CN116348603A

CN116348603A - 重组微生物及其用途

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Publication number: CN116348603A
Application number: CN202280006823.8A
Authority: CN
Inventors: 刘鸿鸣; M·科普克
Original assignee: Lanzatech Inc
Current assignee: Lanzatech Inc
Priority date: 2021-02-08
Filing date: 2022-02-07
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2042-02-07
Also published as: KR20230051629A; CA3195088C; US20240018527A1; EP4208554A1; CA3195088A1; TW202231867A; ZA202304231B; JP2023540405A; WO2022170191A1; AU2024203354A1; US20220251573A1; AU2022218205A1; EP4208554A4; CN116348603B; WO2022170191A9; AU2022218205A9; TWI837582B; US11788092B2

Abstract

微生物经基因工程改造以产生3‑羟基丙酸酯(3‑HP)。该微生物为一氧化碳营养型产乙酸菌。该微生物使用伍德‑永达尔(Wood‑Ljungdahl)路径产生乙酰基‑coA以固定CO/CO₂。引入来自含有此酶的微生物的β‑丙氨酸丙酮酸氨基转移酶。另外，还可引入乙酰基‑coA羧化酶。可改进3‑HP的产生。此可通过改进的启动子或更高拷贝数或催化更高效的酶来实现。

Description

重组微生物及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年2月8日提交的美国临时专利申请第63/147,108号的权益，其全部内容以引用的方式并入本文中。

政府权利

本公开是在政府支持下根据能源部(Department of Energy)授予的合作协议DE-SC0019090进行的。政府对本发明享有一定的权利。

技术领域

本公开涉及重组微生物和用于通过对包含CO和/或CO₂的底物进行微生物发酵来产生3-羟基丙酸酯[3-HP]的方法。

背景技术

3-羟基丙酸酯[3-HP]为一种平台化学品，充当用于产生聚合物材料的前体并且作为化学原料。聚(3-羟基丙酸)[P(3-HP)]为一种可生物降解聚合物，具有良好特性，如不寻常的高热稳定性。

3-HP可用于衍生多种贵重工业化学品，其包括：丙烯酸，其用于制造油漆、纸、粘合剂、纺织品、专用涂料、油墨和超吸收性聚合物聚丙烯酸酯；1，3-丙二醇，其用作溶剂、粘合剂、化妆品或用于制造用于地毯和纺织物的聚对苯二甲酸丙二醇酯；3-羟基丙醛，其用于食品制备，用作饲料添加剂和用作营养工业中的防腐剂。

3-HP由美国能源部列为第三大最重要的可再生化学品，并且3-HP的全球市场开放量已估计为每年363万吨(Sauer等人，2008年，Bozell等人，2010年，美国能源部报告：48-49)。

本公开的目的为提供重组微生物和一种用于通过微生物发酵产生3-HP的方法，其可提供优于已知方法的一个或多个优势，或至少为公众提供有用选择。

发明内容

本公开通常提供尤其用于通过对包含CO和/或CO₂的底物进行微生物发酵来产生3-HP的方法，以及用于此类方法中的重组微生物。其组合两个不同的CO₂固定路径以产生单个代谢产物。

在第一方面中，本公开提供一种厌氧产乙酸重组微生物，其能够通过发酵包含CO和/或CO₂的底物来产生3-HP和任选的一种或多种其它产物。

在一个特定实施方案中，微生物适于在3-HP生物合成路径中表达不天然存在于衍生重组微生物的亲本微生物中的一种或多种酶(或其一个或多个亚基)。在另一实施方案中，微生物适于在3-HP生物合成路径中过度表达天然存在于衍生重组微生物的亲本微生物中的一种或多种酶(或其一个或多个亚基)。在一个实施方案中，微生物适于在3-HP生物合成路径中表达不天然存在于亲本微生物中的一种或多种酶(或其一个或多个亚基)，并且在3-HP生物合成路径中过度表达天然存在于亲本微生物中的一种或多种酶(或其一个或多个亚基)。

