KR20240046579A - 이소프레노이드 알코올 및 유도체의 생성을 위한 미생물 발효 - Google Patents

이소프레노이드 알코올 및 유도체의 생성을 위한 미생물 발효 Download PDF

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KR20240046579A
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션 데니스 심슨
마이클 퀩키
마이클 ??키
루퍼트 올리버 존 노먼
쉬바니 가그
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란자테크, 인크.
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Abstract

본 개시는 이소프레노이드 알코올, 이소프레노이드 알코올 유도체 또는 이의 테르펜 전구체를 미생물 발효에 의해 생성하는 방법을 제공한다. 전형적으로, 방법은 재조합 박테리아를 기체 기질의 존재 하에 배양하는 단계를 포함하며, 이에 의해 박테리아는 이소프레노이드 알코올, 이소프레노이드 알코올 유도체, 테르펜 또는 이들의 전구체를 생성한다. 미생물은 하나 이상의 외인성 효소를 포함할 수 있다.

Description

이소프레노이드 알코올 및 유도체의 생성을 위한 미생물 발효
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2021년 8월 24일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/260,534호의 이익을 주장하며, 이의 전문은 본원에 참조로서 포함된다.
기술분야
본 개시는 이소프레노이드 알코올, 이소프레노이드 알코올 유도체, 테르펜 및/또는 이의 전구체를 기체 기질의 미생물 발효에 의해 생성하기 위한 재조합 미생물 및 방법에 관한 것이다.
이소프레노이드 알코올은 이러한 신규한 합성 대사 경로에서 이소프레노이드 전구체의 생성을 위한 주요 중간 생성물이다. 테르펜은 5-탄소 이소프렌 단위로 구성된 다양한 종류의 자연 발생 화학물질이다. 테르펜 유도체는 탄소 골격의 산화 또는 재배열 또는 다수의 작용기 첨가 또는 재배열에 의해 형성될 수 있는 테르페노이드(이소프레노이드로도 알려짐)를 포함한다.
테르펜의 예는 이소프렌(C5 헤미테르펜), 파르네센(C15 세스퀴테르펜), 아르테미시닌(C15 세스퀴테르펜), 시트랄(C10 모노테르펜), 카로티노이드(C40 테트라테르펜), 멘톨(C10 모노테르펜), 캄포(C10 모노테르펜) 및 카나비노이드를 포함한다.
3-메틸-부트-2-에노일-CoA 및 3-메틸-부트-3-에노일-CoA와 같은 이소프레노이드 아실-CoA 및 프레놀 및 이소프레놀과 같은 이소프레노이드 알코올은 인산화 효소를 통해 이소프레노이드 전구체, 예컨대, 이소펜테닐 포스페이트(IP), 디메틸알릴 포스페이트(DMAP), IPP 및 DMAPP로 전환될 수 있는 주요 경로 중간체이다. 임의의 이러한 생성물은 원하는 경우 추가로 변형될 수 있다. 테르펜은 다양한 산업에서 사용되는 귀중한 상업용 생성물이다. 테르펜의 가장 높은 톤 사용은 수지, 용매, 방향제 및 비타민으로서의 사용이다. 예를 들어, 이소프렌은 합성 고무(시스-1,4-폴리이소프렌)의 생성, 예를 들어, 타이어 산업에서 사용되고; 파르네센은 수송에 사용되는 에너지 밀도가 높은 드롭-인 연료 또는 제트-연료로서 사용되며; 아르테미시닌은 말라리아 약물로서 사용되고; 시트랄, 카로티노이드, 멘톨, 캄포 및 카나비노이드는 제약, 부타디엔의 제조에 사용되고 방향족 성분으로서 사용된다.
테르펜은 석유화학 공급원 및 테르펜 공급원료, 예컨대 터펜틴으로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 이소프렌은 에틸렌의 생성에서 나프타의 부산물 또는 오일 균열로서 석유화학적으로 생성된다. 또한, 많은 테르펜은 천연 공급원으로부터 비교적 적은 양으로 추출된다. 그러나, 이러한 생성 방법은 비용이 많이 들고, 지속 불가능하며, 종종 기후 변화의 한 원인이 된다는 점을 포함하는 환경 문제를 야기한다.
이소프렌의 극인화성 성질로 인해, 알려진 생성 방법은 화재 및 폭발 가능성을 제한하기 위한 광범위한 안전 장치를 필요로 한다.
본 개시의 목적은 종래 기술의 단점 중 하나 이상을 극복하거나, 적어도 이소프레노이드 알코올, 이소프레노이드 알코올 유도체, 테르펜 및 다른 관련 생성물을 생성하기 위한 대안적인 수단을 대중에게 제공하는 것이다.
미생물 발효는 이소프레노이드 알코올, 이소프레노이드 알코올 유도체, 및/또는 테르펜의 생성을 위한 대안적인 선택지를 제공한다. 본 개시의 반응은 탄소 재배열 및 작용기의 첨가/제거를 위한 다양한 대사 경로 및 효소와 조합하여 사용되는 경우 이소프레노이드 전구체의 합성을 위한 플랫폼으로서 기능한다. 이소프레노이드 알코올은 이러한 신규한 합성 대사 경로에서 이소프레노이드 전구체의 생성을 위한 주요 중간 생성물이다. 테르펜은 자연에서 편재하며, 예를 들어, 박테리아 세포 벽 생합성에 관여하고, UV 광 노출로부터 잎을 보호하기 위해 일부 나무(예를 들어, 포플러)에 의해 생성된다. 그러나, 모든 박테리아가 대사 산물로서 테르펜 및/또는 전구체를 생성하기 위해 필요한 세포 기계(cellular machinery)를 포함하는 것은 아니다. 예를 들어, 일산화탄소를 포함하는 기질을 발효시켜 에탄올과 같은 생성물을 생성할 수 있는 클로스트리디움 아우토에타노게눔(C. autoethanogenum) 또는 클로스트리디움 륭달리이(C. ljungdahlii)와 같은 일산화탄소영양 아세토겐은 대사 생성물로서 임의의 테르펜 및/또는 이들의 전구체를 생성하고 방출하는 것으로 알려져 있지 않다. 또한, 대부분의 박테리아는 상업적 가치가 있는 임의의 이소프레노이드 알코올 또는 테르펜을 생성하는 것으로 알려져 있지 않다.
본 개시는 특히, CO를 포함하는 기질의 미생물 발효 및 이러한 방법에서 사용되는 재조합 미생물에 의해 하나 이상의 이소프레노이드 알코올, 이소프레노이드 알코올 유도체, 테르펜 및/또는 이의 전구체를 생성하기 위한 방법을 일반적으로 제공한다.
본 개시는 생성물을 기체 기질로부터 생성할 수 있는 유전자 조작 미생물을 제공하며, 미생물은 적어도 아세틸-CoA 합성효소를 포함하는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산 및
a) i) 케토-아실-CoA 티올라제(KAT1), ii) 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 코엔자임 A(HMG-CoA) 합성효소, iii) 메틸글루타코닐-CoA 가수분해효소(MGCH), iv) 3-메틸크로토닐-CoA 카르복실라제(MCCC), v) 아실-CoA 환원효소(ACOAR) 및 vi) 알코올 탈수소효소(ADH)를 포함하는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산;
b) i) KAT1, ii) HMG-CoA 합성효소, iii) MGCH, MCCC, iv) 포스포트랜스부티라제 부티레이트 키나제(Ptb-buk), v) 아세트알데하이드-페레독신 산화환원효소(AOR) 및 vi) (ADH)를 포함하는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산;
c) i) KAT1 또는 PTAr 및 ACKr, ii) CoA 전이효소 A/B(CtfAB), iii) 아세토아세테이트 데카르복실라제(ADC) 또는 ADC 및 하이드록시이소발레레이트 합성효소(HIVS), iv) 하이드록시이소발레레이트 티오에스테라제(3HBZCT), v) 하이드록시이소펜틸-CoA 가수분해효소(HPHL), vi) ACOAR 및 vii) ADH를 포함하는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산;
d) i) KAT1 또는 PTAr 및 ACKr, ii) CoA 전이효소 A/B(CtfAB), iii) ADC 또는 ADC 및 HIVS, iv) 3HBZCT, v) HPHL, vi) Ptb-buk, vii) AOR 및 ADH를 포함하는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산;
e) i) KAT1, ii) HMG-CoA 합성효소, iii) 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 코엔자임 A(HMG-CoA) 환원효소, iv) 메발로네이트 키나제(MK), v) 포스포메발로네이트 키나제(PMK), vi) 디포스포메발로네이트 데카르복실라제(DMD), vii) 이소-펜테닐디포스페이트 이성질화효소(IDI), viii) 디메틸알릴 디포스페이트 키나제(DMPKK) 및 ix) 디메틸알릴 포스페이트 키나제(DMPK)를 포함하는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산;
f) i) KAT1, ii) HMG-CoA 합성효소, iii) 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 코엔자임 A(HMG-CoA) 환원효소, iv) 메발로네이트 키나제(MK), v) 포스포메발로네이트 데카르복실라제(PMVD), vi) 이소-펜테닐포스페이트 이성질화효소(IPI) 및 vii) 프레닐포스파타제(DMPase)를 포함하는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산;
g) i) 티올라제, 아실-CoA 아세틸트랜스퍼라제 또는 폴리케티드 합성효소, ii) β-케토아실-CoA 환원효소 또는 β-하이드록시아실-CoA 탈수소효소, iii) β-하이드록시아실-CoA 탈수효소, iv) 트랜스-에노일-CoA 환원효소 또는 부티릴-CoA 탈수소효소/전자 전달 플라보단백질 AB(Bcd-EtfAB), v) 알코올 형성 아실-CoA 환원효소 또는 알데하이드 형성 아실-CoA 카르복실레이트 환원효소, vi) 가수분해 효소 또는 ADH 및 vii) 알코올 탈수효소를 포함하는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산
중 적어도 하나를 포함하며, 미생물은 C1-고정 미생물이며, 생성물은 이소프레노이드 알코올이다.
일 구현예의 미생물은 이소프레노이드 알코올이 프레놀이다.
일 구현예의 미생물은 프레놀을 이소프레놀로 전환할 수 있는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일 구현예의 미생물은 프레놀을 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP)로 전환할 수 있는 효소의 군을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일 구현예의 미생물은 이소프레놀을 이소펜테닐 디포스페이트(IPP)로 전환할 수 있는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일 구현예의 미생물은 이소펜테닐 디포스페이트 이성질화효소 및 제라닐트랜스트랜스퍼라제로 구성되는 군으로부터 선택되는 외인성 효소를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일 구현예의 미생물은 프레놀을 DMAPP로 전환할 수 있는 효소의 군이 알코올 디포스포키나제이다.
일 구현예의 미생물은 이소프레놀을 IPP로 전환할 수 있는 효소의 군이 알코올 디포스포키나제이다.
일 구현예의 미생물은 아세토하이드록시산 이성질환원효소, 아세토아세테이트 데카르복실레이트, 아실-CoA 탈수소효소, 아실-CoA 환원효소, 아실-CoA 합성효소, 아실-CoA 전이효소, 알코올 탈수효소, 알코올 탈수소효소, 알데하이드 데카르복실라제, 알파-케토산 데카르복실라제, 알파-케토산 탈수소효소, 카르복실레이트 키나제, 카르복실레이트 환원효소, 탈수효소, 디하이드록시산 탈수효소, 디올 탈수효소, 에노에이트 가수분해효소, 에노일-CoA 가수분해효소, 에노일-CoA 환원효소, 글루타코닐-CoA 데카르복실라제, 하이드록시산 탈수효소, 하이드록시산 탈수소효소, 하이드록시아실-CoA 탈수효소, 하이드록시아실-CoA 탈수소효소, 하이드록시메틸아실-CoA 합성효소, 이성질환원효소, 이소프로필말레이트 탈수소효소, 이소프로필말레이트 이성질화효소, 이소프로필말레이트 합성효소, 뮤타제, 오메가-산화 효소, 포스포트랜스아실라제, 티오에스테라제 또는 티올라제로부터 선택되는 이소프레노이드 알코올(들)을 생성할 수 있는 3개 이상의 효소를 추가로 포함하며, 상기 생성은 선택적으로 이소프레노이드 아실-CoA를 통해 진행된다.
일 구현예의 미생물은 이소프레노이드 알코올(들)을 이소프레노이드 전구체(들)로 전환하기 위한 하나 이상의 인산화 효소(들); 및 d) 선택적으로 상기 이소프레노이드 전구체(들)를 다른 이소프레노이드 전구체(들) 또는 이소프레노이드(들) 또는 이의 유도체(들)로 전환하기 위한 하나 이상의 효소(들)를 추가로 포함하며, 상기 효소(들) 중 하나 이상은 이종성 효소이다.
일 구현예의 미생물은 이소프레노이드 전구체(들)를 생성하는 재조합 미생물 또는 선택적으로 이소프레노이드(들) 또는 이의 유도체(들)이고, 상기 재조합 미생물은 a) 아실-CoA + 제2 아실-CoA의 축합을 촉매하여 베타-케토아실 CoA를 형성하는 티올라제 또는 케토아세틸-CoA 합성효소(각각의 상기 아실-CoA는 아세틸-CoA, 글리콜릴-CoA, 프로피오닐-CoA, 말로닐-CoA, 치환되지 않은 아실-CoA, 또는 관능화된 아실-CoA로부터 선택됨); b) 선택적으로 하나 이상의 반복(들)(상기 베타-케토아실 CoA는 하나 이상의 효소를 사용하여 변형된 후 단계 a)의 새로운 축합 반복을 위한 아실-CoA 프라이머 유닛으로 사용됨); c) 상기 베타-케토아실 CoA를 이소프레노이드 알코올로 전환하기 위한 3개 이상의 효소(들)(상기 효소(들)는 베타-환원 효소(들) 및 알코올 형성 종결 효소(들)를 포함함); d) 상기 이소프레노이드 알코올(들)을 이소프레노이드 전구체(들)로 전환하기 위한 하나 이상의 인산화 효소(들); 및 e) 선택적으로 상기 이소프레노이드 전구체(들)를 다른 이소프레노이드 전구체(들) 또는 이소프레노이드(들) 또는 이의 유도체(들)로 전환하기 위한 하나 이상의 효소(들)를 포함하며, 하나 이상의 상기 효소(들)는 이종성이다.
일 구현예의 미생물은 외인성 효소 이소펜테닐 디포스페이트 이성질화효소 및 제라닐트랜스트랜스퍼라제 둘 모두를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일 구현예의 미생물은 리모넨 합성효소, 피넨 합성효소, 파르네센 합성효소 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일 구현예의 미생물은 이소프렌 합성효소를 포함하는 외인성 효소를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일 구현예의 미생물은 일산화탄소 탈수소효소를 갖는다.
일 구현예의 미생물은 DXS 경로에 대한 파괴 돌연변이를 더 포함한다.
일 구현예의 미생물은 파괴 돌연변이가 녹아웃이다.
일 구현예의 미생물은 외인성 효소가 적어도 e)를 a), b), c), d), f) 및 g) 중 임의의 하나 이상과 조합하여 직렬로 포함한다.
일 구현예의 미생물은 외인성 효소를 코딩하는 핵산이 코돈 최적화된 핵산이다.
일 구현예의 미생물은 외인성 효소를 코딩하는 핵산이 미생물의 게놈 내에 통합된다.
일 구현예의 미생물은 외인성 효소를 코딩하는 핵산이 플라스미드에 혼입된다.
일 구현예의 미생물은 외인성 효소를 코딩하는 핵산이 구성적 프로모터에 의해 조절된다.
본 개시는 이소프레노이드 알코올을 생성하는 방법을 제공하며, 제1항에 따른 미생물을 일산화탄소 및 이산화탄소로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 C1 화합물을 탄소 공급원으로서 사용하여 배양하여 미생물이 이소프레노이드 알코올을 생성할 수 있게 한다.
본 개시는 이소프레노이드 알코올, 이소프레노이드 알코올 유도체 또는 테르펜 전구체를 생성하는 방법을 제공하며, 일산화탄소 및 이산화탄소로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 C1 화합물을 제1항에 따른 미생물과 접촉시켜 제공하여 미생물이 C1 화합물로부터 이소프레노이드 알코올, 이소프레노이드 알코올 유도체 또는 테르펜 전구체를 생성할 수 있게 한다.
일 구현예의 방법은 미생물에게 수소를 포함하는 기체가 제공된다.
일 구현예의 방법은 이소프레노이드 알코올이 회수된다.
일 구현예의 방법은 미생물에게 수소를 포함하는 기체가 제공된다.
일 구현예의 방법은 테르펜 전구체가 회수된다.
일 구현예의 방법은 C1 화합물이 철금속 생성물 제조, 비철 생성물 제조, 석유 정제, 석탄 가스화, 전력 생성, 카본 블랙 생성, 암모니아 생성, 메탄올 생성 및 코크스 제조로 구성되는 군으로부터 선택되는 산업 공정으로부터 유래된다.
일 구현예의 방법은 C1 화합물이 합성가스이다.
일 구현예의 미생물은 미생물이 클로스트리디움 아우토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리디움 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리디움 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes), 클로스트리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리디움 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리디움 마그눔(Clostridium magnum), 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator), 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 무렐라 테르마우토트로피카(Moorella thermautotrophica) 및 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다.　
일 구현예의 미생물은 이소프레노이드 알코올이 테르페노이드, 비타민 A, 리코펜, 스쿠알렌, 이소프렌, 피넨, 네롤, 시트랄, 캄포, 멘톨, 리모넨, 네롤리돌, 파르네솔, 파르네센, 피톨, 카로틴, 리날로올 및 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 테르펜으로 전환된다.
본 개시의 미생물을 조작함에 있어서, 본 발명자들은 놀랍게도 생성물을 기체 기질로부터 생성할 수 있는 미생물을 유전자 조작할 수 있었으며, 미생물은 (Cn)-아실 CoA의 β-케토아실-CoA로의 전환을 촉매하는 단계; β-케토아실-CoA의 β-하이드록시아실-CoA로의 전환을 촉매하는 단계; β-하이드록시아실-CoA의 트랜스-Δ2-에노일-CoA로의 전환을 촉매하는 단계; 및 트랜스-Δ2-에노일-CoA의 (Cn+2) 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 단계를 포함하는 반복 경로; 및 하나 이상의 종결 효소를 포함하며, 미생물은 티오에스테라제에서 파괴 돌연변이를 포함하는 C1-고정 박테리아이다. 이러한 경로는 생성을 위해 C4, C6, C8, C10, C12, C14 알코올, 케톤, 에놀 또는 디올의 범위를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 보다 높은 사슬 길이에 대한 특이성을 갖는 동일한 효소 또는 이의 조작된 변이체를 사용하여 추가로 연장될 수 있다. 상이한 유형의 분자는 또한 티올라제 단계에서 아세틸-CoA와 상이한 프라이머 또는 연장 유닛을 사용하여 수득될 수 있다. 이는 CO를 포함하는 기질 및/또는 CO2를 포함하는 기질을 사용하여 일차 알코올을 생성하기 위한 지속 가능한 발효를 제공한다.
프라이머 및 연장제는 옥살릴-CoA, 아세틸-CoA, 말로닐 CoA, 숙시닐-CoA, 하이드록시아세틸-CoA, 3-하이드록시프로프리오닐-CoA, 4-하이드록시부티릴-CoA, 2-아미노아세틸-CoA, 3-아미노프로피오닐-CoA, 4-아미노부티릴-CoA, 이소부티릴-CoA, 3-메틸-부티릴-CoA, 2-하이드록시프로프리오닐-CoA, 3-하이드록시부티릴-CoA, 2-아미노프로프리오닐-CoA, 프로피오닐-CoA 및 발레릴-CoA로부터 선택된다. 또한, 박테리아는 역방향 β-산화 경로에서 효소의 군을 발현하고, 박테리아는, 일차 알코올, 트랜스 Δ2 지방산 알코올, β-케토 알코올, 1,3-디올, 1,4-디올, 1,6-디올, 이산, β-하이드록시 산, 카르복시산 또는 탄화수소를 생성하는 능력을 획득한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA는 프라이머/스타터 분자이며, 이는 짝수 사슬 n-알코올 및/또는 카르복시산의 합성을 야기한다. 또 다른 구현예에서, 프로피오닐-CoA는 스타터/프라이머 분자이며, 이는 홀수 사슬 n-알코올 및/또는 카르복시산의 합성을 가능하게 한다.
일 구현예에서, 프라이머는 아세틸-CoA 또는 프로피오닐-CoA 이외의 것일 수 있지만, 아세틸-CoA는 프라이머와 축합되어 연장 유닛으로서 작용하여 2개의 탄소 유닛을 추가할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상이한 종결 효소와 조합된 이들 프라이머는 다른 생성물의 합성을 야기한다.
일 구현예에서, 본 개시는 하나 이상의 종결 효소가 알코올 형성 코엔자임-A 티오에스테르 환원효소, 알데하이드 형성 CoA 티오에스테르 환원효소, 알코올 탈수소효소, 티오에스테라제, 아실-CoA:아세틸-CoA 전이효소, 포스포트랜스아실라제 및 카르복실레이트 키나제; 알데하이드 페레독신 산화환원효소; 알데하이드 형성 CoA 티오에스테르 환원효소, 알데하이드 데카르보닐라제, 알코올 탈수소효소; 알데하이드 탈수소효소, 아실-CoA 환원효소 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다는 점을 설명한다.
일 구현예에서, 본 개시는 베타 산화 사이클의 역전의 다수의 턴의 작동을 설명하며, 이는 사이클의 턴(들)으로부터 생성된 아실-CoA를 추가 아세틸-CoA 분자와 축합하여 각각의 사이클 턴마다 2개의 탄소만큼 아실-CoA를 연장시키는 것을 필요로 한다. 또 다른 구현예에서, 다수의 사이클 턴의 개시 및 연장은, 탄소 수가 증가하는 경로 중간체에 작용할 수 있는 다른 경로 효소와 조합된 보다 긴 사슬의 아실-CoA 분자에 대한 특이성을 갖는 티올라제(들)의 사용을 필요로 한다.
본 발명자들은 클로스트리디움 아우토에타노게눔에서 본 개시의 효능을 입증하였지만, 본 개시는 위에서 논의되고 본원에서 추가로 논의되는 바와 같이, CO 및/또는 CO2를 포함하는 기질 상에서의 혐기성 아세트산생성 미생물 및 발효의 보다 넓은 군에 적용 가능하다.
본 개시는 역 베타 산화 유사 경로에서 프라이머 및 연장 유닛으로서 관능화된 아실-CoA를 수용하는 CoA-의존성 신장 플랫폼을 제공한다. 생성물은 임의의 지점에서 꺼낼 수 있고, 원하는 경우 추가로 변형시킬 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 다양한 효소 조합을 통해 피루브산염과 같은 중심 탄소 대사산물로부터 생성물 합성을 가능하게 하는 반응이 가능하다. 3-메틸-부트-2-에노일-CoA 및 3-메틸-부트-3-에노일-CoA와 같은 이소프레노이드 아실-CoA 및 프레놀 및 이소프레놀과 같은 이소프레노이드 알코올은 인산화 효소를 통해 이소프레노이드 전구체, 예컨대, 이소펜테닐 포스페이트(IP), 디메틸알릴 포스페이트(DMAP), IPP 및 DMAPP로 전환될 수 있는 주요 경로 중간체이다. 위와 같이, 임의의 이러한 생성물은 원하는 경우 추가로 변형될 수 있다.
본 개시의 다른 양태는 프레놀 대신 3-메틸-3-부테놀(이소프레놀)을 통한 베타-산화 역전을 사용하는 경로를 제공한다. 이러한 경로는 티올라제에 의해 촉매되는 프라이머 및 연장 유닛으로부터 시작된다. 하이드록시아실-CoA 탈수소효소, 에노일-CoA 가수분해효소 및 에노일-CoA 환원효소에 의해 촉매되는 3개의 베타-환원 단계 후, 4-하이드록시-2-메틸부타노일-CoA가 생성된다. 4-하이드록시-2-메틸부타노일-CoA는 알코올-형성 아실-CoA 환원효소 또는 알데하이드 형성 아실-CoA 환원효소 및 알코올 탈수소효소 또는 카르복실레이트 환원효소 및 티오에스테라제, 아실-CoA 합성효소, 아실-CoA 전이효소 및 카르복실레이트 키나제 + 포스포트랜스아실라제로 구성되는 군으로부터 선택되는 가수분해 효소에 의해 2-메틸-1,4-부탄디올로 전환된다. 그런 다음, 알코올 탈수효소는 2-메틸-1,4-부탄디올을 3-메틸-3-부테놀(이소프레놀)로 전환한다. 그런 다음, 이소프레놀은 인산화의 1단계 또는 2단계에 의해 IPP로 전환된다. 2단계에 의해 인산화되는 경우, 제1 단계는 알코올 키나제에 의해 촉매되고 제2 단계는 포스페이트 키나제에 의해 촉매된다. 1단계 인산화는 알코올 디포스포키나제에 의해 촉매된다. 이소펜테닐 피로포스페이트 이성질화효소(IDI)는 DMAPP를 IPP로 전환한다. DMAPP 및 IPP는 GPP 합성효소에 의해 촉매되는 GPP로 축합된다.
본 개시는 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체 및 선택적으로 하나 이상의 다른 생성물을 생성할 수 있는 일산화탄소영양 아세트산생성 재조합 미생물을 제공한다.
일 특정 구현예에서, 미생물은 재조합 미생물이 유래되는 모 미생물에 존재하지 않는 메발로네이트(MVA) 경로에서 하나 이상의 효소(본원에서 외인성 효소로서 지칭될 수 있음)를 발현하도록 구성된다. 다른 구현예에서, 미생물은 재조합 미생물이 유래되는 모 미생물에 존재하는 메발로네이트(MVA) 경로에서 하나 이상의 효소(본원에서 내인성 효소로서 지칭될 수 있음)를 과발현하도록 구성된다.
추가 구현예에서, 미생물은
a) 메발로네이트(MVA) 경로에서 하나 이상의 외인성 효소를 발현하고/하거나 메발로네이트(MVA) 경로에서 하나 이상의 내인성 효소를 과발현하고;
b) DXS 경로에서 하나 이상의 외인성 효소를 발현하고/하거나 DXS 경로에서 하나 이상의 내인성 효소를 과발현하도록 구성된다.
일 구현예에서, 메발로네이트(MVA) 경로로부터 유래하는 하나 이상의 효소는
a) 티올라제(EC 2.3.1.9),
b) HMG-CoA 합성효소(EC 2.3.3.10),
c) HMG-CoA 환원효소(EC 1.1.1.88),
d) 메발로네이트 키나제(EC 2.7.1.36),
e) 포스포메발로네이트 키나제(EC 2.7.4.2),
f) 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제(EC 4.1.1.33) 및
g) 이들 중 임의의 하나의 기능적으로 동등한 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
추가 구현예에서, DXS 경로로부터 유래하는 하나 이상의 효소는
a) 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 합성효소 DXS(EC:2.2.1.7),
b) 1-데옥시-D-자일룰로스 5-포스페이트 환원이성질화효소 DXR(EC:1.1.1.267),
c) 2-C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트 시티딜릴트랜스퍼라제 IspD(EC:2.7.7.60),
d) 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나제 IspE(EC:2.7.1.148),
e) 2-C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트 합성효소 IspF(EC:4.6.1.12),
f) 4-하이드록시-3-메틸부트-2-엔-1-일 디포스페이트 합성효소 IspG(EC:1.17.7.1),
g) 4-하이드록시-3-메틸부트-2-에닐 디포스페이트 환원효소(EC:1.17.1.2) 및
h) 이들 중 임의의 하나의 기능적으로 동등한 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
추가 구현예에서, 하나 이상의 추가 외인성 또는 내인성 효소가 발현되거나 과발현되어 테르펜 화합물 또는 이의 전구체의 생성을 초래하며, 발현되는 외인성 효소 또는 과발현되는 내인성 효소는
a) 제라닐트랜스트랜스퍼라제 Fps(EC:2.5.1.10),
b) 헵타프레닐 디포스페이트 합성효소(EC:2.5.1.10),
c) 옥타프레닐-디포스페이트 합성효소(EC:2.5.1.90),
d) 이소프렌 합성효소(EC 4.2.3.27),
e) 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성질화효소(EC 5.3.3.2),
f) 파르네센 합성효소(EC 4.2.3.46 / EC 4.2.3.47) 및
g) 이들 중 임의의 하나의 기능적으로 동등한 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 모 미생물은 CO를 포함하는 기질을 발효하여 아세틸 CoA를 생성할 수 있으나, 아세틸 CoA를 메발론산 또는 이소펜테닐 피로포스페이트(IPP)로 전환할 수 없으며, 재조합 미생물은 메발로네이트 경로에 관여하는 하나 이상의 효소를 발현하도록 구성된다.
일 구현예에서, 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체는 메발론산, IPP, 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP), 이소프렌, 제라닐 피로포스페이트(GPP), 파르네실 피로포스페이트(FPP) 및 파르네센으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 미생물은 하나 이상의 내인성 핵산의 발현을 증가시키도록 구성되는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 하나 이상의 내인성 핵산은 전술한 효소 중 하나 이상을 코딩한다.
일 구현예에서, 발현을 증가시키도록 구성되는 하나 이상의 외인성 핵산은 조절 요소이다. 일 구현예에서, 조절 요소는 프로모터이다. 일 구현예에서, 프로모터는 구성 프로모터이다. 일 구현예에서, 프로모터는 우드-륭달 유전자 클러스터 또는 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 오페론 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 미생물은 전술한 효소 중 하나 이상을 코딩하고 이를 발현하도록 구성되는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 미생물은 적어도 2개의 효소를 코딩하고 이를 발현하도록 구성되는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다. 다른 구현예에서, 미생물은 효소 중 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 이상을 코딩하고 발현하도록 구성되는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다.
일 구현예에서, 하나 이상의 외인성 핵산은 핵산 작제물 또는 벡터이고, 특정 일 구현예에서, 임의의 조합의 전술한 효소 중 하나 이상을 코딩하는 플라스미드이다.
일 구현예에서, 외인성 핵산은 발현 플라스미드이다.
일 특정 구현예에서, 모 미생물은 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아의 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 박테리아는 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이, 클로스트리디움 라그스달레이, 클로스트리디움 카르복시디보란스, 클로스트리디움 드라케이, 클로스트리디움 스카톨로게네스, 클로스트리디움 아세티쿰, 클로스트리디움 포르미코아세티쿰, 클로스트리디움 마그눔, 부티리박테리디움 메틸로트로피쿰, 아세토박테리움 우디이, 알칼리바쿨룸 박키이, 블라우티아 프로덕타, 유박테리움 리모숨, 무렐라 테르모아세티카, 무렐라 테르마우토트로피카, 스포로무사 오바타, 스포로무사 실바세티카, 스포로무사 스패로이데스, 옥소박터 펜니기이, 및 테르모아내로박터 키부이를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본원에 개시된 미생물의 일부 양태에서, 미생물은 아세토박테리움, 알칼리바쿨룸, 블라우티아, 부티리박테리움, 클로스트리디움, 쿠프리아비두스, 유박테리움, 무렐라, 옥소박터, 스포로무사 및 테르모아내로박터로 구성되는 군으로부터 선택되는 속의 구성원이다.
본원에 개시된 미생물의 일부 양태에서, 미생물은 아세토박테리움 우디이, 알칼리바쿨룸 박키이, 블라우티아 프로덕타, 부티리박테리움 메틸로트로피쿰, 클로스트리디움 아세티쿰, 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 카르복시디보란스, 클로스트리디움 코스카티이, 클로스트리디움 드라케이, 클로스트리디움포르미코아세티쿰, 클로스트리디움 륭달리이, 클로스트리디움 마그눔, 클로스트리디움 라그스달레이, 클로스트리디움 스카톨로게네스, 쿠프리아비두스 네카토르, 유박테리움 리모숨, 무렐라 테르마우토트로피카, 무렐라 테르모아세티카, 옥소박터 펜니기이, 스포로무사 오바타, 스포로무사 실바세티카, 스포로무사 스패로이데스 및 테르모아내로박터 키우비로 구성되는 군으로부터 선택되는 모 미생물로부터 유래된다.
