조를 보여준다.
도 11a 내지 도 11c는 균주 sFA212를 사용하는 연속 CSTR 발효에서 사전 처리된 옥수수 스토버-유래 신가스(23.3% H2, 38.7% CO, 19.6% CO2, 및 18.4% N2)의 효과의 시험 결과를 보여준다. 도 11a: HPLC에 의해 분석된 대사 프로파일; 도 11b: GC-TCD에 의해 분석된 기체 프로파일(음성=흡수); 도 11c: GC-FID에 의해 분석된 2-PE 프로파일. 6.9일 및 10.9일 사이에서(총 4일) 실제 신가스가 사용되었다.
본원에 개시된 것은 신가스로부터의 2-페닐에탄올(2-PE)의 드 노보(de novo) 생합성을 위한 방법과 조성물이고, 이는 2-PE를 제조하기 위한 천연 및 석유화학 공정에 대한 의존성을 경감시키는 잠재력을 갖는다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 전반에 걸쳐 사용되는 하기 용어는 하기와 같이 정의된다:
용어 "발효"는 기질에서 화학적 변화를 일으키는 대사 과정으로 해석되어야 한다. 예를 들어, 발효 공정은 하나 이상의 기질을 수용하고 하나 이상의 미생물의 이용을 통해 하나 이상의 생성물을 생성한다. 용어 "발효", "가스 발효" 등은 가스화에 의해 생성된 신가스와 같은 하나 이상의 기질을 수용하고 하나 이상의 C1-고정 미생물의 이용을 통해 하나 이상의 생성물을 생성하는 공정으로 해석되어야 한다. 바람직하게는, 발효 공정은 하나 이상의 생물반응기의 사용을 포함한다. 발효 공정은 "배치" 또는 "연속"으로 기술될 수 있다. "배치 발효"는 생물반응기가 미생물과 함께 원료, 예를 들어 탄소 공급원으로 충진되며, 발효가 완결될 때까지 생성물이 생물반응기에 남아 있는 발효 공정을 기술하기 위해 사용된다. "배치" 공정에서는 발효가 완결된 후 생성물을 추출하고, 다음 "배치"가 시작되기 전에 생물반응기를 세척한다. "연속 발효"는 발효 공정이 더 오랜 시간 동안 연장되고 발효 도중 생성물 및/또는 대사 산물을 추출하는 발효 공정을 기술하기 위해 사용된다. 바람직하게는 발효 공정은 연속식이다.
용어 "비-천연 발생"은 미생물에 관하여 사용되는 경우, 미생물이 기준 종의 야생형 균주를 포함한 기준 종의 천연 발생 균주에서 발견되지 않는 유전적 변형을 적어도 하나 가짐을 의미한다. 비-천연 발생 미생물은 전형적으로, 실험실 또는 연구 시설에서 개발된다.
용어 "유전적 변형," "유전적 변경," 또는 "유전적 조작"은 광범위하게는 인간에 의한 미생물의 게놈 또는 핵산의 조작을 지칭한다. 마찬가지로, 용어 "유전적으로 변형된," "유전적으로 변경된," 또는 "유전자 조작된"은 이러한 유전적 변형, 유전적 변경 또는 유전적 조작을 함유하는 미생물을 지칭한다. 이들 용어는 실험실-발생된 미생물을 자연-발생 미생물로부터 구별하는 데 사용될 수 있다. 유전적 변형의 방법은 예를 들어 이종성 유전자 발현, 유전자 또는 프로모터 삽입 또는 결실, 핵산 돌연변이, 변경된 유전자 발현 또는 불활성화, 효소 조작, 지향 진화(directed evolution), 지식-기초 설계, 무작위 돌연변이발생 방법, 유전자 셔플링, 및 코돈 최적화를 포함한다.
클로스트리디아와 같은 미생물의 대사 공학은 에탄올과 같은 자연적인 대사 산물 이외의 많은 중요한 연료 및 화학 분자를 생산하는 능력을 엄청나게 확장할 수 있다. 최근에, 인트론 기반 방법(ClosTron)(문헌[Kuehne, Strain Eng: Methods and Protocols, 389-407, 2011]), 대립형질 교환 방법(ACE)(문헌[Heap, Nucl Acids Res, 40: e59, 2012; Ng, PLoS One, 8: e56051, 2013]), 삼계 교배(Triple Cross)(문헌[Liew, Frontiers Microbiol, 7: 694, 2016]), I-SceI를 통해 매개된 방법(문헌[Zhang, Journal Microbiol Methods, 108: 49-60, 2015]), MazF(문헌[Al-Hinai, Appl Environ Microbiol, 78: 8112-8121, 2012]) 또는 기타 다른 방법(문헌[Argyros, Appl Environ Microbiol, 77: 8288-8294, 2011]), Cre-Lox(문헌[Ueki, mBio, 5: e01636-01614, 2014]), 및 CRISPR/Cas9(문헌[Nagaraju, Biotechnol Biofuels, 9: 219, 2016])을 포함하여 클로스트리디아에 대한 게놈 공학을 위한 여러 가지 상이한 방법이 개발되어 왔다. 그러나, 느리고 힘든 사이클링 시간과 종 간의 이러한 유전 기술의 이전 가능성에 대한 제한으로 인해 몇 가지 이상의 유전적 변화를 반복적으로 도입하는 것은 매우 어려운 도전 과제로 여전히 남아 있다. 추가로, 클로스트리디아의 C1 대사가 C1 흡수, 전환, 및 생성물 합성을 향한 탄소/에너지/산화환원 흐름을 최대화할 변형을 안정적으로 예측할 만큼 아직 충분히 이해되지 않는다. 따라서, 클로스트리디아에 표적 경로를 도입하는 것은 여전히 지루하고 시간이 많이 걸리는 과정으로 남아 있다.
"재조합형"은 핵산, 단백질 또는 미생물이 유전적 변형, 조작 또는 재조합의 생성물임을 나타낸다. 일반적으로, 용어 "재조합형"은 다수의 공급원, 예컨대 둘 이상의 상이한 균주 또는 종의 미생물로부터 유래되는 유전적 물질을 함유하거나 이에 의해 인코딩되는 핵산, 단백질 또는 미생물을 지칭한다.
"야생형"은 이것이 자연에서 발생하며 돌연변이체 또는 변이체 형태로부터 구분되는 바와 같이 유기체, 균주, 유전자 또는 특징의 전형적인 형태를 지칭한다.
"내인성" 또는 "천연"은 본 개시내용의 미생물이 유래하는 야생형 또는 부모 미생물에 존재하거나 발현하는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 내인성 유전자는 본 개시내용의 미생물이 유래되는 야생형 또는 부모 미생물에 천연적으로 존재하는 유전자이다. 일 실시형태에서, 내인성 유전자의 발현은 외인성 조절 요소, 예컨대 외인성 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
"외인성"은 본 개시내용의 미생물의 외부에서 기원하는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 외인성 유전자 또는 효소는 인공적으로 또는 재조합적으로 생성되고 본 개시내용의 미생물에 도입되거나 발현될 수 있다. 외인성 유전자 또는 효소는 또한 이종성 미생물로부터 단리되고 본 개시내용의 미생물에 도입되거나 발현될 수 있다. 외인성 핵산은 본 개시내용의 미생물의 게놈 내로 통합되거나 본 개시내용의 미생물에서 염색체-외 상태, 예를 들어 플라스미드에 잔류하도록 적응될 수 있다.
"이종"은 본 개시내용의 미생물이 유래하는 야생형 또는 부모 미생물 내에 존재하지 않는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 이종 유전자 또는 효소는 상이한 균주 또는 종으로부터 유래되고 본 개시내용의 미생물 내에 도입 또는 발현될 수 있다. 이종 유전자 또는 효소는 이것이 상이한 균주 또는 종에서 발생하는 형태로 본 개시내용의 미생물 내에 도입 또는 발현될 수 있다. 대안적으로, 이종 유전자 또는 효소는 일부 방식으로 예를 들어 본 개시내용의 미생물에서의 발현을 위해 이를 코돈-최적화함으로써 또는 기능을 변경시키기 위해, 예컨대 효소 활성의 방향을 역전시키거나 기질 특이성을 변경시키기 위해 이를 조작함으로써 변형될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드," "뉴클레오티드," "뉴클레오티드 서열," "핵산," 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용된다. 이들은 임의의 길이의 뉴클레오티드(데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드)의 중합체성 형태, 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 공지되거나 공지되지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연결 분석으로부터 정의된 유전자좌(유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은-헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합형 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 주어질 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 간섭될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 예컨대 표지화 성분과의 컨쥬게이션에 의해 추가로 변형될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터 (예컨대 mRNA 또는 다른 RNA 전사체로) 전사되는 과정, 및/또는 전사된 mRNA가 후속하여 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사체 및 인코딩된 폴리펩티드는 통틀어 "유전자 생성물"로 지칭될 수 있다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드," 및 "단백질"는 본원에서 상호교환적으로 사용되어, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 중합체는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 중합체는 비-아미노산에 의해 간섭될 수 있다. 상기 용어는 또한 하기에 의해 변형되었던 아미노산을 포괄한다: 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작, 예컨대 표지화 성분과의 컨쥬게이션. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 둘 모두를 포함한 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산, 및 아미노산 유사체 및 펩티도모방체를 포함한다.
"효소 활성," 또는 간단히 "활성"은 광범위하게는 비제한적으로 반응을 촉매하기 위한 효소의 활성, 효소의 양 또는 효소의 유용성을 포함한 효소적 활성을 지칭한다. 이에, 효소 활성을 "증가시키는" 것은 반응을 촉매화하기 위해 효소의 활성을 증가시키거나, 효소의 양을 증가시키거나, 효소의 유용성을 증가시키는 것을 포함한다. 유사하게는, 효소 활성을 "저하시키는" 것은 반응을 촉매화하기 위해 효소의 활성을 저하시키거나, 효소의 양을 저하시키거나, 효소의 유용성을 저하시키는 것을 포함한다.
"코돈 최적화"는 특정 균주 또는 종에서 핵산의 최적화된 또는 향상된 번역을 위한 핵산, 예컨대 유전자의 돌연변이를 지칭한다. 코돈 최적화는 더 신속한 번역 속도 또는 더 높은 번역 정확도를 초래할 수 있다.
"과발현된"은 본 개시내용의 미생물이 유래되는 야생형 또는 부모 미생물과 비교하여 본 개시내용의 미생물에서 핵산 또는 단백질의 발현의 증가를 지칭한다. 과발현은 유전자 복사 수, 유전자 전사 속도, 유전자 번역 속도 또는 효소 분해 속도를 변형시키는 것을 포함한 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다.
용어 "변이체"는 핵산 및 단백질의 서열이 기준 핵산 및 단백질의 서열, 예컨대 선행 기술에 개시되거나 본원에 예시된 기준 핵산 및 단백질의 서열로부터 달라진 핵산 및 단백질을 포함한다. 본 개시내용의 방법 및 조성물은 기준 핵산 또는 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 변이체 핵산 또는 단백질을 사용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 변이체 단백질은 기준 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 수행하거나 실질적으로 동일한 반응을 촉매화할 수 있다. 변이체 유전자는 기준 유전자와 동일한 단백질 또는 실질적으로 동일한 단백질을 인코딩할 수 있다. 변이체 프로모터는 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진하는 기준 프로모터와 실질적으로 동일한 능력을 가질 수 있다.
상기 핵산 또는 단백질은 본원에서 "기능적으로 등가인 변이체" 또는 "기능성 동족체"로서 지칭될 수 있다. 예로써, 핵산의 기능적으로 동등한 변이체는 대립유전자 변이체, 유전자 절편, 돌연변이 유전자, 다형성 및 동등물을 포함할 수 있다. 다른 미생물로부터의 상동성 유전자 또한 기능적으로 등가인 변이체의 예이다. 이들은 종, 예컨대 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 클로스트리디움 베이예린키이 또는 클로스트리디움 륭달리이 내의 상동성 유전자를 포함하고, 이들의 세부사항은 웹사이트, 예컨대 Genbank 또는 NCBI 상에서 공개적으로 입수 가능하다. 기능적으로 등가인 변이체는 또한 핵산의 서열이 특정 미생물에 대한 코돈 최적화의 결과 달라지는 핵산을 포함한다. 핵산의 기능적으로 등가인 변이체는 바람직하게는 기준 핵산과 적어도 대략 70%, 대략 80%, 대략 85%, 대략 90%, 대략 95%, 대략 98% 또는 그 이상의 핵산 서열 동일성(상동성 퍼센트)을 가질 것이다. 단백질의 기능적으로 등가인 변이체(즉, 기능성 동족체)는 바람직하게는 기준 단백질과 적어도 대략 70%, 대략 80%, 대략 85%, 대략 90%, 대략 95%, 대략 98% 또는 그 이상의 아미노산 동일성(상동성 퍼센트)을 가질 것이다. 변이체 핵산 또는 단백질의 기능적 등가성은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
핵산 또는 아미노산 서열 동일성은 2개의 배열된 서열 간의 동일한 아미노산 서열을 필요로 한다. 따라서, 기준 서열과 80% 핵산 또는 아미노산 동일성을 공유하는 후보 서열은, 배열 후, 후보 서열 중 80%의 핵산 또는 아미노산이 기준 서열 중 상응하는 핵산 또는 아미노산과 동일하도록 요구된다. 본 발명에 따른 동일성은 컴퓨터 분석, 예컨대, 비제한적으로, ClustalW 컴퓨터 정렬 프로그램(문헌[Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-4680]), 및 이에 제안된 디폴트 파라미터의 보조에 의해 결정된다. 예를 들어, ClustalW 소프트웨어와 이의 디폴트 세팅을 사용하여, 쿼리의 성숙한(생활성) 부분과 기준 폴리펩티드가 배열된다. 완전 보존된 잔기의 수가 계수되고, 이를 기준 폴리펩티드의 길이로 나눈다.