在一个实施方案中，一种或多种酶选自由以下组成的群组：β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶(BAPAT)(EC 2.6.1.19)；丙二酸半醛还原酶(MSR)(EC 1.1.1.59和EC 1.1.1.295)；乙酰基-CoA羧化酶(ACC)(EC 6.4.1.2)；以及它们中的任一者的功能等效变异体。

在一个实施方案中，亲本微生物能够使包含CO和/或CO₂的底物发酵以产生乙酰基-CoA，但不能将乙酰基-CoA转化成3-HP，并且重组微生物适于表达涉及将乙酰基-CoA转化成3-HP的一种或多种酶(或其一个或多个亚基)。

在一个实施方案中，微生物包含一种或多种外源核酸，该一种或多种外源核酸适于增加亲本微生物原生的一种或多种核酸的表达，并且该一种或多种核酸编码前文所提及的一种或多种酶(或其一个或多个亚基)。

在一个实施方案中，适于增加表达的一种或多种外源核酸为调节元件。在一个实施方案中，调节元件为启动子。

在一个实施方案中，启动子为组成性启动子。在一个实施方案中，启动子选自包含伍德-永达尔(Wood-Ljungdahl)基因簇或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子的群组。

在一个实施方案中，微生物包含编码并且适于表达前文所提及的一种或多种酶(或其一个或多个亚基)的一种或多种外源核酸。在一个实施方案中，微生物包含编码并且适于表达至少两种酶(或其一个或多个亚基)的一种或多种外源核酸。

在一个实施方案中，一种或多种外源核酸为核酸构建体或载体，在一个特定实施方案中为质粒，其以任何组合编码前文所提及的一种或多种酶。

在一个实施方案中，外源核酸为表达质粒。

在一个实施方案中，亲本微生物选自厌氧产乙酸菌的群组。

在一个特定实施方案中，亲本微生物选自一氧化碳营养型产乙酸细菌的群组，在一个实施方案中选自包含以下的群组：自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、嗜一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、德雷克氏梭菌(Clostridium drakei)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、大梭菌(Clostridium magnum)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculum bacchii)、布劳特氏菌属(Blautia producta)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、热醋酸穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermautotrophica)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、银醋酸鼠孢菌(Sporomusa silvacetica)、球形鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)和基伍嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui)。

在一个实施方案中，亲本微生物为自产乙醇梭菌或扬氏梭菌。在一个特定实施方案中，微生物为自产乙醇梭菌DSM23693。在另一特定实施方案中，微生物为扬氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。

在一个实施方案中，亲本微生物缺乏编码β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶和/或乙酰基-CoA羧化酶或它们的一个或多个亚基的一种或多种基因。

在第二方面中，本公开提供编码一种或多种酶(或其一个或多个亚基)的核酸，其在微生物中表达时允许微生物通过发酵包含CO和/或CO₂的底物来产生3-HP。

在一个实施方案中，核酸编码两种或更多种酶(或其一个或多个亚基)，该核酸在微生物中表达时允许微生物通过发酵包含CO的底物来产生3-HP。

在一个实施方案中，酶选自β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶和乙酰CoA羧化酶以及它们的任何一者或多者的功能等效变异体。

在一个实施方案中，核酸包含核酸序列，其以任何次序编码β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶、乙酰CoA羧化酶或它们的任何一者或多者的功能等效变异体。

在一个实施方案中，编码β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶的核酸具有SEQ ID NO：13的序列，或为其功能等效变异体。在一个实施方案中，编码β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶的核酸具有SEQ ID NO：14的序列，或为其功能等效变异体。在一个实施方案中，编码β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶的核酸具有SEQ ID NO：15的序列，或为其功能等效变异体。

在一个实施方案中，本公开的核酸进一步包含启动子。在一个实施方案中，启动子允许基因在其控制下的组成性表达。在一特定实施方案中，使用伍德-永达尔簇启动子。在另一特定实施方案中，使用磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。在一个特定实施方案中，启动子来自自产乙醇梭菌。