일 구현예에서, 모 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노게눔 또는 클로스트리디움 륭달리이이다. 일 특정 구현예에서, 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노게눔 DSM23693이다. 또 다른 특정 구현예에서, 미생물은 클로스트리디움 륭달리이 DSM13528(또는 ATCC55383)이다.
일 구현예에서, 모 미생물은 DXS 경로 및/또는 메발로네이트(MVA) 경로에서 하나 이상의 유전자가 결여되어 있다. 일 구현예에서, 모 미생물은
a) 티올라제(EC 2.3.1.9),
b) HMG-CoA 합성효소(EC 2.3.3.10),
c) HMG-CoA 환원효소(EC 1.1.1.88),
d) 메발로네이트 키나제(EC 2.7.1.36),
e) 포스포메발로네이트 키나제(EC 2.7.4.2),
f) 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제(EC 4.1.1.33),
g) 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 합성효소 DXS(EC:2.2.1.7),
h) 1-데옥시-D-자일룰로스 5-포스페이트 환원이성질화효소 DXR(EC:1.1.1.267),
i) 2-C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트 시티딜릴트랜스퍼라제 IspD(EC:2.7.7.60),
j) 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나제 IspE(EC:2.7.1.148),
k) 2-C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트 합성효소 IspF(EC:4.6.1.12),
l) 4-하이드록시-3-메틸부트-2-엔-1-일 디포스페이트 합성효소 IspG(EC:1.17.7.1),
m) 4-하이드록시-3-메틸부트-2-에닐 디포스페이트 환원효소(EC:1.17.1.2) 및
n) 이들 중 임의의 하나의 기능적으로 동등한 변이체로부터 선택되는 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자가 결여되어 있다.
제2 양태에서, 본 개시는 미생물에서 발현되는 경우 미생물이 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체를 생성할 수 있게 하는 하나 이상의 효소를 코딩하는 핵산을 제공한다.
일 구현예에서, 핵산은 미생물에서 발현되는 경우 미생물이 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체를 생성할 수 있게 하는 2개 이상의 효소를 코딩한다. 일 구현예에서, 본 개시의 핵산은 이러한 효소 중 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 그 이상을 코딩한다.
일 구현예에서, 핵산은 메발로네이트(MVA) 경로에서 하나 이상의 효소를 코딩한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 효소는
a) 티올라제(EC 2.3.1.9),
b) HMG-CoA 합성효소(EC 2.3.3.10),
c) HMG-CoA 환원효소(EC 1.1.1.88),
d) 메발로네이트 키나제(EC 2.7.1.36),
e) 포스포메발로네이트 키나제(EC 2.7.4.2),
f) 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제(EC 4.1.1.33) 및
g) 이들 중 임의의 하나의 기능적으로 동등한 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 핵산은 티올라제(아세틸 CoA c-아세틸트랜스퍼라제일 수 있음), HMG-CoA 합성효소 및 HMG-CoA 환원효소를 코딩한다,
추가 구현예에서, 핵산은 메발로네이트(MVA) 경로 내의 하나 이상의 효소 및 DXS 경로 내의 하나 이상의 추가 핵산을 코딩한다. 일 구현예에서, DXS 경로로부터 유래하는 하나 이상의 효소는
a) 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 합성효소 DXS(EC:2.2.1.7),
b) 1-데옥시-D-자일룰로스 5-포스페이트 환원이성질화효소 DXR(EC:1.1.1.267),
c) 2-C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트 시티딜릴트랜스퍼라제 IspD(EC:2.7.7.60),
d) 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나제 IspE(EC:2.7.1.148),
e) 2-C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트 합성효소 IspF(EC:4.6.1.12),
f) 4-하이드록시-3-메틸부트-2-엔-1-일 디포스페이트 합성효소 IspG(EC:1.17.7.1),
g) 4-하이드록시-3-메틸부트-2-에닐 디포스페이트 환원효소(EC:1.17.1.2) 및
h) 이들 중 임의의 하나의 기능적으로 동등한 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
추가 구현예에서, 하나 이상의 추가 외인성 또는 내인성 효소를 코딩하는 핵산은 발현되거나 과발현되어 테르펜 화합물 또는 이의 전구체의 생성을 초래하며, 발현되는 외인성 핵산 또는 과발현되는 내인성 효소는
a) 제라닐트랜스트랜스퍼라제 Fps(EC:2.5.1.10),
b) 헵타프레닐 디포스페이트 합성효소(EC:2.5.1.10),
c) 옥타프레닐-디포스페이트 합성효소(EC:2.5.1.90),
d) 이소프렌 합성효소(EC 4.2.3.27),
e) 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성질화효소(EC 5.3.3.2),
f) 파르네센 합성효소(EC 4.2.3.46 / EC 4.2.3.47) 및
g) 이들 중 임의의 하나의 기능적으로 동등한 변이체로 구성되는 군으로부터 선택되는 효소를 코딩한다.
일 구현예에서, 티올라제(EC 2.3.1.9)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 40의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 티올라제(EC 2.3.1.9)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 41의 서열을 갖는 아세틸 CoA c-아세틸 전이효소이거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, HMG-CoA 합성효소(EC 2.3.3.10)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 42의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, HMG-CoA 환원효소(EC 1.1.1.88)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 43의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 메발로네이트 키나제(EC 2.7.1.36)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 51의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 포스포메발로네이트 키나제(EC 2.7.4.2)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 52의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제(EC 4.1.1.33)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 53의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 합성효소 DXS(EC:2.2.1.7)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 1의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 환원이성질화효소 DXR(EC:1.1.1.267)을 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 3의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 2-C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트 시티딜릴트랜스퍼라제 IspD(EC:2.7.7.60)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 5의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나제 IspE(EC:2.7.1.148)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 7의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 2-C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트 합성효소 IspF(EC:4.6.1.12)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 9의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 4-하이드록시-3-메틸부트-2-엔-1-일 디포스페이트 합성효소 IspG(EC:1.17.7.1)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 11의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 4-하이드록시-3-메틸부트-2-에닐 디포스페이트 환원효소(EC:1.17.1.2)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 13의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 제라닐트랜스트랜스퍼라제 Fps를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 15의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 헵타프레닐 디포스페이트 합성효소를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 17의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 폴리프레닐 합성효소인 옥타프레닐-디포스페이트 합성효소(EC:2.5.1.90)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 19에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 이소프렌 합성효소(ispS)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 21의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성질화효소(idi)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 54의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 파르네센 합성효소를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 57의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 핵산은 다음의 효소
a) 이소프렌 합성효소;
b) 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성질화효소(idi); 및
c) 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 합성효소 DXS;
또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 코딩한다.
일 구현예에서, 핵산은 다음의 효소
a) 티올라제;
b) HMG-CoA 합성효소;
c) HMG-CoA 환원효소;
d) 메발로네이트 키나제;
e) 포스포메발로네이트 키나제;
f) 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제;
g) 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성질화효소(idi); 및
h) 이소프렌 합성효소;
또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 코딩한다.
일 구현예에서, 핵산은 다음의 효소
a) 제라닐트랜스트랜스퍼라제 Fps; 및
b) 파르네센 합성효소
또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 코딩한다.
일 구현예에서, 본 개시의 핵산은 프로모터를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 프로모터는 이의 조절 하에서 유전자의 구성적 발현을 가능하게 한다. 특정 구현예에서, 우드-륭달 클러스터 프로모터가 사용된다. 또 다른 특정 구현예에서, 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 오페론 프로모터가 사용된다. 특정 일 구현예에서, 프로모터는 C. 아우토에타노게눔으로부터 유래한다.
제3 양태에서, 본 개시는 제2 양태의 하나 이상의 핵산을 포함하는 핵산 작제물 또는 벡터를 제공한다.
특정 일 구현예에서, 핵산 작제물 또는 벡터는 발현 작제물 또는 벡터이다. 특정 일 구현예에서, 발현 작제물 또는 벡터는 플라스미드이다.
제4 양태에서, 본 개시는 제2 양태의 핵산 또는 제3 양태의 벡터 또는 작제물 중 임의의 하나 이상을 포함하는 숙주 유기체를 제공한다.
제5 양태에서, 본 개시는 본 개시의 제3 양태에서 언급되는 발현 작제물 또는 벡터 및 메틸화 작제물 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 조성물은 본 개시의 제1 양태에 따라 재조합 미생물을 생성할 수 있다.
특정 일 구현예에서, 발현 작제물/벡터 및/또는 메틸화 작제물/벡터는 플라스미드이다.
제6 양태에서, 본 개시는 본 개시의 제1 양태의 재조합 미생물을 사용하여 CO를 포함하는 기질을 발효시키는 단계를 포함하는 미생물 발효에 의해 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체 및 선택적으로 하나 이상의 다른 생성물의 생성 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 방법은
(a) CO를 포함하는 기질을 본 개시의 제1 양태의 하나 이상의 미생물의 배양물을 함유하는 생물반응기에 제공하는 단계; 및
(b) 생물반응기에서 배양물을 혐기성 발효하여 적어도 하나의 테르펜 및/또는 이의 전구체를 생성하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 방법은
(a) 산업 공정의 결과로서 생성된 CO 함유 기체를 포획하는 단계;
(b) 본 개시의 제1 양태의 하나 이상의 미생물을 함유하는 배양물에 의해 적어도 하나의 테르펜 및/또는 이의 전구체를 생성하기 위해 CO 함유 기체를 혐기성 발효하는 단계를 포함한다.
본 방법 양태의 특정 구현예에서, 미생물은 수성 배양 배지에서 유지된다.
본 방법 양태의 특정 구현예에서, 기질의 발효는 생물반응기에서 발생한다.
일 구현예에서, 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체는 메발론산, IPP, 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP), 이소프렌, 제라닐 피로포스페이트(GPP), 파르네실 피로포스페이트(FPP) 및 파르네센으로부터 선택된다.
바람직하게는, CO를 포함하는 기질은 CO를 포함하는 기체 기질이다. 일 구현예에서, 기질은 산업 폐기체를 포함한다. 특정 구현예에서, 기체는 제철소 폐기체 또는 합성가스이다.
일 구현예에서, 기질은 전형적으로 주 성분으로서 CO, 예컨대 부피 기준 적어도 약 20% 내지 약 100% CO, 부피 기준 20% 내지 70% CO, 부피 기준 30% 내지 60% CO 및 부피 기준 40% 내지 55% CO를 함유할 것이다. 특정 구현예에서, 기질은 부피 기준 약 25%, 또는 약 30%, 또는 약 35%, 또는 약 40%, 또는 약 45%, 또는 약 50% CO, 또는 약 55% CO　또는 약 60% CO를 포함한다.
특정 구현예에서, 방법은 테르펜 및/또는 이의 전구체 및 선택적으로 하나 이상의 다른 생성물을 발효 브로쓰로부터 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
제7 양태에서, 본 개시는 제6 양태의 방법에 의해 생성되는 경우 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체를 제공한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체는 메발론산, IPP, 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP), 이소프렌, 제라닐 피로포스페이트(GPP), 파르네실 피로포스페이트(FPP) 및 파르네센으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 본 개시는 본 개시의 제1 양태의 미생물의 생성 방법을 제공하며, 이는 미생물이 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체 및 선택적으로 하나 이상의 다른 생성물을 생성할 수 있거나 생성을 증가시킬 수 있도록 하나 이상의 핵산을 도입하여 일산화탄소영양 아세트산생성 모 미생물을 형질전환시키는 단계를 포함하며, 모 미생물은 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체를 생성할 수 없거나 더 낮은 수준으로 생성한다.
일 특정 구현예에서, 모 미생물은 메발로네이트(MVA) 경로 및 선택적으로 DXS 경로에서 하나 이상의 효소를 발현하도록 구성되는 하나 이상의 외인성 핵산을 도입하여 형질전환된다. 다른 구현예에서, 모 미생물은 해당 모 미생물에 자연적으로 존재하는 메발로네이트(MVA) 경로 및 선택적으로 DXS 경로에서 하나 이상의 효소를 과발현하도록 구성되는 하나 이상의 핵산으로 형질전환된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 효소는 전술한 바와 같다.
일 구현예에서, 메발로네이트 경로 또는 DXS 경로 또는 테르펜 생합성 경로에서 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 단리된 유전자 조작 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아가 제공되며, 이에 의해 박테리아는 효소를 발현한다. 효소는
a) 티올라제(EC 2.3.1.9);
b) HMG-CoA 합성효소(EC 2.3.3.10);
c) HMG-CoA 환원효소(EC 1.1.1.88);
d) 메발로네이트 키나제(EC 2.7.1.36);
e) 포스포메발로네이트 키나제(EC 2.7.4.2);
f) 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제(EC 4.1.1.33); 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 합성효소 DXS(EC:2.2.1.7);
g) 1-데옥시-D-자일룰로스 5-포스페이트 환원이성질화효소 DXR(EC:1.1.1.267);
h) 2-C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트 시티딜릴트랜스퍼라제 IspD(EC:2.7.7.60);
i) 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나제 IspE(EC:2.7.1.148);
j) 2-C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트 합성효소 IspF(EC:4.6.1.12);
k) 4-하이드록시-3-메틸부트-2-엔-1-일 디포스페이트 합성효소 IspG((EC:1.17.7.1);
l) 4-하이드록시-3-메틸부트-2-에닐 디포스페이트 환원효소(EC:1.17.1.2); 제라닐트랜스트랜스퍼라제 Fps(EC:2.5.1.10);
m) 헵타프레닐 디포스페이트 합성효소(EC:2.5.1.10);
n) 옥타프레닐-디포스페이트 합성효소(EC:2.5.1.90);
o) 이소프렌 합성효소(EC 4.2.3.27);
p) 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성질화효소(EC 5.3.3.2); 및
q) 파르네센 합성효소(EC 4.2.3.46 / EC 4.2.3.47)로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 박테리아는 상기 핵산의 부재 시 효소를 발현하지 않는다. 일부 양태에서, 혐기성 조건 하에서 효소를 발현하는 박테리아를 제공한다.
일 구현예는 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아에서 복제할 수 있는 플라스미드를 제공한다. 플라스미드는 메발로네이트 경로 또는 DXS 경로 또는 테르펜 생합성 경로에서 효소를 코딩하는 핵산을 포함하며, 이에 의해 플라스미드가 박테리아 내에 있는 경우, 효소는 상기 박테리아에 의해 발현된다. 효소는
a) 티올라제(EC 2.3.1.9);
b) HMG-CoA 합성효소(EC 2.3.3.10);
c) HMG-CoA 환원효소(EC 1.1.1.88);
d) 메발로네이트 키나제(EC 2.7.1.36);
e) 포스포메발로네이트 키나제(EC 2.7.4.2);
f) 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제(EC 4.1.1.33); 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 합성효소 DXS(EC:2.2.1.7);
g) 1-데옥시-D-자일룰로스 5-포스페이트 환원이성질화효소 DXR(EC:1.1.1.267);
h) 2-C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트 시티딜릴트랜스퍼라제 IspD(EC:2.7.7.60);
i) 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나제 IspE(EC:2.7.1.148);
j) 2-C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트 합성효소 IspF(EC:4.6.1.12);
k) 4-하이드록시-3-메틸부트-2-엔-1-일 디포스페이트 합성효소 IspG((EC:1.17.7.1);
l) 4-하이드록시-3-메틸부트-2-에닐 디포스페이트 환원효소(EC:1.17.1.2); 제라닐트랜스트랜스퍼라제 Fps(EC:2.5.1.10);
m) 헵타프레닐 디포스페이트 합성효소(EC:2.5.1.10);
n) 옥타프레닐-디포스페이트 합성효소(EC:2.5.1.90);
o) 이소프렌 합성효소(EC 4.2.3.27);
p) 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성질화효소(EC 5.3.3.2); 및
q) 파르네센 합성효소(EC 4.2.3.46 / EC 4.2.3.47)로 구성되는 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, CO 및/또는 CO2를 이소프렌으로 전환하기 위한 공정이 제공된다. 공정은 기체 CO-함유 및/또는 CO2-함유 기질을 배양 배지에서 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아의 배양물을 함유하는 생물반응기에 전달하여 박테리아가 CO 및/또는 CO2를 이소프렌으로 전환하도록 하는 단계 및 이소프렌을 생물반응기로부터 회수하는 단계를 포함한다. 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아는 이소프렌 합성효소를 발현하도록 유전자 조작된다.
또 다른 구현예는 이소프렌 합성효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 유전자 조작 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아를 제공한다. 박테리아는 이소프렌 합성효소를 발현하고, 박테리아는 디메틸알릴 디포스페이트를 이소프렌으로 전환할 수 있다. 일 양태에서, 이소프렌 합성효소는 파풀루스 트레물로이데스 효소이다. 또 다른 양태에서, 핵산은 코돈 최적화 핵산이다. 또 다른 양태에서, 이소프렌 합성효소의 발현은 클로스트리디움 아우토에타노게눔으로부터의 피루브산염: 페레독신 산화환원효소 유전자에 대한 프로모터의 전사 조절 하에 있다.
다른 구현예는 CO 및/또는 CO2를 이소펜틸 디포스페이트(IPP)로 전환하기 위한 공정을 제공한다. 공정은 기체 CO-함유 및/또는 CO2-함유 기질을 배양 배지에서 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아의 배양물을 함유하는 생물반응기에 전달하여 박테리아가 CO 및/또는 CO2를 이소펜틸 디포스페이트(IPP)로 전환하도록 하는 단계 및 IPP를 생물반응기로부터 회수하는 단계를 포함한다. 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아는 이소펜틸 디포스페이트 델타 이성질화효소를 발현하도록 유전자 조작된다.
또 다른 구현예는 이소펜틸 디포스페이트 델타 이성질화효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 유전자 조작 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아를 제공한다. 박테리아는 이소펜틸 디포스페이트 델타 이성질화효소를 발현하고, 박테리아는 디메틸알릴 디포스페이트를 이소펜틸 디포스페이트로 전환할 수 있다. 일부 양태에서, 핵산은 클로스트리디움 베이예린키이(Clostridium beijerinckii) 이소펜틸 디포스페이트 델타 이성질화효소를 코딩한다. 다른 양태에서, 핵산은 클로스트리디움 아우토에타노게눔으로부터의 피루브산염: 페레독신 산화환원효소 유전자에 대한 프로모터의 전사 조절 하에 있다. 또 다른 양태에서, 핵산은 클로스트리디움 아우토에타노게눔으로부터의 피루브산염: 페레독신 산화환원효소 유전자에 대한 프로모터의 전사 조절 하에 있고 이소프렌 합성효소를 코딩하는 제2 핵산의 하류에 있다.
또 다른 구현예는 CO 및/또는 CO2를 이소펜틸 디포스페이트(IPP) 및/또는 이소프렌으로 전환하기 위한 공정을 제공한다. 공정은 기체 CO-함유 및/또는 CO2-함유 기질을 배양 배지에서 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아의 배양물을 함유하는 생물반응기에 전달하여 박테리아가 CO 및/또는 CO2를 이소펜틸 디포스페이트(IPP) 및/또는 이소프렌으로 전환하도록 하는 단계 및 IPP 및/또는 이소프렌을 생물반응기로부터 회수하는 단계를 포함한다. 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아는 데옥시자일룰로스 5-포스페이트 합성효소(DXS) 효소를 코딩하는 핵산의 증가된 복제 수를 갖도록 유전자 조작되며, 여기서 증가된 복제 수는 게놈 당 1보다 크다.
또 다른 구현예는 데옥시자일룰로스 5-포스페이트 합성효소(DXS) 효소를 코딩하는 핵산의 게놈 당 1개 초과의 복제 수를 포함하는 단리된 유전자 조작 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아를 제공한다. 일부 양태에서, 단리된 유전자 조작 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아는 이소프렌 합성효소를 코딩하는 핵산을 더 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 단리된 유전자 조작 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아는 이소펜틸 디포스페이트 델타 이성질화효소를 코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 단리된 유전자 조작 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아는 이소펜틸 디포스페이트 델타 이성질화효소를 코딩하는 핵산 및 이소프렌 합성효소를 코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구현예는 포스포메발로네이트 키나제(PMK)를 코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 유전자 조작 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아를 제공한다. 박테리아는 코딩된 효소를 발현하며, 효소는 박테리아에 대해 고유하지 않다. 일부 양태에서, 효소는 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 효소이다. 일부 양태에서, 효소는 하나 이상의 C. 아우토에타노게눔 프로모터의 조절 하에 발현된다. 일부 양태에서, 박테리아는 티올라제(thlA/vraB)를 코딩하는 핵산, HMG-CoA 합성효소(HMGS)를 코딩하는 핵산 및 HMG-CoA 환원효소(HMGR)를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 티올라제는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 티올라제이다. 일부 양태에서, 박테리아는 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제(PMD)를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
또 다른 구현예는 알파-파르네센 합성효소를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 단리된 유전자 조작 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아를 제공한다. 일부 양태에서, 핵산은 C. 아우토에타노게눔에서의 발현에 대해 코돈 최적화된다. 일부 양태에서, 알파-파르네센 합성효소는 말루스 x 도메스티카 알파-파르네센 합성효소이다. 일부 양태에서, 박테리아는 제라닐트랜스트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산 분절을 추가로 포함한다. 일부 양태에서,
제라닐트랜스트랜스퍼라제는 대장균(E. coli) 제라닐트랜스트랜스퍼라제이다.
본 개시의 임의의 양태 또는 구현예를 위해 적합한 단리된 유전자 조작 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아는 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이, 클로스트리디움 라그스달레이, 클로스트리디움 카르복시디보란스, 클로스트리디움 드라케이, 클로스트리디움 스카톨로게네스, 클로스트리디움 아세티쿰, 클로스트리디움 포르미코아세티쿰, 클로스트리디움 마그눔, 부티리박테리움 메틸로트로피쿰, 아세토박테리움 우디이, 알칼리바쿨룸 박키이, 블라우티아 프로덕타, 유박테리움 리모숨, 무렐라 테르모아세티카, 무렐라 테르마우토트로피카, 스포로무사 오바타, 스포로무사 실바세티카, 스포로무사 스패로이데스, 옥소박터 펜니기이 및 테르모아내로박터 키부이로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 개시는 또한 본 출원의 명세서에 언급되거나 표시된 부분, 요소 및 특징부로 개별적으로 또는 집합적으로, 둘 이상의 상기 부분, 요소 또는 특징부의 임의의 또는 모든 조합으로 구성되도록 광범위하게 구성될 수 있고, 본 개시가 관련된 분야에서 공지된 등가물을 갖는 특정 정수가 본원에서 언급되는 경우, 이러한 공지된 등가물은 개별적으로 제시된 것처럼 본 명세서에 포함되는 것으로 간주된다.
모든 신규한 양태에서 고려되어야 하는 본 개시의 이들 및 다른 양태는 첨부된 도면을 참조하여 단지 예시로서 제공되는 다음의 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1: 테르펜의 생성을 위한 경로도, 본 출원에서 설명되는 유전자 표적은 굵은 화살표로 강조되어 있다.
도 2: 플라스미드 pMTL 85146-ispS의 유전자 맵
도 3: 플라스미드 pMTL 85246-ispS-idi의 유전자 맵
도 4: 플라스미드 pMTL85246-ispS-idi-dxs의 유전자 맵
도 5: 플라스미드 pMTL 85246-ispS-idi-dxs에 대한 서열분석 결과
도 6: DXS 및 메발로네이트 경로를 통한 CO로부터의 테르펜 생성을 위한 에너지 비교
도 7: 메발로네이트 경로
도 8: C. 아우토에타노게눔 형질전환체에서 이소프렌 발현 플라스미드 pMTL 85246-ispS-idi의 존재를 확인하는 아가로스 겔 전기영동 영상. 레인 1 및 20은 100 bp Plus DNA Ladder를 나타낸다. 레인 3 내지 6, 9 내지 12, 15 내지 18은 4개의 상이한 클론으로부터 단리된 플라스미드를 주형으로 하는 PCR을 나타내며, 각각은 colE1, ermB 및 idi의 순서로 존재한다. 레인 2, 8 및 14는 음성 대조군으로서 주형이 없는 PCR을 나타내며, 각각은 colE1, ermB 및 idi의 순서로 존재한다. 레인 7, 13, 및 19는 대장균으로부터 유래한 pMTL 85246-ispS-idi를 양성 대조군으로서 갖는 PCR을 나타내며, 각각은 colE1, ermB 및 idi의 순서로 존재한다.
도 9: 메발로네이트 발현 플라스미드 pMTL8215-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR
도 10: 이소프렌 발현 플라스미드 pMTL 8314-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS
도 11: 파르네센 발현 플라스미드 pMTL8314-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS
도 12: 플라스미드 pMTL 85246-ispS-idi-dxs의 유전자 맵
도 13: 플라스미드 pMTL 85146-ispS를 운반하는 C. 아우토에타노게눔을 사용한 유전자 발현 실험을 위한 증폭 차트
도 14: 플라스미드 pMTL 85246-ispS-idi를 운반하는 C. 아우토에타노게눔을 사용한 유전자 발현 실험을 위한 증폭 차트
도 15: 플라스미드 pMTL 85246-ispS-idi-dxs를 운반하는 C. 아우토에타노게눔을 사용한 유전자 발현 실험을 위한 증폭 차트
도 16: 플라스미드 pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS의 존재에 대한 PCR 확인. 예상 밴드 크기 1584 bp. DNA 마커 Fermentas 1 kb DNA 래더(ladder).
도 17: 플라스미드 pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS를 운반하는 형질전환된 C. 아우토에타노게눔에 대한 성장 곡선.
도 18: 유전자 메발로네이트 키나제(MK 서열 식별 번호: 51), 포스포메발로네이트 키나제(PMK 서열 식별 번호: 52), 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제(PMD 서열 식별 번호: 53), 이소펜틸-디포스페이트 델타-이성질화효소(idi 서열 식별 번호: 54), 제라닐트랜스트랜스퍼라제(ispA 서열 식별 번호: 56) 및 파르네센 합성효소(FS 서열 식별 번호: 57)의 발현을 나타내는 RT-PRC 데이터.
도 19: pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS를 운반하는 1mM의 메발로네이트 스파이크 배양물에서 파르네센의 존재에 대한 GC-MS 검출 및 형태. 질량이 93인 이온을 함유하는 피크에 대해 스캔한 GC-MS 크로마토그램. 크로마토그램 1 및 2는 형질전환된 C. 아우토에타노게눔이고, 3은 C. 아우토에타노게눔 샘플과 동시에 실행되는 베타-파르네센 표준이다. 4는 알파-파르네센 생성을 나타내는 M9 글루코오스상에서 성장된 플라스미드 pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS를 운반하는 대장균이고, 5는 대장균 샘플의 시점에 실행되는 베타-파르네센 표준이다. 대장균과 C. 아우토에타노게눔 샘플 사이의 체류 시간의 차이는 기기에 대한 사소한 변화로 인한 것이다. 그러나, 베타-파르네센 표준과 생성된 알파-파르네센 사이의 체류 시간의 차이는 두 경우 모두에서 정확히 동일하며, 이는 질량 스펙트럼의 일치와 함께 C. 아우토에타노게눔에서 알파-파르네센의 생성을 확인한다.
도 20: 도 19에서 1A 및 2A로 표지된 피크에 대한 MS 스펙트럼. MS 스펙트럼은 피크가 알파-파르네센임을 확인하는 NIST 데이터베이스 스펙트럼(도 21)과 일치한다.
도 21: NIST 질량 스펙트럼 데이터베이스로부터의 알파-파르네센에 대한 MS 스펙트럼.
도 22: 실질 최대 이소프레놀 선택도 계산.
도 23: 경로 1: 이소프레노이드 알코올(IPA) 경로.
도 24: 경로 2: IPA 경로 + Ptb-buk
도 25: 경로 3: 아세톤을 통한 IPA 경로
도 26: 경로 4: 아세톤 + Ptb-buk를 통한 IPA 경로
도 27: 경로 5: 메발로네이트 경로
도 28: 경로 6: 메발로네이트 경로 + IPP 우회
도 29: 경로 1 내지 경로 6의 대사산물.
다음은 본 개시의 바람직한 구현예를 포함하여 일반적인 용어로 제공되는 본 개시의 설명이다. 본 개시는, 본 개시를 뒷받침하는 실험 데이터, 본 개시의 다양한 양태의 구체적인 예 및 본 개시를 수행하는 수단을 제공하는　아래의 "실시예"라는 제목하에 주어진 개시로부터 추가로 설명된다.
본 발명자들은 놀랍게도, 일산화탄소영양 아세트산생성 미생물을 조작하여 이소프레노이드 알코올, 이소프레노이드 알코올 유도체, 테르펜 및 이소프렌 및 파르네센을 포함하는 이의 전구체를 기체 기질의 발효에 의해 생성할 수 있었다. 이는 이들 생성을 위한 현재의 방법에 비해 이점을 가질 수 있는 이들 생성물의 생성을 위한 대안적인 수단을 제공한다. 또한, 이는 그렇지 않을 경우 대기 중으로 방출되어 환경을 오염시킬 수 있는 산업 공정의 일산화탄소를 사용하는 수단을 제공한다.
용어 "비-천연 발생"은 미생물에 관하여 사용되는 경우, 미생물이 기준 종의 야생형 균주를 포함한 기준 종의 천연 발생 균주에서 발견되지 않는 적어도 하나의 유전적 변형을 가짐을 의미한다. 비-천연 발생 미생물은 전형적으로 실험실 또는 연구 시설에서 개발된다. 본 개시의 미생물은 비-천연 발생 미생물이다.
용어 "유전자 변형", "유전자 변경" 또는 "유전자 조작"은 광범위하게는 인간에 의한 미생물의 게놈 또는 핵산의 조작을 지칭한다. 마찬가지로, 용어 "유전자 변형된," "유전자 변경된," 또는 "유전자 조작된"은 이러한 유전자 변형, 유전자 변경 또는 유전자 조작을 함유하는 미생물을 지칭한다. 이들 용어는 실험실-발생된 미생물을 천연-발생 미생물로부터 구별하는 데 사용될 수 있다. 유전자 변형의 방법은 예를 들어 이종 유전자 발현, 유전자 또는 프로모터 삽입 또는 결실, 핵산 돌연변이, 변경된 유전자 발현 또는 불활성화, 효소 조작, 지향 진화(directed evolution), 지식-기초 설계, 무작위 돌연변이발생 방법, 유전자 셔플링 및 코돈 최적화를 포함한다. 본 개시의 미생물은 유전자 조작된다.
"재조합"은 핵산, 단백질 또는 미생물이 유전자 변형, 조작 또는 재조합의 생성물임을 나타낸다. 일반적으로, 용어 "재조합"은 다수의 공급원, 예컨대 둘 이상의 상이한 균주 또는 종의 미생물로부터 유래되는 유전적 물질을 함유하거나 이에 의해 코딩되는 핵산, 단백질 또는 미생물을 지칭한다. 본 개시의 미생물은 일반적으로 재조합 미생물이다.
"야생형"은 자연에서 발생하며 돌연변이체 또는 변이체 형태로부터 구분되는 바와 같이 유기체, 균주, 유전자 또는 특징의 전형적인 형태를 지칭한다.
"내인성"은 본 개시의 미생물이 유래되는 야생형 또는 모 미생물에 존재하거나 발현되는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 내인성 유전자는 본 개시의 미생물이 유래되는 야생형 또는 모 미생물에 천연적으로 존재하는 유전자이다. 일 구현예에서, 내인성 유전자의 발현은 외인성 조절 요소, 예컨대 외인성 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
"외인성"은 본 개시의 미생물의 외부에서 기원하는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 외인성 유전자 또는 효소는 인공적으로 또는 재조합적으로 생성되고 본 개시의 미생물에 도입되거나 발현될 수 있다. 외인성 유전자 또는 효소는 또한 이종 미생물로부터 단리되고 본 개시의 미생물에 도입되거나 발현될 수 있다. 외인성 핵산은 본 개시의 미생물의 게놈 내로 통합되거나 본 개시의 미생물에서 염색체-외 상태, 예를 들어 플라스미드에 잔류하도록 구성될 수 있다.