핵산은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 본 개시내용의 미생물에 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 노출 핵산으로서 전달될 수 있거나, 하나 이상의 작용제, 예컨대 리포솜으로 제제화될 수 있다. 핵산은 적절하다면 DNA, RNA, cDNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 제한 저해제는 특정한 실시형태에서 사용될 수 있다. 추가의 벡터는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 코스미드 및 인공 염색체를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 핵산은 플라스미드를 사용하여 본 개시내용의 미생물에 전달될 수 있다. 예로서, 형질전환(형질도입 또는 형질감염을 포함함)은 전기천공, 초음파처리, 폴리에틸렌 글리콜-매개 형질전환, 화학적 또는 천연 적격(competence), 원생동물 형질전환, 프로파지(prophage) 유도 또는 컨쥬게이션에 의해 달성될 수 있다. 활성 제한 효소 시스템을 갖는 특정한 실시형태에서, 핵산을 미생물 내로 도입하기 전에 핵산을 메틸화하는 것이 필요할 수 있다.
추가로, 핵산은 특정 핵산을 증가시키거나 아니면 이의 발현을 제어하기 위해, 프로모터와 같은 조절 요소를 포함하도록 고안될 수 있다. 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도적 프로모터일 수 있다. 이상적으로, 프로모터는 우드-륭달 경로 프로모터, 페레독신 프로모터, 피루베이트:페레독신 옥시도환원효소 프로모터, Rnf 복합체 오페론 프로모터, ATP 합성효소 오페론 프로모터, 또는 포스포트랜스아세틸라아제/아세테이트 키나아제 오페론 프로모터이다.
"미생물"은 현미경적 유기체, 특히, 박테리아, 고세균, 바이러스 또는 진균류이다. 본 개시내용의 미생물은 통상적으로 박테리아이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "미생물"에 대한 언급은 "박테리아"를 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
"모 미생물(parental microorganism)"은 본 개시내용의 미생물을 생성하는데 사용되는 미생물이다. 모체 미생물은 자연 발생 미생물(즉, 야생형 미생물) 또는 사전에 변형되었던 미생물(즉, 돌연변이 또는 재조합 미생물)일 수 있다. 본 개시내용의 미생물은 모 미생물에서 발현되지 않거나 과발현되지 않은 하나 이상의 효소를 발현하거나 과발현하도록 변형될 수 있다. 유사하게, 본 개시내용의 미생물은 모 미생물이 함유하지 않은 하나 이상의 유전자를 함유하도록 변형될 수 있다. 본 개시내용의 미생물은 또한 모 미생물에서 발현된 하나 이상의 효소를 발현하지 않거나 더 적은 양으로 발현하도록 변형될 수 있다. 일 실시형태에서, 모 미생물은 클로스트리디움 오토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리, 또는 클로스트리디움 라그스달레이이다. 바람직한 실시형태에서, 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노게눔 LZ1561이고, 이것은 부다페스트 조약의 조건에 따라 2010년 6월 7일에 독일 브라운슈바이크 D-38124 인호펜슈트라쎄 7B에 소재하는 독일 생물 자원센터(DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 기탁되고 수탁 번호 DSM23693가 부여되었다. 이 균주는 국제공개 WO 2012/015317호로 공개된 국제출원 PCT/NZ2011/000144호에 기술되어 있다.
용어 "~로부터 유래된"은 핵산, 단백질, 또는 미생물이 상이한(예를 들어, 부모 또는 야생형) 핵산, 단백질 또는 미생물로부터 변형되거나 또는 적응되어 새로운 핵산, 단백질, 또는 미생물을 생성하는 것을 나타낸다. 이러한 변형 또는 적응은 전형적으로는 핵산 또는 유전자의 삽입, 결실, 돌연변이 또는 치환을 포함한다. 일반적으로, 본 개시내용의 미생물은 모 미생물로부터 유래된다. 일 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 클로스트리디움 오토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리, 또는 클로스트리디움 라그스달레이로부터 유래된다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 DSMZ 수탁 번호 DSM23693으로 기탁된 클로스트리디움 오토에타노게눔 LZ1561로부터 유래된다.
본 개시내용의 미생물은 기능적 특징에 기초하여 추가로 분류될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 미생물은 C1-고정 미생물, 혐기성 생물, 아세토겐, 에탄올로겐, 일산화탄소 영양 생물 및/또는 메탄영양체일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 표 1은 미생물의 대표적인 목록을 제공하고, 이들의 기능적인 특징을 식별한다.
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"우드-륭달"은 예를 들어 문헌[Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008]에 기술된 바와 같은 탄소 고정의 우드-륭달 경로를 지칭한다. "우드-륭달 미생물"은 예상대로 우드-륭달 경로를 함유하는 미생물을 지칭한다. 일반적으로, 본 발명의 미생물은 본연의 우드-륭달 경로를 함유한다. 본원에서, 우드-륭달 경로는 본연의, 비변형된 우드-륭달 경로일 수 있거나, 우드-륭달 경로는 이 경로가 CO, CO2, 및/또는 H2를 아세틸-CoA로 전환하는 작용을 여전히 하는 한 어느 정도의 유전적 변형(예를 들어, 과발현, 이종성 발현, 녹아웃 등)을 갖는 우드-륭달 경로일 수 있다.
"C1"은 1-탄소 분자, 예를 들어, CO, CO2, CH4 또는 CH3OH를 지칭한다. "C1-옥시게네이트"는 적어도 하나의 산소 원자를 또한 포함하는 1-탄소 분자, 예를 들어, CO, CO2 또는 CH3OH를 지칭한다. "C1-탄소 공급원"은 본 발명의 미생물에 대한 부분 또는 단독 탄소 공급원으로서 작용하는 1개의 탄소-분자를 지칭한다. 예를 들어, C1-탄소 공급원은 CO, CO2, CH4, CH3OH 또는 CH2O2 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, C1-탄소 공급원은 CO 및 CO2 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. "C1-고정 미생물"은 C1 탄소 공급원으로부터 하나 이상의 생성물을 생성하는 능력을 갖는 미생물이다. 전형적으로, 본 개시내용의 미생물은 C1-고정 박테리아이다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 C1-고정 미생물로부터 유래된다.
"혐기성 생물"은 성장을 위해 산소를 필요로 하지 않는 미생물이다. 혐기성 생물은 산소가 특정 임계치를 초과하여 존재하는 경우 부정적으로 반응하거나 심지어 사멸할 수도 있다. 그러나, 일부 혐기성 생물은 낮은 수준(예를 들어, 0.000001% 내지 5% 산소)의 산소를 견딜 수 있다. 통상적으로, 본 개시내용의 미생물은 혐기성 생물이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 혐기성 생물로부터 유래된다.
"아세토겐"은 에너지 보존, 및 아세틸-CoA 및 아세틸-CoA 유래 생성물, 예를 들어 아세테이트의 합성을 위한 이의 주요 기전으로서 우드-륭달 경로를 사용하는 절대적 혐기성 박테리아이다(문헌[Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008]). 특히, 아세토겐은 (1) CO2로부터 아세틸-CoA의 환원적 합성을 위한 기전, (2) 말단 전자-수용, 에너지 보존 과정, (3) 세포 탄소의 합성에서 CO2의 고정(동화)을 위한 기전으로서 우드-륭달 경로를 사용한다(문헌[Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 3rd edition, p. 354, New York, NY, 2006]). 모든 자연 발생 아세토겐은 C1-고정, 혐기성, 독립 영양 생물, 및 비-메탄 영양 생물이다. 통상적으로, 본 개시내용의 미생물은 아세토겐이다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 아세토겐으로부터 유래된다.
"에탄올로겐"은 에탄올을 생성하거나 생성할 수 있는 미생물이다. 통상적으로, 본 개시내용의 미생물은 에탄올로겐이다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 에탄올로겐으로부터 유래된다.
"독립 영양 생물"은 유기 탄소의 부재 하에 성장할 수 있는 미생물이다. 대신에, 독립 영양 생물은 무기 탄소 공급원, 예를 들어 CO 및/또는 CO2를 사용한다. 통상적으로, 본 개시내용의 미생물은 독립 영양 생물이다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 자가영양 생물로부터 유래된다.
"일산화탄소 영양 생물"은 탄소 및 에너지의 단독 공급원으로서 CO를 이용할 수 있는 미생물이다. 통상적으로, 본 개시내용의 미생물은 일산화탄소 영양 생물이다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 일산화탄소 영양 생물로부터 유래된다.
"메탄 영양 생물"은 탄소 및 에너지의 유일한 공급원으로서 메탄을 이용할 수 있는 미생물이다. 특정한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 메탄 영양 생물이거나 메탄 영양 생물로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 메탄 영양 생물이 아니거나 메탄 영양 생물로부터 유래되지 않는다.
보다 광범위하게는, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 임의의 속 또는 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미생물은 아세토박테리움, 알칼리바쿨룸, 블라우티아, 부티리박테리움, 클로스트리디움, 유박테리움, 무렐라, 옥소박테르, 스포로무사, 및 써모아나에로박터로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 구성원일 수 있다. 특히, 미생물은 아세토박테리움 우디이, 알칼리바쿨룸 박키이, 블라우티아 프로덕타, 부티리박테리움 메틸로트로피쿰, 클로스트리디움 아세티쿰, 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 카르복시디보란스, 클로스트리디움 코스카티이, 클로스트리디움 드라케이, 클로스트리디움 포르미코아세티쿰, 클로스트리디움 륭달리이, 클로스트리디움 마그눔, 클로스트리디움 라그스달레이, 클로스트리디움 스카톨로게네스, 유박테리움 리모숨, 무렐라 테르마우토트로피카, 무렐라 테르모아세티카, 옥소박터 펜니기이, 스포로무사 오바타, 스포로무사 실바세티카, 스포로무사 스파에로이데스, 및 써모아나에로박터 키부이로 이루어진 군으로부터 선택되는 부모 박테리아로부터 유래될 수 있다.
이들 유형의 미생물은 생명의 열역학적 한계에서 생존하는 것으로 알려져 있고(문헌[Schuchmann, Nat Rev Microbiol, 12: 809-821, 2014]), 따라서, 본 발명 이전에, 특히 2-PE가 이들 미생물에 대해 독성 효과를 가질 가능성을 고려할 때, 이들이 유의한 양으로 훨씬 적게, C8 방향족 알코올을 전부 합성할 수 있는지는 알려져 있지 않았다.
바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이 및 클로스트리디움 라그스달레이 종을 포함하는 클로스트리디아의 클러스터로부터 유래된다. 이들 종은 문헌[Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994](클로스트리디움 오토에타노게눔), 문헌[Tanner, Int J System Bacteriol, 43: 232-236, 1993](클로스트리디움 륭달리이) 및 Huhnke의 국제공개 WO 2008/028055호(클로스트리디움 라그스달레이)에 의해 처음으로 보고되고 특성화되었다.
이들 3개 종은 많은 유사성을 갖는다. 특히, 이들 종은 모두 클로스트리디움 속의 C1 고정, 혐기성, 아세토겐성, 에탄올로겐성, 및 일산화탄소 영양성 구성원이다. 이들 종은 유사한 유전자형 및 표현형, 및 에너지 보존 및 발효 대사 방식을 갖는다. 더욱이, 이들 종은, 99% 초과로 동일한 16S rRNA DNA를 갖는 클로스트리디움 rRNA 상동 그룹 I 내에 군집지어지며, 약 22 내지 30 몰%의 DNA G + C 함량을 가지며, 그람 양성이며, 유사한 형태 및 크기를 갖고(0.5 내지 0.7 x 3 내지 5 μm 사이의 대수 성장 세포), 중온성이며(30 내지 37℃에서 최적 성장), 약 4 내지 7.5의 유사한 pH 범위를 갖고(최적 pH 약 5.5 내지 6를 가짐), 시토크롬이 없고, Rnf 복합체를 통해 에너지를 보존한다. 또한, 카르복실산으로부터 이들의 상응하는 알코올로의 환원이 이들 종에서 나타났다(문헌[Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012]). 중요하게는, 이들 종은 또한 모두 특정 조건 하에 CO-함유 가스 상에서 강한 독립영양 성장을 보여주며, 에탄올 및 아세테이트(또는 아세트산)를 주 발효 생성물로서 생산하고, 소량의 2,3-부탄디올 및 락트산을 생성한다.
그러나, 이들 3개 종은 또한 많은 차이를 갖는다. 이들 종은 상이한 공급원들로부터 단리되었다: 토끼 소화관으로부터의 클로스트리디움 오토에타노게눔, 양계장 폐기물로부터 클로스트리디움 륭달리이, 및 담수 침강물로부터의 클로스트리디움 라그스달레이. 이들 종은 다양한 당(예를 들어, 람노스, 아라비노스), 산(예를 들어, 글루코네이트, 시트레이트), 아미노산(예를 들어, 아르기닌, 히스티딘), 및 다른 기질(예를 들어, 베타인, 부탄올)의 사용 면에서 상이하다. 더욱이, 이들 종은 특정 비타민(예를 들어, 티아민, 비오틴)에 대한 영양요구성 면에서 상이하다. 이들 종은 우드-륭달 경로 유전자 및 단백질의 핵산 및 아미노산 서열에서 차이를 갖지만, 이들 유전자 및 단백질의 일반적인 구성 및 수는 모든 종들에서 동일한 것으로 밝혀졌다(문헌[Kφpke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011]).
따라서, 요약하자면, 클로스트리디움 오토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이 또는 클로스트리디움 라그스달레이의 특징들 중 많은 것들은 해당 종에 특이적이지 않으며, 그보다는 클로스트리디움 속의 C1 고정, 혐기성, 아세토겐성, 에탄올로겐성, 및 일산화탄소영양성 구성원의 이 클러스터에 대한 일반적인 특징이다. 그러나, 이들 종은 실제로 구별되기 때문에, 이들 종 중 하나의 유전자 변형 또는 조작은 이들 종 중 다른 것에서 동일한 효과를 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, 성장, 성능 또는 생성물 생성에서의 차이가 관찰될 수 있다.