在第三方面中，本公开提供包含第二方面的一种或多种核酸的核酸构建体或载体。

在一个特定实施方案中，核酸构建体或载体为表达构建体或载体。在一个特定实施方案中，表达构建体或载体为质粒。

在第四方面中，本公开提供宿主生物体，其包含第七方面的核酸或第三方面的载体或构建体中的任何一者或多者。

在第五方面中，本公开提供一种组合物，其包含如本公开的第三方面中所提及的表达构建体或载体和甲基化构建体或载体。

优选地，该组合物能够产生根据本公开的第一方面的重组微生物。

在一个特定实施方案中，表达构建体/载体和/或甲基化构建体/载体为质粒。

在第六方面中，本公开提供一种用于通过微生物发酵产生3-HP和任选的一种或多种其它产物的方法，其包括使用本公开的第一方面的重组微生物发酵包含CO和/或CO₂的底物。

在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：

(a)将包含CO和/或CO₂的底物提供至含有本公开的第一方面的一种或多种微生物的培养物的生物反应器中；以及

(b)厌氧地发酵生物反应器中的培养物以产生3-HP。

在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：

(a)在将气体释放至大气中之前，捕获由于工业工艺产生的含CO和/或CO₂气体：

(b)对含CO和/或CO₂气体进行厌氧发酵以通过含有本公开的第一方面的一种或多种微生物的培养物产生至少3-HP。

在方法方面的特定实施方案中，微生物维持于水性培养基中。

在方法方面的特定实施方案中，底物的发酵发生于生物反应器中。

优选地，包含CO和/或CO₂的底物为包含CO和/或CO₂的气态底物。在一个实施方案中，底物包含工业废气。在某些实施方案中，气体为钢厂废气或合成气。

在特定实施方案中，底物为包含CO的底物。

在底物包含CO₂但无CO的本公开的实施方案中，底物优选地还包含H₂。

在一个实施方案中，底物包含CO和CO₂。在一个实施方案中，底物包含CO₂和H₂。在另一实施方案中，底物包含CO、CO₂和H₂。

在一个实施方案中，底物将通常含有主要比例的CO，如至少约20体积％至约100体积％CO、20体积％至70体积％CO、30体积％至60体积％CO以及40体积％至55体积％CO。在特定实施方案中，底物包含约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或约40体积％、或约45体积％、或约50体积％CO，或约55体积％CO，或约60体积％CO。

在某些实施方案中，该方法进一步包括从发酵液回收3-HP和任选的一种或多种其它产物的步骤。

在第七方面中，本公开提供在通过第六方面的方法产生时的3-HP。

在另一方面中，本公开提供一种用于产生本公开的第一方面的微生物的方法，其包括利用一种或多种外源核酸转化亲本微生物，使得微生物能够通过发酵包含CO和/或CO₂的底物来产生3-HP和任选的一种或多种其它产物，其中亲本微生物不能够通过发酵包含CO和/或CO₂的底物来产生3-HP。

在一个特定实施方案中，利用适于在3-HP生物合成路径中表达不天然存在于亲本微生物中的一种或多种酶的一种或多种外源核酸来转化亲本微生物。在另一实施方案中，利用适于在3-HP生物合成路径中过度表达天然存在于亲本微生物中的一种或多种酶的一种或多种核酸来转化亲本微生物。在另一实施方案中，利用一种或多种外源核酸转化亲本微生物，该一种或多种外源核酸适于在3-HP生物合成路径中表达不天然存在于亲本微生物中的一种或多种酶，并且在3-HP生物合成路径中过度表达不天然存在于亲本微生物中的一种或多种酶。