"이종"은 본 개시의 미생물이 유래하는 야생형 또는 모 미생물 내에 존재하지 않는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 이종 유전자 또는 효소는 상이한 균주 또는 종으로부터 유래되고 본 개시의 미생물 내에 도입 또는 발현될 수 있다. 이종 유전자 또는 효소는 이것이 상이한 균주 또는 종에서 발생하는 형태로 본 개시의 미생물 내에 도입 또는 발현될 수 있다. 대안적으로, 이종 유전자 또는 효소는 일부 방식으로 예를 들어 본 개시의 미생물에서의 발현을 위해 이를 코돈-최적화함으로써 또는 기능을 변경시키기 위해, 예컨대 효소 활성의 방향을 역전시키거나 기질 특이성을 변경시키기 위해 이를 조작함으로써 변형될 수 있다.
특히, 본원에 기술된 미생물에서 발현되는 이종 핵산 또는 단백질은 바실러스, 클로스트리디움, 쿠프리아비두스, 에스케리키아, 글루코노박터, 하이포미크로비움, 리시니바실러스, 패니바실러스, 슈도모나스, 세디멘티콜라, 스포로사르치나, 스트렙토마이세스, 테르미티오바실러스, 테르모토가, 제아, 클레브시엘라(Klebsiella), 미코박테리움(Mycobacterium), 살모넬라(Salmonella), 미코박테로이데스(Mycobacteroides), 스타필로콕쿠스(Staphylococcus), 부르콜데리아(Burkholderia), 리스테리아(Listeria), 악시네토박터(Acinetobacter), 시겔라(Shigella), 네이쎄리아(Neisseria), 보르데텔라(Bordetella), 스트렙토콕쿠스(Streptococcus), 엔테로박터(Enterobacter), 비브리오(Vibrio), 레지오넬라(Legionella), 잔토모나스(Xanthomonas), 세라티아(Serratia), 크로노박터(Cronobacter), 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 헬리코박터(Helicobacter), 예르시니아(Yersinia), 쿠티박테리움(Cutibacterium), 프란치셀라(Francisella), 펙토박테리움(Pectobacterium), 아르코박터(Arcobacter), 락토바실러스, 쉐와넬라(Shewanella), 에르위니아(Erwinia), 술푸로스피릴룸(Sulfurospirillum), 펩토콕카세애(Peptococcaceae), 테르모콕쿠스(Thermococcus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 피로콕쿠스(Pyrococcus), 글리신, 호모(Homo), 랄스토니아(Ralstonia), 브레비박테리움(Brevibacterium), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 제오바실러스(Geobacillus), 보스(bos), 갈루스(gallus), 아내로콕쿠스(Anaerococcus), 제노푸스(Xenopus), 암블리린쿠스(Amblyrhynchus), 라투스(rattus), 무스(mus), 수스(sus), 로도콕쿠스(Rhodococcus), 리조비움(Rhizobium), 메가스패라(Megasphaera), 메조리조비움(Mesorhizobium), 펩토콕쿠스(Peptococcus), 아그로박테리움(Agrobacterium), 캄필로박터(Campylobacter), 아세토박테리움, 알칼리바쿨룸, 블라우티아, 부티리박테리움, 유박테리움, 무렐라, 옥소박터, 스포로무사, 테르모아내로박터, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 패니바실러스, 픽티바실러스(Fictibacillus), 리시니바실러스, 오르니티니바실러스(Ornithinibacillus), 할로바실러스(Halobacillus), 쿠르티아(Kurthia), 렌티바실러스(Lentibacillus), 아녹시바실러스(Anoxybacillus), 솔리바실러스(Solibacillus), 비르기바실러스(Virgibacillus), 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus), 스포로사르치나,살리미크로비움(Salimicrobium), 스포로사르치나, 플란코콕쿠스(Planococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 테르매로박터(Thermaerobacter), 설포바실러스(Sulfobacillus) 또는 심비오박테리움(Symbiobacterium)으로부터 유래될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드," "뉴클레오티드," "뉴클레오티드 서열," "핵산," 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용된다. 이들은 임의의 길이의 뉴클레오티드(데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드)의 중합체성 형태, 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 공지되거나 공지되지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연결 분석으로부터 정의된 유전자위(유전자위들), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은-헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 주어질 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 간섭될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터 (예컨대 mRNA 또는 다른 RNA 전사체로) 전사되는 과정, 및/또는 전사된 mRNA가 후속하여 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사체 및 코딩된 폴리펩티드는 통틀어 "유전자 생성물"로 지칭될 수 있다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드," 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되어, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 중합체는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 중합체는 비-아미노산에 의해 간섭될 수 있다. 상기 용어는 또한 하기에 의해 변형되었던 아미노산을 포괄한다: 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작, 예컨대 표지화 성분과의 컨쥬게이션. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 둘 모두를 포함한 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산, 및 아미노산 유사체 및 펩티도모방체를 포함한다.
"효소 활성", 또는 간단히 "활성"은 광범위하게는 비제한적으로 반응을 촉매하기 위한 효소의 활성, 효소의 양 또는 효소의 유용성을 포함한 효소적 활성을 지칭한다. 이에, 효소 활성을 "증가시키는" 것은 반응을 촉매화하기 위해 효소의 활성을 증가시키거나, 효소의 양을 증가시키거나, 효소의 유용성을 증가시키는 것을 포함한다. 유사하게는, 효소 활성을 "저하시키는" 것은 반응을 촉매화하기 위해 효소의 활성을 저하시키거나, 효소의 양을 저하시키거나, 효소의 유용성을 저하시키는 것을 포함한다.
"돌연변이화된"은, 본 개시의 미생물이 유래되는 야생형 또는 모 미생물과 비교하여 본 개시의 미생물에서의 변형된 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 일 구현예에서, 돌연변이는 효소를 코딩하는 유전자에서의 결실, 삽입 또는 치환일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 돌연변이는 효소에서의 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환일 수 있다.
"파괴된 유전자"는 유전자의 발현, 유전자의 조절 활성, 또는 코딩된 단백질 또는 효소의 활성을 감소시키거나 삭제하기 위해 일부 방식으로 변형되었던 유전자를 지칭한다. 교란은 유전자 또는 효소를 부분적으로 불활성화시키거나, 완전히 불활성화시키거나 결실시킬 수 있다. 교란은 유전자, 단백질 또는 효소의 발현 또는 활성을 완전히 삭제하는 녹아웃(KO; knockout) 돌연변이일 수 있다. 교란은 또한, 단백질 또는 효소의 발현 또는 활성을 감소시키지만 전적으로 삭제하지는 않는 녹다운(knock-down) 돌연변이일 수 있다. 교란은 또한, 효소에 의해 생성되는 생성물의 생합성을 감소시키거나, 예방하거나 차단하는 임의의 것일 수 있다. 파괴는 예를 들어, 단백질 또는 효소를 코딩하는 유전자에서의 돌연변이, 효소를 코딩하는 유전자의 발현에 관여하는 유전적 조절 요소에서의 돌연변이, 효소의 활성을 감소시키거나 저해하는 단백질을 생성하는 핵산의 도입, 또는 단백질 또는 효소의 발현을 저해하는 핵산(예를 들어, 안티센스 RNA, RNAi, TALEN, siRNA, CRISPR, 또는 CRISPRi) 또는 단백질의 도입을 포함할 수 있다. 교란은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 도입될 수 있다. 본 개시의 목적을 위해, 교란은 천연 발생이 아니며, 실험실-발생일 수 있다.
"모 미생물"은 본 개시내용의 미생물을 생성하는데 사용되는 미생물이다. 모 미생물은 자연 발생 미생물(즉, 야생형 미생물) 또는 사전에 변형되었던 미생물(즉, 돌연변이 또는 재조합 미생물)일 수 있다. 본 개시의 미생물은 모 미생물에서 발현되지 않거나 과발현되지 않은 하나 이상의 효소를 발현하거나 과발현하도록 변형될 수 있다. 유사하게, 본 개시의 미생물은 모 미생물이 함유하지 않은 하나 이상의 유전자를 함유하도록 변형될 수 있다. 본 개시의 미생물은 또한 모 미생물에서 발현된 하나 이상의 효소를 발현하지 않거나 더 적은 양으로 발현하도록 변형될 수 있다.
본 개시의 미생물은 본질적으로 임의의 모 미생물로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 본 개시의 미생물은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리디움 베이예린키이(Clostridium beijerinckii), 에스케리키아 콜라이 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군으로부터 선택된 모 미생물로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서는, 미생물은 아세토박테리움 우디이,알칼리바쿨룸 박키이, 블라우티아 프로덕타, 부티리박테리움 메틸로트로피쿰, 클로스트리디움 아세티쿰, 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 카르복시디보란스, 클로스트리디움 코스카티이, 클로스트리디움 드라케이, 클로스트리디움 포르미코아세티쿰, 클로스트리디움 륭달리이, 클로스트리디움 마그눔, 클로스트리디움 라그스달레이, 클로스트리디움 스카톨로게네스, 유박테리움 리모숨, 무렐라 테르마우토트로피카, 무렐라 테르모아세티카, 옥소박터 펜니기이, 스포로무사 오바타, 스포로무사 실바세티카, 스포로무사 스파에로이데스, 및 써모아나에로박터 키부이로 이루어진 군으로부터 선택된 모 미생물로부터 유래된다. 바람직한 구현예에서, 모 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이 또는 클로스트리디움 라그스달레이이다. 특히 바람직한 구현예에서, 모 미생물은 클로스트리듐 아우토에타노게눔 LZ1561이고, 이는 부다페스트 조약의 조건에 따라 2010년 6월 7일에 독일 브라운슈바이크 D-38124 인호펜슈트라쎄 7B에 소재하는 독일생물자원센터(DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 2010년 6월 7일에 기탁되고 수탁 번호 DSM23693가 부여되었다. 이 균주는 WO 제2012/015317호로 공개된 국제 특허 출원 제PCT/NZ2011/000144호에 설명되어 있다.
용어 "~로부터 유래된"은 핵산, 단백질, 또는 미생물이 상이한(예를 들어, 모 또는 야생형) 핵산, 단백질 또는 미생물로부터 변형되거나 또는 적응되어 새로운 핵산, 단백질, 또는 미생물을 생성하는 것을 나타낸다. 이러한 변형 또는 적응은 전형적으로는 핵산 또는 유전자의 삽입, 결실, 돌연변이 또는 치환을 포함한다. 대체로, 본 개시의 미생물은 모 미생물로부터 유래된다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이, 또는 클로스트리디움 라그스달레이로부터 유래된다. 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 미생물은 DSMZ 수탁 번호 DSM23693으로 기탁된 클로스트리디움 아우토에타노게눔 LZ1561로부터 유래된다.
본 개시의 미생물은 기능적 특징에 기초하여 추가로 분류될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 미생물은 C1-고정 미생물, 혐기성 생물, 아세토겐, 에탄올로겐, 일산화탄소 영양 생물 및/또는 메탄영양체일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다.
표 1은 미생물의 대표적인 목록을 제공하고, 이들의 기능적인 특징을 식별한다.
[표 1]
"우드-륭달"은 예를 들어 문헌[Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008]에 설명된 바와 같은 탄소 고정의 우드-륭달 경로를 지칭한다. "우드-륭달 미생물"은 예상대로 우드-륭달 경로를 함유하는 미생물을 지칭한다. 종종, 본 개시내용의 미생물은 본연의 우드-륭달 경로를 함유한다. 본원에서, 우드-륭달 경로는 천연의, 비변형된 우드-륭달 경로일 수 있거나, 우드-륭달 경로는 이 경로가 CO, CO2, 및/또는 H2를 아세틸-CoA로 전환하는 작용을 여전히 하는 한 어느 정도의 유전적 변형(예를 들어, 과발현, 이종 발현, 녹아웃 등)을 갖는 우드-륭달 경로일 수 있다.
"C1"은 1-탄소 분자, 예를 들어, CO, CO2, CH4 또는 CH3OH를 지칭한다. "C1-옥시게네이트"는 적어도 하나의 산소 원자를 또한 포함하는 1-탄소 분자, 예를 들어, CO, CO2 또는 CH3OH를 지칭한다. "C1-탄소 공급원"은 본 개시내용의 미생물에 대한 부분 또는 단독 탄소 공급원으로서 작용하는 1개의 탄소-분자를 지칭한다. 예를 들어, C1-탄소 공급원은 CO, CO2, CH4, CH3OH, 또는 CH2O2 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, C1-탄소 공급원은 CO 및 CO2 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. "C1-고정 미생물"은 C1-탄소 공급원으로부터 하나 이상의 생성물을 생성하는 능력을 갖는 미생물이다. 종종, 본 개시내용의 미생물은 C1-고정 박테리아이다. 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 C1-고정 미생물로부터 유래된다.
"혐기성 생물"은 성장을 위해 산소를 필요로 하지 않는 미생물이다. 혐기성 생물은 산소가 특정 임계치를 초과하여 존재하는 경우 부정적으로 반응하거나 심지어 사멸할 수도 있다. 그러나, 일부 혐기성 생물은 이따금 "미소산소(microoxic) 조건"으로 지칭되는 저수준의 산소(예를 들어 0.000001 내지 5% 산소)를 관용할 수 있다. 종종, 본 개시내용의 미생물은 혐기성 생물이다. 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 혐기성 생물로부터 유래된다.
"아세토겐"은 에너지 보존, 및 아세틸-CoA 및 아세틸-CoA 유래 생성물, 예를 들어 아세테이트의 합성을 위한 이의 주요 기전으로서 우드-륭달 경로를 사용하는 절대적 혐기성 박테리아이다(문헌[Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008]). 특히, 아세토겐은 (1) CO2로부터 아세틸-CoA의 환원적 합성을 위한 메커니즘, (2) 말단 전자-수용, 에너지 보존 과정, (3) 세포 탄소의 합성에서 CO2의 고정(동화)을 위한 메커니즘으로서 우드-륭달 경로를 사용한다(문헌[Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 제3판, p. 354, New York, NY, 2006]). 모든 자연 발생 아세토겐은 C1-고정, 혐기성, 독립 영양 생물 및 비-메탄 영양 생물이다. 흔히, 본 개시의 미생물은 아세토겐이다. 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 아세토겐으로부터 유래된다.
"에탄올로겐"은 에탄올을 생성하거나 생성할 수 있는 미생물이다. 종종, 본 개시의 미생물은 에탄올로겐이다. 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 에탄올로겐으로부터 유래된다.
"독립 영양 생물"은 유기 탄소의 부재 하에 성장할 수 있는 미생물이다. 대신에, 독립 영양 생물은 무기 탄소 공급원, 예를 들어 CO 및/또는 CO2를 사용한다. 종종, 본 개시의 미생물은 독립 영양 생물이다. 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 자가영양 생물로부터 유래된다.
"일산화탄소 영양 생물"은 탄소 및 에너지의 단독 공급원으로서 CO를 이용할 수 있는 미생물이다. 종종, 본 개시의 미생물은 일산화탄소 영양 생물이다. 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 일산화탄소 영양 생물로부터 유래된다.
"메탄 영양 생물"은 탄소 및 에너지의 유일한 공급원으로서 메탄을 이용할 수 있는 미생물이다. 특정 구현예에서, 본 개시의 미생물은 메탄 영양 생물이거나 메탄 영양 생물로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 본 개시의 미생물은 메탄 영양 생물이 아니거나 메탄 영양 생물로부터 유래되지 않는다.
바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이 또는 클로스트리디움 라그스달레이 종을 포함하는 클로스트리디아의 클러스터로부터 유래된다. 이들 종이 먼저 보고되었으며 문헌[Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994(클로스트리디움 아우토에타노게눔)], 문헌[Tanner, Int J System Bacteriol , 43: 232-236, 1993(클로스트리디움 륭달리이)] 및 문헌[Huhnke, WO　2008/028055(클로스트리디움 라그스달레이)]에 의해 특징화되었다.
이들 3개 종은 많은 유사성을 갖는다. 특히, 이들 종은 모두 클로스트리디움 속의 C1 고정, 혐기성, 아세트산생성, 에탄올생성 및 일산화탄소영양 구성원이다. 이들 종은 유사한 유전자형 및 표현형, 및 에너지 보존 및 발효 대사 방식을 갖는다. 더욱이, 이들 종은, 99% 초과로 동일한 16S rRNA DNA를 갖는 클로스트리디움 rRNA 상동 군 I 내에 군집화되고, 약 22 내지 30 몰%의 DNA G + C 함량을 가지며, 그람 양성이고, 형태 및 크기가 유사하며 (0.5 내지 0.7 x 3 내지 5 μm 사이의 대수 성장 세포), 중온성이고 (30 내지 37°C에서 최적 성장), 약 4 내지 7.5의 유사한 pH 범위를 가지며 (최적 pH 약 5.5 내지 6을 가짐), 시토크롬이 없고, Rnf 복합체를 통해 에너지를 보존한다. 또한, 카르복실산으로부터 이들의 상응하는 알코올로의 환원이 이들 종에서 나타났다(문헌[Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012]). 중요하게는, 이들 종은 또한 모두 특정 조건 하에서 CO-함유 기체상에서 강한 독립영양 성장을 나타내고, 에탄올 및 아세테이트(또는 아세트산)를 주 발효 생성물로서 생성하며, 소량의 2,3-부탄디올 및 락트산을 생성한다.
그러나, 이들 3개 종은 또한 많은 차이를 갖는다. 이들 종은 다음의 상이한 공급원으로부터 단리되었다: 토끼 소화관으로부터 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 양계장 폐기물로부터 클로스트리디움 륭달리이 및 담수 침강물로부터 클로스트리디움 라그스달레이. 이들 종은 다양한 당(예를 들어, 람노스, 아라비노스), 산(예를 들어, 글루코네이트, 시트레이트), 아미노산(예를 들어, 아르기닌, 히스티딘) 및 다른 기질(예를 들어, 베타인, 부탄올)의 활용 면에서 상이하다. 더욱이, 이들 종은 특정 비타민(예를 들어, 티아민, 비오틴)에 대한 영양요구성 면에서 상이하다. 이들 종은 우드-륭달 경로 유전자 및 단백질의 핵산 및 아미노산 서열에서 차이를 갖지만, 이들 유전자 및 단백질의 일반적인 구성 및 수는 모든 종들에서 동일한 것으로 밝혀졌다(문헌[Kφpke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011]).
따라서, 요약하자면, 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이 또는 클로스트리디움 라그스달레이의 많은 특징은 해당 종에 특이적이지 않으며, 그보다는 클로스트리디움 속의 C1 고정, 혐기성, 아세트산생성, 에탄올생성 및 일산화탄소영양 구성원의 이 클러스터에 대한 일반적인 특징이다. 그러나, 이들 종은 실제로 구별되기 때문에, 이들 종 중 하나의 유전자 변형 또는 조작은 이들 종 중 다른 것에서 동일한 효과를 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, 성장, 성능 또는 생성물 생성에서 차이가 관찰될 수 있다.
본 개시내용의 미생물은 또한, 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이 또는 클로스트리디움 라그스달레이의 단리물 또는 돌연변이체로부터 유래될 수 있다. 클로스티리디움 아우토에타노게눔의 단리물 및 돌연변이체는 JA1-1(DSM10061)(문헌[Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994]), LBS1560(DSM19630)(WO 2009/064200) 및 LZ1561(DSM23693)(WO 2012/015317)을 포함한다. 클로스트리디움 륭달리이의 단리물 및 돌연변이체는 ATCC 49587(문헌[Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993]), PETCT(DSM13528, ATCC 55383), ERI-2(ATCC 55380)(US 5,593,886), C-01(ATCC 55988)(US 6,368,819), O-52(ATCC 55989)(US 6,368,819) 및 OTA-1(문헌[Tirado-Acevedo, Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii, PhD thesis, North Carolina State University, 2010])을 포함한다. 클로스트리디움 라그스달레이의 단리물 및 돌연변이체는 PI 1(ATCC BAA-622, ATCC PTA-7826)(WO 2008/028055)을 포함한다.
그러나, 위에서 설명되는 바와 같이, 본 개시의 미생물은 또한, 본질적으로 임의의 모 미생물, 예컨대, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 클로스트리디움 베이예린키이, 에스케리키아 콜라이 및 사카로미세스 세레비지애로 구성되는 군으로부터 선택되는 모 미생물로부터 유래될 수 있다.
파괴 돌연변이의 도입은, 표적 생성물을 생성하지 않거나 표적 생성물을 실질적으로 생성하지 않거나, 본 개시내용의 미생물이 유래되는 모 미생물과 비교하여 표적 생성물을 감소된 양으로 생성하는 본 개시내용의 미생물을 초래한다. 예를 들어, 본 개시내용의 미생물은 표적 생성물을 생성하지 않거나, 모 미생물보다 적어도 약 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 적은 표적 생성물을 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 미생물은 약 0.001, 0.01, 0.10, 0.30, 0.50 또는 1.0 g/L 미만의 표적 생성물을 생성할 수 있다.
효소에 대한 예시적인 서열 및 공급원이 본원에 제공되긴 하지만, 본 개시는 이들 서열 및 공급원으로 제한되는 것이 아니며 - 본 개시는 변이체를 또한 포괄한다. 용어 "변이체"는 핵산 및 단백질의 서열이 기준 핵산 및 단백질의 서열, 예컨대 선행 기술에 개시되거나 본원에 예시된 기준 핵산 및 단백질의 서열로부터 달라진 핵산 및 단백질을 포함한다. 본 개시내용은 기준 핵산 또는 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 변이체 핵산 또는 단백질을 사용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 변이체 단백질은 기준 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 수행하거나 실질적으로 동일한 반응을 촉매화할 수 있다. 변이체 유전자는 기준 유전자와 동일한 단백질 또는 실질적으로 동일한 단백질을 코딩할 수 있다. 변이체 프로모터는 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진하는 기준 프로모터와 실질적으로 동일한 능력을 가질 수 있다.
그러나 핵산 또는 단백질은 본원에서 "기능적으로 동등한 변이체"로 지칭될 수 있다. 예로써, 핵산의 기능적으로 동등한 변이체는 대립유전자 변이체, 유전자 절편, 돌연변이 유전자, 다형성 등을 포함할 수 있다. 다른 미생물로부터의 상동성 유전자 또한 기능적으로 동등한 변이체의 예이다. 이들은 종, 예컨대 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 클로스트리디움 베이예린키이 또는 클로스트리디움 륭달리이 내의 상동성 유전자를 포함하고, 이들의 세부사항은 웹사이트, 예컨대 Genbank 또는 NCBI 상에서 공개적으로 입수 가능하다. 기능적으로 동등한 변이체는 또한 핵산의 서열이 특정 미생물에 대한 코돈 최적화의 결과 달라지는 핵산을 포함한다. 핵산의 기능적으로 동등한 변이체는 바람직하게는 기준 핵산과 적어도 대략 70%, 대략 80%, 대략 85%, 대략 90%, 대략 95%, 대략 98% 또는 그 이상의 핵산 서열 동일성(상동성 퍼센트)을 가질 것이다. 단백질의 기능적으로 동등한 변이체는 바람직하게는, 기준 단백질과 적어도 대략 70%, 대략 80%, 대략 85%, 대략 90%, 대략 95%, 대략 98% 또는 그 이상의 아미노산 동일성(상동성 퍼센트)을 가질 것이다. 변이체 핵산 또는 단백질의 기능적 등가성은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
"상보성"은 전통적인 왓슨-크릭 또는 다른 비-전통적인 유형에 의해 또 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성하는 핵산의 능력을 지칭한다. 상보성 백분율은, 제2 핵산 서열과 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭 염기쌍 형성)을 형성할 수 있는 핵산 분자 내 잔기의 퍼센트를 나타낸다(예를 들어, 10개 중 5, 6, 7, 8, 9, 10개는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 상보적임). "완벽하게 상보적인"은, 핵산 서열의 모든 인접 잔기들이 제2 핵산 서열 내의 동일한 수의 인접 잔기들과 수소 결합을 형성할 것임을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "실질적으로 상보적인"은, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 뉴클레오티드들의 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%. 97%, 98%, 99% 또는 100%인 상보성도를 지칭하거나, 엄격한 조건 하에 혼성화하는 2개의 핵산들을 지칭한다.
"혼성화"는, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여, 뉴클레오티드 잔기의 염기들 사이에서 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성하는 반응을 지칭한다. 수소 결합은 왓슨 크릭 염기쌍 형성, 후그스타인(Hoogstein) 결합에 의해, 또는 임의의 다른 서열 특이적인 방식으로 발생할 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2개 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자가-혼성화 가닥, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 보다 고비용의 과정에서 일 단계, 예컨대 PCR의 개시, 또는 효소에 의한 폴리뉴클레오티드의 절단을 구축할 수 있다. 주어진 서열과 혼성화할 수 있는 서열은 주어진 서열의 "보체"로서 지칭된다.
핵산은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 본 개시내용의 미생물에 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 노출 핵산으로서 전달될 수 있거나, 하나 이상의 작용제, 예컨대 리포솜으로 제형화될 수 있다. 핵산은 적절하다면 DNA, RNA, cDNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 제한 억제제는 특정한 구현예에서 사용될 수 있다. 추가의 벡터는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 코스미드 및 인공 염색체를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산은 플라스미드를 사용하여 본 개시내용의 미생물에 전달될 수 있다. 예로서, 형질전환(형질도입 또는 형질감염을 포함함)은 전기천공, 초음파처리, 폴리에틸렌 글리콜-매개 형질전환, 화학적 또는 천연 적격, 원생동물 형질전환, 프로파지 유도 또는 접합에 의해 달성될 수 있다. 활성 제한 효소 시스템을 갖는 특정 구현예에서, 핵산을 미생물 내로 도입하기 전에 핵산을 메틸화하는 것이 필요할 수 있다.
추가로, 핵산은 특정 핵산을 증가시키거나 아니면 이의 발현을 제어하기 위해, 프로모터와 같은 조절 요소를 포함하도록 설계될 수 있다. 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도적 프로모터일 수 있다. 이상적으로, 프로모터는 우드-륭달 경로 프로모터, 페레독신 프로모터, 피루브산염:페레독신 산화환원효소 프로모터, Rnf 복합체 오페론 프로모터, ATP 합성효소 오페론 프로모터, 또는 포스포트랜스아세틸라아제/아세테이트 키나아제 오페론 프로모터이다.
본 개시는 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 경우에 본원에서 구체적으로 예시된 서열과 상이한 서열을 갖는 핵산을 사용하여 실시될 수 있음을 이해해야 한다. 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 경우, 이는 코딩된 단백질 또는 펩티드가 실질적으로 동일한 기능을 갖는다는 것을 의미한다. 프로모터 서열을 나타내는 핵산 서열의 경우, 변이체 서열은 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진하는 능력을 가질 것이다. 이러한 핵산은 본원에서 "기능적으로 동등한 변이체"로 지칭될 수 있다. 예로써, 핵산의 기능적으로 동등한 변이체는 대립유전자 변이체, 유전자 절편, 돌연변이(결실, 삽입, 뉴클레오티드 치환 등)을 포함하는 유전자, 및/또는 다형성 등을 포함할 수 있다. 다른 미생물 유래의 상동성 유전자는 또한 본원에서 구체적으로 예시된 서열의 기능적으로 동등한 변이체의 예로서 간주될 수 있다.
이들은 클로스트리디움 륭달리이, 클로로플렉스 아우란티아쿠스, 메탈로스파에라 및 술폴로버스 종과 같은 종에서의 상동성 유전자가 포함하며, 이의 세부 사항은 Genbank 또는 NCBI와 같은 웹사이트에서 공개적으로 이용할 수 있다. 문구 "기능적으로 동등한 변이체"는 또한 핵산의 서열이 특정 유기체에 대한 코돈 최적화의 결과로서 달라지는 핵산을 포함한다. 본원에서 핵산의 "기능적으로 동등한 변이체"는 바람직하게는 식별된 핵산과 적어도 약 70%, 바람직하게는 약 80%, 보다 바람직하게는 약 85%, 바람직하게는 약 90%, 바람직하게는 약 95% 이상의 핵산 서열 동일성을 가질 것이다.
본 개시는 본원에서 구체적으로 예시된 아미노산 서열과 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드를 사용하여 실시될 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 변이체는 본원에서 "기능적으로 동등한 변이체"로 지칭될 수 있다. 단백질 또는 펩티드의 기능적으로 동등한 변이체는, 식별된 단백질 또는 펩티드와 적어도 40%, 바람직하게는 50%, 바람직하게는 60%, 바람직하게는 70%, 바람직하게는 75%, 바람직하게는 80%, 바람직하게는 85%, 바람직하게는 90%, 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 동일성을 공유하고 관심 펩티드 또는 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 갖는 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 이러한 변이체는 단백질 또는 펩티드의 단편의 범위 내에 있으며, 여기서 단편은 폴리펩티드의 절단된 형태를 포함하되, 결실은 1 내지 5, 10, 15, 20, 25개의 아미노산일 수 있고, 폴리펩티드의 어느 하나의 말단에서 잔기 1 내지 25로부터 연장될 수 있으며, 여기서 결실은 영역 내의 임의의 길이일 수 있고; 또는 내부 위치에 있을 수 있다. 본원의 특이적 폴리펩티드의 기능적으로 동등한 변이체는 또한, 예를 들어 이전 단락에서 예시된 바와 같이, 다른 종의 박테리아에서 상동성 유전자에 의해 발현된 폴리펩티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 개시의 미생물은 재조합 미생물을 생성하기 위해 당업계에 공지된 임의의 수의 기술을 사용하여 모 미생물 및 하나 이상의 외인성 핵산으로부터 제조될 수 있다. 단지 예로서, 형질전환(형질도입 또는 형질감염을 포함함)은 전기천공, 초음파처리, 폴리에틸렌 글리콜-매개 형질전환, 화학적 또는 천연 적격, 또는 접합에 의해 달성될 수 있다. 적절한 전환 기술은, 예를 들어 문헌[Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbour, 1989]에 설명되어 있다.
특정 구현예에서, 형질전환될 미생물에서 활성인 제한 시스템으로 인해, 미생물 내로 도입될 핵산을 메틸화할 필요가 있다. 이는, 후술하는 내용 및 이에 이어서 본원의 실시예 부분에서 추가로 예시되는 내용에 포함하는 다양한 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
예를 들어, 일 구현예에서, 본 개시의 재조합 미생물은 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다: (i) 본원에 기술된 바와 같은 발현 작제물/벡터의 셔틀 미생물 내로 도립하는 단계 및 (ii) 메틸전이효소 유전자를 포함하는 작제물/벡터의 메틸화; 메틸전이효소 유전자의 발현; 셔틀 미생물로부터 하나 이상의 작제물/벡터의 단리; 및, 하나 이상의 작제물/벡터를 목적 미생물 내로 도입하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 단계 B의 메틸전이효소 유전자는 구성적으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, 단계 B의 메틸전이효소 유전자의 발현이 유도된다.
셔틀 미생물은 미생물, 바람직하게는 발현 작제물/벡터를 구성하는 핵산 서열의 메틸화를 용이하게 하는 제한 음성 미생물이다. 특정 구현예에서, 셔틀 미생물은 제한 음성 대장균, 바실러스 서브틸리스, 또는 락토코쿠스 락티스이다.
메틸화 작제물/벡터는 메틸전이효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일단 발현 작제물/벡터 및 메틸화 작제물/벡터가 셔틀 미생물 내로 도입되면, 메틸화 작제물/벡터 상에 존재하는 메틸전이효소 유전자가 유도된다. 본 개시의 특정 일 구현예에서 메틸화 작제물/벡터는 유도성 lac 프로모터를 포함하고 락토오스 또는 이의 유사체, 보다 바람직하게는 이소프로필--D-티오-갈락토시드(IPTG)의 첨가에 의해 유도되지만, 유도는 임의의 적절한 프로모터 시스템에 의해 이루어질 수 있다. 다른 적절한 프로모터는 ara, tet, 또는 T7 시스템을 포함한다. 본 개시의 추가의 구현예에서, 메틸화 작제물/벡터 프로모터는 구성적 프로모터이다.