"기질"은 본 개시내용의 미생물에 대한 탄소 및/또는 에너지 공급원을 지칭한다. 통상적으로, 기질은 기체이며, C1-탄소 공급원, 예를 들어 CO, CO2, 및/또는 CH4를 포함한다. 바람직하게는, 기질은 CO 또는 CO + CO2의 C1-탄소 공급원을 포함한다. 기질은 다른 비-탄소 성분, 예를 들어, H2, N2 또는 전자를 추가로 포함할 수 있다.
상기 기질은 일반적으로 적어도 일부 양의 CO, 예를 들어 약 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 몰%의 CO를 포함한다. 기질은 일정 범위의 CO, 예를 들어 약 20 내지 80, 30 내지 70, 또는 40 내지 60 몰%의 CO를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 기질은 약 40 내지 70 몰%의 CO(예를 들어, 제철소 또는 용광로 가스), 약 20 내지 30 몰%의 CO(예를 들어, 순산소로(basic oxygen furnace) 가스), 또는 약 15 내지 45 몰%의 CO(예를 들어, 합성 가스)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 기질은 비교적 소량의 CO, 예를 들어 약 1 내지 10 또는 1 내지 20 몰%의 CO를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 미생물은 통상적으로 기질 내 적어도 일부의 CO를 생성물로 전환시킨다. 일부 실시형태에서, 기질은 CO를 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는다(1 몰% 미만).
기질은 일정량의 H2를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기질은 약 1, 2, 5, 10, 15, 20, 또는 30 몰%의 H2를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 기질은 비교적 많은 양의 H2, 예를 들어 약 60, 70, 80, 또는 90 몰% H2를 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 기질은 H2를 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는다(1 몰% 미만).
기질은 일정량의 CO2를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기질은 약 1 내지 80 또는 1 내지 30 몰%의 CO2를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 기질은 약 20, 15, 10 또는 5 몰% 미만의 CO2를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 기질은 CO2를 포함하지 않거나 CO2를 실질적으로(1 몰% 미만) 포함하지 않는다.
기질은 통상적으로 기체이긴 하지만, 기질은 대안적인 형태로도 제공될 수 있다. 예를 들어, 기질은 마이크로버블 분산액 생성기(microbubble dispersion generator)를 사용하여 CO-함유 가스로 포화된 액체에 용해될 수 있다. 추가의 예로서, 기질은 고체 지지체에 흡착될 수 있다.
기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 산업 공정의 부산물로서 또는 일부 다른 공급원, 예를 들어 자동차 배기 매연, 전기분해, 열분해, 반탄화, 또는 가스화로부터 수득된 폐가스일 수 있다. 예를 들어, 폐기물은 열분해, 반탄화, 또는 가스화에 의해 재순환되어 기질 및/또는 C1-탄소 공급원을 생성할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 산업 공정은 제강 제조 등의 철금속 제품 제조, 비철금속 제품 제조, 석유 정제, 석탄 가스화, 전력 생산, 카본 블랙 생산, 종이 및 펄프 제조, 흑색 리큐어 가스화, 암모니아 생산, 메탄올 생산, 코크 제조로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 실시형태에서, 기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 대기 중으로 배출되기 전에 임의의 편리한 방법을 사용하여 산업 공정으로부터 포집할 수 있다.
기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 신가스, 예컨대 석탄 또는 정제 잔류물의 가스화, 바이오매스 또는 리그노셀룰로오스성 물질의 가스화, 또는 천연 가스의 개질(reforming)에 의해 수득되는 신가스일 수 있다. 다른 실시형태에서, 신가스는 도시 고체 폐기물 또는 산업 고체 폐기물의 가스화로부터 수득될 수 있다.
기질의 조성은 반응의 효율 및/또는 비용에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 산소(O2)의 존재는 혐기성 발효 공정의 효율을 감소시킬 수 있다. 기질의 조성에 따라, 임의의 원치 않는 불순물, 예를 들어 독소, 원치 않는 성분, 또는 먼지 입자를 제거하고/하거나 바람직한 성분의 농도를 증가시키기 위해 상기 기질을 처리하거나 스크럽하거나 여과하는 것이 바람직할 수 있다.
특정한 실시형태에서, 발효는 당, 전분, 리그닌 셀룰로오스 또는 헤미셀룰로오스와 같은 탄수화물 기질의 부재 하에 수행된다.
본 개시내용의 미생물은 기체성 기질로 배양되어 하나 이상의 생성물을 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 미생물은 에탄올(국제공개 WO 2007/117157호), 아세테이트(국제공개 WO 2007/117157호), 1-부탄올(국제공개 WO 2008/115080호, WO 2012/053905호, 및 WO 2017/066498호), 부티레이트(국제공개 WO 2008/115080호), 2,3-부탄디올(국제공개 WO 2009/151342호 및 WO 2016/094334호), 락테이트(국제공개 WO 2011/112103호), 부텐(국제공개 WO 2012/024522호), 부타디엔(국제공개 WO 2012/024522호), 메틸 에틸 케톤(2-부타논)(국제공개 WO 2012/024522호 및 WO 2013/185123호), 에틸렌(국제공개 WO 2012/026833호), 아세톤(국제공개 WO 2012/115527호), 이소프로판올(국제공개 WO 2012/115527호), 지질(국제공개 WO 2013/036147호), 3-히드록시프로피오네이트(3-HP)(국제공개 WO 2013/180581호), 테르펜, 예를 들어 이소프렌(국제공개 WO 2013/180584호), 지방산(국제공개 WO 2013/191567호), 2-부탄올(국제공개 WO 2013/185123호), 1,2-프로판디올(국제공개 WO 2014/036152호), 1-프로판올(국제공개 WO 2017/066498호), 1-헥산올(국제공개 WO 2017/066498호), 1-옥탄올(국제공개 WO 2017/066498호), 코리스메이트-유래 생성물(국제공개 WO 2016/191625호), 3-히드록시부티레이트(국제공개 WO 2017/066498호), 1,3-부탄디올(국제공개 WO 2017/066498호), 2-히드록시이소부티레이트 또는 2-히드록시이소부티르산(국제공개 WO 2017/066498호), 이소부틸렌(국제공개 WO 2017/066498호), 아디프산(국제공개 WO 2017/066498호), 1,3 헥산디올(국제공개 WO 2017/066498호), 3-메틸-2-부탄올(국제공개 WO 2017/066498호), 2-부텐-1-올(국제공개 WO 2017/066498호), 이소발레레이트(국제공개 WO 2017/066498호), 이소아밀 알코올(국제공개 WO 2017/066498호), 및/또는 모노에틸렌 글리콜(국제공개 WO 2019/126400호)에 더불어 2-페닐에탄올을 생성할 수 있거나 이를 생성하도록 조작될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 미생물 바이오매스 자체는 생성물로 간주될 수 있다. 이러한 생성물은 디젤, 제트 연료 및/또는 가솔린 중 적어도 하나의 성분을 제조하도록 추가로 전환될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 2-페닐에탄올은 프레이그런스, 에센셜 오일, 향미료, 및 비누의 성분으로서 사용될 수 있다. 추가로, 미생물 바이오매스는 추가로 처리되어 단세포 단백질(SCP)을 생산할 수 있다.
"천연 생성물"은 유전적으로 비변형된 미생물에 의해 생성되는 생성물이다. 예를 들어, 에탄올, 아세테이트 및 2,3-부탄디올은 클로스트리디움 오토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리 및 클로스트리디움 라그스달레이의 천연 생성물이다. "비-천연 생성물"은 유전적으로 변형된 미생물에 의해 생성되지만, 유전적으로 변형된 미생물이 유래되는 유전적으로 변형되지 않은 미생물에 의해서는 생성되지 않는 생성물이다.
"선택성"은 목표 생성물의 생성량 대 미생물에 의해 생성된 모든 발효 생성물의 생성량의 비율을 지칭한다. 본 개시내용의 미생물은 특정 선택성 또는 최소 선택성으로 생성물을 생성하도록 조작될 수 있다. 일 실시형태에서, 목표 생성물은 본 개시내용의 미생물에 의해 생성된 전체 발효 생성물의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50% 또는 75%를 차지한다. 일 실시형태에서, 표적 생성물은 본 개시내용의 미생물에 의해 생성되는 모든 발효 생성물 중 적어도 약 10%를 차지하여, 본 개시내용의 미생물이 적어도 10%의 표적 생성물에 대한 선택성을 갖도록 한다. 다른 실시형태에서, 표적 생성물은 본 개시내용의 미생물에 의해 생성되는 모든 발효 생성물 중 적어도 약 30%를 차지하여, 본 개시내용의 미생물이 적어도 30%의 표적 생성물에 대한 선택성을 갖도록 한다.
"효율을 증가시키는 것," "증가된 효율" 등은 성장 속도, 생성물 생성 속도 또는 부피, 소모되는 기질의 1부피당 생성물 부피, 또는 생성물 선택도를 증가시키는 것을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 효율은 본 개시내용의 미생물이 유래되는 부모 생성물의 성능에 비해 측정될 수 있다.
통상적으로, 배양은 생물반응기에서 수행된다. 용어 "생물반응기"는 하나 이상의 용기, 탑, 또는 배관 구성으로 구성된 배양/발효 장치, 예를 들어 연속 교반식 탱크 반응기(CSTR: continuous stirred tank reactor), 고정화 세포 반응기(ICR: immobilized cell reactor), 살수층 반응기(TBR: trickle bed reactor), 버블 컬럼(bubble column), 가스 리프트 발효조(gas lift fermenter), 정적 혼합기(static mixer), 또는 기액 접촉에 적합한 다른 용기 또는 다른 장치를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 생물반응기는 제1 성장 반응기 및 제2 배양/발효 반응기를 포함할 수 있다. 기질은 이들 반응기 중 하나 또는 둘 모두에 제공될 수 있다. 본원에서, 용어 "배양" 및 "발효"는 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 배양/발효 공정의 성장 단계 및 생성물 생합성 단계 둘 모두를 포함한다.
배양물은 일반적으로 상기 미생물이 성장하도록 하기에 충분한 영양분, 비타민 및/또는 미네랄을 함유하는 수성 배양 배지에서 유지된다. 바람직하게는, 수성 배양 배지는 혐기성 미생물 성장 배지, 예를 들어 최소 혐기성 미생물 성장 배지이다. 적합한 배지는 당업계에 널리 공지되어 있다.
배양/발효는 바람직하게는 표적 생성물의 제조를 위한 적절한 조건 하에 수행되어야 한다. 통상적으로, 배양/발효는 혐기성 조건 하에 수행된다. 고려해야 할 반응 조건은 압력(또는 분압), 온도, 가스 유량, 액체 유량, 배지 pH, 배지 산화환원 전위, 교반 속도(연속 교반식 탱크 반응기를 사용하는 경우), 접종원 수준, 액상 중의 가스를 제한하지 않는 최대 가스 기질 농도, 및 생성물 억제를 피하기 위한 최대 생성물 농도를 포함한다. 특히, 생성물이 기체 제한 조건 하에 배양에 의해 소모될 수 있으므로, 기질의 도입 속도는 액상에서의 기체의 농도가 제한되지 않도록 제어할 수 있다.
특정한 실시형태에서, 발효는 광의 부재 하에, 또는 광합성 미생물의 에너지 요건을 충족시키기에 불충분한 양의 광의 존재 하에 수행된다. 특정한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 비-광합성 미생물이다.
일부 실시형태에서, 2-페닐에탄올은 예를 들어 분별 증류, 증발, 투과증발, 가스 스트리핑, 상 분리 및 예를 들어 액체-액체 추출을 비롯한 추출 발효를 비롯한 당업계에 공지된 임의의 방법 또는 방법들의 조합을 사용하여 발효 브로쓰로부터 분리되거나 정제될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 2-페닐에탄올은 발효 브로쓰의 일부를 생물반응기로부터 연속적으로 제거하며 미생물 세포를 상기 브로쓰로부터(편리하게는 여과에 의해) 분리하고 2-페닐에탄올을 브로쓰로부터 회수함으로써 발효 브로쓰로부터 회수된다. 일반적으로, 알코올 및/또는 아세톤은 예를 들어 증류에 의해 회수될 수 있다. 분리된 미생물 세포는 바람직하게는 다시 생물반응기로 재순환된다. 2-페닐에탄올이 제거된 후 남은 무세포 투과액은 또한 바람직하게는 생물반응기로 되돌아간다. 배지가 생물반응기로 되돌아가기 전에 배지를 보충하기 위해 무세포 투과액에 추가 영양소를 첨가할 수 있다.
실시형태
일 실시형태에서, 본 개시내용은 2-페닐에탄올을 제조할 수 있는 미생물을 제공하고, 여기서 미생물은 페닐피루베이트를 페닐아세트알데히드로 전환하는 이종 효소 및 페닐아세트알데히드를 2-페닐에탄올로 전환하는 이종 효소를 포함한다.
일부 실시형태에서, 페닐피루베이트를 페닐아세트알데히드로 전환하는 이종 효소는 데카르복실라아제이고, 페닐아세트알데히드를 2-페닐에탄올로 전환하는 이종 효소는 페닐아세트알데히드 환원효소이다. 특히, 데카르복실라아제는 페닐피루베이트-특이적 데카르복실라아제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 데카르복실라아제 효소를 인코딩하는 핵산은 aro10(사카로마이세스 세레비시아에 유래) 또는 abPPDC(아조스피릴리움 브라실렌스 유래)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이종 데카르복실라아제 효소를 인코딩하는 핵산은 하기를 포함한다: (i) 서열 번호: 1, 2, 또는 4; (ii) 서열 번호: 1, 2, 또는 4로 인코딩된 데카르복실라아제 효소와 기능적으로 상동성인 데카르복실라아제 효소를 인코딩하는 서열 번호: 1, 2, 또는 4와 적어도 90% 동일한 핵산; 또는 (iii) 서열 번호: 1, 2, 또는 4로 인코딩된 데카르복실라아제 효소와 적어도 90% 동일한 기능적으로 상동성인 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산.