在某些实施方案中，一种或多种酶如前文所述。

在某一实施方案中，亲本微生物如前文所述。

根据一个实施方案，提供一种用于将CO或CO₂转化成3-羟基丙酸酯(3-HP)的方法。将含CO和/或含CO₂的气态底物传递至生物反应器中，该生物反应器含有培养基中一氧化碳营养型产乙酸细菌的培养物，使得细菌将CO和/或CO₂转化成3-HP。一氧化碳营养型产乙酸细菌经基因工程改造以表达β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶。其还表达乙酰基-CoA羧化酶，无论为天然的或外源的。从生物反应器回收3-HP。

根据另一实施方案，提供一种经分离、基因工程改造的一氧化碳营养型产乙酸细菌，其包含编码β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶的核酸。核酸对于宿主细菌为外源的。细菌表达β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶，并且细菌经由与丙酮酸和β-丙氨酸的氨基转移反应获取产生丙二酸半醛的能力。β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶通常与由SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少85％相同。β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶通常与由SEQ ID NO：14的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少85％相同。β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶通常与由SEQ ID NO：15的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少85％相同。在一个实施方案中，选择β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶，因为丙酮酸为中心代谢物和辅因子，其提供不同优势，如驱动酶促通量。

细菌可进一步包含编码乙酰辅酶A羧化酶的外源核酸。核酸可以可操作地连接至启动子。核酸可能已经密码子优化。核酸或经编码羧化酶可来自非硫光合细菌。细菌可选自由以下组成的群组：自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、嗜一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、布劳特氏菌属、粘液真杆菌、热醋酸穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、银醋酸鼠孢菌、球形鼠孢菌、普氏产醋杆菌和基伍嗜热厌氧菌。外源核酸的供体细菌可为非硫光合细菌，如橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)、金属球菌属(Metallosphaera)和硫化叶菌属(Sulfolobus spp.)。

经基因工程改造细菌可通过在包含气态碳源的培养基中生长来培养。碳源可包含CO和/或CO₂，它们可用作能量源或碳源中的任一者或两者。细菌可任选地在严格厌氧条件下生长。碳源可包含工业废料产物或废气。

本公开也可广泛地认为包括在本申请说明书中单独地或共同地提及或指示的部分、元件和特征，呈该等部分、元件或特征中的两者或更多者的任何或所有组合形式，并且其中本文中提及特定整数，其具有本公开涉及的领域中已知的等效物，这些已知等效物被视为并入本文中，如同个别地阐述一般。

附图说明

本公开的这些和其它方面(应视为在其所有新颖方面中)将参考附图从以下仅借助于示例给出的描述而变得显而易见，在附图中：

图1展示导致自产乙醇梭菌从气体发酵生物合成3-羟基丙酸(3-HP)和1，3-丙二醇(1，3-PDO)的代谢路径。需要异源表达的酶促步骤以黑色展示，而天然反应以灰色展示。碳和氢通过伍德-永达尔路径(WLP)同化为乙酰基-CoA，其随后通过丙酮酸：：铁氧化还原蛋白氧化还原酶(PFOR)转化为丙酮酸。经由丙酮酸羧化酶(PYC)、苹果酸脱氢酶(MDH)、延胡索酸水合酶(FH)、天冬氨酸解氨酶(AAL)和天冬氨酸氨基转移酶(AAT)的作用，形成L-天冬氨酸。天冬氨酸-4-脱羧酶(ADC)接着将L-天冬氨酸转化为L-丙氨酸。关键路径中间体β-丙氨酸可经由天冬氨酸-1-脱羧酶(PAND)的异源表达从L-天冬氨酸合成或经由2，3-丙氨酸氨基变位酶(AAM)从L-丙氨酸合成。丙氨酸脱氢酶(ALADH)可经异源表达以将丙酮酸转化为L-丙氨酸。β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶(BAPAT)和/或γ-氨基丁酸转氨酶(GABT)可接着将β-丙氨酸转化为丙二酸半醛，其接着经由丙二酸半醛(MSR)还原为3-HP。丙氨酸转氨酶(AT)可经异源表达以将L-丙氨酸转化为丙酮酸以进行BAPAT反应。谷氨酸脱氢酶(GDH)可经异源表达以将谷氨酸转化为α-酮戊二酸以进行GABT反应。根据3-HP，1，3-PDO可经由醛：：铁氧化还原蛋白氧化还原酶(AOR)和乙醇脱氢酶(ADH)的作用产生。NAD(P)H包括NADPH和NADH。