특정 구현예에서, 메틸화 작제물/벡터는, 메틸화 작제물/벡터 상에 존재하는 임의의 유전자가 셔틀 미생물에서 발현되도록 셔틀 미생물의 동일성에 특이적인 복제 기점을 갖는다. 바람직하게는, 발현 작제물/벡터는 목적 미생물의 동일성에 특이적인 복제 기점을 가지기 때문에, 발현 작제물/벡터 상에 존재하는 임의의 유전자는 목적 미생물에서 발현된다.
메틸전이효소의 발현은 발현 작제물/벡터 상에 존재하는 유전자의 메틸화를 초래한다. 그런 다음, 발현 작제물/벡터는 다수의 공지된 방법 중 어느 하나에 따라 셔틀 미생물로부터 단리될 수 있다. 단지 예로서, 후술하는 실시예 부분에 기술된 방법론은 발현 작제물/벡터를 단리하는데 사용될 수 있다.
특정 일 구현예에서, 작제물/벡터 둘 모두는 동시에 단리된다.
발현 작제물/벡터는 임의의 수의 공지된 방법을 사용하여 목적 미생물 내로 도입될 수 있다. 그러나, 예로서, 이하에서 실시예 부분에 기술된 방법론이 사용될 수 있다. 발현 작제물/벡터가 메틸화되기 때문에, 발현 작제물/벡터 상에 존재하는 핵산 서열은 목적 미생물에 통합되고 성공적으로 발현될 수 있다.
메틸전이효소 유전자는 셔틀 미생물 내로 도입되고 과발현될 수 있는 것으로 예상된다. 따라서, 일 구현예에서, 생성된 메틸전이는 공지된 방법을 사용하여 수집되고 발현 플라스미드를 메틸화하도록 시험관 내에서 사용될 수 있다. 그런 다음, 발현 작제물/벡터는 발현을 위해 목적 미생물 내로 도입될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 메틸전이효소 유전자가 셔틀 미생물의 게놈 내로 도입된 다음, 발현 작제물/벡터가 셔틀 미생물 내로 도입되고, 하나 이상의 작제물/벡터가 셔틀 미생물로부터 단리된 다음, 발현 작제물/벡터는 목적 미생물 내로 도입된다.
위에서 정의된 바와 같은 발현 작제물/벡터 및 메틸화 작제물/벡터가 조합되어 물질의 조성을 제공할 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 조성물은 본 개시의 재조합 미생물을 생성하기 위한 제한 장벽 메커니즘을 우회하는 데 특히 유용하다.
특정 일 구현예에서, 발현 작제물/벡터 및/또는 메틸화 작제물/벡터들은 플라스미드이다.
당업자는 본 개시의 미생물을 생성하는 데 사용되는 다수의 적절한 메틸전이효소가 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 예로서, 바실러스 서브틸리스 파지 ΦT1 메틸전이효소 및 이후 본원의 실시예에 기술된 메틸전이효소가 사용될 수 있다. 원하는 메틸전이효소의 서열 및 유전자 코드에 대한 적절한 메틸전이효소를 코딩하는 핵산이 용이하게 이해될 것이다.
메틸전이효소 유전자의 발현을 허용하도록 구성된 임의의 수의 작제물/벡터가 메틸화 작제물/벡터를 생성하는 데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 기질은 CO를 포함한다. 일 구현예에서, 기질은 CO2 및 CO를 포함한다. 다른 구현예에서, 기질은 CO2 및 H2를 포함한다. 다른 구현예에서, 기질은 CO2 및 CO 및 H2를 포함한다.
"기질"은 본 개시의 미생물에 대한 탄소 및/또는 에너지 공급원을 지칭한다. 종종, 기질은 기체이고, C1-탄소 공급원, 예를 들어, CO, CO2 및/또는 CH4를 포함한다. 바람직하게는, 기질은 CO 또는 CO + CO2의 C1-탄소 공급원을 포함한다. 기질은 다른 비-탄소 성분, 예를 들어, H2, N2 또는 전자를 추가로 포함할 수 있다. 그러나, 다른 구현예에서, 기질은 탄수화물, 예컨대 당(sugar), 전분, 섬유, 리그닌, 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, 탄수화물은 프룩토스, 갈락토스, 글루코스, 락토스, 말토스, 수크로스, 자일로스 또는 이들의 일부 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 기질은 (D)-자일로스를 포함하지 않는다(문헌[Alkim, Microb Cell Fact, 14: 127, 2015]). 일부 구현예에서, 기질은 펜토스, 예컨대 자일로스를 포함하지 않는다(문헌[Pereira, Metab Eng, 34: 80-87, 2016]). 일부 구현예에서, 기질은 기체성 기질과 탄수화물 기질 둘 모두를 포함할 수 있다(혼합영양(mixotrophic) 발효). 기질은 다른 비-탄소 성분, 예를 들어, H2, N2 또는 전자를 추가로 포함할 수 있다.
기체 기질은 일반적으로, 적어도 일부 양의 CO, 예컨대 약 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 몰% CO를 포함한다. 기체 기질은 CO 범위, 예컨대 약 20 내지 80 몰%, 30 내지 70 몰% 또는 40 내지 60 몰% CO를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 기체 기질은 약 40 내지 70 몰% CO(예를 들어, 제철소 또는 용광로 기체), 약 20 내지 30 몰% CO(예를 들어, 제강 전로 기체), 또는 약 15 내지 45 몰% CO(예를 들어, 합성가스)를 포함한다. 일부 구현예에서, 기체 기질은 상대적으로 소량의 CO, 예컨대 약 1 내지 10 몰% 또는 1 내지 20 몰% CO를 포함할 수 있다. 본 개시의 미생물은 통상적으로 기체 기질 내 적어도 일부의 CO를 생성물로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 기체 기질은 CO를 포함하지 않거나 CO를 실질적으로(1 몰% 미만) 포함하지 않는다.
기체 기질은 일부 양의 H2를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기체 기질은 약 1, 2, 5, 10, 15, 20 또는 30 몰% H2를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 기체 기질은 상대적으로 다량의 H2, 예컨대 약 60, 70, 80 또는 90 몰% H2를 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 기체 기질은 H2를 포함하지 않거나 H2를 실질적으로(1 몰% 미만) 포함하지 않는다.
기체 기질은 일부 양의 CO2를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기체 기질은 약 1 내지 80 몰% 또는 1 내지 30 몰% CO2를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 기체 기질은 약 20, 15, 10 또는 5 몰% 미만의 CO2를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 기체 기질은 CO2를 포함하지 않거나 CO2를 실질적으로(1 몰% 미만) 포함하지 않는다.
기체 기질은 또한, 대안적인 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 기체 기질은 액체 내에 용해되거나 고체 지지체 상으로 흡착될 수 있다.
기체 기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 산업적 과정의 부산물로서 또는 일부 다른 공급원으로부터, 예컨대 자동차 매연 또는 바이오매스 가스화로부터 수득되는 폐기체 또는 오프가스일 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 산업 공정은 제강 제조 등의 철금속 제품 제조, 비철금속 제품 제조, 석유 정제, 석탄 가스화, 전력 생성, 카본블랙 생성, 암모니아 생성, 메탄올 생성, 코크스 제조로 이루어진 군에서 선택된다. 이들 구현예에서, 기체 기질 및/또는 C1-탄소 공급원은, 이것이 대기 중으로 배출되기 전에 임의의 편리한 방법을 사용하여 산업적 과정으로부터 포획될 수 있다.
기체 기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 합성가스, 예컨대 석탄 또는 정제 잔류물(residue)의 가스화, 바이오매스 또는 리그노셀룰로스성 물질의 가스화, 또는 천연 가스의 개질(reforming)에 의해 수득되는 합성가스일 수 있다. 다른 구현예에서, 합성가스는 도시 고체 폐기물 또는 산업 고체 폐기물의 가스화로부터 수득될 수 있다.
기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 산업 공정의 부산물로서 또는 또 다른 공급원, 예를 들어 자동차 배기 매연, 바이오가스, 매립지 가스, 직접 공기 포획, 또는 전기분해로부터 수득되는 폐기체일 수 있다. 기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 열분해, 반탄화, 또는 가스화에 의해 생성되는 합성가스일 수 있다. 다시 말해, 폐기물 중 탄소는 열분해, 반탄화 또는 가스화에 의해 재순환되어 기질 및/또는 C1-탄소 공급원으로서 사용되는 합성가스를 생성할 수 있다. 기판 및/또는 C1-탄소 공급원은 메탄을 포함한 기체일 수 있다.
특정 구현예에서, 이러한 산업 공정은 철 금속 제품 제조, 예컨대, 철강 제조, 비철 제품 제조, 석유 정제, 전력 생성, 카본 블랙 생성, 제지 및 펄프 제조, 암모니아 생성, 메탄올 생성, 코크스 제조, 석유화학 생성, 탄수화물 발효, 시멘트 제조, 호기성 소화, 혐기성 소화, 촉매 공정, 천연 가스 추출, 셀룰로오스 발효, 오일 추출, 지질 저류층의 산업적 처리, 천연 가스 석탄 및 석유와 같은 화석 자원 처리, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 산업 공정 내의 특정 처리 단계의 예는 촉매 재생, 유체 촉매 크래킹, 및 촉매 재생을 포함한다. 공기 분리 및 직접 공기 포획은 다른 적절한 산업 공정이다. 철강 및 철합금 제조에서의 특정한 예는 용광로 기체, 제강 전로 기체, 코크스 오븐 기체, 직접환원로 노상가스, 및 철 제련으로부터의 잔류 기체를 포함한다. 이러한 구현예에서, 기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 대기 중으로 배출되기 전에 임의의 공지된 방법을 사용하여 해당 산업 공정으로부터 포획될 수 있다.
기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 합성가스로서 알려진 합성 가스일 수 있으며, 이는 개질, 부분 산화, 또는 가스화 공정으로부터 수득될 수 있다. 가스화 공정의 예는, 석탄의 가스화, 정제 잔류물의 가스화, 석유 코크스의 가스화, 바이오매스의 가스화, 리노셀룰로오스 물질의 가스화, 폐목재의 가스화, 흑액(black liquor)의 가스화, 도시 고형 폐기물의 가스화, 도시 액체 폐기물의 가스화, 산업 고형 폐기물의 가스화, 산업 액체 폐기물의 가스화, 폐기물 유래 연료의 가스화, 하수물의 가스화, 하수 슬러지의 가스화, 폐수 처리로부터의 슬러지의 가스화, 바이오가스의 가스화를 포함한다. 개질 공정의 예는, 증기 메탄 개질, 증기 나프타 개질, 천연 가스 개질, 바이오가스 개질, 매립 가스 개질, 나프타 개질, 및 건식 메탄 개질을 포함한다. 부분 산화 공정의 예는, 열 및 촉매 부분 산화 공정, 천연 가스의 촉매 부분 산화, 탄화수소의 부분 산화를 포함한다. 도시 고형 폐기물의 예는, 타이어, 플라스틱, 및 신발, 의류 및 직물과 같은 섬유이다. 도시 고형 폐기물은 단순히 매립형 폐기물일 수 있다. 도시 고형 폐기물은 분류되거나 분류되지 않을 수 있다. 바이오매스의 예로는 리그노셀룰로오스 물질을 포함할 수 있으며, 미생물 바이오매스를 또한 포함할 수 있다. 리그노셀룰로오스 물질은 농업 폐기물 및 산림 폐기물을 포함할 수 있다.
기판 및/또는 C1-탄소 공급원은 메탄을 포함한 기체 스트림일 수 있다. 이러한 메탄 함유 기체는 파쇄, 오수 처리, 가축, 농업 및 지방자치 고형 폐기물 매립지와 같은 화석 메탄 방출로부터 수득될 수 있다. 또한, 메탄은 전기 또는 열을 생성하기 위해 연소될 수 있고, C1 부산물은 기판 또는 탄소 공급원으로서 사용될 수 있는 것으로 예상된다.
기체 기질의 조성물은 반응의 효율 및/또는 비용에 유의한 영향을 가질 수 있다. 예를 들어, 산소(O2)의 존재는 혐기성 발효 공정의 효율을 감소시킬 수 있다. 기질의 조성에 따라, 임의의 원치 않는 불순물, 예를 들어 독소, 원치 않는 성분, 또는 먼지 입자를 제거하고/하거나 바람직한 성분의 농도를 증가시키기 위해 기질을 처리하거나 스크럽하거나 여과하는 것이 바람직할 수 있다.
소정의 구현예에서, 발효는 탄수화물 기질, 예컨대 당, 전분, 섬유질, 리그닌, 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스의 부재 하에 수행된다.
일부 구현예에서, CO 및 H2로부터 에틸렌 글리콜(MEG)로의 전반적인 에너지론은 하기 제시된 바와 같이 글루코스로부터 에틸렌 글리콜로의 것들에 비해 바람직하며, 여기서, CO 및 H2에 대한 더 음성의 깁스 자유 에너지, ΔrG'm 값은 에틸렌 글리콜로의 더 큰 구동력을 나타낸다. 기질로서 글루코스 대 CO의 비교를 위한 전반적인 반응 델타 G의 계산은 평형 장치(equilibrator)(http://equilibrator.weizmann.ac.il/)를 사용하여 수행되었으며, 이는 생물학적 시스템에서 경로의 전반적인 실행 가능성 또는 경로에서의 개별적인 단계를 평가하는 표준 방법이다(문헌[Flamholz, E. Noor, A. Bar-Even, R. Milo (2012) eQuilibrator - the biochemical thermodynamics calculator Nucleic Acids Res 40:D770-5; Noor, A. Bar-Even, A. Flamholz, Y. Lubling, D. Davidi, R. Milo (2012) An integrated open framework for thermodynamics of reactions that combines accuracy and coverageBioinformatics 28:2037-2044; Noor, H.S. Haraldsdottir, R. Milo, R.M.T. Fleming (2013) Consistent Estimation of Gibbs Energy Using Component Contributions PLoS Comput Biol 9(7): e1003098; Noor, A. Bar-Even, A. Flamholz, E. Reznik, W. Liebermeister, R. Milo (2014) Pathway Thermodynamics Highlights Kinetic Obstacles in Central Metabolism PLoS Comput Biol 10(2):e1003483]). 계산은 하기와 같다:
에틸렌 글리콜, 글리옥실레이트 및/또는 글리콜레이트에 더하여, 본 개시의 미생물은 하나 이상의 공동 생성물을 생성하도록 배양될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 미생물은 에탄올(WO 2007/117157), 아세테이트(WO 2007/117157), 1-부탄올(WO 2008/115080, WO 2012/053905 및 WO 2017/066498), 부티레이트(WO 2008/115080), 2,3-부탄디올(WO 2009/151342 및 WO 2016/094334), 락테이트(WO 2011/112103), 부텐(WO 2012/024522), 부타디엔(WO 2012/024522), 메틸 에틸 케톤(2-부타논)(WO 2012/024522 및 WO 2013/185123), 에틸렌(WO 2012/026833), 아세톤(WO 2012/115527), 이소프로판올(WO 2012/115527), 지질(WO 2013/036147), 3-하이드록시프로피오네이트(3-HP)(WO 2013/180581), 테르펜, 예를 들어 이소프렌(WO 2013/180584), 지방산(WO 2013/191567), 2-부탄올(WO 2013/185123), 1,2-프로판디올(WO 2014/036152), 1 프로판올(WO 2017/066498), 1 헥산올(WO 2017/066498), 1 옥탄올(WO 2017/066498), 코리스메이트-유래 생성물(WO 2016/191625), 3 하이드록시부티레이트(WO 2017/066498), 1,3 부탄디올(WO 2017/066498), 2-하이드록시이소부티레이트 또는 2-하이드록시이소부티르산(WO 2017/066498), 이소부틸렌(WO 2017/066498), 아디프산(WO 2017/066498), 1,3 헥산디올(WO 2017/066498), 3-메틸-2-부탄올(WO 2017/066498), 2-부텐-1-올(WO 2017/066498), 이소발레레이트(WO 2017/066498), 이소아밀 알코올(WO 2017/066498) 및/또는 모노에틸렌 글리콜(WO 2019/126400)에 더불어 2-페닐에탄올을 생성할 수 있거나 이를 생성하도록 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 에틸렌 글리콜에 더하여, 본 개시의 미생물은 또한, 에탄올, 2,3-부탄디올 및/또는 숙시네이트를 생성한다. 특정 구현예에서, 미생물 바이오매스 자체는 생성물로 간주될 수 있다. 이러한 생성물은 디젤, 제트 연료 및/또는 가솔린 중 적어도 하나의 성분을 제조하도록 추가로 전환될 수 있다. 특정 구현예에서, 2-페닐에탄올은 프레이그런스, 에센셜 오일, 향미료, 및 비누의 성분으로서 사용될 수 있다. 또한, 미생물 바이오매스는 임의의 방법 또는 당업계에 공지된 방법의 조합에 의해 단일 세포 단백질(SCP)을 생성하도록 추가로 가공될 수 있다. 본 개시의 미생물은 하나 이상의 표적 생성물 이외에 또한 에탄올, 아세테이트 및/또는 2,3-부탄디올을 생성할 수 있다.
"천연 생성물"은 유전적으로 비변형된 미생물에 의해 생성되는 생성물이다. 예를 들어, 에탄올, 아세테이트 및 2,3-부탄디올은 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이 및 클로스트리디움 라그스달레이의 천연 생성물이다. "비-천연 생성물"은 유전적으로 변형된 미생물에 의해 생성되지만, 유전적으로 변형된 미생물이 유래되는 유전적으로 변형되지 않은 미생물에 의해서는 생성되지 않는 생성물이다. 에틸렌 글리콜은 임의의 천연-발생 미생물에 의해 생성되는 것으로 알려져 있지 않아서, 이는 모든 미생물의 비-천연 생성물이다.
"선택성"은 표적 생성물의 생성량 대 미생물에 의해 생성된 모든 발효 생성물의 생성량의 비를 지칭한다. 본 개시내용의 미생물은 특정 선택성 또는 최소 선택성으로 생성물을 생성하도록 조작될 수 있다. 일 구현예에서, 표적 생성물, 예컨대 에틸렌 글리콜은 본 개시의 미생물에 의해 생성되는 모든 발효 생성물의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50% 또는 75%를 차지한다. 일 구현예에서, 에틸렌 글리콜은 본 개시의 미생물에 의해 생성되는 모든 발효 생성물들의 적어도 약 10%를 차지하여, 본 개시의 미생물은 적어도 10%의, 에틸렌 글리콜에 대한 선택도를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 에틸렌 글리콜은 본 개시의 미생물에 의해 생성되는 모든 발효 생성물들의 적어도 약 30%를 차지하여, 본 개시의 미생물은 적어도 30%의, 에틸렌 글리콜에 대한 선택도를 갖는다.
하나 이상의 발효 생성물 중 적어도 하나는 배양에 의해 생성된 바이오매스일 수 있다. 적어도 일부의 미생물 바이오매스는 단세포 단백질(SCP)로 전환될 수 있다. 적어도 일부의 단세포 단백질은 동물 사료의 성분으로서 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 개시는 미생물 바이오매스 및 적어도 하나의 부형제를 포함하는 동물 사료를 제공하며, 여기에서 미생물 바이오매스는 CO, CO2, 및 H2 중 하나 이상을 포함하는 기체 기질 상에서 성장된 미생물을 포함한다.
"단세포 단백질"(SCP)은 단백질이 풍부한 인간 및/또는 동물 사료에 사용될 수 있는 미생물 바이오매스를 지칭하며, 종종 대두박 또는 어분과 같은 통상적인 단백질 보충 공급원을 대체한다. 단세포 단백질 또는 다른 생성물을 생성하기 위해, 공정은 추가의 분리, 가공, 또는 처리 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 미생물 바이오매스를 멸균하는 단계, 미생물 바이오매스를 원심분리하는 단계, 및/또는 미생물 바이오매스를 건조하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 미생물 바이오매스는 분무 건조 또는 패들 건조를 사용하여 건조한다. 방법은 또한 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 미생물 바이오매스의 핵산 함량을 감소시키는 단계를 포함할 수 있는데, 이는 핵산 함량이 높은 식이 섭취가 핵산 분해 생성물의 축적 및/또는 위장 장애를 초래할 수 있기 때문이다. 단세포 단백질은 가축 또는 애완동물과 같은 동물에게 먹이기에 적합할 수 있다. 특히, 동물 사료는 하나 이상의 육우, 젖소, 돼지, 양, 염소, 말, 노새, 당나귀, 사슴, 물소/들소, 라마, 알파카, 순록, 낙타, 들소, 가얄, 야크, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 뿔닭, 스쿼브/비둘기, 어류, 새우, 갑각류, 고양이, 개 및 설치류에게 먹이기에 적합할 수 있다. 동물 사료의 조성은 다양한 동물의 영양 요건에 맞게 조정될 수 있다. 또한, 공정은 미생물 바이오매스를 하나 이상의 부형제와 블렌딩하거나 또는 조합하는 단계를 포함할 수 있다.
"미생물 바이오매스"는 미생물 세포를 포함하는 생물학적 물질을 지칭한다. 예를 들어, 미생물 바이오매스는 박테리아, 고세균, 바이러스 또는 진균의 순수하거나 실질적으로 순수한 배양물을 포함하거나 또는 이로 구성될 수 있다. 발효 브로쓰로부터 처음 분리될 때, 미생물 바이오매스는 일반적으로 많은 양의 물을 포함한다. 이 물은 미생물 바이오매스를 건조 또는 가공함으로써 제거되거나 감소될 수 있다.
"부형제"는 동물 사료의 형태, 특성 또는 영양 함량을 향상시키거나 변경하도록 미생물 바이오매스에 첨가될 수 있는 임의의 물질을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 부형제는 탄수화물, 섬유, 지방, 단백질, 비타민, 미네랄, 물, 향료, 감미료, 항산화제, 효소, 보존제, 프로바이오틱 또는 항생제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 부형제는 건초, 짚, 사일리지, 곡물, 오일 또는 지방, 또는 다른 식물성 물질일 수 있다. 부형제는 문헌[Chiba, Section 18: Diet Formulation and Common Feed Ingredients, Animal Nutrition Handbook, 3rd revision, pages 575-633, 2014]에서 확인된 임의의 공급 성분일 수 있다.
"바이오폴리머"는 살아있는 유기체의 세포에 의해 생성된 천연 중합체를 지칭한다. 소정의 구현예에서, 바이오폴리머는 PHA이다. 소정의 구현예에서, 바이오폴리머는 PHB이다.
"바이오플라스틱"은 재생 가능한 바이오매스 공급원으로부터 생성된 플라스틱 재료를 지칭한다. 바이오플라스틱은 식물성 지방 및 오일, 옥수수 전분, 짚, 우드칩, 톱밥, 또는 재활용 음식 쓰레기와 같은 재생 가능한 공급원으로부터 생성될 수 있다.
본원에서, 산(예를 들어, 아세트산 또는 2-하이드록시이소부티르산)에 대한 지칭은 또한, 상응하는 염(예를 들어, 아세테이트 또는 2-하이드록시이소부티레이트)을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
통상적으로, 배양은 생물반응기에서 수행된다. 용어 "생물반응기"는 하나 이상의 용기, 탑, 또는 배관 구성으로 이루어진 배양/발효 장치, 예를 들어 연속 교반식 탱크 반응기(CSTR: continuous stirred tank reactor), 고정화 세포 반응기(ICR: immobilized cell reactor), 살수층 반응기(TBR: trickle bed reactor), 버블 컬럼(bubble column), 가스 리프트 발효조(gas lift fermenter), 정적 혼합기(static mixer), 또는 기액 접촉에 적합한 다른 용기 또는 다른 장치를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 제1 성장 반응기 및 제2 배양/발효 반응기를 포함할 수 있다. 기질은 이들 반응기 중 하나 또는 둘 모두에 제공될 수 있다. 본원에서, 용어 "배양" 및 "발효"는 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 배양/발효 공정의 성장 단계 및 생성물 생합성 단계 둘 모두를 포함한다.
배양물은 일반적으로 미생물이 성장하도록 하기에 충분한 영양분, 비타민 및/또는 미네랄을 함유하는 수성 배양 배지에서 유지된다. 바람직하게는, 수성 배양 배지는 혐기성 미생물 성장 배지, 예를 들어 최소 혐기성 미생물 성장 배지이다. 적합한 배지는 당업계에 널리 공지되어 있다.
배양/발효는 바람직하게는, 에틸렌 글리콜의 생성을 위한 적절한 조건 하에 수행되어야 한다. 필요한 경우, 배양/발효는 혐기성 조건 하에 수행된다. 고려해야 할 반응 조건은 압력(또는 분압), 온도, 기체 유량, 액체 유량, 배지 pH, 배지 산화환원 전위, 교반 속도(연속 교반식 탱크 반응기를 사용하는 경우), 접종원 수준, 액상 중의 기체를 제한하지 않는 최대 기체 기질 농도, 및 제품 억제를 회피하기 위한 최대 제품 농도를 포함한다. 특히, 기질의 도입 속도는 액체상 내 기체의 농도가 제한적으로 되지 않도록 보장하기 위해 제어될 수 있다.
상승된 압력에서 생물반응기를 작동하면 기체 상태에서 액체 상태로의 기체 물질 전달 속도가 증가한다. 따라서, 대기압보다 높은 압력에서 배양/발효를 수행하는 것이 일반적으로 바람직하다. 또한, 주어진 기체 변환 속도가, 부분적으로는, 기질 체류 시간의 함수이며, 체류 시간에 따라 생물반응기의 소요 부피가 달라지므로, 가압 시스템을 이용하면 생물반응기에 필요한 부피를 크게 줄일 수 있고, 결과적으로 배양/발효 장비의 투자비를 줄일 수 있다. 이는, 결과적으로는, 생물반응기의 액체 부피를 유입 기체 유량으로 나눈 값으로 정의되는 체류 시간이 생물반응기가 대기압보다 높은 압력에서 유지되는 경우 감소될 수 있다는 것을 의미한다. 최적 반응 조건은 부분적으로는 사용되는 특정 미생물에 따라 달라질 것이다. 그러나, 일반적으로는, 대기압보다 높은 압력에서 발효를 진행하는 것이 바람직하다. 또한, 제공된 기체 전환 속도가 부분적으로는 기질 체류 시간의 함수이고 원하는 체류 시간을 달성하는 것이 결과적으로는 생물반응기의 필요한 시간을 나타내기 때문에, 가압된 시스템의 사용은 필요한 생물반응기의 부피 및 결과적으로 발효 장비의 자본 비용을 크게 감소시킬 수 있다.
특정한 구현예에서, 발효는 광의 부재 하에, 또는 광합성 미생물의 에너지 요건을 충족시키기에 불충분한 양의 광의 존재 하에 수행된다. 특정한 구현예에서, 본 개시내용의 미생물은 비-광합성 미생물이다.
표적 생성물은, 예를 들어 분별 증류, 증발, 투과증발, 기체 스트리핑, 상 분리, 및 예를 들어 액-액 추출을 포함하는 추출 발효를 포함하는 당업계에 알려진 임의의 방법 또는 방법의 조합을 사용하여 발효 브로쓰로부터 분리하거나 정제할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 표적 생성물은 발효 브로쓰의 일부를 생물반응기로부터 연속적으로 제거하여 미생물 세포를 브로쓰로부터 (편리하게는 여과에 의해) 분리하고 1종 이상의 표적 생성물을 브로쓰로부터 회수함으로써 발효 브로쓰로부터 회수된다. 알코올 및/또는 아세톤은, 예를 들어, 증류에 의해 회수될 수 있다. 산은, 예를 들어, 활성탄 상에 흡착시킴으로써 회수될 수 있다. 분리된 미생물 세포는 바람직하게는 생물반응기로 돌아간다. 표적 생성물이 제거된 후 남은 무세포 투과액은 또한 바람직하게는 생물반응기로 되돌아간다. 생물반응기로 되돌려지기 전에, 추가 영양소(예를 들어, 비타민 B)가 배지를 보충하기 위해 무세포 투과액에 첨가될 수 있다. 정제 기술은 친화도 태그 정제(예: His, Twin-Strep, 및 FLAG), 비드 기반 시스템, 팁 기반 접근법, 및 대규모의 자동화된 정제를 위한 FPLC 시스템을 포함할 수 있다. 친화도 태그에 의존하지 않는 정제 방법(예를 들어, 염화(salting out), 이온 교환 및 크기 배제)이 또한 개시된다.
본원에서 지칭되는 바와 같이, "발효 브로쓰"는 적어도 영양 배지 및 박테리아 세포를 포함하는 배양 배지이다.
본원에서 지칭되는 바와 같이, "셔틀 미생물"은 메틸전이효소가 발현되고 목적 미생물과 구별되는 미생물이다.
본원에서 지칭되는 바와 같이, "목적 미생물"은 발현 작제물/벡터 상에 포함된 유전자가 발현되고 셔틀 미생물과 구별되는 미생물이다.
용어 "주 발효 생성물"은 최고 농도 및/또는 수율로 생성되는 하나의 발효 생성물을 의미하는 것으로 의도된다.
용어 "효율의 증가", "증가된 효율" 등은 발효 공정과 관련하여 사용되는 경우, 발효의 촉매 작용을 하는 미생물 성장 속도, 높은 생성물 농도에서의 성장 및/또는 생성물 생성 속도, 소모된 기질 부피당 생성된 원하는 생성물의 부피, 원하는 생성물의 생성 속도 또는 생성 수준 및 생성된 원하는 생성물의 기타 발효 부산물과의 상대적 비율 중 하나 이상을 증가시키는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
"일산화탄소를 포함하는 기질" 및 이와 유사한 용어는, 예를 들어, 성장 및/또는 발효를 위해 하나 이상의 박테리아 계통에 일산화탄소를 이용할 수 있는 임의의 기질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"일산화탄소를 포함하는 기체 기질"이라는 구절 및 이와 유사한 구절 및 용어는 일산화탄소의 수준을 함유하는 임의의 기체를 포함한다. 특정 구현예에서, 기질은, 부피 기준 적어도 약 20% 내지 약 100% CO, 부피 기준 20% 내지 70% CO, 부피 기준 30% 내지 60% CO, 및 부피 기준 40% 내지 55% CO를 함유한다. 특정 구현예에서, 기질은 부피 기준 약 25%, 또는 약 30%, 또는 약 35%, 또는 약 40%, 또는 약 45%, 또는 약 50% CO, 또는 약 55% CO　또는 약 60% CO를 포함한다.
기질이 임의의 수소를 함유하는 것은 필수적이지 않지만, H2의 존재는 본 개시내용의 방법에 따른 생성물의 생성에 유해하지 않아야 한다. 특정 구현예에서, 수소의 존재는 알콜 생성의 전체 효율을 개선한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 기질은 약 2:1 또는 1:1 또는 1:2 비율의 H2:CO를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 기질은 부피 기준 약 30% 이하의 H2, 부피 기준 20% 이하의 H2, 부피 기준 약 15% 이하의 H2 또는 부피 기준 약 10% 이하의 H2를 포함한다. 다른 구현예에서, 기질 스트림은 5% 미만 또는 4% 미만 또는 3% 미만 또는 2% 미만 또는 1% 미만의 낮은 농도의 H2를 포함하거나, 실질적으로 수소가 없다. 기질은 또한 일부 CO2, 예를 들어, 부피 기준 약 1% 내지 약 80%의 CO2 또는 약 1% 내지 약 30%의 CO2를 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 기질은 부피 기준 약 20% 이하의 CO2를 포함한다. 특정 구현예에서, 기질은 부피 기준 약 15% 이하의 CO2, 부피 기준 약 10% 이하의 CO2 또는 부피 기준 약 5% 이하의 CO2를 포함하거나, 실질적으로 CO2를 포함하지 않는다.