일부 실시형태에서, 이종 데카르복실라아제 효소를 인코딩하는 핵산은 aro10, abPPDC, 또는 서열 번호: 1, 2, 또는 4, 또는 예를 들어 이와 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 86%, 또는 적어도 87%, 또는 적어도 88%, 또는 적어도 89%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는 기능적 동족체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이종 데카르복실라아제 효소를 인코딩하는 핵산은 예를 들어 aro10, abPPDC, 또는 서열 번호: 1, 2, 또는 4에 의해 인코딩된 데카르복실라아제 효소와 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 86%, 또는 적어도 87%, 또는 적어도 88%, 또는 적어도 89%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100% 폴리펩티드 서열 동일성을 갖는 기능적 동족체 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 이종 PAR 효소를 인코딩하는 핵산은 blPAR, ecPAR, lePAR, rrPAR, rsPAR, 또는 adh6(도 4a에 나열된 공급원)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이종 PAR 효소를 인코딩하는 핵산은 하기를 포함한다: (i) 서열 번호: 3, 5, 6, 7, 8, 또는 9; (ii) 서열 번호: 3, 5, 6, 7, 8, 또는 9로 인코딩된 PAR 효소와 기능적으로 상동성인 PAR 효소를 인코딩하는 서열 번호: 3, 5, 6, 7, 8, 또는 9와 적어도 90% 동일한 핵산; 또는 (iii) 서열 번호: 3, 5, 6, 7, 8, 또는 9로 인코딩된 PAR 효소와 적어도 90% 동일한 기능적으로 상동성인 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산.
일부 실시형태에서, 이종 PAR 효소를 인코딩하는 핵산은 blPAR, ecPAR, lePAR, rrPAR, rsPAR, adh6, 또는 서열 번호: 3, 5, 6, 7, 8, 또는 9, 또는 예를 들어 이와 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 86%, 또는 적어도 87%, 또는 적어도 88%, 또는 적어도 89%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는 기능적 동족체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이종 PAR 효소를 인코딩하는 핵산은 예를 들어 blPAR, ecPAR, lePAR, rrPAR, rsPAR, adh6, 또는 서열 번호: 3, 5, 6, 7, 8, 또는 9에 의해 인코딩된 PAR 효소와 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 86%, 또는 적어도 87%, 또는 적어도 88%, 또는 적어도 89%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100% 폴리펩티드 서열 동일성을 갖는 기능적 동족체 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 하기 중 하나 이상을 추가로 포함한다: 포스포에놀피루베이트 및 에리트로오스-4-포스페이트를 2-데히드로-3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트로 전환하는 이종 효소; 3-데히드로시키메이트를 시키메이트로 전환하는 이종 효소; 또는 코리스메이트를 페닐피루베이트로 전환하는 이종 효소.
일부 실시형태에서, 포스포에놀피루베이트 및 에리트로오스-4-포스페이트를 2-데히드로-3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트로 전환하는 이종 효소는 2-데히드로-3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트 합성효소이고; 3-데히드로시키메이트를 시키메이트로 전환하는 이종 효소는 시키메이트 탈수소효소이거나; 또는 코리스메이트를 페닐피루베이트로 전환하는 이종 효소는 이관능성 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 탈수효소이다.
일부 실시형태에서, 이종 시키메이트 탈수소효소를 인코딩하는 핵산은 cgAroE(코리네박테리움 글루타미쿰 유래) 또는 ecAroE(에스케리키아 콜라이 유래)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이종 시키메이트 탈수소효소를 인코딩하는 핵산은 하기를 포함한다: (i) 서열 번호: 11 또는 12; (ii) 서열 번호: 11 또는 12로 인코딩된 시키메이트 탈수소효소와 기능적으로 상동성인 시키메이트 탈수소효소를 인코딩하는 서열 번호: 11 또는 12와 적어도 90% 동일한 핵산; 또는 (iii) 서열 번호: 11 또는 12로 인코딩된 시키메이트 탈수소효소와 적어도 90% 동일한 기능적으로 상동성인 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산.
일부 실시형태에서, 이종 시키메이트 탈수소효소를 인코딩하는 핵산은 cgAroE, ecAroE, 또는 서열 번호: 11 또는 12, 또는 예를 들어 이와 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 86%, 또는 적어도 87%, 또는 적어도 88%, 또는 적어도 89%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는 기능적 동족체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이종 시키메이트 탈수소효소를 인코딩하는 핵산은 예를 들어 cgAroE, ecAroE, 또는 서열 번호: 11 또는 12에 의해 인코딩된 시키메이트 탈수소효소와 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 86%, 또는 적어도 87%, 또는 적어도 88%, 또는 적어도 89%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100% 폴리펩티드 서열 동일성을 갖는 기능적 동족체 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 이종 DAHP 합성효소를 인코딩하는 핵산은 aroG를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이종 DAHP 합성효소를 인코딩하는 핵산은 하기를 포함한다: (i) 서열 번호: 10; (ii) 서열 번호: 10으로 인코딩된 DAHP 합성효소와 기능적으로 상동성인 DAHP 합성효소를 인코딩하는 서열 번호: 10과 적어도 90% 동일한 핵산; 또는 (iii) 서열 번호: 10으로 인코딩된 DAHP 합성효소와 적어도 90% 동일한 기능적으로 상동성인 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산.
일부 실시형태에서, 이종 DAHP 합성효소를 인코딩하는 핵산은 aroG 또는 서열 번호: 10, 또는 예를 들어 이와 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 86%, 또는 적어도 87%, 또는 적어도 88%, 또는 적어도 89%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는 기능적 동족체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이종 DAHP 합성효소를 인코딩하는 핵산은 예를 들어 aroG, 또는 서열 번호: 10에 의해 인코딩된 DAHP 합성효소와 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 86%, 또는 적어도 87%, 또는 적어도 88%, 또는 적어도 89%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100% 폴리펩티드 서열 동일성을 갖는 기능적 동족체 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 이종 이관능성 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 탈수효소를 인코딩하는 핵산은 pheA1 또는 pheA2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이종 이관능성 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 탈수효소를 인코딩하는 핵산은 하기를 포함한다: (i) 서열 번호: 13 또는 14; (ii) 서열 번호: 13 또는 14로 인코딩된 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 탈수효소와 기능적으로 상동성인 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 탈수효소를 인코딩하는 서열 번호: 13 또는 14와 적어도 90% 동일한 핵산; 또는 (iii) 서열 번호: 13 또는 14로 인코딩된 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 탈수효소와 적어도 90% 동일한 기능적으로 상동성인 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산.
일부 실시형태에서, 이종 이관능성 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 탈수효소를 인코딩하는 핵산은 pheA1, pheA2 또는 서열 번호: 13 또는 14, 또는 예를 들어 이와 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 86%, 또는 적어도 87%, 또는 적어도 88%, 또는 적어도 89%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는 기능적 동족체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이종 이관능성 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 탈수효소를 인코딩하는 핵산은 예를 들어 pheA1, pheA2, 또는 서열 번호: 13 또는 14에 의해 인코딩된 이관능성 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 탈수효소와 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 86%, 또는 적어도 87%, 또는 적어도 88%, 또는 적어도 89%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100% 폴리펩티드 서열 동일성을 갖는 기능적 동족체 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 미생물은 하기 옵션 중에서 선택된 이종 효소의 세트를 포함한다:
(1) ecAroE, kivD, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(2) ecAroE, abPPDC, ecPAR, pheA1, 및 aroG;
(3) cgAroE, abPPDC, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(4) ecAroE, abPPDC, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(5) cgAroE, kivD, rrPAR, pheA2, 및 aroG;
(6) ecAroE, abPPDC, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(7) pheA1, aroG, abPPDC, 및 ecPAR;
(8) egAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
(9) ecAroE, abPPDC, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
(10) cgAroE, aro10, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
(11) cgAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
(12) cgAroE, aro10, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(13) ecAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
(14) ecAroE, aro10, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
(15) ecAroE, aro10, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(16) cgAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
(17) cgAroE, aro10, rsPAR, pheA2, 및 aroG;
(18) cgAroE, abPPDC, blPAR, pheA2, 및 aroG;
(19) ecAroE, kivD, blPAR, pheA2, 및 aroG;
(20) cgAroE, aro10, blPAR, pheA2, 및 aroG;
(21) ecAroE, abPPDC, blPAR, pheA2, 및 aroG;
(22) ecAroE, abPPDC, adh6, pheA1, 및 aroG;
(23) cgAroE, abPPDC, adh6, pheA2, 및 aroG;
(24) cgAroE, abPPDC, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
(25) ecAroE, aro10, rsPAR, pheA2, 및 aroG;
(26) ecAroE, aro10, adh6, pheA2, 및 aroG; 또는
(27) ecAroE, abPPDC, ecPAR, pheA2, 및 aroG.
일부 실시형태에서, 미생물은 하기 옵션 중에서 선택된 이종 핵산의 세트를 포함한다:
(1) ecAroE, kivD, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(2) ecAroE, abPPDC, ecPAR, pheA1, 및 aroG;
(3) cgAroE, abPPDC, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(4) ecAroE, abPPDC, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(5) cgAroE, kivD, rrPAR, pheA2, 및 aroG;
(6) ecAroE, abPPDC, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(7) pheA1, aroG, abPPDC, 및 ecPAR;
(8) egAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
(9) ecAroE, abPPDC, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
(10) cgAroE, aro10, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
(11) cgAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
(12) cgAroE, aro10, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(13) ecAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
(14) ecAroE, aro10, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
(15) ecAroE, aro10, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(16) cgAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
(17) cgAroE, aro10, rsPAR, pheA2, 및 aroG;
(18) cgAroE, abPPDC, blPAR, pheA2, 및 aroG;
(19) ecAroE, kivD, blPAR, pheA2, 및 aroG;
(20) cgAroE, aro10, blPAR, pheA2, 및 aroG;
(21) ecAroE, abPPDC, blPAR, pheA2, 및 aroG;
(22) ecAroE, abPPDC, adh6, pheA1, 및 aroG;
(23) cgAroE, abPPDC, adh6, pheA2, 및 aroG;
(24) cgAroE, abPPDC, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
(25) ecAroE, aro10, rsPAR, pheA2, 및 aroG;
(26) ecAroE, aro10, adh6, pheA2, 및 aroG; 또는
(27) ecAroE, abPPDC, ecPAR, pheA2, 및 aroG.
일부 실시형태에서, 미생물은 표 3에 기재된 조합 균주 2C03, 1C10, 2C54, 2C09, 2C47, 2C55, 2C53, H57, 1C47, 2C10, 2A18, 1C54, 2C01, 1C31, 2B17, 2C52, 1C09, H18, H58, 2C27, 2D22, 2D07, 2D24, 2D03, 1C29, 2B26, 2C38, 2A27, 2C12, 또는 2B27의 이종 유전자 및 프로모터를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 2-페닐에탄올 생성 박테리아를 생성하도록 박테리아를 형질전환시키는 데 사용될 수 있는 플라스미드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 플라스미드는 (a) 이종 데카르복실라아제 효소를 인코딩하는 핵산; 및 (b) 이종 페닐아세트알데히드 환원효소(PAR)를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라스미드는 (a) 이종 데카르복실라아제 효소를 인코딩하는 핵산; (b) 이종 페닐아세트알데히드 환원효소(PAR)를 인코딩하는 핵산; (c) 이종 시키메이트 탈수소효소를 인코딩하는 핵산; (d) 이종 DAHP 합성효소를 인코딩하는 핵산; 및 (e) 이종 이관능성 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 탈수효소를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 2-플라스미드 시스템을 제공하고, 첫 번째 플라스미드는 (a) 이종 데카르복실라아제 효소를 인코딩하는 핵산; (b) 이종 페닐아세트알데히드 환원효소(PAR)를 인코딩하는 핵산; 및 (c) 이종 시키메이트 탈수소효소를 인코딩하는 핵산을 포함하고; 두 번째 플라스미드는 (d) 이종 DAHP 합성효소를 인코딩하는 핵산; 및 (e) 이종 이관능성 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 탈수효소를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 플라스미드(들)이 박테리아로 형질전환되는 경우, 바람직하게는 박테리아는 효소를 발현한다. 대안적으로, 효소는 유도성 프로모터가 발현을 위해 사용되는 경우, 유도된 경우에만 발현될 수 있다.
일 실시형태는 2-페닐에탄올을 제조할 수 있는 미생물이고, 여기서 미생물은 (a) 페닐피루베이트를 페닐아세트알데히드로 전환하는 이종 효소; 및 (b) 페닐아세트알데히드를 2-페닐에탄올로 전환하는 이종 효소를 포함한다.
실시형태에서, (a) 페닐피루베이트를 페닐아세트알데히드로 전환하는 이종 효소는 데카르복실라아제이고, (b) 페닐아세트알데히드를 2-페닐에탄올로 전환하는 이종 효소는 페닐아세트알데히드 환원효소인, 미생물.
실시형태에서, 데카르복실라아제는 페닐피루베이트-특이적 데카르복실라아제인, 미생물.
실시형태에서, C1-고정 미생물인, 미생물.
실시형태에서, 우드-륭달 미생물인, 미생물.
실시형태에서, 박테리아인, 미생물.
실시형태에서, 아세토박테리움, 알칼리바쿨룸, 블라우티아, 부티리박테리움, 클로스트리디움, 유박테리움, 무렐라, 옥소박터, 스포로무사 및 써모아나에로박터로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 구성원인, 미생물.
실시형태에서, 자연적으로 페닐피루베이트를 생성할 수 있는, 미생물.
실시형태에서, CO, CO2, 및/또는 H2를 아세틸-CoA로 전환하는 우드-륭달 경로를 포함하는, 미생물.