다음의 설명에서, 본 개시의 구현예는 "CO를 함유하는 기체 기질"을 전달하는 단계 및 발효시키는 단계의 측면에서 설명된다. 그러나, 기체 기질은 대안적인 형태로 제공될 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, CO를 함유하는 기체 기질은 액체에 용해된 상태로 제공될 수 있다. 본질적으로, 액체를 일산화탄소 함유 기체로 포화시킨 후 액체를 생물반응기에 첨가한다. 이는 표준 방법론을 사용하여 달성될 수 있다. 예로서, 마이크로버블 분산액 발생기(문헌[Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3 / October 2002])를 사용할 수 있었다. 추가의 예로서, CO를 함유하는 기체 기질은 고체 지지체에 흡착될 수 있다. 이러한 대안적인 방법은 용어 "CO를 함유하는 기질" 등의 사용에 포함된다.
본 개시의 특정 구현예에서, CO-함유 기체 기질은 산업용 오프 기체 또는 폐기체이다. "산업용 폐기체 또는 오프 기체"는 산업 공정에 의해 생성된 CO를 포함하는 임의의 기체를 포함하는 것으로 광범위하게 간주되어야 하며 하며, 철 금속 생성물 제조, 비철 생성물 제조, 석유 정제 공정, 석탄의 기체화, 바이오매스의 기체화, 전력 생성, 카본 블랙 생성 및 코크스 제조의 결과로서 생성된 기체를 포함한다. 추가의 실시예는 본원의 다른 부분에서 제공될 수 있다.
문맥상 달리 요구하지 않는 한, 구절 "발효", "발효 공정" 또는 "발효 반응" 등은 본원에서 사용된 바, 해당 방법의 성장 단계 및 생성물 생합성 단계를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 일부 구현예에서, 생물반응기는 제1 성장 반응기 및 제2 발효 반응기를 포함할 수 있다. 이와 같이, 발효 반응에 금속 또는 조성물을 첨가하는 것은 이들 반응기 중 하나 또는 둘 모두에 첨가하는 것을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "생물반응기"는 하나 이상의 용기 및/또는 타워, 또는 배관 장치로 이루어진 발효 장치를 포함하며, 이는 연속 교반식 탱크 반응기(CSTR: Continuous Stirred Tank Reactor), 고정화 세포 반응기(ICR: immobilized cell reactor), 살수층 반응기(TBR: Trickle Bed Reactor), 버블 컬럼(Bubble Column), 가스 리프트 발효조(Gas Lift Fermenter), 정적 혼합기(Static Mixer), 또는 기체-액체 접촉에 적합한 다른 용기 또는 다른 장치를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 제1 성장 반응기 및 제2 발효 반응기를 포함할 수 있다. 이와 같이, 생물반응기 또는 발효 반응에 기질을 첨가한다고 언급할 경우, 적절한 경우 이들 반응기 중 하나 또는 둘 모두에 첨가하는 것을 포함하는 것으로 이해해야 한다.
"외인성 핵산"은 도입되는 미생물의 외부에서 기원하는 핵산이다. 외인성 핵산은 도입될 미생물(예를 들어, 재조합 미생물이 유래되는 모 미생물), 도입될 유기체와 상이한 미생물의 균주 또는 종을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 공급원으로부터 유래될 수 있거나 인공적으로 또는 재조합적으로 생성될 수 있다. 일 구현예에서, 외인성 핵산은 도입될 미생물 내에 자연적으로 존재하는 핵산 서열을 나타내며, 이들은 (예를 들어, 서열(예를 들어, 유전자)의 복제 수를 증가시키거나, 발현을 증가시키기 위해 강하거나 구성적인 프로모터를 도입하여) 특정 유전자의 발현을 증가시키거나 과발현하도록 도입된다. 다른 구현예에서, 외인성 핵산은 도입될 미생물 내에 자연적으로 존재하지 않는 핵산 서열을 나타내고, (예를 들어, 프로모터와 같은 조절 요소의 도입의 경우) 미생물 내에 자연적으로 존재하지 않는 생성물의 발현 또는 미생물에 대해 천연인 유전자의 발현 증가를 허용한다. 외인성 핵산은 도입될 미생물의 게놈 내로 통합되거나 염색체외 상태로 유지되도록 구성될 수 있다.
"외인성"은 또한 단백질을 지칭하는 데 사용될 수 있다. 이는 재조합 미생물이 유래되는 모 미생물에 존재하지 않는 단백질을 지칭한다.
재조합 미생물 및 핵산 또는 단백질과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "내인성"은 재조합 미생물이 유래되는 모 미생물에 존재하는 임의의 핵산 또는 단백질을 지칭한다.
본 개시는 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 경우에 본원에서 구체적으로 예시된 서열과 상이한 서열을 갖는 핵산을 사용하여 실시될 수 있음을 이해해야 한다. 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 경우, 이는 코딩된 단백질 또는 펩티드가 실질적으로 동일한 기능을 갖는다는 것을 의미한다. 프로모터 서열을 나타내는 핵산 서열의 경우, 변이체 서열은 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진하는 능력을 가질 것이다. 이러한 핵산은 본원에서 "기능적으로 동등한 변이체"로 지칭될 수 있다. 예로써, 핵산의 기능적으로 동등한 변이체는 대립유전자 변이체, 유전자 절편, 돌연변이(결실, 삽입, 뉴클레오티드 치환 등)를 포함하는 유전자 및/또는 다형성 등을 포함할 수 있다. 다른 미생물 유래의 상동성 유전자는 또한 본원에서 구체적으로 예시된 서열의 기능적으로 동등한 변이체의 예로서 간주될 수 있다. 이들은 종, 예컨대, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 클로스트리디움 베이예린키이, 클로스트리디움 사카로부틸리쿰 및 클로스트리디움 사카로퍼부틸아세토니쿰 내의 상동성 유전자를 포함하고, 이들의 세부사항은 웹사이트, 예컨대 Genbank 또는 NCBI 상에서 공개적으로 입수 가능하다. 문구 "기능적으로 동등한 변이체"는 또한 핵산의 서열이 특정 유기체에 대한 코돈 최적화의 결과로서 달라지는 핵산을 포함한다. 본원에서 핵산의 "기능적으로 동등한 변이체"는 바람직하게는 식별된 핵산과 적어도 약 70%, 바람직하게는 약 80%, 보다 바람직하게는 약 85%, 바람직하게는 약 90%, 바람직하게는 약 95% 이상의 핵산 서열 동일성을 가질 것이다.
본 개시는 본원에서 구체적으로 예시된 아미노산 서열과 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드를 사용하여 실시될 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 변이체는 본원에서 "기능적으로 동등한 변이체"로 지칭될 수 있다. 단백질 또는 펩티드의 기능적으로 동등한 변이체는 식별된 단백질 또는 펩티드와 적어도 40%, 바람직하게는 50%, 바람직하게는 60%, 바람직하게는 70%, 바람직하게는 75%, 바람직하게는 80%, 바람직하게는 85%, 바람직하게는 90%, 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 동일성을 공유하고 관심 펩티드 또는 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 갖는 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 이러한 변이체는 단백질 또는 펩티드의 단편의 범위 내에 있으며, 여기서 단편은 폴리펩티드의 절단된 형태를 포함하되, 결실은 1 내지 5, 10, 15, 20, 25개의 아미노산일 수 있고, 폴리펩티드의 어느 하나의 말단에서 잔기 1 내지 25로부터 연장될 수 있으며, 여기서 결실은 영역 내의 임의의 길이일 수 있고; 또는 내부 위치에 있을 수 있다. 본원의 특이적 폴리펩티드의 기능적으로 동등한 변이체는 또한, 예를 들어, 이전 단락에서 예시된 바와 같이, 다른 종의 박테리아에서 상동성 유전자에 의해 발현된 폴리펩티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용되는 "실질적으로 동일한 기능"은 핵산 또는 폴리펩티드가 변이체인 핵산 또는 폴리펩티드의 기능을 수행할 수 있음을 의미하도록 의도된다. 예를 들어, 본 개시의 효소의 변이체는 해당 효소와 동일한 반응을 촉매할 수 있을 것이다. 그러나, 변이체가 변이체인 폴리펩티드 또는 핵산과 동일한 수준의 활성을 갖는 것을 의미하도록 간주되어서는 안 된다.
임의의 수의 공지된 방법을 사용하여 기능적으로 동등한 변이체가 변이체인 핵산 또는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 기능을 갖는지 여부를 평가할 수 있다. 그러나, 예로서, 방법은 문헌[Silver et al. (1991, Plant Physiol. 97: 1588-1591)] 또는 문헌[Zhao et al. (2011, Appl Microbiol Biotechnol, 90:1915-1922)](이소프렌 합성효소의 경우), 문헌[Green et al. (2007, Phytochemistry; 68:176-188)](파르네센 합성효소의 경우), 문헌[Kuzuyama et al. (2000, J. Bacteriol. 182, 891-897)](1-데옥시-D-자일룰로스 5-포스페이트 합성효소 Dxs의 경우), 문헌[Berndt and Schlegel (1975, Arch. Microbiol. 103, 21-30)] 또는 문헌[Stim-Herndon et al. (1995, Gene 154: 81-85)](티올라제의 경우), 문헌[Cabano et al. (1997, Insect Biochem. Mol. Biol. 27: 499-505)](HMG-CoA 합성효소의 경우), 문헌[Ma et al. (2011, Metab. Engin., 13:588-597)](HMG-CoA 환원효소 및 메발로네이트 키나제 효소의 경우), 문헌[Herdendorf and Miziorko (2007, Biochemistry, 46: 11780-8)](포스포메발로네이트 키나제의 경우) 및 문헌[Krepkiy et al. (2004, Protein Sci. 13: 1875-1881)](메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제의 경우)에 의해 설명된다. 또한, Trutko 등에 의해 설명된 바와 같이 포스미도마이신 또는 메비놀린과 같은 억제제를 사용하여 DXS 및 메발로네이트 경로의 유전자를 식별하는 것이 가능하다(문헌[Trutko et al. (2005, Microbiology 74: 153-158]).
본 개시와 관련하여 사용되는 경우 "과발현하다", "과발현" 및 유사한 용어 및 문구는 동일한 조건 하에서 모 미생물의 (핵산을 포함하는) 단백질의 발현 수준과 비교하여 (이를 코딩하는 하나 이상의 핵산의 발현을 포함하는) 하나 이상의 단백질의 발현의 임의의 증가를 포함하는 것으로 광범위하게 간주되어야 한다. 단백질(또는 핵산)이 임의의 특정 수준에서 발현되는 것을 의미하도록 간주되어서는 안 된다.
"모 미생물"은 본 개시의 재조합 미생물을 생성하기 위해 사용되는 미생물이다. 모 미생물은 자연에서 발생하는 미생물(즉, 야생형 미생물) 또는 이전에 변형되었으나 본 개시의 대상인 효소 중 하나 이상을 발현하거나 과발현하지 않는 것일 수 있다. 따라서, 재조합 미생물은 모 미생물에서 발현되지 않거나 과발현되지 않은 하나 이상의 효소를 발현하거나 과발현하도록 변형되었을 수 있다.
용어 핵산 "작제물" 또는 "벡터" 및 유사한 용어는 유전 물질을 세포 내로 전달하기 위한 비히클로서 사용하기에 적합한 임의의 핵산(DNA 및 RNA 포함)을 포함하도록 광범위하게 간주되어야 한다. 해당 용어는 플라스미드, 바이러스(박테리오파지 포함), 코스미드 및 인공 염색체를 포함하도록 간주되어야 한다. 작제물 또는 벡터는 하나 이상의 조절 요소, 복제 기점, 다중 클로닝 부위 및/또는 선택성 마커를 포함할 수 있다. 일 특정 구현예에서, 작제물 또는 벡터는 작제물 또는 벡터에 의해 코딩되는 하나 이상의 유전자의 발현을 허용하도록 구성된다. 핵산 작제물 또는 벡터는 노출 핵산뿐만 아니라 세포에 대한 전달을 용이하게 하기 위해 하나 이상의 작용제(예를 들어, 핵산이 함유된 유기체인 리포좀-접합 핵산)으로 제형화된 핵산을 포함한다.
본원에서 지칭되는 "테르펜"은 단순 및 복합 테르펜 및 알코올, 알데하이드 및 케톤과 같은 산소 함유 테르펜 화합물을 포함하여 함께 결합된 C5 이소프렌 단위로 구성되는 임의의 화합물을 포함하도록 광범위하게 간주되어야 한다. 단순 테르펜은 코니퍼와 같은 식물의 정유 및 수지에서 발견된다. 보다 복합적인 테르펜은 테르페노이드 및 비타민 A, 카로티노이드 색소(예컨대, 리코펜), 스쿠알렌 및 고무를 포함한다. 모노테르펜의 예는 이소프렌, 피넨, 네롤, 시트랄, 캄포, 멘톨, 리모넨을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 세스퀴테르펜의 예는 네롤리돌, 파르네솔을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 디테르펜의 예는 피톨, 비타민 A1을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 스쿠알렌은 트리테르펜의 일례이고, 카로틴(프로비타민 A1)은 테트라테르펜이다.
"테르펜 전구체"는 아세틸 CoA 및 선택적으로 피루브산염으로부터 시작하여 테르펜을 형성하기 위해 반응 동안 생성된 화합물 또는 중간체이다. 용어는 메발로네이트(MVA) 경로 및 선택적으로 DXS 경로에서 발견되는 전구체 화합물 또는 중간체뿐만 아니라 FPP 및 GPP와 같은 장쇄 테르펜의 하류 전구체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 이는 메발론산, IPP, 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP), 제라닐 피로포스페이트(GPP) 및 파르네실 피로포스페이트(FPP)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
"DXS 경로"는 피루브산염 및 D-글리세르알데하이드-3-포스페이트로부터 DMAPP 또는 IPP로의 효소 경로이다. 이는 데옥시자일룰로스 5-포스페이트(DXP/DXPS/DOXP 또는 DXS) / 메틸에리트리톨 포스페이트(MEP) 경로로도 알려져 있다.
"메발로네이트(MVA) 경로"는 아세틸-CoA에서 IPP로의 효소 경로이다.
미생물
테르펜의 생성을 위한 2개의 경로, 즉, 당분해의 2개의 주요 중간체인 피루브산염 및 D-글리세르알데하이드-3-포스페이트(G3P)로부터 시작하는 데옥시자일룰로스 5-포스페이트(DXP/DXPS/DOXP 또는 DXS) / 메틸에리트리톨 포스페이트(MEP) 경로(문헌[Hunter et al., 2007, J. Biol. chem. 282: 21573-77]) 및 아세틸-CoA로부터 시작하는 메발로네이트(MVA) 경로(문헌[Miziorko, 2011, Arch Biochem Biophys, 505: 131-143])가 공지되어 있다. 많은 상이한 부류의 미생물이 이들 경로 중 어느 하나의 존재에 대해 조사되었으나(문헌[Lange et al., 2000, PNAS, 97: 13172-77]; 문헌[Trutko et al., 2005, Microbiology, 74: 153-158]; 문헌[Julsing et al., 2007, Appl Microbiol Biotechnol, 75: 1377-84]), 일산화탄소영양 아세토겐은 조사되지 않았다. 예를 들어, DXS 경로는 대장균, 바실러스 또는 미코박테리움(Mycobacterium)에 존재하는 반면, 메발로네이트 경로는 효모 사카로미세스, 클로로플렉수스(Cloroflexus) 또는 믹소콕쿠스(Myxococcus)에 존재할 것으로 밝혀졌다.
일산화탄소영양 아세토겐인 C. 아우토에타노게눔, C. 륭달리이의 게놈이 2개의 경로 중 어느 하나의 존재에 대해 발명자들에 의해 분석되었다. DXS 경로의 모든 유전자는 C. 아우토에타노게눔 및 C. 륭달리이에서 식별되었으며(표 1) 메발로네이트 경로는 없다. 또한, C. 아우토에타노게눔 또는 C. 륭달리이와 같은 일산화탄소영양 아세토겐은 대사 최종 생성물로서 임의의 테르펜을 생성하는 것으로 알려져 있지 않다.
이소프렌 단위로부터 테르펜의 하류 합성을 위한 유전자도 두 유기체 모두에서 식별하였다(표 2).
테르펜은 에너지 밀도가 높은 화합물이며, 이들의 합성은 세포가 ATP와 같은 뉴클레오시드 트리포스페이트의 형태로 에너지를 투자하도록 요구한다. 당을 기질로서 사용하는 것은 당분해로부터 공급되어 ATP의 여러 분자를 수득하기에 충분한 에너지를 필요로 한다. 기질로서 당을 사용하는 DXS 경로를 통한 테르펜 및/또는 전구체의 생성은 피루브산염 및 D-글리세르알데하이드-3-포스페이트(G3P)의 가용성으로 인해 비교적 간단한 방식으로 진행되며, G3P는 C5 오탄당 및 C6 육탄당 당으로부터 유래된다. 따라서, 이들 C5 및 C6 분자는 테르펜을 구성하는 C5 이소프렌 단위로 비교적 쉽게 전환된다.
CO 또는 CO2와 같은 C1 기질을 사용하는 혐기성 아세토겐의 경우, C1 단위로부터 헤미테르페노이드와 같은 장분자를 합성하는 것이 더 어렵다. 이는 C10 모노테르펜, C15 세스퀴테르펜 또는 C40 테트라테르펜과 같은 장쇄 테르펜의 경우에 특히 그러하다. 현재까지 아세토겐(천연 및 재조합 유기체 모두)에서 보고된 대부분의 탄소 원자를 갖는 생성물은 C4 화합물 부탄올(문헌[Kφpke et al., 2011, Curr. Opin. Biotechnol. 22: 320-325]; 문헌[Schiel-Bengelsdorf and D
Figure pct00007
rre, 2012, FEBS Letters: 10.1016/j.febslet.2012.04.043]; 문헌[Kφpke et al., 2011, Proc. Nat. Sci. U.S.A. 107: 13087-92]; US 특허 2011/0236941) 및 2,3-부탄디올(문헌[Kφpke et al., 2011, Appl. Environ. Microbiol. 77:5467-75])이다. 본 발명자들은 아세틸 CoA 중간체를 통해 C1 공급원료 CO를 사용하여 이들 장쇄 테르펜 분자를 혐기적으로 생성하는 것이 놀랍게도 가능하다는 점을 나타내었다.
혐기성 아세토겐의 우드-륭달 경로의 에너지가 막 출현하고 있으나, 호기성 성장 조건 또는 당 발효 유기체의 당분해와 달리, ATP는 기질 수준 인산화에 의해 우드-륭달 경로에서 획득되지 않으며, 실제로는, 포름산염에 대한 CO2의 활성화에는 하나의 분자의 ATP가 실제로 필요하며 막 구배가 요구된다. 본 발명자들은 생성물 형성을 위한 경로가 에너지 효율적인 것이 중요하다는 점을 주목한다. 본 발명자들은 아세토겐에서 기질 CO 또는 CO2가 아세틸-CoA 내로 직접 채널링되며, 이는 특히 당계 시스템과 비교되는 경우 테르펜 및/또는 이들의 전구체에 대한 가장 직접적인 경로를 나타내며, 6개의 반응만이 요구된다는 점을 주목한다(도 1). 더 적은 ATP가 일산화탄소영양 아세토겐에서 이용 가능하나, 본 발명자들은 이러한 보다 직접적인 경로가 (중간 반응의 화학적 동기력이 높기 때문에) 더 높은 대사 유동을 유지할 수 있다고 생각한다. 매우 효과적인 대사 유동은 테르펜 생합성 경로에서 여러 중간체, 예컨대, 주요 중간체인 메발로네이트 및 FPP가 효율적으로 전환되지 않는 경우 대부분의 박테리아에 독성이 있기 때문에 중요하다.
ATP 가용성이 더 높음에도 불구하고, 이러한 중간 독성의 문제는 당으로부터 테르펜의 생성에 있어서 장애물일 수 있다.
메발로네이트 경로 대 DXS 경로를 통한 CO로부터의 테르펜 전구체 IPP 및 DMAPP 생성의 에너지(도 6)를 비교하는 경우, 본 발명자들은 메발로네이트 경로가 ATP로서 더 적은 뉴클레오시드 트리포스페이트를 필요로 하고, 더 적은 환원 당량을 필요로 하며, 또한 아세틸-CoA로부터 6개의 필요한 반응 단계만을 가져 DXS 경로와 비교되는 경우 더 직접적이라는 것을 주목하였다. 이는 반응 속도 및 대사 유동에 이점을 제공하고 전체 에너지 효율을 증가시킨다. 또한, 필요한 효소의 수가 적을수록 재조합 미생물을 생성하는 데 필요한 재조합 방법이 단순화된다.
메발로네이트 경로를 갖는 아세토겐은 식별되지 않았으나, 본 발명자들은 메발로네이트 경로 및 선택적으로 DXS 경로를 클로스트리디움 아우토에타노게눔 또는 C. 륭달리이와 같은 일산화탄소영양 아세토겐 내로 도입하여 C1 탄소 기질 CO로부터 테르펜 및/또는 이의 전구체를 효율적으로 생성하는 것이 가능하다는 점을 보여주었다. 이들은 이것이 모든 일산화탄소영양 아세트산생성 미생물에 적용 가능하다고 생각한다.
또한, 테르펜 및/또는 이의 전구체의 생성이 혐기성 조건 하에서 재조합 미생물을 사용하여 가능한 것으로 나타난 적이 없다. 이소프렌의 혐기성 생성은 이소프렌이 산소의 존재 하에 매우 가연성이고 실온 및 대기압에서 1.5 내지 2.0%의 가연성 하한(lower flammable limit, LFL) 및 2.0 내지 12%의 가연성 상한(upper flammable limit, UFL)을 갖기 때문에 보다 안전한 작동 환경을 제공하는 이점을 갖는다. 화염은 산소의 부재 시 발생할 수 없기 때문에, 본 발명자들은 모든 생성물 농도, 기체 조성, 온도 및 압력 범위에 걸쳐 더 안전할 것이므로 혐기성 발효 공정이 바람직하다고 생각한다.
위에서 논의한 바와 같이, 본 개시는 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체 및 선택적으로 하나 이상의 다른 생성물을 생성할 수 있는 재조합 미생물을 제공한다.
추가 구현예에서, 미생물은
메발로네이트(MVA) 경로로부터 하나 이상의 외인성 효소를 발현하고/하거나 메발로네이트(MVA) 경로로부터 하나 이상의 내인성 효소를 과발현하고;
DXS 경로로부터 하나 이상의 외인성 효소를 발현하고/하거나 DXS 경로로부터 하나 이상의 내인성 효소를 과발현하도록 구성된다.
일 구현예에서, 재조합 미생물이 유래되는 모 미생물은 CO를 포함하는 기질을 발효하여 아세틸 CoA를 생성할 수 있으나, 아세틸 CoA를 메발론산 또는 이소펜테닐 피로포스페이트(IPP)로 전환할 수 없으며, 재조합 미생물은 메발로네이트 경로에 관여하는 하나 이상의 효소를 발현하도록 구성된다.
미생물은 예를 들어, (예를 들어, 유전자의 발현을 유도하기 위해 더 강하거나 구성적인 프로모터를 도입하여) 미생물 내의 천연 유전자의 발현을 증가시키는 단계, 효소를 코딩하고 발현하도록 구성되는 외인성 핵산을 도입하여 특정 효소를 코딩하는 유전자의 복제 수를 증가시키는 단계, 모 미생물 내에 자연적으로 존재하지 않는 효소를 코딩하고 발현하도록 구성되는 외인성 핵산을 도입하는 단계를 포함하는 임의의 수의 재조합 방법에 의해 하나 이상의 효소를 발현하거나 과발현하도록 구성될 수 있다.
일 구현예에서, 하나 이상의 효소는 메발로네이트(MVA) 경로로부터 유래되며
a) 티올라제(EC 2.3.1.9),
b) HMG-CoA 합성효소(EC 2.3.3.10),
c) HMG-CoA 환원효소(EC 1.1.1.88),
d) 메발로네이트 키나제(EC 2.7.1.36),
e) 포스포메발로네이트 키나제(EC 2.7.4.2),
f) 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제(EC 4.1.1.33) 및
g) 이들 중 임의의 하나의 기능적으로 동등한 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
추가 구현예에서, DXS 경로로부터 유래하는 선택적인 하나 이상의 효소는
a) 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 합성효소 DXS(EC:2.2.1.7),
b) 1-데옥시-D-자일룰로스 5-포스페이트 환원이성질화효소 DXR(EC:1.1.1.267),
c) 2-C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트 시티딜릴트랜스퍼라제 IspD(EC:2.7.7.60),
d) 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나제 IspE(EC:2.7.1.148),
e) 2-C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트 합성효소 IspF(EC:4.6.1.12),
f) 4-하이드록시-3-메틸부트-2-엔-1-일 디포스페이트 합성효소 IspG(EC:1.17.7.1),
g) 4-하이드록시-3-메틸부트-2-에닐 디포스페이트 환원효소(EC:1.17.1.2) 및
h) 이들 중 임의의 하나의 기능적으로 동등한 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 하나 이상의 외인성 또는 내인성 추가 효소가 발현되거나 과발현되어 테르펜 화합물 및/또는 이의 전구체의 생성을 초래하며, 발현되는 외인성 효소 또는 과발현되는 내인성 효소는
a) 제라닐트랜스트랜스퍼라제 Fps(EC:2.5.1.10),
b) 헵타프레닐 디포스페이트 합성효소(EC:2.5.1.10),
c) 옥타프레닐-디포스페이트 합성효소(EC:2.5.1.90),
d) 이소프렌 합성효소(EC 4.2.3.27),
e) 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성질화효소(EC 5.3.3.2),
f) 파르네센 합성효소(EC 4.2.3.46 / EC 4.2.3.47) 및
g) 이들 중 임의의 하나의 기능적으로 동등한 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
단지 예로서, 효소 각각에 대한 서열 정보는 본원의 도면에 열거되어 있다.
본 개시의 미생물에 사용되는 효소는 상이한 속 및 종의 박테리아 또는 다른 유기체를 포함하는 임의의 적절한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 그러나, 일 구현예에서, 효소는 스타필로콕쿠스 아우레우스로부터 유래된다.
일 구현예에서, 효소 이소프렌 합성효소(ispS)는 포플러 트레물로이데스로부터 유래된다. 추가 구현예에서, 이는 이하 서열 식별 번호: 21에 예시된 핵산 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 효소 데옥시자일룰로스 5-포스페이트 합성효소는 서열 식별 번호: 1에 예시된 핵산 서열 및/또는 이하 서열 식별 번호: 2에 예시된 아미노산 서열에 의해 코딩된 C. 아우토에타노게눔으로부터 유래되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 효소 1-데옥시-D-자일룰로스 5-포스페이트 환원이성질화효소 DXR은 C. 아우토에타노게눔으로부터 유래되고 서열 식별 번호: 3에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 효소 2-C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트 시티딜트랜스퍼라제 IspD는 C. 아우토에타노게눔으로부터 유래되고 서열 식별 번호: 5에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 효소 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나제 IspE는 C. 아우토에타노게눔으로부터 유래되고 서열 식별 번호: 7에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 효소 2-C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트 합성효소 IspF는 C. 아우토에타노게눔으로부터 유래되고 서열 식별 번호: 9에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 효소 4-하이드록시-3-메틸부트-2-엔-1-일 디포스페이트 합성효소 IspG는 C. 아우토에타노게눔으로부터 유래되고 서열 식별 번호: 11에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 효소 4-하이드록시-3-메틸부트-2-에닐 디포스페이트 환원효소는 C. 아우토에타노게눔으로부터 유래되고 서열 식별 번호: 13에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 효소 메발로네이트 키나제(MK)는 스타필로콕쿠스 아우레우스 아종 아우레우스 Mu50으로부터 유래되고 이하 서열 식별 번호: 51에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 효소 포스포메발로네이트 키나제(PMK)는 스타필로콕쿠스 아우레우스 아종 아우레우스 Mu50으로부터 유래되고 이하 서열 식별 번호: 52에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 효소 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제(PMD)는 스타필로콕쿠스 아우레우스 아종 아우레우스 Mu50으로부터 유래되고 이하 서열 식별 번호: 53에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 효소 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성질화효소(idi)는 클로스트리디움 베이예린키이로부터 유래되고, 이하 서열 식별 번호: 54에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 효소 티올라제(thIA)는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824로부터 유래되고 이하 서열 식별 번호: 40에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 효소는 티올라제 효소이고, 스타필로콕쿠스 아우레우스 아종 아우레우스 Mu50으로부터 유래된 아세틸-CoA c-아세틸트랜스퍼라제(vraB)이며, 이하 서열 식별 번호: 41에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 효소 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 합성효소(HMGS)는 스타필로코콕쿠스 아우레우스 아종 아우레우스 Mu50으로부터 유래되고 이하 서열 식별 번호: 42에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 효소 하이드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소(HMGR)는 스타필로콕쿠스 아우레우스 아종 아우레우스 Mu50으로부터 유래되고 이하 서열 식별 번호: 43에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 효소 제라닐트랜스트랜스퍼라제(ispA)는 대장균 균주K-12 하위균주MG1655로부터 유래되고 이하 서열 식별 번호: 56에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 효소 헵타프레닐 디포스페이트 합성효소는 C. 아우토에타노게눔으로부터 유래되고 서열 식별 번호: 17에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 효소 폴리프레닐 합성효소는 C. 아우토에타노게눔으로부터 유래되고 서열 식별 번호: 19에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 효소 알파-파르네센 합성효소(FS)는 말루스 x 도메스티카로부터 유래되고 이하 서열 식별 번호: 57에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
미생물에 사용되는 효소 및 기능적 변이체는 통상의 기술자에 공지된 검정에 의해 식별될 수 있다. 특정 구현예에서, 효소 이소프렌 합성효소는 문헌[Silver et al. (1991, Plant Physiol. 97: 1588-1591)] 또는 문헌[Zhao et al. (2011, Appl Microbiol Biotechnol, 90:1915-1922)]에 개략된 방법에 의해 식별될 수 있다. 추가 특정 구현예에서, 효소 파르네센 합성효소는 문헌[Green et al., 2007, Phytochemistry; 68:176-188]에 개략된 방법에 의해 식별될 수 있다. 추가 특정 구현예에서, 메발로네이트 경로로부터 유래한 효소는 문헌[Cabano et al. (1997, Insect Biochem. Mol. Biol. 27: 499-505)](HMG-CoA 합성효소의 경우), 문헌[Ma et al. (2011, Metab. Engin., 13:588-597)](HMG-CoA 환원효소 및 메발로네이트 키나제 효소의 경우), 문헌[Herdendorf and Miziorko (2007, Biochemistry, 46: 11780-8)](포스포메발로네이트 키나제의 경우) 및 문헌[Krepkiy et al. (2004, Protein Sci. 13: 1875-1881)](메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제의 경우)에 의해 개략된 방법에 의해 식별될 수 있다. (문헌[Ma et al., 2011, Metab. Engin., 13:588-597.]) DXS 경로의 1-데옥시-D-자일룰로스 5-포스페이트 합성효소는 문헌[Kuzuyama et al. (2000, J. Bacteriol. 182, 891-897)]에 개략된 방법을 사용하여 검정될 수 있다. 또한, Trutko 등에 의해 설명된 바와 같이 포스미도마이신 또는 메비놀린과 같은 억제제를 사용하여 DXS 및 메발로네이트 경로의 유전자를 식별하는 것이 가능하다(문헌[Trutko et al. (2005, Microbiology 74: 153-158]).
일 구현예에서, 미생물은 하나 이상의 내인성 핵산의 발현을 증가시키도록 구성되는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 하나 이상의 내인성 핵산은 전술한 효소 중 하나 이상을 코딩한다. 일 구현예에서, 발현을 증가시키도록 구성되는 하나 이상의 외인성 핵산은 조절 요소이다. 일 구현예에서, 조절 요소는 프로모터이다. 일 구현예에서, 프로모터는 바람직하게는 적절한 발효 조건 하에서 매우 활성인 구성적 프로모터이다. 유도성 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 프로모터는 우드-륭달 유전자 클러스터 또는 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 오페론 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택된다. 발현, 바람직하게는, 적절한 발효 조건 하에서 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 다른 프로모터는 예시적인 구현예에 대한 대안으로서 효과적일 것임을 통상의 기술자는 이해할 것이다.