실시형태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는, 미생물: (c) 아세틸-CoA를 피루베이트로 전환하는 천연 효소; (d) 피루베이트를 포스포에놀피루베이트로 전환하는 천연 효소; (e) 포스포에놀피루베이트 및 에리트로오스-4-포스페이트를 2-데히드로3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트로 전환하는 천연 효소; (f) 2-데히드로3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트를 3-데히드로퀴네이트로 전환하는 천연 효소; (g) 3-데히드로퀴네이트를 3-데히드로시키메이트로 전환하는 천연 효소; (h) 3-데히드로시키메이트를 시키메이트로 전환하는 천연 효소; (i) 시키메이트를 시키메이트 3-포스페이트로 전환하는 천연 효소; (j) 시키메이트 3-포스페이트를 5-O-(1-카르복시비닐)-시키메이트 3-포스페이트로 전환하는 천연 효소; (k) 5-O-(1-카르복시비닐)-시키메이트 3-포스페이트를 코리스메이트로 전환하는 천연 효소; 또는 (l) 코리스메이트를 페닐피루베이트로 전환하는 천연 효소.
실시형태에서, (c) 아세틸-CoA를 피루베이트로 전환하는 천연 효소는 피루베이트:페레독신 옥시도환원효소이고; (d) 피루베이트를 포스포에놀피루베이트로 전환하는 천연 효소는 피루베이트 포스페이트 디키나아제이고; (e) 포스포에놀피루베이트 및 에리트로오스-4-포스페이트를 2-데히드로3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트로 전환하는 천연 효소는 2-데히드로-3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트 합성효소이고; (f) 2-데히드로3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트를 3-데히드로퀴네이트로 전환하는 천연 효소는 3-데히드로퀴네이트 합성효소이고; (g) 3-데히드로퀴네이트를 3-데히드로시키메이트로 전환하는 천연 효소는 3-데히드로퀴네이트 탈수효소이고; (h) 3-데히드로시키메이트를 시키메이트로 전환하는 천연 효소는 시키메이트 탈수소효소이고; (i) 시키메이트를 시키메이트 3-포스페이트로 전환하는 천연 효소는 시키메이트 키나아제이고; (j) 시키메이트 3-포스페이트를 5-O-(1-카르복시비닐)-시키메이트 3-포스페이트로 전환하는 천연 효소는 5-에놀피루빌시키메이트 3-포스페이트 합성효소이고; (k) 5-O-(1-카르복시비닐)-시키메이트 3-포스페이트를 코리스메이트로 전환하는 천연 효소는 코리스메이트 합성효소이거나; 또는 (l) 코리스메이트를 페닐피루베이트로 전환하는 천연 효소는 이관능성 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 탈수효소인, 미생물.
실시형태에서, 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 미생물: (e) 포스포에놀피루베이트 및 에리트로오스-4-포스페이트를 2-데히드로-3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트로 전환하는 이종 효소; (h) 3-데히드로시키메이트를 시키메이트로 전환하는 이종 효소; 또는 (l) 코리스메이트를 페닐피루베이트로 전환하는 이종 효소.
실시형태에서, (e) 포스포에놀피루베이트 및 에리트로오스-4-포스페이트를 2-데히드로-3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트로 전환하는 이종 효소는 2-데히드로-3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트 합성효소이고; (h) 3-데히드로시키메이트를 시키메이트로 전환하는 이종 효소는 시키메이트 탈수소효소이거나; 또는 (i) 코리스메이트를 페닐피루베이트로 전환하는 이종 효소는 이관능성 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 탈수효소인, 미생물.
실시형태 중 어느 하나에서, 생물이 하기를 포함하는, 미생물:
(1) ecAroE, kivD, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(2) ecAroE, abPPDC, ecPAR, pheA1, 및 aroG;
(3) cgAroE, abPPDC, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(4) ecAroE, abPPDC, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(5) cgAroE, kivD, rrPAR, pheA2, 및 aroG;
(6) ecAroE, abPPDC, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(7) pheA1, aroG, abPPDC, 및 ecPAR;
(8) egAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
(9) ecAroE, abPPDC, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
(10) cgAroE, aro10, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
(11) cgAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
(12) cgAroE, aro10, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(13) ecAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
(14) ecAroE, aro10, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
(15) ecAroE, aro10, lePAR, pheA2, 및 aroG;
(16) cgAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
(17) cgAroE, aro10, rsPAR, pheA2, 및 aroG;
(18) cgAroE, abPPDC, blPAR, pheA2, 및 aroG;
(19) ecAroE, kivD, blPAR, pheA2, 및 aroG;
(20) cgAroE, aro10, blPAR, pheA2, 및 aroG;
(21) ecAroE, abPPDC, blPAR, pheA2, 및 aroG;
(22) ecAroE, abPPDC, adh6, pheA1, 및 aroG;
(23) cgAroE, abPPDC, adh6, pheA2, 및 aroG;
(24) cgAroE, abPPDC, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
(25) ecAroE, aro10, rsPAR, pheA2, 및 aroG;
(26) ecAroE, aro10, adh6, pheA2, 및 aroG; 또는
(27) ecAroE, abPPDC, ecPAR, pheA2, 및 aroG.
실시형태 중 어느 하나에서, 미생물이 조합 균주 2C03, 1C10, 2C54, 2C09, 2C47, 2C55, 2C53, H57, 1C47, 2C10, 2A18, 1C54, 2C01, 1C31, 2B17, 2C52, 1C09, H18, H58, 2C27, 2D22, 2D07, 2D24, 2D03, 1C29, 2B26, 2C38, 2A27, 2C12, 또는 2B27의 이종 유전자 및 프로모터를 포함하는, 미생물.
실시형태 중 어느 하나에서, 2-페닐에탄올을 생성하기 위해 CO, CO2, 및/또는 H2를 포함하는 가스성 기질을 발효시키는, 미생물.
실시형태에서, 가스성 기질은 신가스 또는 산업 폐기 가스를 포함하는, 미생물.
실시형태에서, 임의의 다른 C3+ 알코올을 생성하지 않는, 미생물.
실시형태에서, 임의의 다른 C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, 또는 C10 알코올을 생성하지 않는, 미생물.
일 실시형태는 실시형태 중 어느 하나의 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 2-페닐에탄올의 제조 방법이다.
실시형태에서, 상기 가스성 기질이 CO, CO2, 및/또는 H2를 포함하는 C1-탄소원을 포함하는, 방법.
실시형태 중 어느 하나에서, 상기 가스성 기질은 신가스 또는 산업 폐기 가스를 포함하는, 방법.
실시예
하기 실시예는 본 개시내용의 방법과 조성물을 추가로 예시하지만, 본 개시내용의 범위를 임의의 방식으로 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
본 작업에서, 데카르복실라아제 및 페닐아세트알데히드 환원효소(PAR)의 표적화된 대사 엔지니어링이 C1-고정 박테리아에서 수행되어 2-PE 선택성 및 생산율을 개선하였다. 2-PE 생합성에 대한 플럭스를 추가로 개선하기 위해, 시키메이트 경로로부터의 3개의 이종 유전자를 조합 방식으로 추가로 포함시켰다. 하기 실시예의 2-PE 생합성 경로 및 이종 발현된 유전자가 도 1에 강조되어 있다.
실시예 1. 쇼트 바틀에서 C. 오토에타노게눔 의 2-PE 내성
2-PE는 26 내지 43 mM(3.2 내지 5.3 g/L) 수준에서 스타필로코쿠스 아우레우스 및 엔테로코쿠스 파에시움과 같은 그람-양성 미생물에 대해 성장 억제 효과를 발휘하는 것으로 보고되었다(문헌[Corre et al., Res Microbiol. 1990;141(4):483-97]). C. 오토에타노게눔의 자가영양 성장에 대한 2-PE의 독성을 연구하기 위해, 2-PE 챌린지 시험(0, 0.2, 0.6, 2 및 5 g/L에서)을 합성 기체 블렌드(50% CO, 10% H2, 30% CO2 및 10% N2)를 갖는 쇼트 바틀에서 실시하였다. 확인되지 않은 배양물과 비교하여, 2 g/L의 2-PE는 성장 지연 단계를 증가시키고, 바이오매스 농도를 낮췄다(도 2a 및 도 2b). 5 g/L 챌린지 수준에서, 성장은 감지되지 않았다(도 2a 및 도 2b). 0.2 g/L 및 0.6 g/L에서 2-PE 챌린지는 C. 오토에타노게눔의 자가영양 성장에 대한 영향이 적었다.
실시예 2. 개선된 2-PE 선택성 및 생산율에 대한 데카르복실라아제 변이체의 시험
2-PE 균주 최적화를 위해, 페닐피루베이트-특이적 데카르복실라아제(사카로마이세스 세레비시아에 유래 aro10(문헌[Kneen et al., FEBS J. 2011;278:1842―53])(서열 번호: 4) 및 아조스피릴리움 브라실렌스 유래 abPPDC(문헌[Spaepen et al., J Bacteriol. 2007;189:7626 LP ― 7633])(서열 번호: 2))를 갖는 두 개의 플라스미드를 C. 오토에타노게눔으로 형질변환하여 균주 sFA212 및 sFA213을 각각 유도했다. 데카르복실라아제 kivd_la(락토코쿠스 락티스 유래)(서열 번호: 1)를 발현하는 대조군 균주(sFA200)와 이들 두 데카르복실라아제 균주는, 쇼트 바틀에서 합성 기체 믹스(50% CO, 10% H2, 30% CO2, 및 10% N2) 하에서 자가영양 성장에 적용되었다(도 3a 및 도 3b). 3개의 데카르복실라아제 균주는 유사한 성장 프로파일을 보였지만, 상이한 알코올 프로파일을 보였다(도 3a 및 도 3b). 불꽃 이온화 검출과 엔드-포인트 기체 크로마토그래피(GC-FID) 결과는 aro10 균주가 대조군 kivd_la 균주에 비해 57% 적은 2-PE를 생성하면서, 5.6 mg/L 2-메틸-1-프로판올 및 4.0 mg/L 3-메틸-1-부탄올을 생성하였다는 것을 보였다. 대조적으로, abPPDC 균주는 대조군 균주와 유사한 양의 2-PE를 생성하였지만, 분지형-사슬 알코올은 생성하지 않았다. 일부 실시형태에서, abPPDC 균주에 의한 2-PE에 대한 증가된 선택성은 분지형-사슬 알코올이 세포 독성에 대한 부가 효과를 나타낼 수 있기 때문에 다운스트림 생성물 분리를 단순화할 수 있고, 균주 안정성을 개선할 수 있다.
이와 본원에 개시된 다른 실시예에 대하여, 하기와 같이 선형 및 분지형-사슬 알코올에 대해 GC-FID를 수행하였다. 오토샘플러, 불꽃 이온화 검출기(FID) 및 ZB-1 컬럼(30 m x 0.32 mm x 0.3 μm)에 직렬 연결된 Phenomenex ZB-WAXplus 컬럼(30 m x 0.32 mm x 1 μm)이 장착된 Agilent 7890B GC를 사용하여 기체 크로마토그래피 분석에 의해 알코올 농도를 측정하였다. 깨끗한 2 mL 미세원심분리 튜브에 1.400 mL의 샘플을 이동시킨 후 20 μL의 내부 표준 용액(에탄올 중 페닐 아세테이트)을 첨가함으로써 샘플을 제조하였다. 이에, 400 μL의 클로로포름을 첨가하고, 매스를 기록하였다. 60초 동안 샘플을 수평으로 흔들고, 5분 동안 14,000 x g에서 원심분리한 후, 200 μL의 하부층을 소량의 삽입물을 함유하는 유리 바이알에 이동시켰다. 10:1의 분할비 및 250℃의 주입구 온도를 사용하여 1-uL 주입물 분석을 수행하였다. 70℃(유지 없음)의 오븐 온도에서 시작하여, 3℃/분에서 120℃로 초기 램프(유지 없음), 및 7℃/분에서 230℃로 마지막 램프(14분 유지)로 분리를 달성하였다. 캐리어 기체로서 헬륨을 이용하여 컬럼 유속을 35 cm/초로 설정하였다. 400 mL/분에서 공기, 40 mL/분에서 수소 기체, 및 15 mL/분에서 헬륨(메이크업 기체)을 이용하여 FID를 280℃로 설정하였다. 선형 핏을 사용하는 내부 표준 보정을 사용하여 결과를 계산하였다.
실시예 3. 개선된 2-PE 생산율에 대한 페닐아세트알데히드 환원효소(PAR) 변이체의 시험
2-PE 경로(도 1)의 마지막 단계를 촉매화하는, 페닐아세트알데히드 환원효소(PAR)의 5개의 유전자 변이체(lePAR(서열 번호: 9), ecPAR(서열 번호: 6), blPAR(서열 번호: 5), rrPAR(서열 번호: 7), 및 rsPAR(서열 번호: 8); 도 4a 및 도 4b)을 데카르복실라아제 abPPDC(서열 번호: 2) 및 시키메이트 탈수소효소 ecAroE(서열 번호: 11)를 갖는 발현 벡터로 개별 클로닝하였다. C. 오토에타노게눔으로 형질변환 후, 생성된 재조합 균주를 200 kPa 합성 기체 믹스(50% CO, 10% H2, 30% CO2, 및 10% N2)를 갖는 12-웰 플레이트에서 2-PE 생산율에 대해 시험하였다. 유도제를 1일째에 첨가하고, 7일째에 GC-FID 분석을 위해 샘플을 수집하였다. 3개의 신규한 PAR 균주(blPAR, ecPAR, 및 rsPAR)는 adh6(서열 번호: 3) 대조군 균주에 비해 보다 많은 2-PE(바이오매스에 의해 정규화됨)를 생성하였다(도 4c).