일 구현예에서, 미생물은 전술한 효소 중 하나 이상을 코딩하고 이를 발현하도록 구성되는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 미생물은 적어도 2개의 효소를 코딩하고 이를 발현하도록 구성되는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다. 다른 구현예에서, 미생물은 효소 중 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 이상을 코딩하고 발현하도록 구성되는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다.
하나의 특정 구현예에서, 미생물은 본 개시의 효소 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다.
미생물은 하나 이상의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 2개 이상의 유전적 요소(예컨대 유전자 또는 조절 요소(예를 들어, 프로모터))로 모 미생물을 형질전환시키는 것이 바람직한 경우, 이들은 하나 이상의 외인성 핵산에 함유될 수 있다.
일 구현예에서, 하나 이상의 외인성 핵산은 핵산 작제물 또는 벡터이고, 특정 일 구현예에서, 임의의 조합의 전술한 효소 중 하나 이상을 코딩하는 플라스미드이다.
외인성 핵산은 모 미생물의 형질전환 시 염색체외로 유지될 수 있거나 모 미생물의 게놈 내로 통합될 수 있다. 따라서, 이들은 염색체외 작제물(예를 들어, 복제 기점, 프로모터 및 다른 조절 요소 또는 서열)의 통합(예를 들어, 상동성 재조합 및 숙주 게놈 내로의 표적화된 통합을 허용하는 영역) 또는 발현 및 복제를 보조하도록 구성되는 추가 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 전술한 바와 같은 하나 이상의 효소를 코딩하는 외인성 핵산은 외인성 핵산에 의해 코딩되는 하나 이상의 효소의 발현을 촉진하도록 구성되는 프로모터를 추가로 포함할 것이다. 일 구현예에서, 프로모터는 바람직하게는 적절한 발효 조건 하에서 매우 활성인 구성적 프로모터이다. 유도성 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 프로모터는 우드-륭달 유전자 클러스터 및 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택된다. 발현, 바람직하게는, 적절한 발효 조건 하에서 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 다른 프로모터는 예시적인 구현예에 대한 대안으로서 효과적일 것임을 통상의 기술자는 이해할 것이다.
일 구현예에서, 외인성 핵산은 발현 플라스미드이다.
일 특정 구현예에서, 모 미생물은 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아의 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 박테리아는 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이, 클로스트리디움 라그스달레이, 클로스트리디움 카르복시디보란스, 클로스트리디움 드라케이, 클로스트리디움 스카톨로게네스, 클로스트리디움 아세티쿰, 클로스트리디움 포르미코아세티쿰, 클로스트리디움 마그눔, 부티리박테리디움 메틸로트로피쿰, 아세토박테리움 우디이, 알칼리바쿨룸 박키이, 블라우티아 프로덕타, 유박테리움 리모숨, 무렐라 테르모아세티카, 무렐라 테르마우토트로피카, 스포로무사 오바타, 스포로무사 실바세티카, 스포로무사 스패로이데스, 옥소박터 펜니기이, 및 테르모아내로박터 키부이를 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 특정 구현예에서, 모 미생물은 C. 아우토에타노게눔, C. 륭달리이 및 C. 라그스달레이 종 및 관련 단리물을 포함하는 에탄올생성 아세트산생성 클로스트리디아의 클러스터로부터 선택된다. 이들은 균주 C. 아우토에타노게눔 JAI-1T(DSM10061)(문헌[Abrini J, Naveau H, Nyns E-J: Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Arch Microbiol 1994, 4: 345-351]), C. 아우토에타노게눔 LBS1560(DSM19630)(문헌[Simpson SD, Forster RL, Tran PT, Rowe MJ, Warner IL: Novel bacteria and methods thereof. 국제 특허 2009, WO/2009/064200]), C. 아우토에타노게눔 LBS1561(DSM23693), C. 륭달리이 PETCT(DSM13528 = ATCC 55383)(문헌[Tanner RS, Miller LM, Yang D: Clostridium ljungdahlii sp. nov., an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I. Int J Syst Bacteriol Bacteriol 1993, 43: 232-236]), C. 륭달리이 ERI-2(ATCC 55380)(문헌[Gaddy JL: Clostridium stain which produces acetic acid from waste gases. US 특허 1997, 5,593,886]), C. 륭달리이 C-01(ATCC 55988)(문헌[Gaddy JL, Clausen EC, Ko C-W: Microbial process for the preparation of acetic acid as well as solvent for its extraction from the fermentation broth. US 특허, 2002, 6,368,819]), C. 륭달리이 O-52(ATCC 55989)(문헌[Gaddy JL, Clausen EC, Ko C-W: Microbial process for the preparation of acetic acid as well as solvent for its extraction from the fermentation broth. US 특허, 2002, 6,368,819]), C. 라그스달레이 P11T(ATCC BAA-622)(문헌[Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: Isolation and Characterization of novel Clostridial Species. 국제 특허 2008, WO 2008/028055]), 관련 단리물, 예컨대, "C. 코스카티이"(문헌[Zahn et al - Novel ethanologenic species Clostridium coskatii (US 특허 출원 제US20110229947호)]) 및 "클로스트리디움 종" (문헌[Tyurin et al., 2012, J. Biotech Res. 4: 1-12]) 또는 돌연변이화된 균주, 예컨대, C. 륭달리이 OTA-1(문헌[Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii. PhD thesis, North Carolina State University, 2010])를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이들 균주는 클로스트리듐 rRNA 클러스터 I 내에 서브클러스터를 형성하고 이들의 16S rRNA 유전자는 약 30%의 유사한 낮은 GC 함량으로 99%를 초과하여 동일하다. 그러나, DNA-DNA 재결합 및 DNA 지문분석 실험은 이들 균주가 구별되는 종에 속한다는 것을 나타내었다(문헌[Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: Isolation and Characterization of novel Clostridial Species. 국제 특허 2008, WO 2008/028055]).
이러한 클러스터의 모든 종은 유사한 형태 및 크기를 가지고(대수 성장 세포는 0.5~0.7 x 3~5 μm임), 중온성이며(최적 성장 온도는 30 내지 37°C임), 엄격하게 혐기성이다(문헌[Tanner RS, Miller LM, Yang D: Clostridium ljungdahlii sp. nov., an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I. Int J Syst Bacteriol Bacteriol 1993, 43: 232-236; Abrini J, Naveau H, Nyns E-J: Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Arch Microbiol 1994, 4: 345-351; Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: Isolation and Characterization of novel Clostridial Species. 국제 특허 2008, WO 2008/028055]). 또한, 이들은 모두 동일한 주요 계통유전적 형질, 예컨대, 동일한 pH 범위(pH 4 내지 7.5, 최적의 초기 pH가 5.5 내지 6임), 유사한 성장 속도를 갖는 CO 함유 기체 상의 강한 자가영양성 성장 및 주 발효 최종 생성물로서 에탄올 및 아세트산을 갖는 유사한 대사 프로파일 및 특정 조건 하에서 형성된 소량의 2,3-부탄디올 및 락트산을 공유한다. (문헌[Tanner RS, Miller LM, Yang D: Clostridium ljungdahlii sp. nov., an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I. Int J Syst Bacteriol Bacteriol 1993, 43: 232-236; Abrini J, Naveau H, Nyns E-J: Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Arch Microbiol 1994, 4: 345-351; Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: Isolation and Characterization of novel Clostridial Species. 국제 특허 2008, WO 2008/028055]). 인돌 생성은 또한 3개의 종 모두에서 관찰되었다. 그러나, 해당 종은 다양한 당(예를 들어, 람노스, 아라비노스), 산(예를 들어, 글루코네이트, 시트레이트), 아미노산(예를 들어, 아르기닌, 히스티딘) 및 다른 기질(예를 들어, 베타인, 부탄올)의 기질 활용 면에서 상이하다. 또한, 일부 종은 특정 비타민(예를 들어, 티아민, 비오틴)에 대한 영양요구성인 것으로 밝혀진 반면 다른 종은 그렇지 않았다.
일 구현예에서, 모 일산화탄소영양 아세트산생성 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이, 클로스트리디움 라그스달레이, 클로스트리디움 카르복시디보란스, 클로스트리디움 드라케이, 클로스트리디움 스카톨로게네스, 부티리박테리움 리모숨, 부티리박테리움 메틸로트로피쿰, 아세토박테리움 우디이, 알칼리바쿨룸 박키이, 블라우티아 프로덕타, 유박테리움 리모숨, 무렐라 테르모아세티카, 무렐라 테르마우토트로피카, 옥소박터 펜니기이 및 테르모아내로박터 키부이로 구성되는 군으로부터 선택된다.
제1 또는 제2 양태의 일 특정 구현예에서, 모 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이, 클로스트리디움 라그스달레이, 클로스트리디움 카르복시디보란스, 클로스트리디움 드라케이, 클로스트리디움 스카톨로게네스, 클로스트리디움 아세티쿰, 클로스트리듐 포르미코아세티쿰, 클로스트리디움 마그눔을 포함하는 일산화탄소영양 클로스트리디아의 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 미생물은 종 C. 아우토에타노게눔, C. 륭달리이 및 "C. 라그스달레이" 및 관련 단리물을 포함하는 일산화탄소영양 클로스트리디아의 클러스터로부터 선택된다. 이는 균주 C. 아우토에타노게눔 JAI-1T(DSM10061)(문헌[Abrini, Naveau, & Nyns, 1994]), C. 아우토에타노게눔 LBS1560(DSM19630)(WO/2009/064200), C. 아우토에타노게눔 LBS1561(DSM23693), C. 륭달리이 PETCT(DSM13528 = ATCC 55383)(문헌[Tanner, Miller, & Yang, 1993]), C. 륭달리이 ERI-2(ATCC 55380)(US 특허 5,593,886), C. 륭달리이 C-01(ATCC 55988)(US 특허 6,368,819), C. 륭달리이 O-52(ATCC 55989)(US 특허 6,368,819) 또는 "C. 라그스달레이 P11T"(ATCC BAA-622)(WO 2008/028055) 및 관련 단리물, 예컨대, "C. 코스카티이"(US 미국 2011/0229947), "클로스트리디움 종MT351"(문헌[Michael Tyurin & Kiriukhin, 2012]) 및 이들의 돌연변이체 균주, 예컨대, C. 륭달리이 OTA-1(문헌[Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii. PhD thesis, North Carolina State University, 2010])을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
이들 균주는 DNA-DNA 재결합 및 DNA 지문분석 실험에 의해 결정된 바와 같이(WO 2008/028055, US 특허 2011/0229947) 구별되는 종이지만, 16S rRNA 유전자 수준에서 적어도 99% 동일성을 갖는 클로스트리디움 rRNA 클러스터 I(문헌[Collins et al., 1994]) 내에 서브클러스터를 형성한다.
이러한 클러스터의 균주는 유사한 유전자형 및 표현형 둘 모두를 갖는 공통 특성에 의해 정의되며 이들은 모두 동일한 에너지 보존 및 발효 대사 방식을 공유한다. 이러한 클러스터의 균주는 시토크롬이 결여되어 있고 Rnf 복합체를 통해 에너지를 보존한다.
이러한 클러스터의 모든 균주는 약 4.2 MBp의 게놈 크기(문헌[Kφpke et al., 2010]) 및 약 32 %mol의 GC 조성(문헌[Abrini et al., 1994]; 문헌[Kφpke et al., 2010]; 문헌[Tanner et al., 1993])(WO 2008/028055; US 특허 2011/0229947) 및 우드-륭달 경로의 효소(일산화탄소 탈수소효소, 포르밀-테트라하이드로폴레이트 합성효소, 메틸렌-테트라하이드로폴레이트 탈수소효소, 포르밀-테트라하이드로폴레이트 사이클로하이드롤라제, 메틸렌-테트라하이드로폴레이트 환원효소 및 일산화탄소 탈수소효소/아세틸-CoA 합성효소), 수소화효소, 포름산염 탈수소효소, Rnf 복합체(rnfCDGEAB), 피루브산염:페레독신 산화환원효소, 알데히드:페레독신 산화환원효소(문헌[Kφpke et al., 2010, 2011])를 코딩하는 보존된 필수적인 핵심 유전자 오페론을 갖는다. 기체 흡수를 담당하는 우드-륭달 경로 유전자의 조직 및 수는 핵산 및 아미노산 서열의 차이에도 불구하고 모든 종에서 동일한 것으로 밝혀졌다(문헌[Kφpke et al., 2011]).
균주는 모두 유사한 형태 및 크기를 가지고(대수 성장 세포는 0.5 내지 0.7 x 3 내지 5 μm임), 중온성이며(최적 성장 온도는 30 내지 37°C임), 엄격하게 혐기성이다(문헌[Abrini et al., 1994]; 문헌[Tanner et al., 1993])(WO 2008/028055). 또한, 이들은 모두 동일한 주요 계통유전적 형질, 예컨대, 동일한 pH 범위(pH 4 내지 7.5, 최적의 초기 pH가 5.5 내지 6임), 유사한 성장 속도를 갖는 CO 함유 기체 상의 강한 자가영양성 성장 및 주 발효 최종 생성물로서 에탄올 및 아세트산을 갖는 대사 프로파일을 공유하며, 특정 조건 하에서 형성된 소량의 2,3-부탄디올 및 락트산을 갖는다(문헌[Abrini et al., 1994]; 문헌[Kφpke et al., 2011]; 문헌[Tanner et al., 1993]). 그러나, 해당 종은 다양한 당(예를 들어, 람노스, 아라비노스), 산(예를 들어, 글루코네이트, 시트레이트), 아미노산(예를 들어, 아르기닌, 히스티딘) 및 다른 기질(예를 들어, 베타인, 부탄올)의 기질 활용 면에서 상이하다. 일부 종은 특정 비타민(예를 들어, 티아민, 비오틴)에 대한 영양요구성인 것으로 밝혀진 반면 다른 종은 그렇지 않았다. 카르복실산의 상응하는 알코올로의 환원은 이들 유기체의 범위에서 나타났다(문헌[Perez, Richter, Loftus, & Angenent, 2012]).
따라서, 설명되는 형질은 C. 아우토에타노게눔 또는 C. 륭달리이와 같은 하나의 유기체에 특이적이지 않고, 오히려 일산화탄소영양 에탄올 합성 클로스트리디아에 대한 일반적인 형질이다. 따라서, 본 개시는 성능에 차이가 있을 수 있으나 이들 계통에 걸쳐 작용할 것으로 예상될 수 있다.
본 개시의 재조합 일산화탄소영양 아세트산생성 미생물은 재조합 미생물을 생성하기 위해 당해 기술분야에 공지된 임의의 수의 기법을 사용하여 모 일산화탄소영양 아세트산생성 미생물 및 하나 이상의 외인성 핵산으로부터 제조될 수 있다. 단지 예로서, (형질도입 또는 형질감염을 포함하는) 형질전환은 전기천공, 전기융합, 초음파처리, 폴리에틸렌 글리콜-매개 형질전환, 접합 또는 화학적 또는 천연 적격에 의해 달성될 수 있다. 적합한 형질전환 기법은 예를 들어, 문헌[Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, 1989]에 설명되어 있다.
전기천공은 C. 륭달리이(문헌[Kφpke et al., 2010]; 문헌[Leang, Ueki, Nevin, & Lovley, 2012])(PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), C. 아우토에타노게눔(PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), 아세토박테리움 우디이(문헌[Strδtz, Sauer, Kuhn, & D
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rre, 1994]) 또는 무렐라 테르모아세티카(문헌[Kita et al., 2012])와 같은 여러 일산화탄소영양 아세토겐에 대해 설명되었으며 많은 클로스트리디아, 예컨대, C. 아세토부틸리쿰(문헌[Mermelstein, Welker, Bennett, & Papoutsakis, 1992]), C. 셀룰로리티쿰(문헌[Jennert, Tardif, Young, & Young, 2000]) 또는 C. 테르모셀룸(문헌[MV Tyurin, Desai, & Lynd, 2004])에서 사용되는 표준 방법이다.
전기융합은 아세트산생성 클로스트리듐 종 MT351에 대해 설명되었다(문헌[Tyurin and Kiriukhin, 2012]).
C. 스카톨로게네스의 경우, 일산화탄소영양 아세토겐에 대해서도 프로파지 Prasanna Tamarapu Parthasarathy 유도가 설명되었다(문헌[2010, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project Western Kentucky University]).
접합은 아세토겐 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)(문헌[Herbert, O'Keeffe, Purdy, Elmore, & Minton, 2003]) 및 C. 아세토부틸리쿰(문헌[Williams, Young, & Young, 1990])을 포함하는 많은 다른 클로스트리디아에 대한 선택 방법으로서 설명되었다.
일 구현예에서, 모 균주는 CO를 유일한 탄소 및 에너지 공급원으로서 사용한다.
일 구현예에서, 모 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노게눔 또는 클로스트리디움 륭달리이이다. 특정 일 구현예에서, 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노게눔 DSM23693이다. 또 다른 특정 구현예에서, 미생물은 클로스트리디움 륭달리이 DSM13528(또는 ATCC55383)이다.
핵산
본 개시는 또한 본 개시의 재조합 미생물을 생성하는 데 사용되는 하나 이상의 핵산 또는 핵산 작제물을 제공한다.
일 구현예에서, 핵산은 미생물에서 발현되는 경우 미생물이 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체를 생성할 수 있게 하는 메발로네이트(MVA) 경로 및 선택적으로 DXS 경로 내의 효소 중 하나 이상을 코딩하는 서열을 포함한다. 일 특정 구현예에서, 본 개시는 미생물에서 발현되는 경우 미생물이 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체를 생성할 수 있게 하는 2개 이상의 효소를 코딩하는 핵산을 제공한다. 일 구현예에서, 본 개시의 핵산은 이러한 효소 중 3개, 4개, 5개 이상을 코딩한다.
일 구현예에서, 핵산에 의해 코딩되는 하나 이상의 효소는 메발로네이트(MVA) 경로로부터 유래되며
a) 티올라제(EC 2.3.1.9),
b) HMG-CoA 합성효소(EC 2.3.3.10),
c) HMG-CoA 환원효소(EC 1.1.1.88),
d) 메발로네이트 키나제(EC 2.7.1.36),
e) 포스포메발로네이트 키나제(EC 2.7.4.2),
f) 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제(EC 4.1.1.33) 및
g) 이들 중 임의의 하나의 기능적으로 동등한 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
추가 구현예에서, 핵산에 의해 코딩되는 하나 이상의 선택적인 효소는 DXS 경로로부터 유래되며
a) 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 합성효소 DXS(EC:2.2.1.7),
b) 1-데옥시-D-자일룰로스 5-포스페이트 환원이성질화효소 DXR(EC:1.1.1.267),
c) 2-C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트 시티딜릴트랜스퍼라제 IspD(EC:2.7.7.60),
d) 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나제 IspE(EC:2.7.1.148),
e) 2-C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트 합성효소 IspF(EC:4.6.1.12),
f) 4-하이드록시-3-메틸부트-2-엔-1-일 디포스페이트 합성효소 IspG(EC:1.17.7.1),
g) 4-하이드록시-3-메틸부트-2-에닐 디포스페이트 환원효소(EC:1.17.1.2) 및
h) 이들 중 임의의 하나의 기능적으로 동등한 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
추가 구현예에서, 핵산은 테르펜 화합물 및/또는 이의 전구체의 생성을 초래하기 위해 발현되거나 과발현되는 하나 이상의 추가 효소를 코딩하며, 발현되는 외인성 효소 또는 과발현되는 내인성 효소는
a) 제라닐트랜스트랜스퍼라제 Fps(EC:2.5.1.10),
b) 헵타프레닐 디포스페이트 합성효소(EC:2.5.1.10),
c) 옥타프레닐-디포스페이트 합성효소(EC:2.5.1.90),
d) 이소프렌 합성효소(EC 4.2.3.27),
e) 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성질화효소(EC 5.3.3.2),
f) 파르네센 합성효소(EC 4.2.3.46 / EC 4.2.3.47) 및
g) 이들 중 임의의 하나의 기능적으로 동등한 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
각각의 위의 효소를 코딩하는 예시적인 아미노산 서열 및 핵산 서열이 본원에 제공되거나 전술한 바와 같이 GenBank로부터 수득될 수 있다. 그러나, 통상의 기술자는 본원에 포함된 정보, GenBank 및 다른 데이터베이스 및 유전자 코드와 관련하여 효소 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 코딩하는 대안적인 핵산 서열을 쉽게 이해할 것이다.
추가 구현예에서, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824로부터 유래된 티올라제(thIA)를 코딩하는 핵산은 이하 서열 식별 번호: 40에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
추가 구현예에서, 스타필로콕쿠스 아우레우스 아종 아우레우스 Mu50으로부터 유래된 아세틸-CoA c-아세틸트랜스퍼라제(vraB)인 티올라제를 코딩하는 핵산은 이하 서열 식별 번호: 41에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
추가 구현예에서, 스타필로콕쿠스 아우레우스 아종 아우레우스 Mu50으로부터 유래된 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 합성효소(HMGS)를 코딩하는 핵산은 이하 서열 식별 번호: 42에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
추가 구현예에서, 스타필로콕쿠스 아우레우스 아종 아우레우스 Mu50으로부터 유래된 하이드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소(HMGR)를 코딩하는 핵산은 이하 서열 식별 번호: 43에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
추가 구현예에서, 스타필로콕쿠스 아우레우스 아종 아우레우스 Mu50으로부터 유래된 메발로네이트 키나제(MK)를 코딩하는 핵산은 이하 서열 식별 번호: 51에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
추가 구현예에서, 스타필로콕쿠스 아우레우스 아종 아우레우스 Mu50으로부터 유래된 포스포메발로네이트 키나제(pMK)를 코딩하는 핵산은 이하 서열 식별 번호: 52에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
추가 구현예에서, 스타필로콕쿠스 아우레우스 아종 아우레우스 Mu50으로부터 유래된 메발로네이트 디포스포네이트 데카르복실라제(PMD)를 코딩하는 핵산은 이하 서열 식별 번호: 53에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
추가 구현예에서, C. 아우토에타노게눔으로부터 유래된 데옥시자일룰로스 5-포스페이트 합성효소를 코딩하는 핵산은 이하 서열 식별 번호: 1에 예시된 핵산 서열 및/또는 서열 식별 번호: 2에 예시된 아미노산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 환원이성질화효소 DXR(EC:1.1.1.267)을 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 3의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 2-C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트 시티딜릴트랜스퍼라제 IspD(EC:2.7.7.60)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 5의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나제 IspE(EC:2.7.1.148)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 7의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 2-C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트 합성효소 IspF(EC:4.6.1.12)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 9의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 4-하이드록시-3-메틸부트-2-엔-1-일 디포스페이트 합성효소 IspG(EC:1.17.7.1)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 11의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 4-하이드록시-3-메틸부트-2-에닐 디포스페이트 환원효소(EC:1.17.1.2)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 13의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
추가 구현예에서, 대장균 균주K-12 하위균주MG1655로부터 유래되는 제라닐트랜스트랜스퍼라제(ispA)를 코딩하는 핵산은 이하 서열 식별 번호: 56에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 헵타프레닐 디포스페이트 합성효소를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 17의 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 폴리프레닐 합성효소인 옥타프레닐-디포스페이트 합성효소(EC:2.5.1.90)를 코딩하는 핵산은 서열 식별 번호: 19에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 포플러 트레물로이데스로부터 유래되는 이소프렌 합성효소(ispS)를 코딩하는 핵산은 이하 서열 식별 번호: 21에 예시되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
추가 구현예에서, 클로스트리디움 베이예린키이로부터 유래되는 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성질화효소(idi)를 코딩하는 핵산은 이하 서열 식별 번호: 54에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
추가 구현예에서, 말루스 x 도메스티카로부터 유래되는 알파-파르네센 합성효소(FS)를 코딩하는 핵산은 이하 서열 식별 번호: 57에 예시된 핵산 서열에 의해 코딩되거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에서, 본 개시의 핵산은 프로모터를 추가로 포함할 것이다. 일 구현예에서, 프로모터는 이의 조절 하에서 유전자의 구성적 발현을 가능하게 한다. 그러나, 유도성 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 통상의 기술자는 본 개시에서 사용되는 프로모터를 쉽게 이해할 것이다. 바람직하게는, 프로모터는 적절한 발효 조건 하에서 높은 수준의 발현을 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 우드-륭달 클러스터 프로모터가 사용된다. 또 다른 구현예에서, 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 프로모터가 사용된다. 다른 구현예에서, 피루브산염:페레독신 산화환원효소 프로모터, Rnf 복합체 오페론 프로모터 또는 ATP 합성효소 오페론 프로모터. 일 특정 구현예에서, 프로모터는 C. 아우토에타노게눔으로부터 유래한다.
본 개시의 핵산은 모 미생물의 형질전환 시 염색체외 핵산으로 유지될 수 있거나 미생물의 게놈 내로 통합되도록 구성될 수 있다. 따라서, 본 개시의 핵산은 염색체외 작제물(예를 들어, 복제 기점, 프로모터 및 다른 조절 서열)의 통합(예를 들어, 상동성 재조합 및 숙주 게놈 내로의 표적화된 통합을 허용하는 영역) 또는 발현 및 복제를 보조하도록 구성되는 추가 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 핵산은 핵산 작제물 또는 벡터이다. 일 특정 구현예에서, 핵산 작제물 또는 벡터는 발현 작제물 또는 벡터이나, 클로닝에 사용된 것들과 같은 다른 작제물 및 벡터가 본 개시에 포함된다. 특정 일 구현예에서, 발현 작제물 또는 벡터는 플라스미드이다.
본 개시의 발현 작제물/벡터는 프로모터에 더하여 임의의 수의 조절 요소뿐만 아니라 원하는 경우 추가 단백질의 발현에 적합한 추가 유전자를 함유할 수 있음을 이해할 것이다. 일 구현예에서, 발현 작제물/벡터는 하나의 프로모터를 포함한다. 다른 구현예에서, 발현 작제물/벡터는 2개 이상의 프로모터를 포함한다. 일 특정 구현예에서, 발현 작제물/벡터는 발현될 각 유전자에 대한 하나의 프로모터를 포함한다. 일 구현예에서, 발현 작제물/벡터는 발현될 각 유전자에 대한 하나 이상의 리보솜 결합 부위, 바람직하게는 리보솜 결합 부위를 포함한다.
통상의 기술자는 본원에 설명되는 핵산 서열 및 작제물/벡터 서열이 리보솜 결합 부위 및/또는 제한 부위에 필요한 것과 같은 표준 링커 뉴클레오티드를 함유할 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 링커 서열은 필요한 것으로 해석되어서는 안 되며 정의된 서열에 대한 제한을 제공하지 않는다.
본 개시의 발현 작제물/벡터를 포함하는 핵산 및 핵산 작제물은 당해 기술분야에서 표준인 임의의 수의 기법을 사용하여 작제될 수 있다. 예를 들어, 화학적 합성 또는 재조합 기법이 사용될 수 있다. 이러한 기법은 예를 들어, 문헌[Sambrook et al (Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)]에 설명되어 있다. 추가 예시적인 기법은 다음의 본원의 실시예 부분에서 설명된다. 본질적으로, 개별 유전자 및 조절 요소는 유전자가 발현되어 원하는 단백질을 형성할 수 있도록 서로 작동 가능하게 연결될 것이다. 본 개시에 사용하기에 적합한 벡터는 당업자에 의해 이해될 것이다. 그러나, 예로서, 다음의 벡터가 적합할 수 있다: pMTL80000 벡터, pIMP1, pJIR750 및 다음의 본원의 실시예 부분에서 예시된 플라스미드.
본 개시의 핵산은 RNA, DNA, 또는 cDNA를 포함하는 임의의 적절한 형태일 수 있음을 이해해야 한다.
본 개시는 또한 본원에 설명된 핵산 중 임의의 하나 이상을 포함하는 숙주 유기체, 특히 바이러스, 박테리아 및 효모를 포함하는 미생물을 제공한다.
유기체를 생성하는 방법
하나 이상의 외인성 핵산은 모 미생물에 노출 핵산으로서 전달될 수 있거나 형질전환 과정을 용이하게 하기 위해 하나 이상의 작용제(예를 들어, 핵산이 함유된 유기체인 리포좀-접합 핵산)으로 제형화될 수 있다. 하나 이상의 핵산은 적절하다면 DNA, RNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 제한 억제제는 특정 구현예에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Murray, N.E. et al. (2000) Microbial. Molec. Biol. Rev. 64, 412] 참조.
본 개시의 미생물은 재조합 미생물을 생성하기 위해 당해 기술분야에 공지된 임의의 수의 기법을 사용하여 모 미생물 및 하나 이상의 외인성 핵산으로부터 제조될 수 있다. 단지 예로서, 형질전환(형질도입 또는 형질감염을 포함함)은 전기천공, 초음파처리, 폴리에틸렌 글리콜-매개 형질전환, 화학적 또는 천연 적격, 또는 접합에 의해 달성될 수 있다. 적절한 형질전환 기법은, 예를 들어 문헌[Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbour, 1989]에 설명되어 있다.
특정 구현예에서, 형질전환될 미생물에서 활성인 제한 시스템으로 인해, 미생물 내로 도입될 핵산을 메틸화할 필요가 있다. 이는, 아래에서 설명하는 내용 및 이후 본원의 실시예 부분에서 추가로 예시되는 내용을 포함하는 다양한 기법을 사용하여 수행될 수 있다.
예로서, 일 구현예에서, 본 개시의 재조합 미생물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다:
a) (i) 본원에 설명된 바와 같은 발현 작제물/벡터 및 (ii) 메틸전이효소 유전자를 포함하는 메틸화 작제물/벡터의 셔틀 미생물 내로의 도입;
b) 메틸전이효소 유전자의 발현;
c) 셔틀 미생물로부터 하나 이상의 작제물/벡터의 단리; 및
d) 하나 이상의 작제물/벡터를 목적 미생물 내로 도입.
일 구현예에서, 단계 B의 메틸전이효소 유전자는 구성적으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, 단계 B의 메틸전이효소 유전자의 발현이 유도된다.
셔틀 미생물은 발현 작제물/벡터를 구성하는 핵산 서열의 메틸화를 용이하게 하는 미생물, 바람직하게는 제한 음성 미생물이다. 특정 구현예에서, 셔틀 미생물은 제한 음성 대장균, 바실러스 서브틸리스, 또는 락토콕쿠스 락티스이다.
메틸화 작제물/벡터는 메틸전이효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일단 발현 작제물/벡터 및 메틸화 작제물/벡터가 셔틀 미생물 내로 도입되면, 메틸화 작제물/벡터 상에 존재하는 메틸전이효소 유전자가 유도된다. 본 개시의 특정 일 구현예에서 메틸화 작제물/벡터는 유도성 lac 프로모터를 포함하고 락토오스 또는 이의 유사체, 보다 바람직하게는 이소프로필--D-티오-갈락토시드(IPTG)의 첨가에 의해 유도되지만, 유도는 임의의 적절한 프로모터 시스템에 의해 이루어질 수 있다. 다른 적절한 프로모터는 ara, tet, 또는 T7 시스템을 포함한다. 본 개시의 추가의 구현예에서, 메틸화 작제물/벡터 프로모터는 구성적 프로모터이다.
특정 구현예에서, 메틸화 작제물/벡터는, 메틸화 작제물/벡터 상에 존재하는 임의의 유전자가 셔틀 미생물에서 발현되도록 셔틀 미생물의 동일성에 특이적인 복제 기점을 갖는다. 바람직하게는, 발현 작제물/벡터는 목적 미생물의 동일성에 특이적인 복제 기점을 가지기 때문에, 발현 작제물/벡터 상에 존재하는 임의의 유전자는 목적 미생물에서 발현된다.
메틸전이효소의 발현은 발현 작제물/벡터 상에 존재하는 유전자의 메틸화를 초래한다. 그런 다음, 발현 작제물/벡터는 다수의 공지된 방법 중 어느 하나에 따라 셔틀 미생물로부터 단리될 수 있다. 단지 예로서, 후술하는 실시예 부분에 기술된 방법론은 발현 작제물/벡터를 단리하는 데 사용될 수 있다.
특정 일 구현예에서, 작제물/벡터 둘 모두는 동시에 단리된다.
발현 작제물/벡터는 임의의 수의 공지된 방법을 사용하여 목적 미생물 내로 도입될 수 있다. 그러나, 예로서, 이하에서 실시예 부분에 기술된 방법론이 사용될 수 있다. 발현 작제물/벡터가 메틸화되기 때문에, 발현 작제물/벡터 상에 존재하는 핵산 서열은 목적 미생물에 통합되고 성공적으로 발현될 수 있다.
메틸전이효소 유전자는 셔틀 미생물 내로 도입되고 과발현될 수 있는 것으로 예상된다. 따라서, 일 구현예에서, 생성된 메틸전이효소는 공지된 방법을 사용하여 수집되고 발현 플라스미드를 메틸화하도록 시험관 내에서 사용될 수 있다. 그런 다음, 발현 작제물/벡터는 발현을 위해 목적 미생물 내로 도입될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 메틸전이효소 유전자가 셔틀 미생물의 게놈 내로 도입된 다음, 발현 작제물/벡터가 셔틀 미생물 내로 도입되고, 하나 이상의 작제물/벡터가 셔틀 미생물로부터 단리된 다음, 발현 작제물/벡터는 목적 미생물 내로 도입된다.
위에서 정의된 바와 같은 발현 작제물/벡터 및 메틸화 작제물/벡터가 조합되어 물질의 조성을 제공할 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 조성물은 본 개시의 재조합 미생물을 생성하기 위한 제한 장벽 메커니즘을 우회하는 데 특히 유용하다.
특정 일 구현예에서, 발현 작제물/벡터 및/또는 메틸화 작제물/벡터들은 플라스미드이다.
당업자는 본 개시의 미생물을 생성하는 데 사용되는 다수의 적절한 메틸전이효소를 이해할 것이다. 그러나, 예로서, 바실러스 서브틸리스 파지 ΦT1 메틸전이효소 및 이후 본원의 실시예에 설명된 메틸전이효소가 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 메틸전이효소는 서열 식별 번호: 60의 아미노산 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다. 원하는 메틸전이효소의 서열 및 유전자 코드에 대한 적합한 메틸전이효소를 코딩하는 핵산이 용이하게 이해될 것이다. 일 구현예에서, 메틸전이효소를 코딩하는 핵산은 다음의 본원의 실시예에 설명된 것과 같다(예를 들어, 서열 식별 번호: 63의 핵산 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체임).
메틸전이효소 유전자의 발현을 허용하도록 구성된 임의의 수의 작제물/벡터가 메틸화 작제물/벡터를 생성하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 예로서, 이하에서 실시예 부분에 설명된 플라스미드가 사용될 수 있다.
생성 방법
본 개시는 본 개시의 재조합 미생물을 사용하여 CO를 포함하는 기질을 발효시키는 단계를 포함하는 미생물 발효에 의한 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체 및 선택적으로 하나 이상의 다른 생성물의 생성 방법을 제공한다. 바람직하게는, 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체는 주 발효 생성물이다. 본 개시의 방법은 산업 공정으로부터 총 대기 탄소 방출을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
바람직하게는, 발효는 본 개시의 재조합 미생물을 사용하여 적어도 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체를 생성하기 위해 생물반응기에서 기질을 혐기성 발효시키는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체는 메발론산, IPP, 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP), 이소프렌, 제라닐 피로포스페이트(GPP), 파르네실 피로포스페이트(FPP) 및 파르네센으로부터 선택된다.
테르페노이드 주요 중간체 IPP 및 DMAPP로부터 이소프렌을 직접 생성한 후 이를 사용하여 장쇄 테르펜을 합성하는 대신, 제라닐트랜스퍼라제를 통해 C10 모노테르페노이드 또는 C15 세스퀴테르페노이드와 같은 장쇄 테르펜을 직접 합성하는 것도 가능하다(표 6 참조). C15 세스퀴테르페노이드 빌딩 블록 파르네실-PP로부터, 에탄올과 유사하게 수송 연료로서 사용될 수 있는 파르네센을 생성하는 것이 가능하다.
일 구현예에서, 방법은
(a) CO를 포함하는 기질을 본 개시의 하나 이상의 미생물의 배양물을 함유하는 생물반응기에 제공하는 단계; 및
(b) 생물반응기에서 배양물을 혐기성 발효하여 적어도 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체를 생성하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 방법은
a) 산업 공정의 결과로서 생성된 CO 함유 기체를 포획하는 단계;
b) 본 개시의 하나 이상의 미생물을 함유하는 배양물에 의해 적어도 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체를 생성하기 위해 CO 함유 기체를 혐기성 발효하는 단계를 포함한다.
본 개시의 일 구현예에서, 미생물에 의해 발효된 기체 기질은 CO를 함유하는 기체 기질이다. 기체 기질은 산업 공정의 부산물로서 또는 일부 다른 공급원, 예를 들어 자동차 배기 매연으로부터 수득되는 CO-함유 폐기체일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 산업 공정은 철금속 제품 제조, 예를 들어 제철소, 비철 제품 제조, 석유 정제 공정, 석탄의 가스화, 전력 생산, 카본블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산, 코크스 제조로 구성된 군으로부터 선택된다. 이러한 구현예에서, CO 함유 기체는 대기 중으로 배출되기 전에 임의의 편리한 방법을 사용하여 산업 공정으로부터 포획될 수 있다. CO는 합성가스(일산화탄소 및 수소를 포함하는 기체)의 성분일 수 있다. 산업 공정으로부터 생성된 CO는 일반적으로 연소되어 CO2를 생성하며, 따라서 본 개시는 CO2 온실 기체 방출을 감소시키고 바이오연료로서 사용하기 위한 테르펜을 생성하는 데 특히 유용하다. 기체상 CO 함유 기질의 조성에 따라, 발효에 도입하기 전에 원하지 않는 불순물, 예컨대 먼지 입자를 제거하기 위해 이를 처리하는 것이 바람직할 수도 있다. 예를 들어, 기체 기질은 공지된 방법을 사용하여 여과되거나 스크럽될 수 있다.
박테리아의 성장 및 CO의 적어도 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체로의 전환을 위해, CO-함유 기질 기체에 더하여, 적합한 액체 영양 배지가 생물반응기에 공급될 필요가 있다는 점을 인식할 것이다. 기질 및 배지는 연속식, 배치식 또는 배치식 유가식 방식으로 생물반응기에 공급될 수 있다. 영양 배지는 사용되는 미생물의 성장을 허용하기에 충분한 비타민 및 무기질을 함유할 것이다. CO를 사용하여 테르펜 및/또는 이의 전구체를 생성하기 위한 발효에 적합한 혐기성 배지가 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 적합한 배지가 문헌[Biebel(2001)]에 설명되어 있다. 본 개시의 일 구현예에서, 배지는 아래의 실시예 부분에서 설명된 바와 같다.
발효는 바람직하게는 CO의 적어도 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체로의 발효가 발생하기 위한 적절한 조건 하에서 수행되어야 한다. 고려되어야 하는 반응 조건은 압력, 온도, 기체 유량, 액체 유량, 배지 pH, 배지 산화환원 전위, 교반 속도(연속 교반식 탱크 반응기를 사용하는 경우), 접종원 수준, 액상 중의 CO가 제한되지 않도록 하는 최대 기체 기질 농도 및 생성물 억제를 피하기 위한 최대 생성물 농도를 포함한다.
또한, 기질 스트림(또는 기체 기질 내의 CO 부분 압력)의 CO 농도를 증가시킴으로써, CO가 기질인 발효 반응의 효율을 증가시키는 것이 종종 바람직하다. 증가된 압력에서 작동하면 기상으로부터 액상으로 CO의 전달 속도가 유의하게 증가될 수 있고, 여기서 이는 적어도 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체를 생성하기 위해 미생물에 의해 탄소 공급원으로서 흡수될 수 있다. 이는, 결과적으로는, (생물반응기의 액체 부피를 유입 기체 유량으로 나눈 값으로 정의되는) 체류 시간이 생물반응기가 대기압보다 높은 압력에서 유지될 시 감소될 수 있다는 것을 의미한다. 최적 반응 조건은 부분적으로는 사용되는 본 개시의 특정 미생물에 따라 달라질 것이다. 그러나, 일반적으로, 대기압보다 높은 압력에서 발효를 진행하는 것이 바람직하다. 또한, 제공되는 CO의 적어도 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체의 전환 속도는 부분적으로는 기질 체류 시간의 함수이고 원하는 체류 시간의 달성이 결국 생물반응기의 필요한 부피를 좌우하기 때문에, 가압 시스템을 사용하면 생물반응기의 필요한 부피 및 결국 발효 장비의 자본 비용을 크게 감소시킬 수 있다. 미국 특허 제5,593,886호에 제공되는 실시예에 따르면, 반응기 부피는 반응기 작동 압력의 증가에 대해 선형 비율로 감소될 수 있으며, 즉, 10 압력 대기에서 작동되는 생물반응기는 1 압력 대기에서 작동되는 경우에서의 부피의 1/10만이 요구된다.
예로서, 승압에서 기체의 에탄올로의 발효를 수행하는 이점이 설명된 바 있다. 예를 들어, WO 02/08438은 각각 150 g/l/일 및 369 g/l/일의 에탄올 생산성을 제공하는, 30 psig 및 75 psig의 압력 하에서 수행되는 기체의 에탄올로의 발효를 기술한다. 그러나, 대기압에서 유사한 배지 및 투입 기체 조성물을 사용하여 수행된 예시적인 발효는 1일당 리터당 에탄올을 10 내지 20배 적게 생산하는 것으로 밝혀졌다.
또한, CO 함유 기체 기질의 도입 속도는 액상에서 CO의 농도가 제한되지 않도록 보장하는 속도인 것이 바람직하다. 이는, CO-제한된 조건의 결과는 하나 이상의 생성물이 배양에 의해 소비되는 것일 수 있기 때문이다.
발효 반응을 공급하기 위해 사용되는 기체 스트림의 조성은 해당 반응의 효율 및/또는 비용에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, O2는 혐기성 발효 공정의 효율을 감소시킬 수 있다. 발효 전 또는 후에 발효 공정의 단계에서 원치 않거나 불필요한 기체를 처리하면 이러한 단계에 대한 부담을 증가시킬 수 있다(예를 들어, 기체 스트림이 생물반응기에 들어가기 전 압축되는 경우, 불필요한 에너지를 사용해 발효에 필요하지 않은 기체를 압축할 수 있다). 따라서, 원하지 않는 성분을 제거하고 바람직한 성분의 농도를 증가시키기 위해 기질 스트림, 특히 산업 공급원으로부터 유래된 기질 스트림을 처리하는 것이 바람직할 수 있다.
소정의 구현예에서, 본 개시의 박테리아의 배양물은 수성 배양 배지에서 유지된다. 바람직하게는, 수성 배양 배지는 최소 혐기성 미생물 성장 배지이다. 적합한 배지는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제5,173,429호 및 제5,593,886호 및 제WO 02/08438호에 설명되어 있으며, 이는 이후 본원의 실시예 부분에서 설명된 바와 같다.
테르펜 및/또는 이의 전구체, 또는 하나 이상의 테르펜, 이의 전구체 및/또는 하나 이상의 다른 생성물을 함유하는 혼합 스트림은 예를 들어, 분별 증류 또는 증발, 투과증발, 기체 스트리핑 및 예를 들어, 액-액 추출을 포함하는 추출 발효와 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 발효 브로쓰로부터 회수될 수 있다.
본 개시의 특정 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 테르펜 및/또는 이의 전구체 및 하나 이상의 생성물은 발효 브로쓰의 일부를 생물반응기로부터 연속적으로 제거하고, 미생물 세포를 해당 브로쓰로부터 (편리하게는 여과에 의해) 분리하고, 하나 이상의 생성물을 해당 브로쓰로부터 회수함으로써 발효 브로쓰로부터 회수된다. 알코올은, 예를 들어, 증류에 의해 용이하게 회수될 수 있다. 아세톤은, 예를 들어, 증류에 의해 회수될 수 있다. 임의의 생성된 산은, 예를 들어, 활성탄 상에 흡착시킴으로써 회수될 수 있다. 분리된 미생물 세포는 바람직하게는 발효 생물반응기로 복귀한다. 임의의 알코올(들) 및 산(들)이 제거된 후 남은 무세포 투과액은 또한 바람직하게는 발효 생물반응기로 복귀한다. 생물반응기로 복귀되기 전에, 추가 영양소(예를 들어, 비타민 B)가 영양 배지를 보충하기 위해 무세포 투과액에 첨가될 수 있다.
또한, 아세트산의 활성탄으로의 흡착을 향상시키기 위해 위에서 설명한 바와 같이 브로쓰의 pH를 조정하는 경우, 발효 생물반응기 내 브로쓰의 pH와 유사한 pH로 pH를 재조정한 후, 생물반응기로 복귀시켜야 한다.
프레놀/이소프레놀 경로에 대한 효소(표 3):
실시예
본 개시는 이제 다음의 비제한적인 실시예를 참조하여 보다 상세히 설명될 것이다.
실시예 1 - CO로부터 이소프렌을 생성하기 위한 C. 아우토에타노게눔 에서 이소프렌 합성효소의 발현
본 발명자들은 C. 아우토에타노게눔 및 C. 륭달리이와 같은 일산화탄소영양 아세토겐에서 테르펜 생합성 유전자를 식별하였다. 재조합 유기체를 조작하여 이소프렌을 생성하였다. 이소프렌은 UV 방사선으로부터 잎을 보호하기 위해 포플러와 같은 일부 식물에 의해 자연적으로 방출된다. 포플러의 이소프렌 합성효소(EC 4.2.3.27) 유전자를 코돈 최적화하였으며 일산화탄소영양 아세토겐 C. 아우토에타노게눔에 도입하여 CO로부터 이소프렌을 생성하였다. 효소는 테르페노이드 생합성의 주요 중간체 DMAPP(디메틸알릴 디포스페이트)를 비가역적 반응으로 이소프렌으로 나아가게 한다(도 1).
균주 및 성장 조건:
모든 서브클로닝 단계는 위에서 설명한 바와 같이 표준 균주 및 성장 조건을 사용하여 대장균에서 수행하였다(문헌[Sambrook et al, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, 1989]; 문헌[Ausubel et al, Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons, Ltd., Hoboken, 1987]).
C. 아우토에타노게눔 DSM10061 및 DSM23693(DSM10061의 유도체)을 DSMZ(The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, 독일 38124 브라운슈바이크 인호펜스트라세 7 B 소재)로부터 수득하였다. 엄격하게 혐기성 조건 및 기법을 사용하여 37
Figure pct00013
에서 성장을 수행하였다(문헌[Hungate, 1969, Methods in Microbiology, vol. 3B. Academic Press, New York: 117-132]; 문헌[Wolfe, 1971, Adv. Microb. Physiol., 6: 107-146]). 효모 추출물이 없는 화학적으로 정의된 PETC 배지(표 1) 및 30 psi의 일산화탄소 함유 제철소 폐기체(뉴질랜드 글렌브룩(Glenbrook) 소재 New Zealand Steel 현장으로부터 수집함; 조성: 44% CO, 32% N2, 22% CO2, 2% H2)를 유일한 탄소 및 에너지 공급원으로서 사용하였다.
[표 1]
발현 플라스미드의 구축:
표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기법을 본 개시에서 사용하였다(문헌[Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, 1989]; 문헌[Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K: Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Ltd., Hoboken, 1987]). 포플러 트레물로이데스의 이소프렌 합성효소(AAQ16588.1; GI:33358229)를 코돈 최적화하였으며(서열 식별 번호: 21) 합성하였다. C. 아우토에타노게눔의 피루브산염:페레독신 산화환원효소의 프로모터 영역(서열 식별 번호: 22)을 사용하여 유전자를 발현시켰다.
클로스트리디움 아우토에타노게눔 DSM23693의 게놈 DNA를 문헌[Bertram and D
Figure pct00016
rre(1989)]에 의해 변형된 방법을 사용하여 단리하였다. 100-ml의 하룻밤 동안의 배양물을 수집하였고(6,000 x g, 15분, 4°C), 인산 칼륨 완충액(10 mM, pH 7.5)으로 세척하였으며, 1.9 ml STE 완충액(50 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, 200 mM 수크로스; pH 8.0)에 현탁시켰다. 300 μl 리소자임(약 100,000 U)을 첨가하였고, 혼합물을 37°C에서 30분 동안 배양한 후, 280 μl의 10%(w/v) SDS 용액을 첨가하였고, 10분 동안 추가로 배양하였다. 240 μl의 EDTA 용액(0.5 M, pH 8), 20 μl의 트리스-HCl(1 M, pH 7.5), 및 10 μl의 RNase A(Fermentas Life Sciences)를 첨가하여 실온에서 RNA를 분해하였다. 이후, 100 μl 단백질분해효소 K(0.5 U)를 첨가하였고, 1 내지 3시간 동안 37°C에서 단백질분해를 수행하였다. 마지막으로, 600 μl의 과염소산 나트륨(5 M)을 첨가한 후, 페놀-클로로포름 추출 및 이소프로판올 침전이 이어졌다. DNA 양 및 품질을 분광광도법으로 검사하였다. 피루브산염:페레독신 산화환원효소 프로모터 서열을 iProof High Fidelity DNA Polymerase(Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 올리고뉴클레오티드 Ppfor-NotI-F(서열 식별 번호 23: AAGCGGCCGCAAAATAGTTGATAATAATGC) 및 Ppfor-NdeI-R(서열 식별 번호 24: TACGCATATGAATTCCTCTCCTTTTCAAGC) 및 다음 프로그램을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다: 30초 동안 98°C에서 초기 변성, 이후 변성(10초 동안 98°C), 어닐링(30 내지 120초 동안 50 내지 62°C) 및 신장(30 내지 90초 동안 72°C)의 32회 사이클, 이후 최종 연장 단계(10분 동안 72°C).
이소프렌 합성효소 발현 플라스미드의 구축:
발현 플라스미드의 구축은 대장균 DH5α-T1R(Invitrogen) 및 XL1-Blue MRF' Kan(Stratagene)에서 수행하였다. 제1 단계에서, 증폭된 Ppfor 프로모터 영역을 대장균-클로스트리디움 셔틀 벡터 pMTL85141(FJ797651.1; Nigel Minton, University of Nottingham; 문헌[Heap et al., 2009])로 NotI 및 NdeI 제한 부위를 사용하여 클로닝하여 플라스미드 pMTL85146을 생성하였다. 제2 단계로서, ispS를 pMTL85146로 제한 부위 NdeI 및 EcoRI를 사용하여 클로닝하여 플라스미드 pMTL 85146-isp(도 2, 서열 식별 번호: 25)를 생성하였다.
C. 아우토에타노게눔에서의 형질전환 및 발현
형질전환 전, 미국 특허 제2011/0236941호에 설명된 바와 같이 C. 아우토에타노게눔, C. 라그스달레이 및 C. 륭달리이의 메틸전이효소 유전자로부터 설계된 메틸화 플라스미드(서열 식별 번호: 64) 상에서 공동 발현된 합성 하이브리드 제II형 메틸전이효소(서열 식별 번호: 63)를 사용하여 대장균에서 생체내에서 DNA를 메틸화하였다.
발현 플라스미드 및 메틸화 플라스미드 둘 모두를 제한 음성 대장균 XL1-Blue MRF' Kan(Stratagene)의 동일한 세포로 형질전환시켰으며, 이는 이들의 양립성 그람-(-) 복제 기점(발현 플라스미드에서의 고 복제 ColE1 및 메틸화 플라스미드에서의 저 복제 p15A)으로 인해 가능하다. 생체내 메틸화를 1 mM의 IPTG의 첨가로 유도하였으며, 메틸화된 플라스미드를 QIAGEN 플라스미드 Midi 키트(QIAGEN)를 사용하여 단리하였다. 생성된 혼합물을 C. 아우토에타노게눔 DSM23693을 사용하는 형질전환 실험에 사용하였으나, 풍부한 (고 복제) 발현 플라스미드만이 그람-(+) 복제 기점(repL)을 가져 클로스트리디아에서 복제할 수 있다.
C. 아우토에타노게눔으로의 형질전환:
완전한 형질전환 실험 동안, C. 아우토에타노게눔 DSM23693을 탄소 공급원으로서 1 g/L 효모 추출물 및 10 g/l 프룩토스 및 30 psi의 제철소 폐기체(뉴질랜드 글렌브룩 소재 New Zealand Steel 현장으로부터 수집함; 조성: 44% CO, 32% N2, 22% CO2, 2% H2)가 보충된 PETC 배지(표 1)에서 성장시켰다.
적합한 세포를 제조하기 위해, 50 ml의 C. 아우토에타노게눔 DSM23693 배양물을 3일 연속으로 신선한 배지에 계대배양하였다. 이들 세포를 사용하여 0.05의 OD600 nm에서 40 mM DL-트레오닌을 함유하는 50 ml PETC 배지를 접종하였다. 배양물이 0.4의 OD600 nm에 도달한 경우, 세포를 혐기성 챔버 내로 이동시키고 4,700 x g 및 4°C에서 수집하였다. 배양물을 빙냉 전기천공 완충제(270 mM 수크로스, 1 mM MgCl2, 7 mM 인산 나트륨, pH 7.4)으로 2회 세척하였으며, 마지막으로 600 μl 부피의 신선한 전기천공 완충액에 현탁시켰다. 이 혼합물을 1 μg의 메틸화된 플라스미드 혼합물을 함유하는 0.4 cm 전극 갭을 갖는 사전 냉각 전기천공 큐베트 내로 이동시켰으며, Gene 펄서 Xcell 전기천공 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 2.5 kV, 600 Ω 및 25 μF의 설정으로 즉시 펄스화하였다. 3.7 내지 4.0 ms의 시간 상수를 달성하였다. 배양물을 5 ml의 신선한 배지로 이동시켰다. 튜브 홀더가 장착된 Spectronic Helios Epsilon Spectrophotometer(Thermo)를 사용하여 600 nm의 파장에서 세포의 재생을 모니터링하였다. 바이오매스의 초기 적가 후, 세포는 다시 성장하기 시작하였다. 바이오매스가 해당 지점으로부터 2배가 되면, 세포를 수집하였고, 200 μl의 신선한 배지에 현탁시켰으며, 적절한 항생제 4 μg/ml 클라리트로마이신 또는 15 μg/ml 티암페니콜과 함께 선택적 PETC 플레이트(1.2 % Bacto?? Agar(BD) 함유)에 플레이팅하였다. 37°C에서 30 psi 제철소 기체를 4 내지 5일 접종한 후, 콜로니를 볼 수 있었다.
콜로니를 사용하여 항생제가 함유된 2 ml PETC 배지에 접종하였다. 성장이 발생한 경우, 배양물을 5 ml의 부피로 확장하였고, 이후 30 psi의 제철소 기체를 유일한 탄소 공급원으로서 사용하여 50 ml로 확장하였다.
성공적인 형질전환 확인:
DNA 전달을 검증하기 위해, Zyppy 플라스미드 미니프렙 키트(Zymo)를 사용하여 10 ml 배양 부피로부터 플라스미드 미니 프렙을 수행하였다. 단리된 플라스미드의 품질은 클로스트리디움 엑소뉴클레아제 활성으로 인한 제한 분해에 충분하지 않았기 때문에(문헌[Burchhardt and D
Figure pct00017
rre, 1990]), 올리고뉴클레오티드 쌍 colE1-F(서열 식별 번호: 65: CGTCAGACCCCGTAGAAA) + colE1-R(서열 식별 번호: 66: CTCTCCTGTTCCGACCCT)을 갖는 단리된 플라스미드로 PCR을 수행하였다. 다음 조건으로 iNtRON Maximise Premix PCR 키트(Intron Bio Technologies)를 사용하여 PCR을 수행하였다: 2분 동안 94°C에서 초기 변성, 이후 변성(20초 동안 94°C), 어닐링(20초 동안 55°C) 및 신장(60초 동안 72°C)의 35회 사이클, 이후 최종 연장 단계(5분 동안 72°C).
클론의 동일성을 확인하기 위해, 50 ml의 C. 아우토에타노게눔 DSM23693 배양물로부터 게놈 DNA를 단리하였다(상기 참조). 올리고뉴클레오티드 fD1(서열 식별 번호: 67: ccgaattcgtcgacaacAGAGTTTGATCCTGGCTCAG) 및 rP2(서열 식별 번호: 68: cccgggatccaagcttACGGCTACCTTGTTACGACTT)(문헌[Weisberg et al., 1991]) 및 iNtRON Maximise Premix PCR 키트(Intron Bio Technologies)를 다음의 조건으로 사용하여 16s rRNA 유전자에 대해 PCR을 수행하였다: 2분 동안 94°C에서 초기 변성, 이후 변성(20초 동안 94°C), 어닐링(20초 동안 55°C) 및 신장(60초 동안 72°C)의 35회 사이클, 이후 최종 연장 단계(5분 동안 72°C). 서열분석 결과는 C. 아우토에타노게눔(Y18178, GI:7271109)의 16s rRNA 유전자(rrsA)에 대해 적어도 99.9% 동일성이었다.
이소프렌 합성효소 유전자의 발현
qRT-PCR 실험을 수행하여 C. 아우토에타노게눔에서 도입된 이소프렌 합성효소 유전자의 성공적인 발현을 확인하였다.
이소프렌 합성효소 플라스미드 pMTL 85146-ispS를 보유하는 배양물 및 플라스미드가 없는 대조군 배양물을 단독 에너지 및 탄소 공급원으로서 30 psi의 제철소 폐기체(뉴질랜드 글렌브룩 소재 New Zealand Steel 현장으로부터 수집함; 조성: 44% CO, 32% N2, 22% CO2, 2% H2)를 갖는 PETC 배지(표 1) 및 50 mL 혈청 병에서 성장시켰다. 약 0.5의 OD600 nm에서 대수 성장 단계 동안 0.8 mL 샘플을 취하여, 1.6 mL RNA 보호 시약(Qiagen)과 혼합하였다. 혼합물을 원심분리하였고(6,000 x g, 5분, 4°C), 세포 침전물을 액체 질소에서 급속 냉동시켰으며, RNA 추출 시까지 -80°C에서 보관하였다. 매뉴얼의 프로토콜 5에 따라 RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 총 RNA를 단리하였다. 혼합물을 주사기에 10회 통과시켜 세포의 파괴를 수행하였으며, 50 μL의 RNase/DNase-무함유 물에서 용리하였다. DNA-free?? 키트(Ambion)를 사용한 DNase I 처리 후, SuperScript III Reverse Transcriptase Kit(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 역전사 단계를 수행하였다. Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), Qubit Fluorometer(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 겔 전기영동으로 RNA를 확인하였다. 모든 올리고뉴클레오티드 쌍에 대해 비-RT 대조를 수행하였다. 모든 qRT-PCR 반응은 25 ng의 cDNA 주형, 67 nM의 각 올리고뉴클레오티드(표 2) 및 1x iQ?? SYBR® Green Supermix(Bio-Rad Laboratories, Carlsbad, CA, USA)를 갖는 15 μL의 총 반응 부피로 MyiQ?? Single Colour Detection System(Bio-Rad Laboratories, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 2회 수행하였다. 반응 조건은 3분 동안 95°C였으며, 95°C에서 15초 동안, 55°C에서 15초 동안 및 72°C에서 30초 동안의 40회의 사이클이 이어졌다. 올리고뉴클레오티드 이량체화 또는 증폭의 다른 아티팩트의 검출을 위해, qPCR(1°C/s로 58°C에서 95°C까지의 38회의 사이클)의 완료 직후에 용융 곡선 분석을 수행하였다. 정규화를 위해 각각의 cDNA 샘플에 대해 2개의 하우스키핑 유전자(구아닐레이트 키나제 및 포름산염 테트라하이드로폴레이트 리가제)를 포함시켰다. 상대 유전자 발현의 결정은 Relative Expression Software Tool(RESTⓒ) 2008 V2.0.7(38)을 사용하여 수행하였다. 4 로그 단위에 걸친 cDNA의 희석 시리즈를 사용하여 표준 곡선 및 생성된 증폭 효율을 생성하여 mRNA의 농도를 계산하였다.
[표 2] qRT-PCR용 올리고뉴클레오티드
증폭이 올리고뉴클레오티드 쌍 ispS를 사용하는 야생형 균주에서 관찰되지 않았으나, ispS 올리고뉴클레오티드 쌍을 갖는 신호가 플라스미드 pMTL 85146-ispS를 운반하는 균주에 대해 측정되었으며, 이는 ispS 유전자의 성공적인 발현을 확인하였다.
실시예 2 - 주요 테르펜 전구체 DMAPP(디메틸알릴 디포스페이트) 및 IPP(이소펜테닐 디포스페이트) 사이에서 전환하기 위한 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성질화효소의 발현
전구체 DMAPP(디메틸알릴 디포스페이트) 및 IPP(이소펜테닐 디포스페이트)의 가용성 및 균형은 테르펜의 생산에 중요하다. DXS 경로는 IPP 및 DMAPP 둘 모두를 동일하게 합성하지만, 메발로네이트 경로에서 유일한 생성물은 IPP이다. 이소프렌의 생성은 전구체 DMAPP만이 이소프렌 합성효소와 함께 존재할 것을 필요로 하는 반면, 고급 테르펜 및 테르페노이드의 생성을 위해, 제라닐트랜스퍼라제에 의해 제라닐-PP를 생성하는 데 이용 가능한 동일한 양의 IPP 및 DMAPP를 가질 필요가 있다.
이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성질화효소 발현 플라스미드의 구축:
이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성질화효소(YP_001310174.1)를 코딩하는 C. 베이예린키이(유전자 ID:5294264)로부터 유래한 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성질화효소 유전자 idi를 ispS의 하류에 클로닝하였다. C. 아우토에타노게눔에 대해 위에 설명한 바와 동일한 방법을 사용하여 수득한 C. 베이예린키이 NCIMB8052의 게놈 DNA로부터 올리고뉴클레오티드 Idi-Cbei-SacI-F (서열 식별 번호: 26: GTGAGCTCGAAAGGGGAAATTAAATG) 및 Idi-Cbei-KpnI-R(서열 식별 번호: 27: ATGGTACCCCAAATCTTTATTTAGACG)을 사용하여 유전자를 증폭시켰다. PCR 생성물을 SacI 및 KpnI 제한 부위를 사용하여 벡터 pMTL 85146-ispS에 클로닝하여 플라스미드 pMTL85146-ispS-idi(서열 식별 번호: 28)를 수득하였다. 항생제 내성 마커를 catP 에서 ermB(벡터 pMTL82254(FJ797646.1; Nigel Minton, University of Nottingham; 문헌[Heap et al., 2009])로부터 방출됨)로 제한 효소 PmeI 및 FseI를 사용하여 교환하여 플라스미드 pMTL85246-ispS-idi를 형성하였다(도 3).