실시예 4. 2-PE 경로의 조합 분석
2-PE의 생합성을 위한 유전자 변이체 및 최적 플럭스를 결정하기 위해, 금문(GG)법을 사용하여 2-PE 경로 유전자 및 프로모터의 조합 어셈블리를 에스케리키아 콜라이에서 먼저 수행한 후(도 5), C1-이용 미생물로 형질변환하였다. 어셈블리의 스크리닝을 촉진하기 위해, 금문 부위 GG1 및 GG6에 의해 플랭킹된 ccdB 톡신-안티톡신 카운터-선택성 마커를 클로스트리디움-E. 콜라이 셔틀 벡터 pMTL8225로 먼저 클로닝하였다(문헌[Heap, J Microbiol Methods, 78: 79-85, 2009]). 이들 셔틀 벡터는 사전 클로닝된 클로스트리디움 프로모터(도 5에서 P1로 나타남) 및 터미네이터(도 5에서 T3으로 나타남)를 갖는다. 시키메이트 탈수소효소(aroE로 인코딩됨), DAHP 합성효소(aroG로 인코딩됨), 이관능성 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 탈수효소(pheA), 데카르복실라아제, 및 페닐-아세트알데히드(PAR)를 인코딩하는 유전자와 2개의 공여자 백터(터미네이터 및 프로모터를 제공하는 pDonor 2 및 pDonor 4)를 GG 어셈블리를 위해 셔틀 벡터에 첨가하였다. 프로모터 서, 금문 부위, 및 어셈블리 워크플로우는 문헌[Synthetic Biology (2020) vol 5(1): ysaa019]에 기재되어 있다. ermB 항생제 선택성 마커(종합적으로 표 3에서 플라스미드 1로 지칭됨)를 갖는 생성된 조합 플라스미드는 격리(insulated) 방식으로 각각의 aroE(또는 pheA+aroG), 데카르복실라아제 및 PAR을 발현하기 위해 프로모터 및 터미네이터를 갖는다.
이 작업을 위해, 2개의 2-PE 조합 라이브러리를 구성하고 시험하였다: 1-플라스미드 및 2-플라스미드 라이브러리(표 3). 조합 분석에 포함되었던 유전자 변이체(2x aroE (서열 번호: 11, 12), 3x 데카르복실라아제(서열 번호: 1, 2, 4), 6x PAR(서열 번호: 3, 5, 6, 7, 8, 9), 2x 이관능성 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 탈수효소(pheA)(서열 번호: 13, 14), 및 1x DAHP 합성효소(aroG)(서열 번호: 10))는 표 2에 나타나 있다. (도 12)는 실시예 4에 기재된 2개의 2-PE 조합 라이브러리에 이용된 프로모터 변이체와 유전자를 보여준다.
Figure pct00002
Figure pct00003
2-플라스미드 라이브러리의 경우, 상이한 강도의 3개의 프로모터(Pfer-lacO-US, PWL 및 Ppfor)를 사용하여 각각의 aroE, 데카르복실라아제, 및 PAR을 플라스미드 1에서 발현하기 위해 사용하였다. pheA1+aroG 또는 pheA2+aroG의 발현을 구동하였던 단 하나의 프로모터(PWL)를 가진 플라스미드 2(catP 항생제 선택성 마커)를 C. 오토에타노게눔으로 개별적으로 형질변환하였다. 이후, 생성된 형질전환체는 조합 플라스미드 1이 전달된 숙주가 되어, 호환되는 그람-양성 레플리콘과 상이한 항생제 내성을 부여하는 2개의 발현 벡터를 보유한 재조합 균주가 생성되었다. 2-플라스미드 조합 라이브러리에 대한 총 치환은 1944(3 x 2 x 3 x 3 x 3 x 6 x 1 x 2 x 1)였다.
1-플라스미드 라이브러리의 경우, 플라스미드 1에서 aroE는 (pheA1/pheA2) + aroG로 대체되었다. 이는 단 1개의 플라스미드(aroE가 생략) 및 972(3 x 2 x 3 x 3 x 3 x 6)의 치환을 유도했다. 이러한 과정 중, aroG의 START 코돈과 리보솜 결합 부위 사이의 스페이서 거리는 5 내지 8개의 뉴클레오티드로 연장되어 aroG의 번역을 향상하였다.
E. 콜라이의 조합 플라스미드의 어셈블리 효율을 결정하고, 프로모터 및 유전자 변이체 조합을 조사하기 위해, 400개의 플라스미드를 형질변환된 E. 콜라이 균주 NEB10-베타로부터 추출하고, 시퀀싱하였다. 시퀀싱 결과 분석은 각각의 프로모터와 유전자 변이체 다양성이 양호하였고, 51.3%의 어셈블리율을 보였다. C. 오토에타노게눔으로의 이들 시퀀스-확인된 조합 플라스미드의 형질변환 후, 총 162개의 조합 균주(42개의 1-플라스미드 균주 및 120개의 2-플라스미드 균주)를 12-웰 플레이트에서 자가영양 성장시켰다.
8 내지 10일 동안 37℃에서 2 mL 최소 배지 및 200 kPa의 합성 기체 믹스(50% CO, 10% H2, 30% CO2, 및 10% N2)를 갖는 12-웰 플레이트에서 성장 실험을 기술적 복제로 실시하였다(도 7a 내지 도 7c). 이후, 브로쓰 샘플을 바이오매스 측정 및 GC-FID 분석을 위해 취하여 2-PE 타이터를 결정하였다. 유도성 프로모터 P ipl12 하에서 abPPDC와 adh6을 발현하는 플라스미드(플라스미드 1의 백본과 동일)를 갖는 균주 sFA212의 3개의 생물학적 클론을 대조군 균주로서 선택하였는데, 이는 이러한 균주가 12-웰 플레이트, 쇼트 바틀, 및 연속 교반 탱크 반응기(CSTR)에서 지속적으로 많은 양의 2-PE를 제조했기 때문이다. 12-웰 플레이트당 1개의 배지 블랭크 대조군 웰을 음성 대조군으로서 포함시켰고, GC-FID 분석은 1.7 mg/L 미만의 2-PE를 보였고, 이는 크로스-웰 오염을 거의 내지 아예 보이지 않았다.
인큐베이션 8 내지 10일 후, 2-PE 조합 균주는 0.6 내지 1.0 gDCW/L의 바이오매스 농도를 달성했다(도 7c). 이들 162개의 조합 균주 중에서, 80개의 균주(스크리닝된 라이브러리의 49%)는 대조군 균주에 비해 1.5배 초과의 2-PE를 제조하였다(도 7a). 48개의 균주(스크리닝된 라이브러리의 30%)는 대조군 균주에 의해 생성된 2-PE의 절반 미만을 제조하였다(도 7a).
2-PE 조합 라이브러리의 세부 분석을 실시하여 2-PE 제조에 대한 플라스미드의 개수 및 유전자 변이체의 효과를 식별하였다(도 8a 내지 도 8e). 1-플라스미드 및 2-플라스미드 라이브러리, 데카르복실라아제, 및 시키메이트 탈수소효소 사이에서 2-PE 타이터의 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 8a, 도 8c, 및 도 8d). pheA2를 갖는 균주는 pheA1을 갖는 균주에 비해 약간 더 높은 2-PE 타이터를 보였다(도 8b). 일부 PAR 변이체(예를 들어, blPAR)는 adh6 변이체보다 2-PE를 더 제조하였다(도 8e). 각각의 유전자 변이체 또는 플라스미드 개수에서 관찰된 큰 2-PE 타이터 변동은 조합 디자인에서 단일 파라미터의 효과를 희석시킨, 다른 경로 유전자 변이체 및 프로모터 조합의 집합적 효과에 기인할 수 있었다.
대조군 균주 sFA212와 2-PE 타이터를 비교함으로써, 2-PE 제조 조합 균주 상위 30개의 목록과 이의 유전자형의 목록이 생성되었다(표 3). 스크리닝된 조합 라이브러리의 74%가 aroE를 갖는 2-플라스미드 균주였지만, 90%의 상위 30개의 2-PE 제조 균주는 2개의 플라스미드를 보유하였다. 모든 상위 10개의 2-PE 제조 균주는 데카르복실라아제 변이체 kivD_la 또는 abPPDC로 이루어진 반면, 데카르복실라아제 aro10를 갖는 균주는 상위 11개 및 상위 30개 2-PE 제조자 사이에 8번 나타났다. PAR 변이체 lePAR 및 ecPAR을 갖는 균주는 상위 30개의 2-PE 제조자 중 70%를 차지했으며, 이는 스크리닝된 라이브러리에서 전체 대표 57%인 것에 비해 불균형적으로 높다. PAR 변이체 adh6을 갖는 균주는 상위 30개의 2-PE 제조자에서 유의하게 과소 평가되었다: 상위 30에서 단지 6.7% 대 전체 스크리닝된 라이브러리에서 13.6%.
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실시예 5. CSTR에서 신가스 발효로부터의 2-PE 제조
기준 균주 sFA212에 대해 2-PE 제조를 비교하기 위해 연속 발효 모드 하에서 CSTR에서 총 12개의 조합 균주를 특징화하였다. 쇼트 바틀로부터의 활발히 성장하는(초기 지수) 배양물을 대기압에서 합성 기체 블렌드(40% CO, 20% H2, 20% CO2, 및 20% N2)를 갖는 2-L CSTR에 대한 접종원으로서 사용하였다. 바이오매스 농도가 최대 0.5 gDCW/L에 도달하면, 1/일의 배지 희석 속도 및 0.5/일의 박테리아 희석 속도가 유지되었다.
이들 연속 CSTR 조건 하에서, 기준 균주 sFA212는 70 mg/L의 2-PE 타이터를 달성하였다. 5개의 조합 균주(1C29, 2C54, 2C03, 2C53 및 2C31)는 기준 균주에 비해 2-PE를 더 생성하였다(도 9a). 특히, 균주 1C29는 기준 균주보다 2.9배 더 높은 200 mg/L의 2-PE를 생성하였다. 이들의 2-PE 수율을 기준으로, 12개 중 10개의 조합 균주는 기준 균주에 비해 우수한 2-PE 성능을 보였다(도 9b).
2개의 복제 CSTR 실행에서 조합 균주 1C29의 성능은 도 10a 및 도 10b에 나타나 있다. 2-PE 제조를 향상하기 위해, NH4OH 형태의 질소 공급을 복제물 1에 대해 7일째에 15 mM로(도 10a), 그리고 복제물 2에 대해 9일째에 15 mM로(도 10b) 제한하였다. 그 결과, 2-PE 제조는 두 실행에서 모두 증가했고, 각각 350 mg/L 및 300 mg/L에서 최대치였다. 2-PE 생산성은 실행 1의 경우 일시적으로 16 mg/L/시간에서 최대치였다.
바이오매스, 임업 잔류물, 및 도시 고형 폐기물과 같은 폐기물의 가스화에서 유래된 신가스는 흔히 독성 오염물을 함유한다. 예를 들어, 메탄, 에탄, 에틸렌, 및 아세틸렌이 검출된 오염물이고, 이들은 ppm 수준에서 미생물에 독성이 있는 것으로 알려져 있다. 엔지니어링된 C. 오토에타노게눔에서 드 노보 2-PE 생합성의 견고성을 평가하기 위해, 옥수수-스토버 유래 신가스를 사용하는 연속 CSTR 실행에 균주 sFA212를 적용시켰다. 이러한 "실제" 신가스를 기체 처리 시스템을 사용하여 사전 처리하여, 23.3% H2, 38.7% CO, 19.6% CO2, 및 18.4% N2의 후처리 기체 조성을 유도하였다. 실제 신가스의 제한된 이용가능성으로 인해, 6.9일째에 가스 공급이 실제 신가스로 전환되기 전에 합성 블렌딩된 가스(유사한 가스 조성을 가짐)를 초기에 사용하여 정상 상태 발효 배양을 확립했다.
실제 신가스 발효 결과는 (도 11a 내지 도 11c)에 나타나 있으며, 실제 신가스는 6.9일 및 10.9일 사이에서(총 4일) 사용되었다. 더 긴 연속 CSTR 실행을 가능하게 하기 위해, 약간 상이한 가스 조성을 갖는 여러 실제 신가스 바틀을 사용하여, 관찰된 가스 흡수 변동을 유도하였다(도 11b). 실제 신가스로의 전환 후, 2-PE 제조는 계속 증가했고, 10일째에 정상 상태에 도달했다. 8.0일 및 13.7일 사이의 2-PE의 평균 타이터와 생산성은 각각 208 mg/L 및 11.95 mg/L/시간이다.
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본원에서 인용되는 공보, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참고문헌은, 각각의 참고문헌이 개별적으로 및 구체적으로 참고로 포함되는 것으로 표시되고 본원에서 전문이 기재된 것과 동일한 정도로 본원에서 참고로 포함된다. 본원에서 인용된 종래 기술은 그러한 종래 기술이 어떠한 국가에서도 해당 분야의 일반적이고도 공통적인 지식의 일부를 형성하는 것임을 인정하는 것이 아니며, 그렇게 간주해서도 안 된다.
본 개시내용의 방법과 조성물을 설명하는 맥락에서(특히 하기 청구범위의 맥락에서) 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 지시어는 본원에서 달리 지시되거나 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한은 단수 및 복수를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는(comprising, including)", "갖는(having)", 및 "함유하는(containing)"은, 달리 언급되지 않는 한, 개방형 용어(즉, "포함하지만, 이에 제한되지는 않는"의 의미)로 해석되어야 한다. 용어 "본질적으로 이루어진"은 조성, 공정, 또는 방법의 범위를 명시된 물질 또는 단계로 제한하거나, 또는 조성, 공정, 또는 방법의 기본적이고 새로운 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다. 대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 어느 하나, 둘 모두, 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어 "약"은, 달리 명시되지 않는 한, 표시된 범위, 값 또는 구조의 ±20%를 의미한다.