C. 아우토에타노게눔에서의 형질전환 및 발현을 플라스미드 pMTL 85146-ispS에 대해 설명된 바와 같이 수행하였다. 성공적인 형질전환 후, 성장 실험을 50 mL 50 mL의 혈청 병 및 유일한 에너지 및 탄소 공급원으로서 30 psi의 제철소 폐기체(뉴질랜드 글렌브룩 소재 New Zealand Steel 현장으로부터 수집함; 조성: 44% CO, 32% N2, 22% CO2, 2% H2)를 갖는 PETC 배지(표 1)에서 수행하였다. 플라스미드가 성공적으로 도입되었음을 확인하기 위해, 이전에 설명한 바와 같이 형질전환체로부터 플라스미드 미니 프렙 DNA를 수행하였다. colE1(colE1-F: 서열 식별 번호: 65: CGTCAGACCCCGTAGAAA 및 colE1-R: 서열 식별 번호: 66: CTCTCCTGTTCCGACCCT), ermB(ermB-F: 서열 식별 번호: 106: TTTGTAATTAAGAAGGAG 및 ermB-R: 서열 식별 번호 107: GTAGAATCCTTCTTCAAC) 및 idi(Idi-Cbei-SacI-F: 서열 식별 번호 26: GTGAGCTCGAAAGGGGAAATTAAATG 및 Idi-Cbei-KpnI-R: 서열 식별 번호: 27: ATGGTACCCCAAATCTTTATTTAGACG)를 표적화하는 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용하는 단리된 플라스미드에 대한 PCR로 형질전환 성공을 확인하였다(도 8). 유사하게, 이들 형질전환체로부터 게놈 DNA를 추출하였으며, 올리고뉴클레오티드 fD1 및 rP2(상기 참조)를 사용하여 생성된 16s rRNA 앰플리콘은 C. 아우토에타노게눔(Y18178, GI:7271109)의 16S rRNA 유전자에 대한 99.9% 동일성을 확인해주었다.
이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성질화효소 유전자 idi에 대한 올리고뉴클레오티드 쌍(idi-F, 서열 식별 번호: 71: ATA CGT GCT GTA GTC ATC CAA GAT A 및 idiR, 서열 식별 번호: 72: TCT TCA AGT TCA CAT GTA AAA CCC A) 및 플라스미드 pMTL 85146-ispS-idi를 운반하는 C. 아우토에타노게눔을 사용한 혈청 병 성장 실험에서 유래한 샘플을 사용하여 위에서 설명한 바와 같이 유전자 발현의 성공적인 확인을 수행하였다. 이소프렌 합성효소 유전자 ispS에 대한 신호도 관찰되었다(도 14).
실시예 3 - DXS 경로의 과발현
DXS 경로를 통한 유동을 개선하기 위해, 경로의 유전자를 과발현하였다. 피루브산염 및 D-글리세르알데하이드-3-포스페이트(G3P)를 데옥시자일룰로스 5-포스페이트(DXP/DXPS/DOXP)로 전환하는 경로의 초기 단계는 데옥시자일룰로스 5-포스페이트 합성효소(DXS)에 의해 촉매된다.
DXS 과발현 발현 플라스미드의 구축:
위에서 다른 유전자에 대해 설명한 바와 같이, C. 아우토에타노게눔의 dxs 유전자를 올리고뉴클레오티드 Dxs-SalI-F(서열 식별 번호: 29: GCAGTCGACTTTATTAAAGGGATAGATAA) 및 Dxs-XhoI-R(서열 식별 번호 30: TGCTCGAGTTAAAATATATGACTTACCTCTG)로 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 이후, 증폭된 유전자를 SalI 및 XhoI를 갖는 플라스미드 pMTL85246-ispS-idi에 클로닝하여 플라스미드 pMTL85246-ispS-idi-dxs(서열 식별 번호: 31 및 도 4)를 생성하였다. 표 3에 주어진 올리고뉴클레오티드를 사용한 DNA 서열분석으로 돌연변이 없는 ispS, idi 및 dxs의 성공적인 클로닝을 확인하였다(도 5). ispS 및 idi 유전자는 각각 실시예 1 및 2에서 설명된 바와 같다.
[표 3]
서열분석을 위한 올리고뉴클레오티드
C. 아우토에타노게눔에서의 형질전환 및 발현
C. 아우토에타노게눔에서의 형질전환 및 발현을 플라스미드 pMTL 85146-ispS에 대해 설명된 바와 같이 수행하였다. 성공적인 형질전환 후, 성장 실험을 50 mL 50 mL의 혈청 병 및 유일한 에너지 및 탄소 공급원으로서 30 psi의 제철소 폐기체(뉴질랜드 글렌브룩 소재 New Zealand Steel 현장으로부터 수집함; 조성: 44% CO, 32% N2, 22% CO2, 2% H2)를 갖는 PETC 배지(표 1)에서 수행하였다. 유전자 발현의 확인은 OD600 nm = 0.75에서 수집된 샘플로부터 위에서 설명한 바와 같이 수행하였다. 올리고뉴클레오티드 쌍 dxs-F(서열 식별 번호: 73: ACAAAGTATCTAAGACAGGAGGTCA) 및 dxs-R(서열 식별 번호: 74: GATGTCCCACATCCCATATAAGTTT)을 사용하여 플라스미드 pMTL 85146-ispS-idi-dxs를 운반하는 균주 및 야생형 균주 모두에서 유전자 dxs의 발현을 측정하였다. 플라스미드를 운반하는 균주에서의 mRNA 수준은 야생형에 비해 3배 넘게 증가한 것으로 밝혀졌다(도 15). 바이오매스를 RNA 추출 전 정규화하였다.
실시예 4 - 메발로네이트 경로의 도입 및 발현
메발로네이트 경로의 제1 단계(도 7)는 아세틸-CoA의 2개의 분자를 아세토아세틸-CoA(및 HS-CoA)로 전환하는 티올라제에 의해 촉매된다. 이 효소는 동일한 발명자에 의해 일산화탄소영양 아세토겐 클로스트리디움 아우토에타노게눔 및 C. 륭달리이에서 성공적으로 발현되었다(US 특허 2011/0236941). 메발로네이트 경로의 나머지 유전자에 대한 작제물이 설계되었다.
메발로네이트 발현 플라스미드의 구축:
표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기법을 사용하였다(문헌[Sambrook, J., and Russell, D., Molecular cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed., Cold Spring Harbour Lab Press, Cold Spring Harbour, NY, 2001]). 메발로네이트 경로의 상부를 통한 메발로네이트 합성에 필요한 3개의 유전자, 즉, 티올라제(thlA/vraB), HMG-CoA 합성효소(HMGS) 및 HMG-CoA 환원효소(HMGR)를 오페론으로서 코돈 최적화하였다(Pptaack-thlA/vraB-HMGS-Patp-HMGR).
C. 아우토에타노게눔의 포스포트랜스아세틸라제/아세트산 키나제 오페론 프로모터(Ppta-ack)(서열 식별 번호: 61)를 티올라제 및 HMG-CoA 합성효소의 발현에 사용하였던 반면, C. 아우토에타노게눔의 ATP 합성효소(Patp)의 프로모터 영역을 HMG-CoA 환원효소의 발현에 사용하였다. 티올라제의 2개의 변이체, 즉, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 thlA 및 스타필로콕쿠스 아우레우스의 vraB를 합성하였으며, 추가 서브 클로닝을 위해 Nde I 및 EcoR I 제한 부위를 측접시켰다. HMG-CoA 합성효소(HMGS) 및 HMG-CoA 환원효소(HMGR) 둘 모두를 스타필로콕쿠스 아우레우스로부터 합성하였으며 추가 서브 클로닝을 위해 각각 EcoRI -SacI 및 KpnI -XbaI 제한 부위를 측접시켰다. 사용된 모든 최적화된 DNA 서열은 표 4에 제공된다.
[표 4]
메발로네이트 발현 플라스미드의 서열
하이드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소(HMGR)와 함께 ATP 합성효소 프로모터(P atp )를 올리고뉴클레오티드 pUC57-F(서열 식별 번호: 46: AGCAGATTGTACTGAGAGTGC) 및 pUC57-R(서열 식별 번호 47: ACAGCTATGACCATGATTACG) 및 pUC57- Patp-HMGR을 주형으로서 사용하여 증폭시켰다. 2033 bp의 증폭된 단편을 SacI 및 XbaI로 분해하였고 대장균-클로스트리디움 셔틀 벡터 pMTL 82151(FJ7976; Nigel Minton, University of Nottingham, UK; 문헌[Heap et al., 2009, J Microbiol Methods. 78: 79-85])에 결찰시켜 플라스미드 pMTL 82151-Patp-HMGR(서열 식별 번호: 76)을 생성하였다.
3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 합성효소(HMGS)를 올리고뉴클레오티드 EcoRI-HMGS_F(서열 식별 번호 77: AGCCGTGAATTCGAGGCTTTTACTAAAAACA) 및 EcoRI-HMGS_R(서열 식별 번호 78: AGGCGTCTAGATGTTCGTCTCTACAAATAATT)을 사용하여 코돈-합성 플라스미드 pGH-seq3.2로부터 증폭시켰다. 1391 bp의 증폭된 단편을 SacI 및 EcoRI로 분해하였으며 이전에 생성된 플라스미드 pMTL 82151-Patp-HMGR에 결찰시켜 pMTL 82151-HMGS-Patp-HMGR(서열 식별 번호: 79)을 수득하였다. 생성된 플라스미드 pMTL 82151-HMGS-Patp-HMGR(서열 식별 번호: 79) 및 Pptaack-thlA/vraB의 1768 bp의 코돈-최적화 오페론 모두를 Not I 및 EcoR I로 절단하였다. 결찰을 수행한 후 대장균 XL1-Blue MRF' Kan으로 형질전환시켜 플라스미드 pMTL8215- Pptaack-thlA/vraB-HMGS-Patp -HMGR(서열 식별 번호: 50)을 생성하였다.
메발로네이트 경로의 하단부를 통해 메발로네이트로부터 테르페노이드 주요 중간체, 즉, 메발로네이트 키나제(MK), 포스포메발로네이트 키나제(PMK), 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제(PMD), 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성질화효소(idi) 및 이소프렌 합성효소(ispS)를 합성하는 데 필요한 5개의 유전자를 ATG:Biosynthetics GmbH(Merzhausen, Germany)에서 코돈 최적화하였다. 메발로네이트 키나제(MK), 포스포메발로네이트 키나제(PMK) 및 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제(PMD)를 스타필로콕쿠스 아우레우스로부터 수득하였다.
C. 아우토에타노게눔의 RNF 복합체(Prnf)의 프로모터 영역(서열 식별 번호: 62)을 메발로네이트 키나제(MK), 포스포메발로네이트 키나제(PMK) 및 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제(PMD)의 발현에 사용하였던 반면, C. 아우토에타노게눔의 피루브산염:페레독신 산화환원효소(Pfor)의 프로모터 영역(서열 식별 번호: 22)을 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성질화효소(idi) 및 이소프렌 합성효소(ispS)의 발현에 사용하였다. 사용된 모든 DNA 서열은 표 5에 제공된다. 코돈 최적화된 Prnf-MK는 올리고뉴클레오티드 NotI-XbaI-Prnf-MK_F(서열 식별 번호: 80: ATGCGCGGCCGCTAGGTCTAGAATATCGATACAGATAAAAAAATATATAATACAG) 및 SalI-Prnf-MK_R(서열 식별 번호 81: TGGTTCTGTAACAGCGTATTCACCTGC)로 합성된 플라스미드 pGH- Prnf-MK-PMK-PMD로부터 증폭되었다. 이후, 증폭된 유전자를 NotI 및 SalI로 플라스미드 pMTL83145(서열 식별 번호: 49)에 클로닝하여 플라스미드 pMTL8314-Prnf-MK(서열 식별 번호: 82)를 생성하였다. 이어서, 이러한 생성된 플라스미드 및 2165 bp의 코돈 최적화된 단편 PMK-PMD를 SalI 및 HindIII로 분해하였다. 결찰을 수행하여 플라스미드 pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD(서열 식별 번호: 83)를 생성하였다.
메발로네이트 경로가 없는 이소프렌 발현 플라스미드는 제한 부위 AgeI 및 NheI가 측접한 이소프렌 합성효소(ispS)를 이전에 생성된 파르네센 플라스미드인 pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(서열 식별 번호: 91)에 결찰시켜 플라스미드 pMTL8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS(서열 식별 번호: 84)를 생성하였다. 최종 이소프렌 발현 플라스미드인 ppMTL 8314-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS(서열 식별 번호: 58, 도 10)는 제한 부위인 NotI 및 XbaI를 사용하여 pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS(서열 식별 번호: 84)와 pMTL8215- Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR(서열 식별 번호: 50)로부터 유래한 4630 bp의 Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR 단편을 결찰시켜 생성된다.
[표 5]
메발로네이트 경로로부터 유래한 이소프렌 발현 플라스미드의 서열
실시예 5 - 메발로네이트 경로를 통한 CO로부터의 파르네센의 생성을 위한 C. 아우토에타노게눔 에서의 파르네센 합성효소의 도입
테르페노이드 주요 중간체 IPP 및 DMAPP로부터 이소프렌을 직접 생성한 후 이를 사용하여 장쇄 테르펜을 합성하는 대신, 제라닐트랜스퍼라제를 통해 C10 모노테르페노이드 또는 C15 세스퀴테르페노이드와 같은 장쇄 테르펜을 직접 합성하는 것도 가능하다(표 6 참조). C15 세스퀴테르페노이드 빌딩 블록 파르네실-PP로부터, 에탄올과 유사하게 수송 연료로서 사용될 수 있는 파르네센을 생성하는 것이 가능하다.
파르네센 발현 플라스미드의 구축
메발로네이트 경로를 통한 IPP 및 DMAPP로부터의 파르네센 합성에 필요한 2개의 유전자, 즉, 제라닐트랜스트랜스퍼라제(ispA) 및 알파-파르네센 합성효소(FS)를 코돈 최적화하였다. 제라닐트랜스트랜스퍼라제(ispA)는 대장균 균주K-12 하위균주MG1655로부터 수득하였고, 알파-파르네센 합성효소(FS)는 말루스 x 도메스티카로부터 수득하였다. 사용된 모든 DNA 서열은 표 6에 제공된다. 코돈 최적화된 idi는 메발로네이트 경로 idi_F(서열 식별 번호: 86: AGGCACTCGAGATGGCAGAGTATATAATAGCAGTAG) 및 idi_R2(서열 식별 번호 87: AGGCGCAAGCTTGGCGCACCGGTTTATTTAAATATCTTATTTTCAGC)를 통해 합성된 플라스미드 pMTL83245-Pfor-FS-idi(서열 식별 번호: 85)로부터 증폭되었다. 이후, 증폭된 유전자를 XhoI 및 HindIII을 갖는 플라스미드 pMTL83245-Pfor에 클로닝하여 플라스미드 pMTL83245-Pfor-idi(서열 식별 번호: 88)를 생성하였다. 이후, 이러한 생성된 플라스미드 및 파르네센 합성효소(FS)의 1754 bp의 코돈 최적화된 단편을 HindIII 및 NheI로 분해하였다. 결찰을 수행하여 플라스미드 pMTL83245-Pfor-idi-FS(서열 식별 번호: 89)를 생성하였다. 이후, ispA의 946 bp의 단편 및 pMTL83245-Pfor-idi-FS를 AgeI 및 HindIII로 분해하고 결찰시켜 그에 따른 플라스미드 pMTL83245-Pfor-idi-ispA-FS(서열 식별 번호: 90)를 생성하였다. 상부 메발로네이트 경로가 없는 파르네센 발현 플라스미드는 pMTL83245-Pfor-idi-ispA-FS로부터의 Pfor-idi-ispA-FS의 2516bp의 단편을 pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD에 결찰시켜 플라스미드 pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(서열 식별 번호: 91)를 생성하였다. 최종 파르네센 발현 플라스미드 pMTL83145-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(서열 식별 번호: 59 및 도 18)는 pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(서열 식별 번호: 91)와 pMTL8215- Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR(서열 식별 번호: 50)로부터의 Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR의 4630 bp의 단편을 제한 부위 NotbaI 및 XbaI를 사용하여 결찰시켜 생성된다.
[표 6]
메발로네이트 경로로부터 유래한 파르네센 발현 플라스미드의 서열
C. 아우토에타노게눔으로의 형질전환
C. 아우토에타노게눔에서의 형질전환 및 발현을 실시예 1에 설명된 바와 같이 수행하였다.
성공적인 형질전환 확인
pMTL8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(서열 식별 번호 59)의 존재는 pMTL831xxx 시리즈 플라스미드 상에서 garm +ve perplicon의 일부 및 대부분의 cat 유전자를 선택적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 repHF(서열 식별 번호: 92:AAGAAGGGCGTATATGAAAACTTGT) 및 catR(서열 식별 번호: 93: TTCGTTTACAAAACGGCAAATGTGA)을 사용하여 콜로니 PCR로 확인하였다. 1584 bp의 밴드를 수득함(도 16).
C. 아우토에타노게눔에서의 하부 메발로네이트 경로의 발현
하부 메발로네이트 경로 유전자 메발로네이트 키나제(MK 서열 식별 번호: 51), 포스포메발로네이트 키나제(PMK 서열 식별 번호: 52), 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제(PMD 서열 식별 번호: 53), 이소펜틸-디포스페이트 델타-이성질화효소(idi 서열 식별 번호: 54), 제라닐트랜스트랜스퍼라제(ispA 서열 식별 번호: 56) 및 파르네센 합성효소(FS 서열 식별 번호: 57)의 발현의 확인이 실시예 1에서 위에서 설명되는 바와 같이 수행되었다. 표 7에 열거된 올리고뉴클레오티드를 사용함.
[표 7]
플라스미드 pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(서열 식별 번호: 91)에 운반된 하부 메발로네이트 경로에서 유전자의 발현 검출에 사용된 올리고뉴클레오티드의 목록
하부 메발로네이트 경로에서 모든 유전자의 발현을 확인하는 Rt-PCR 데이터는 도 18에 나타나 있으며, 이 데이터는 또한 표 8에 요약되어 있다.
[표 8]
유전자 유전자 메발로네이트 키나제(MK 서열 식별 번호: 51), 포스포메발로네이트 키나제(PMK 서열 식별 번호: 52), 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제(PMD 서열 식별 번호: 53), 이소펜틸-디포스페이트 델타-이성질화효소(idi 서열 식별 번호: 54), 제라닐트랜스트랜스퍼라제(ispA 서열 식별 번호: 56) 및 파르네센 합성효소(FS 서열 식별 번호: 57)에 대한 평균 CT 값.
메발로네이트 공급 실험을 위해 2개의 스타터 배양물로부터 채취한 2개의 독립적인 샘플에 대해(아래 참조).
메발로네이트로부터 알파-파르네센의 생성
플라스미드 pMTL8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS의 성공적인 형질전환을 확인한 후, 유일한 에너지 및 탄소 공급원으로서 30 psi의 제철소 폐기물 기체(뉴질랜드 글렌브룩 소재 New Zealand Steel 현장으로부터 수집함; 조성: 44% CO, 32% N2, 22% CO2, 2% H2)를 갖는 250 ml의 혈청 병 중 PETC 배지(표 1) 50 mL에서 성장 실험을 수행하였다. 모든 배양물을 혈청 병을 보유하도록 구성된 궤도 진탕기 상에서 37°C에서 배양하였다. 형질전환체를 먼저 약 0.4의 OD600까지 성장시킨 후, 1mM 메발론산이 보충된 신선한 배지로 계대배양하였다. 메발론산이 없는 대조군을 동일한 배양물로부터 동시에 설정하였다. GC-MS(기체 크로마토그래피 - 질량 분광법)용 샘플을 각 시점에 채취하였다. 도 17은 2개의 대조군 배양물 및 1mM 메발로네이트를 공급한 2개의 배양물에 대한 대표적인 성장 곡선을 도시한다. 파르네센은 실험 시작 후 66시간 및 90시간차에 채취한 샘플에서 검출되었다(도 19 내지 도 21).
기체 크로마토그래피 - 질량 분광법에 의한 알파-파르네센의 검출
알파-파르네센의 GC-MS 검출을 위해, 2 ml의 헥산을 첨가하고 밀봉된 유리 발치 튜브에서 혼합하기 위해 격렬하게 진탕하여 5 ml의 배양물 상에서 헥산 추출을 수행하였다. 이후, 튜브를 초음파 처리 수조에서 5분 동안 배양하여 상 분리를 촉진하였다. 400 μl 헥산 추출물을 GC 통에 이동시키고 자동 로딩기에 로딩하였다. 샘플을 EC-1000 컬럼 0.25 μm 필름 두께( Grace Davidson, OR, USA) Varian MS 워크스테이션(Varian Inc, Ca. Now Agilent Technologies, CA, USA) 및 NIST MS Search 2.0(Agilent Technologies, CA, USA)이 있는 VARIAN GC3800 MS4000 이온트랩 GC/MS(Varian Inc, CA, USA. Now Agilent Technologies)상에서 분석하였다. 1 ml/분의 헬륨 캐리어 기체 유량과 1 μl의 주입 부피
본 개시는 독자가 과도한 실험 없이 본 개시를 실시할 수 있도록 특정 바람직한 구현예를 참조하여 본원에 설명되었다. 그러나, 통상의 기술자는 많은 구성요소 및 매개변수가 본 개시의 범위를 벗어나지 않고 특정 정도로 변경되거나 변형되거나 공지된 등가물로 대체될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다. 이러한 변형 및 등가물은 개별적으로 제시된 것처럼 본원에 원용된다는 것을 이해해야 한다. 제목, 표제 등이 본 문서의 독자의 이해를 향상시키기 위해 제공되며 이는 본 개시의 범위를 제한하는 것으로 읽혀서는 안 된다.
전후 인용된 모든 출원, 특허 및 간행물의 전체 개시 내용은, 존재하는 경우, 참조로서 본원에 원용된다. 그러나, 본 명세서에서 임의의 출원, 특허 및 간행물에 대한 언급은 이들이 전 세계 임의의 국가에서 유효한 선행 기술을 구성하거나 공통 일반 지식의 일부를 형성한다고 인정하거나 임의의 형태로 암시하는 것이 아니며 이와 같이 간주되어서는 안 된다.
본 명세서 및 다음의 임의의 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 용어 "포함", "포함하는" 등은 배타적인 의미와 반대인 포용적인 의미, 즉, "포함하나 이에 제한되지 않는"의 의미로 해석되어야 한다.
본원에서 인용되는 간행물, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참고문헌은, 각각의 참고문헌이 개별적으로 및 구체적으로 참고로 포함되는 것으로 표시되고 본원에서 전문이 기술된 것과 동일한 정도로 본원에서 참고로 포함된다. 본원에서 인용된 종래 기술은 해당 종래 기술이 어떠한 국가에서도 해당 분야의 일반적이고도 공통적인 지식의 일부를 형성하는 것임을 인정하는 것이 아니며, 그렇게 간주해서도 안 된다.
본 개시내용을 기술하는 문맥에서 사용된 단수(a, an), 정관사(the), 및 기타 유사한 지시사는 (특히, 하기 청구항의 문맥에서) 본원에 달리 명시되지 않거나 문맥상 명확하게 상충되지 않는 한, 단수와 복수를 모두 가리키는 것으로 해석해야 한다. 용어 "포함하는(comprising, including)", "갖는(having)", 및 "함유하는(containing)"은, 달리 언급되지 않는 한, 개방형 용어(즉, "포함하지만, 이에 제한되지는 않는"의 의미)로 해석되어야 한다. 용어 "본질적으로 구성되는"은 조성물, 공정, 또는 방법의 범위를 명시된 물질 또는 단계로 제한하거나, 또는 조성물, 공정, 또는 방법의 기본적이고 새로운 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다. 대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 어느 하나, 둘 모두, 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어 "약"은, 달리 명시되지 않는 한, 표시된 범위, 값 또는 구조의 ±20%를 의미한다.
본원에서 값의 범위의 언급은 달리 본원에 표시되지 않는 한 범위 내에 해당하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 지칭하는 단순한 방법으로 제공하도록 단지 의도되고, 각각의 별개의 값은 본원에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서로 인용된다. 예를 들어, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 정수 범위, 크기 범위, 또는 두께 범위는, 달리 지시되지 않는 한, 인용된 범위 내의 임의의 정수의 값 및 적절한 경우 이의 분수(예를 들어, 정수의 1/10 및 정수의 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 기술되는 모든 방법은, 본원에서 달리 명시되거나 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공되는 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "~ 와 같은")의 사용은 본 개시를 보다 잘 예시하기 위한 것일 뿐이며, 달리 청구되지 않는 한, 본 개시의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 본 개시의 실행에 필수적인 것으로 청구되지 않은 임의의 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 개시내용의 바람직한 구현예가 본원에서 기술된다. 이러한 바람직한 구현예의 변형은 전술한 설명을 읽었을 때 당업자에게 자명해질 수 있다. 본 발명자들은, 당업자들이 이러한 변형을 적합하게 사용할 것으로 예상하며, 본 발명자들은 본 개시내용이 본원에서 구체적으로 기술된 것과는 다르게 실시될 수 있다는 것을 의도한다. 따라서, 본 개시내용은 준거법에 의해 허용되는 한, 본원에 첨부된 청구범위에 언급된 기술 요지의 모든 변형 및 균등물을 포함한다. 또한, 본 발명의 모든 가능한 변형에서의 전술된 요소들의 임의의 조합은, 본원에서 달리 명시되거나 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한, 본 개시내용에 포함된다.

Claims (27)

  1. 생성물을 기체 기질로부터 생성할 수 있는 유전자 조작 미생물로서, 상기 미생물은 적어도 아세틸-CoA 합성효소를 포함하는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산 및
    a) i) 케토-아실-CoA 티올라제(KAT1), ii) 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 코엔자임 A(HMG-CoA) 합성효소, iii) 메틸글루타코닐-CoA 가수분해효소(MGCH), iv) 3-메틸크로토닐-CoA 카르복실라제(MCCC), v) 아실-CoA 환원효소(ACOAR) 및 vi) 알코올 탈수소효소(ADH)를 포함하는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산;
    b) i) KAT1, ii) HMG-CoA 합성효소, iii) MGCH, MCCC, iv) 포스포트랜스부티라제 부티레이트 키나제(Ptb-buk), v) 아세트알데하이드-페레독신 산화환원효소(AOR) 및 vi) (ADH)를 포함하는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산;
    c) i) KAT1 또는 PTAr 및 ACKr, ii) CoA 전이효소 A/B(CtfAB), iii) 아세토아세테이트 데카르복실라제(ADC) 또는 ADC 및 하이드록시이소발레레이트 합성효소(HIVS), iv) 하이드록시이소발레레이트 티오에스테라제(3HBZCT), v) 하이드록시이소펜틸-CoA 가수분해효소(HPHL), vi) ACOAR 및 vii) ADH를 포함하는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산;
    d) i) KAT1 또는 PTAr 및 ACKr, ii) CoA 전이효소 A/B(CtfAB), iii) ADC 또는 ADC 및 HIVS, iv) 3HBZCT, v) HPHL, vi) Ptb-buk, vii) AOR 및 ADH를 포함하는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산;
    e) i) KAT1, ii) HMG-CoA 합성효소, iii) 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 코엔자임 A(HMG-CoA) 환원효소, iv) 메발로네이트 키나제(MK), v) 포스포메발로네이트 키나제(PMK), vi) 디포스포메발로네이트 데카르복실라제(DMD), vii) 이소-펜테닐 디포스페이트 이성질화효소(IDI), viii) 디메틸알릴 디포스페이트 키나제(DMPKK) 및 ix) 디메틸알릴 포스페이트 키나제(DMPK)를 포함하는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산;
    f) i) KAT1, ii) HMG-CoA 합성효소, iii) 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 코엔자임 A(HMG-CoA) 환원효소, iv) 메발로네이트 키나제(MK), v) 포스포메발로네이트 데카르복실라제(PMVD), vi) 이소-펜테닐 포스페이트 이성질화효소(IPI) 및 vii) 프레닐포스파타제(DMPase)를 포함하는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산;
    g) i) 티올라제, 아실-CoA 아세틸트랜스퍼라제 또는 폴리케티드 합성효소, ii) β-케토아실-CoA 환원효소 또는 β-하이드록시아실-CoA 탈수소효소, iii) β-하이드록시아실-CoA 탈수효소, iv) 트랜스-에노일-CoA 환원효소 또는 부티릴-CoA 탈수소효소/전자 전달 플라보단백질 AB(Bcd-EtfAB), v) 알코올 형성 아실-CoA 환원효소 또는 알데하이드 형성 아실-CoA 카르복실레이트 환원효소, vi) 가수분해 효소 또는 ADH 및 vii) 알코올 탈수효소를 포함하는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산;
    중 적어도 하나를 포함하며, 상기 미생물은 C1-고정 미생물이며, 상기 생성물은 이소프레노이드 알코올인, 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이소프레노이드 알코올은 프레놀인, 미생물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 프레놀을 이소프레놀로 전환할 수 있는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 미생물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 프레놀을 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP)로 전환할 수 있는 효소의 군을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 미생물.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 이소프레놀을 이소펜테닐 디포스페이트(IPP)로 전환할 수 있는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 미생물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 이소펜테닐 디포스페이트 이성질화효소 및 제라닐트랜스트랜스퍼라제(geranyltranstransferase)로 구성되는 군으로부터 선택되는 외인성 효소를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 미생물.
  7. 제4항 또는 제5항에 있어서, 외인성 효소 이소펜테닐 디포스페이트 이성질화효소 및 제라닐트랜스트랜스퍼라제 둘 모두를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 미생물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 리모넨 합성효소, 피넨 합성효소, 파르네센 합성효소 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 외인성 효소의 군을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 미생물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 이소프렌 합성효소를 포함하는 외인성 효소를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 미생물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 일산화탄소 탈수소효소를 갖는, 미생물.　
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, DXS 경로에 대한 파괴 돌연변이를 추가로 포함하는, 미생물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 파괴 돌연변이는 녹아웃인, 미생물.　
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 효소는 적어도 e)를 a), b), c), d), f) 및 g) 중 임의의 하나 이상과 조합하여 직렬로 포함하는, 미생물.　
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 효소를 코딩하는 핵산은 코돈 최적화된 핵산인, 미생물.　
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 효소를 코딩하는 핵산은 상기 미생물의 게놈 내에 통합되는, 미생물.　
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 효소를 코딩하는 핵산은 플라스미드에 혼입되는, 미생물.　
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 효소를 코딩하는 핵산은 구성적 프로모터에 의해 조절되는, 미생물.　
  18. 이소프레노이드 알코올을 생성하는 방법으로서, 제1항에 따른 상기 미생물을 일산화탄소 및 이산화탄소로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 C1 화합물을 탄소 공급원으로서 사용하여 배양하여 상기 미생물이 상기 이소프레노이드 알코올을 생성할 수 있게 하는 방법.　
  19. 이소프레노이드 알코올, 이소프레노이드 알코올 유도체 또는 테르펜 전구체를 생성하는 방법으로서, 일산화탄소 및 이산화탄소로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 C1 화합물을 제1항에 따른 상기 미생물과 접촉시켜 제공하여 상기 미생물이 상기 C1 화합물로부터 상기 이소프레노이드 알코올, 이소프레노이드 알코올 유도체 또는 테르펜 전구체를 생성할 수 있게 하는 방법.　
  20. 제18항에 있어서, 상기 미생물에게 수소를 포함하는 기체가 제공되는, 방법.　
  21. 제18항에 있어서, 상기 이소프레노이드 알코올은 회수되는, 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 미생물에게 수소를 포함하는 기체가 제공되는, 방법.　
  23. 제19항에 있어서, 상기 테르펜 전구체는 회수되는, 방법.　
  24. 제18항에 있어서, 상기 C1 화합물은 철금속 생성물 제조, 비철금속 생성물 제조, 석유 정제, 석탄 가스화, 전력 생성, 카본 블랙 생성, 암모니아 생성, 메탄올 생성 및 코크스 제조로 구성되는 군으로부터 선택되는 산업 공정으로부터 유래되는, 방법.
  25. 제18항에 있어서, 상기 C1 화합물은 합성가스인, 방법.
  26. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리디움 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리디움 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes), 클로스트리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리디움 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리디움 마그눔(Clostridium magnum), 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator), 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 무렐라 테르마우토트로피카(Moorella thermautotrophica) 및 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 미생물.　
  27. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소프레노이드 알코올은 테르페노이드, 비타민 A, 리코펜, 스쿠알렌, 이소프렌, 피넨, 네롤, 시트랄, 캄포, 멘톨, 리모넨, 네롤리돌, 파르네솔, 파르네센, 피톨, 카로틴, 리날로올 및 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 테르펜으로 전환되는, 미생물.　
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