본원에서 값의 범위의 언급은 달리 본원에 표시되지 않는 한 범위 내에 해당하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 지칭하는 단순한 방법으로 제공하도록 단지 의도되고, 각각의 별개의 값은 본원에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서로 인용된다. 예를 들어, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 정수 범위, 크기 범위, 또는 두께 범위는, 달리 지시되지 않는 한, 인용된 범위 내의 임의의 정수의 값 및 적절한 경우 이의 분수(예를 들어, 정수의 1/10 및 정수의 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 기술되는 모든 방법은, 본원에서 달리 명시되거나 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 본 개시내용의 방법과 조성물을 보다 잘 예시하기 위한 것일 뿐이며, 달리 청구되지 않는 한, 개시된 방법과 조성물의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 개시된 방법과 조성물의 실행에 필수적인 것으로 청구되지 않은 임의의 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 개시내용의 바람직한 실시형태가 본원에서 기술된다. 이러한 바람직한 실시형태의 변형은 전술한 설명을 읽었을 때 당업자에게 자명해질 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 이러한 변형을 적합하게 사용할 것으로 예상하며, 본 발명자들은 개시된 방법과 조성물이 본원에 구체적으로 기술된 것과는 다르게 실시되기를 의도한다. 따라서, 본 개시내용은 준거법에 의해 허용되는 한, 본원에 첨부된 청구범위에 언급된 기술 요지의 모든 변형 및 균등물을 포함한다. 나아가, 본 발명의 모든 가능한 변형에서의 전술된 요소들의 임의의 조합은 본원에서 달리 명시되거나 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한, 개시된 방법과 조성물에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> LanzaTech, Inc. <120> FERMENTATIVE PRODUCTION OF 2-PHENYLETHANOL FROM GASEOUS SUBSTRATES <130> LT156WO1 <150> 62/991,428 <151> 2020-03-18 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1647 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LZ1561 codon adapted nucleotide sequence of kivD_la <400> 1 atgtatacag ttggagatta tttattagat agattacatg aattaggaat agaagaaata 60 tttggtgtac caggagatta caatttacaa tttttagatc aaataataag tagaaaagat 120 atgaaatggg tggggaatgc aaatgagtta aatgcaagtt acatggctga tggatatgca 180 agaactaaaa aggcagctgc attccttaca acctttggag taggagaact aagtgcagta 240 aatgggcttg caggttcata tgctgaaaac ttacctgtag ttgaaatcgt aggtagtcca 300 acttcaaaag tccaaaacga aggaaaattt gtacaccata ctctggctga cggagatttt 360 aaacatttta tgaaaatgca tgaacctgta acagctgcga gaaccctttt aactgcggaa 420 aatgctacag ttgaaataga tagagtttta agtgctcttt taaaggagag aaagcctgtt 480 tatattaatc ttcccgtaga tgtagctgct gctaaggcag agaaaccttc tttacctttg 540 aaaaaggaaa acagcacttc taatacttcc gatcaagaga 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caggggctaa gcacattata gctattgata tagttgattc taaattagag 660 gctgcaaaaa agtttggagc tacagatctt ataaattcat caactactga tccagtggca 720 gcagttcaag aattaactgg cggcgtagat catgcatttg aagtaattgg attagaagct 780 acgcagaggc aagttcagca attaacaaaa ccaggcggca cggcatattt aataggcata 840 gcaccaccag gaacaactac tgaatttaca tcatcattag atagtttgtt tgctcaaaga 900 agactgcagg ctgttttgat gggtagtagt aatgttaaaa gagatatagc attatatgca 960 gacttgtatg ttcagggacg ttttgaatta gatcatttag tatcaagaga aatatccata 1020 aatgagataa atgatggtta tgaagcatta aaaaaaggtg aagttatacg ttcagttata 1080 accagttttt aa 1092 <210> 6 <211> 1020 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LZ1561 codon adapted nucleotide sequence of phenylacetalyhde reductase (ecPAR) from Escherichia coli <400> 6 atgtcaatga taaaatcata tgcagcaaaa gaagcaggcg gcgaattaga agtttacgaa 60 tatgatccag gggaattaag gcctcaagat gtagaagttc aagttgatta ctgtggaata 120 tgccattccg atttatctat gatagataat gaatggggat ttagtcagta tcctcttgta 180 gcaggacatg aagttattgg cagagttgta gctcttggtt cagcagctca ggataagggc 240 ttacaggtag gtcagagagt agggataggc tggactgccc gttcgtgtgg acactgcgat 300 gcatgtatca gtggaaatca aataaattgt gaacaaggtg cagttccaac tataatgaat 360 aggggcggct ttgcagaaaa attaagagca gattggcaat gggtaattcc tcttccagaa 420 aacatagata tagaatcagc aggtcctctc ctttgtggcg gcattacagt atttaaacct 480 cttcttatgc atcatattac tgctacatca agagtaggag taatcggtat aggcggcctt 540 ggacatatag caattaaact tcttcatgct atgggttgtg aagttacggc atttagttca 600 aatccagcta aagagcaaga agttcttgct atgggtgccg acaaggtagt taacagtagg 660 gatccacagg cactgaaagc actggcggga caatttgatc ttataataaa tacagtaaac 720 gtttctctag attggcaacc atattttgag gcattaactt atggcggcaa tttccataca 780 gttggagccg ttcttacacc actatctgtt ccagctttta cacttatagc aggagatcgt 840 agtgtttccg gctctgcaac tggtactcct tatgaactta gaaaacttat gagatttgca 900 gcaagatcta aagttgcacc taccacagag cttttcccta tgagcaagat aaatgatgca 960 attcagcacg ttagagatgg aaaagcaaga tatagggttg tgttaaaggc tgattattag 1020 <210> 7 <211> 1041 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LZ1561 codon adapted nucleotide sequence of phenylacetalyhde reductase (rrPAR) from Rhodococcus ruber <400> 7 atgaaagctt tgcaatatac agaaatagga agtgaaccag tagtagtaga tgtaccaaca 60 ccagcgccag gaccaggaga gatcttatta aaggtaactg cagcaggact ttgtcattca 120 gatatatttg taatggatat gcctgctgaa cagtatattt atggccttcc attaacgctt 180 ggccatgagg gtgttggaac agttgcagaa ttaggggcag gtgtaacagg atttgaaaca 240 ggtgatgctg ttgctgttta tggaccttgg ggatgcggtg cctgccatgc ttgtgcccgt 300 ggaagggaaa actattgtac tagagctgca gagttaggaa taacaccccc tggactggga 360 tcacctggaa gtatggcaga gtatatgatt gtagattctg caagacattt agttcctata 420 ggtgatttgg atcctgttgc agctgttcct cttacagatg ctggattgac accttatcat 480 gcaataagta gagtgttacc gcttcttgga ccaggatcta cagctgtagt tataggagtt 540 ggcggcttag gacatgttgg catccaaata ttaagagcag tgtcagcagc aagagttata 600 gcagttgatt tagatgatga cagattagct ttagcaagag aagttggtgc agatgcagct 660 gttaaaagtg gagcaggagc agcagatgct attcgtgaac ttacaggcgg cgaaggagca 720 actgctgtgt ttgattttgt aggagctcag agtacaattg atactgcaca gcaggtagta 780 gcaatagacg gccatatatc cgtagttggt attcatgcag gtgctcatgc aaaagtaggt 840 ttttttatga taccttttgg agcttctgtt gtaactcctt actggggtac ccgttctgaa 900 cttatggatg tagtagatct tgcaagagca ggcagacttg atatacatac tgagactttt 960 actttagatg aaggtccgac tgcatataga agactaagag aaggttccat aagaggtagg 1020 ggagtagtag tgcctggata a 1041 <210> 8 <211> 1047 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LZ1561 codon adapted nucleotide sequence of phenylacetalyhde reductase (rsPAR) from Rhodococcus sp. ST-10 <400> 8 atgaaagcaa ttcaatacac aagaatagga gcagaaccag aacttacaga aataccaaaa 60 ccagagccag gaccagggga agttcttctt gaagtaactg cagctggagt atgtcacagt 120 gatgatttta taatgtcgct gcctgaagaa cagtatacat atggactacc acttacatta 180 ggtcatgaag gtgcaggaaa agtagcagct gtaggtgagg gagtagaagg tttagacata 240 ggaactaatg tagtagtata tggaccttgg ggatgtggaa attgctggca ctgctctcaa 300 ggcttggaaa actactgttc aagagctcag gaacttggaa taaatccacc tggacttggt 360 gcaccaggtg cattagctga atttatgatt gtagattcac cacgtcattt agtgcctata 420 ggagatttgg atcctgttaa aactgtacca ctaactgatg caggacttac accttatcat 480 gctataaaaa gaagtttacc aaagttaaga ggcggctcct atgccgttgt aataggaaca 540 ggcggccttg gacatgtagc tatccaatta ttaagacatt tgtctgcagc tactgttata 600 gcacttgacg tttcagcaga taaattggaa cttgctacta aggtaggtgc acatgaagtt 660 gtattatcag acaaggatgc agctgaaaat gtaaggaaaa ttacaggatc acaaggagca 720 gccttagttt tagattttgt tggatatcaa cctacaattg acactgctat ggctgtagct 780 ggtgttggaa gtgatgttac aatagtaggt ataggtgatg gtcaagctca tgcaaaggta 840 ggtttctttc aaagtcctta tgaagcttca gtaactgtac cttattgggg agctagaaat 900 gagttaatag aactcataga tttagctcat gcaggtatat ttgatatttc agtagaaact 960 ttttcacttg acaatggcgc agaagcatat agaagattag ctgctggaac actttcagga 1020 agagcagtag tagttccagg attataa 1047 <210> 9 <211> 987 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LZ1561 codon adapted nucleotide sequence of phenylacetalyhde reductase (lePAR) from Solanum lycopersicum <400> 9 atgtcagtta cagcaaaaac agtttgtgtt acaggtgctt caggttacat tgcttcatgg 60 ttagttaaat ttttacttca ttctggatat aatgttaagg catctgttag ggatccaaat 120 gatcctaaaa agacccagca tctattaagt cttggcggcg ctaaagaaag gcttcactta 180 tttaaggcaa atctacttga agaaggtagc tttgatgctg ttgtagatgg ttgtgaagga 240 gtattccaca ctgcgtcacc attttattac tctgtaactg acccacaagc tgaattgctt 300 gatccagctg taaaaggtac actgaacttg ttaggaagtt gtgcaaaggc accaagcgta 360 aagagagttg tattaactag cagtattgct gctgttgcat actctggtca gccaagaacc 420 ccagaagtag ttgtagatga atcatggtgg acatcaccag attactgtaa agaaaaacaa 480 ctttggtatg ttttaagtaa aactttagct gaagatgctg cttggaaatt tgttaaagaa 540 aagggaatag atatggttgt agttaatcca gctatggtta ttggaccact tttgcagcca 600 acattaaata ctagctctgc agcagtactt tcacttgtaa atggtgctga gacataccca 660 aattcaagtt ttggatgggt aaatgtaaag gacgtagcaa atgctcatat attagcattt 720 gaaaatccat ccgccaatgg aagatatctt atggtagaaa gagtagctca ttattctgat 780 atattgaaaa ttttaagaga tctatatcca actatgcagt taccagaaaa gtgtgcagat 840 gataatcctc ttatgcaaaa ttatcaggtt tcaaaagaaa aggccaaatc tttaggaata 900 gaatttacga ctttagaaga atctatcaaa gaaactgttg aatcactaaa ggagaaaaaa 960 ttctttggcg gctcgtcctc catgtaa 987 <210> 10 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LZ1561 codon adapted nucleotide sequence of AroG from Escherichia coli <400> 10 atgaattatc aaaatgatga tttaagaata aaagaaatta aagaattatt acctcctgta 60 gctttattag aaaaatttcc tgcaactgaa aatgcagcaa atactgtagc acatgcaaga 120 aaagcaatac ataaaatact taaaggtaat gatgatagat tattagtagt aataggacct 180 tgtagtatac atgatcctgt agcagcaaaa gaatatgcaa ctagactttt agcattaaga 240 gaagaattaa aagatgaatt agaaatagta atgagagtat attttgaaaa acctagaact 300 actgtaggat ggaaaggact tataaatgat cctcatatgg ataatagttt tcaaataaat 360 gatggactta gaatagcaag aaaattactt ttagatataa atgatagtgg attacctgca 420 gctggtgaat ttttagatat gataactcct caatatttag cagatttaat gagttgggga 480 gcaattggag caagaactac tgaaagtcaa gtacatagag aagatgcaag tggacttagt 540 tgtcctgtag gatttaaaaa tggaactgat ggaactataa aagtagcaat agatgcaata 600 aatgcagctg gtgcacctca ttgttttctt agtgtaacaa aatggggaca tagtgcaata 660 gtaaatacta gtggaaatgg tgattgtcat ataatactta gaggtggaaa agaacctaat 720 tattctgcaa aacatgtagc agaagtaaaa gaaggactta ataaagctgg acttcctgca 780 caggtaatga tagatttttc tcatgcaaat agtagtaaac aatttaagaa acaaatggat 840 gtatgtgcag atgtatgtca gcaaatagct ggaggtgaaa aagcaataat tggagtaatg 900 gtagaaagtc atttagtaga aggtaatcaa agtttagaaa gtggtgaacc tttagcttat 960 ggaaaaagta taactgatgc atgtatagga tgggaagata ctgatgcact tcttagacaa 1020 cttgcaaatg cagtaaaagc aagaagagga taa 1053 <210> 11 <211> 819 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LZ1561 codon adapted nucleotide sequence of ecAroE from Escherichia coli <400> 11 atggaaactt atgcagtatt tggcaatcct atagcacatt caaaatcacc atttatacat 60 caacaatttg ctcagcaatt aaatattgaa catccttatg gaagagtttt agctccaata 120 aatgatttta taaatacttt aaatgctttt ttttcagcag gcggcaaagg agcaaatgta 180 actgtacctt ttaaagagga agcttttgcc agagcagatg agttaactga aagagcagca 240 ttagctggtg cggttaatac attgatgaga ctagaagatg gtaggctttt aggagataat 300 actgatgggg taggtctttt gtctgatctt gaaagacttt cttttataag acctggcctc 360 cggatccttt taataggtgc aggcggcgca tccaggggag tattacttcc attactatca 420 ctggattgtg cagttactat cactaacaga acagtttcaa gagctgaaga gcttgctaaa 480 ttatttgcac atacaggatc aatccaggca ctttccatgg atgaactaga gggacatgaa 540 tttgacttaa ttataaatgc gactagcagt ggtataagtg gggatatacc agctattccc 600 agctctttaa tacatcctgg aatatactgc tatgatatgt tttatcaaaa aggtaagaca 660 ccgttcttag cttggtgtga acaaagagga agcaagagaa atgcagatgg tcttggcatg 720 ctggttgcac aagcagctca tgcattttta ctatggcatg gagttttacc tgatgttgaa 780 cctgttataa aacagctgca agaagaattg tcagcataa 819 <210> 12 <211> 831 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LZ1561 codon adapted nucleotide sequence of cgAroE from Corynebacterium glutamicum <400> 12 atgggatcac atataactca cagagcagca gttttaggct caccaattga acattcaaaa 60 tcaccagtgc ttcataatac aggatataaa gctttaggac ttgatcaatg ggaatatgac 120 aggtttgaat gcacaggaga tatgttaccg ggcatagttt caggagcaga tgaaacttat 180 cgaggatttt ctgttacaat gccttctaaa tttgctgctt tagaatttgc agatgaagta 240 actgaaagag caagagctat tggatcagca aatacattac ttagaactga aacaggatgg 300 agagcggata atactgatgt ggatggaata agaggtgcat taggtgaatt gttaggaagt 360 gcatctcttg caggaaaaca tgctattgta ataggatcag gcggcactgc aagacctgca 420 atttgggcac ttatagaagc aggagtagca agaataactg tacttaatag atcagataga 480 actgctgaac ttcaaacttt atttgatgaa acaccaacta cgttagcata tgctccactt 540 gagcacttgg atattgaagc tgacgttgta gtttctactg ttccttcagc tgctatagct 600 ggtcttgaag atacactggc tatagcacca gtgttggatg ttatatatga tccatggcca 660 actcctttag tagaagttgc aagagctaaa ggacttaagg ctgtaggcgg ccacgtaatg 720 ttggcccatc aatcatatgg tcaatttgaa cagtttacag gaatggatgc tccaagggat 780 gcaatgagag aagctttaga agaatcactt ggaataagtg aggaacatta g 831 <210> 13 <211> 1014 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LZ1561 codon adapted nucleotide sequence of pheA1 from Escherichia coli <400> 13 atgactagtg aaaatccatt acttgcttta agagaaaaaa tatctgccct tgatgaaaaa 60 ttacttgctt tattagcaga aagaagagag cttgcagttg aggtaggtaa ggcaaagttg 120 ctttcgcaca ggcctgttag agatattgat agggaaagag atcttttgga aagattaata 180 actcttggta aggctcatca tttggatgct cattatataa caagattatt tcagctcata 240 atagaagact cagttcttac tcaacaggca ttgcttcaac aacatttgaa taagatcaat 300 cctcactcag ccagaatagc ttttttaggc ccaaaaggtt cctattcaca tctggctgct 360 agacaatatg cagcaaggca ttttgaacag ttcattgaat cagggtgtgc taaatttgca 420 gatatattta accaggtaga aacaggtcaa gccgattatg ctgtagtacc tatagaaaat 480 acgtcgagtg gtgctattaa tgatgtatat gatcttttac agcacactag cctatccata 540 gtaggagaaa tgactttaac tatagatcac tgccttttag tatcaggtac tacagatctt 600 tcaactataa atacagtata ttctcatcca cagccatttc aacaatgtag taaattccta 660 aacagatatc ctcactggaa gattgaatat actgaaagta ccagtgcagc aatggaaaaa 720 gttgcacagg ctaaatcacc acatgtagct gcattaggtt ctgaggctgg cggcacgttg 780 tatggattac aagtactaga aagaatagaa gccaatcaaa ggcaaaattt tacaagattt 840 gtggttttgg caagaaaagc aataaatgtt tcagatcaag tcccagcaaa aactacatta 900 ctaatggcta caggacaaca ggctggggct ttagttgagg ctttattagt gttgagaaat 960 cacaatttaa taatgactag gcttgaatca agacctattc atggaaatcc ttaa 1014 <210> 14 <211> 1161 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LZ1561 codon adapted nucleotide sequence of pheA2 from Escherichia coli <400> 14 atgacatcag aaaatccatt attggcactt agagaaaaga tatcagcact tgacgaaaaa 60 ttacttgcat tattggcaga gagaagagag cttgctgttg aagttggaaa ggctaagctg 120 ttgtcccacc gtccagttag agatattgac agagaacggg acttattaga aagactcatt 180 acattaggaa aggctcatca tttggatgca cattatatta caagattatt tcagctcata 240 atagaagatt cagtattaac tcaacaggct ttacttcaac agcacttaaa taaaataaat 300 ccacattcag ctaggattgc attcttagga ccaaaaggaa gttatagtca tcttgctgca 360 agacaatatg cagcaagaca ctttgaacaa tttattgaat caggatgtgc taaatttgca 420 gatatcttca atcaagtaga aacaggtcag gctgattatg cagtagttcc aatagaaaat 480 acgtcaagcg gtgctataaa tgatgtatat gatttacttc agcatacaag cttatctata 540 gttggtgaga tgacattgac tatagatcac tgcttacttg taagtggaac tacagatttg 600 tccactataa atactgttta cagccatcca cagccatttc aacagtgtag taaattttta 660 aatagatatc cacactggaa aatagaatac acagaaagta cttccgcagc aatggaaaag 720 gttgcacagg caaagtctcc tcacgttgca gcattaggta gtgaagcagg cggcacactt 780 tatggacttc aagtactcga aaggattgaa gcaaaccaaa ggcaaaattt tactagattt 840 gttgtacttg ccagaaaggc tataaatgta agtgatcagg taccagctaa aactacttta 900 cttatggcaa caggacaaca ggcaggagca ctagtagaag cacttttagt attgagaaat 960 cataatctca taatgacgag gttagagtca agaccaattc atggtaatcc aagagaggaa 1020 atgttttacc ttgatatcca agcaaatctt gaatcagcag aaatgcagaa agcattaaag 1080 gaactgggtg aaataacaag atcaatgaaa gtgcttggat gttatccttc tgaaaatgtg 1140 gtacctgtag atccaactta a 1161

Claims (22)

  1. 2-페닐에탄올을 생성할 수 있는 미생물로서,
    (a) 페닐피루베이트를 페닐아세트알데히드로 전환하는 이종 효소; 및
    (b) 페닐아세트알데히드를 2-페닐에탄올로 전환하는 이종 효소를 포함하는 미생물.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 페닐피루베이트를 페닐아세트알데히드로 전환하는 이종 효소가 데카르복실라아제이고;
    (b) 페닐아세트알데히드를 2-페닐에탄올로 전환하는 이종 효소는 페닐아세트알데히드 환원효소인 미생물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 데카르복실라아제는 페닐피루베이트-특이적 데카르복실라아제인, 미생물.
  4. 제1항에 있어서, C1-고정 미생물인 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 우드-륭달(Wood-Ljungdahl) 미생물인 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 박테리아인 미생물.
  7. 제1항에 있어서, 아세토박테리움(Acetobacterium), 알칼리바쿨룸(Alkalibaculum), 블라우티아(Blautia), 부티리박테리움(Butyribacterium), 클로스트리디움(Clostridium), 유박테리움(Eubacterium), 무렐라(Moorella), 옥소박터(Oxobacter), 스포로무사(Sporomusa) 및 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 구성원인 미생물.
  8. 제1항에 있어서, 자연적으로 페닐피루베이트를 생성할 수 있는 미생물.
  9. 제1항에 있어서, CO, CO2, 및/또는 H2를 아세틸-CoA로 전환하는 우드-륭달 경로를 포함하는 미생물.
  10. 제1항에 있어서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 미생물:
    (c) 아세틸-CoA를 피루베이트로 전환하는 고유 효소;
    (d) 피루베이트를 포스포에놀피루베이트로 전환하는 고유 효소;
    (e) 포스포에놀피루베이트 및 에리트로오스-4-포스페이트를 2-데히드로-3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트로 전환하는 고유 효소;
    (f) 2-데히드로-3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트를 3-데히드로퀴네이트로 전환하는 고유 효소;
    (g) 3-데히드로퀴네이트를 3-데히드로시키메이트로 전환하는 고유 효소;
    (h) 3-데히드로시키메이트를 시키메이트로 전환하는 고유 효소;
    (i) 시키메이트를 시키메이트 3-포스페이트로 전환하는 고유 효소;
    (j) 시키메이트 3-포스페이트를 5-O-(1-카르복시비닐)-시키메이트 3-포스페이트로 전환하는 고유 효소;
    (k) 5-O-(1-카르복시비닐)-시키메이트 3-포스페이트를 코리스메이트로 전환하는 고유 효소; 또는
    (l) 코리스메이트를 페닐피루베이트로 전환하는 고유 효소.
  11. 제10항에 있어서,
    (c) 아세틸-CoA를 피루베이트로 전환하는 고유 효소는 피루베이트:페레독신 옥시도환원효소이고;
    (d) 피루베이트를 포스포에놀피루베이트로 전환하는 고유 효소는 피루베이트 포스페이트 디키나아제이고;
    (e) 포스포에놀피루베이트 및 에리트로오스-4-포스페이트를 2-데히드로-3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트로 전환하는 고유 효소는 2-데히드로-3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트 합성효소이고;
    (f) 2-데히드로-3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트를 3-데히드로퀴네이트로 전환하는 고유 효소는 3-데히드로퀴네이트 합성효소이고;
    (g) 3-데히드로퀴네이트를 3-데히드로시키메이트로 전환하는 고유 효소는 3-데히드로퀴네이트 탈수효소이고;
    (h) 3-데히드로시키메이트를 시키메이트로 전환하는 고유 효소는 시키메이트 탈수소효소이고;
    (i) 시키메이트를 시키메이트 3-포스페이트로 전환하는 고유 효소는 시키메이트 키나아제이고;
    (j) 시키메이트 3-포스페이트를 5-O-(1-카르복시비닐)-시키메이트 3-포스페이트로 전환하는 고유 효소는 5-에놀피루빌시키메이트 3-포스페이트 합성효소이고;
    (k) 5-O-(1-카르복시비닐)-시키메이트 3-포스페이트를 코리스메이트로 전환하는 고유 효소는 코리스메이트 합성효소이거나; 또는
    (l) 코리스메이트를 페닐피루베이트로 전환하는 고유 효소는 이관능성 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 탈수효소인 미생물.
  12. 제1항에 있어서, 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는 미생물:
    (e) 포스포에놀피루베이트 및 에리트로오스-4-포스페이트를 2-데히드로-3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트로 전환하는 이종 효소;
    (h) 3-데히드로시키메이트를 시키메이트로 전환하는 이종 효소; 또는
    (l) 코리스메이트를 페닐피루베이트로 전환하는 이종 효소.
  13. 제12항에 있어서,
    (e) 포스포에놀피루베이트 및 에리트로오스-4-포스페이트를 2-데히드로-3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트로 전환하는 이종 효소는 2-데히드로-3-데옥시-D-아라비노-헵토네이트 7-포스페이트 합성효소이고;
    (h) 3-데히드로시키메이트를 시키메이트로 전환하는 이종 효소는 시키메이트 탈수소효소이거나; 또는
    (l) 코리스메이트를 페닐피루베이트로 전환하는 이종 효소는 이관능성 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 탈수효소인 미생물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 미생물:
    (1) ecAroE, kivD, lePAR, pheA2, 및 aroG;
    (2) ecAroE, abPPDC, ecPAR, pheA1, 및 aroG;
    (3) cgAroE, abPPDC, lePAR, pheA2, 및 aroG;
    (4) ecAroE, abPPDC, lePAR, pheA2, 및 aroG;
    (5) cgAroE, kivD, rrPAR, pheA2, 및 aroG;
    (6) ecAroE, abPPDC, lePAR, pheA2, 및 aroG;
    (7) pheA1, aroG, abPPDC, 및 ecPAR;
    (8) egAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
    (9) ecAroE, abPPDC, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
    (10) cgAroE, aro10, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
    (11) cgAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
    (12) cgAroE, aro10, lePAR, pheA2, 및 aroG;
    (13) ecAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
    (14) ecAroE, aro10, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
    (15) ecAroE, aro10, lePAR, pheA2, 및 aroG;
    (16) cgAroE, abPPDC, lePAR, pheA1, 및 aroG;
    (17) cgAroE, aro10, rsPAR, pheA2, 및 aroG;
    (18) cgAroE, abPPDC, blPAR, pheA2, 및 aroG;
    (19) ecAroE, kivD, blPAR, pheA2, 및 aroG;
    (20) cgAroE, aro10, blPAR, pheA2, 및 aroG;
    (21) ecAroE, abPPDC, blPAR, pheA2, 및 aroG;
    (22) ecAroE, abPPDC, adh6, pheA1, 및 aroG;
    (23) cgAroE, abPPDC, adh6, pheA2, 및 aroG;
    (24) cgAroE, abPPDC, ecPAR, pheA2, 및 aroG;
    (25) ecAroE, aro10, rsPAR, pheA2, 및 aroG;
    (26) ecAroE, aro10, adh6, pheA2, 및 aroG; 또는
    (27) ecAroE, abPPDC, ecPAR, pheA2, 및 aroG.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 조합 균주 2C03, 1C10, 2C54, 2C09, 2C47, 2C55, 2C53, H57, 1C47, 2C10, 2A18, 1C54, 2C01, 1C31, 2B17, 2C52, 1C09, H18, H58, 2C27, 2D22, 2D07, 2D24, 2D03, 1C29, 2B26, 2C38, 2A27, 2C12, 또는 2B27의 이종 유전자 및 프로모터를 포함하는 미생물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 2-페닐에탄올을 제조하기 위해 CO, CO2, 및/또는 H2를 포함하는 가스성 기질을 발효시키는 미생물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 가스성 기질은 신가스(syngas) 또는 산업 폐기 가스를 포함하는, 미생물.
  18. 제16항에 있어서, 임의의 다른 C3+ 알코올을 생성하지 않는 미생물.
  19. 제18항에 있어서, 임의의 다른 C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, 또는 C10 알코올을 생성하지 않는 미생물.
  20. 가스성 기질의 존재 하에서, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 2-페닐에탄올의 제조 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 가스성 기질이 CO, CO2, 및/또는 H2를 포함하는 C1-탄소원을 포함하는, 방법.
  22. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가스성 기질은 신가스 또는 산업 폐기 가스를 포함하는, 방법.
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