图2A至图2B展示在肖特(Schott)瓶中不同量的3-羟基丙酸(0g/L、0.2g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L、5g/L和10g/L)存在下自产乙醇梭菌Δaor菌株的自养生长。图2A：生长曲线；图2B：峰值生物质。Unc＝未攻击；N＝2；误差条＝S.D.。

图3展示自产乙醇梭菌能够在肖特瓶中的自养生长期间将外源3-羟基丙酸转化为1，3-丙二醇。醛：：铁氧化还原蛋白氧化还原酶(AOR)的缺失阻止此天然反应在自产乙醇梭菌中发生。N＝2；误差条＝S.D.。

图4展示使用金门(Golden Gate；GG)方法的3-羟基丙酸路径基因的组合组装。

图5A至图5C展示在12孔培养板中111个3-羟基丙酸(3-HP)组合菌株与200kPa合成气体掺合物(50％CO、10％H₂、30％CO₂和10％N₂)的表征。图5A：终点3-HP滴度；图5B：生物质浓度；图5C：通过生物质浓度归一化的3-HP滴度；培育持续时间＝8天。

图6展示在肖特瓶中的自养生长期间来自组合菌株和WT自产乙醇梭菌菌株的峰值3-羟基丙酸滴度。培育持续时间＝14天；N＝2；误差条＝S.D.。

图7A至图7C展示组合菌株A59B在使用合成气体掺合物(50％CO、10％H₂、30％CO₂和10％N₂)的分批CSTR发酵中的性能。图7A：通过HPLC分析的生物质和代谢物曲线；图7B：通过GC-TCD分析的气体曲线(负＝吸收)；图7C：分别通过LC-MS和GC-MS分析的3-HP和1，3-PDO曲线。

图8A至图8C展示组合菌株B2A在使用合成气体掺合物(50％CO、10％H₂、30％CO₂和10％N₂)的分批CSTR发酵中的性能。图8A：通过HPLC分析的生物质和代谢物曲线；图8B：通过GC-TCD分析的气体曲线(负＝吸收)；图8C：分别通过LC-MS和GC-MS分析的3-HP和1，3-PDO曲线。

图9A至图9C展示组合菌株A63B在使用合成气体掺合物(50％CO、10％H₂、30％CO₂和10％N₂)的分批CSTR发酵中的性能。图9A：通过HPLC分析的生物质和代谢物曲线；图9B：通过GC-TCD分析的气体曲线(负＝吸收)；图9C：分别通过LC-MS和GC-MS分析的3-HP和1，3-PDO曲线。

图10A至图10C展示组合菌株A59B在使用合成气体掺合物(50％CO、10％H₂、30％CO₂和10％N₂)的连续CSTR发酵中的性能。图10A：通过HPLC分析的生物质和代谢物曲线；图10B：通过GC-TCD分析的气体曲线(负＝吸收)；图10C：分别通过LC-MS和GC-MS分析的3-HP和1，3-PDO曲线。D＝稀释速率/天。

具体实施方式

笼统地给出实施方案的以下描述。根据在下文标题“实施例”下所给出的公开内容进一步阐明公开，其提供支持本公开的实验数据、本公开的各种方面的特定实施例和执行本公开的方式。

本发明人出人意料地能够通过发酵包含CO和/或CO₂的底物而将一氧化碳营养型产乙酸微生物工程改造为3-羟基丙酸酯(3-HP)。此为产生3-HP提供一种替代方式，其可具有优于用于产生3-HP的当前方法的益处。另外，其提供使用来自工业工艺的一氧化碳的方式，否则该一氧化碳将被释放至大气中并且污染环境。在本公开中，微生物表达来自β-丙氨酸路径的酶，其导致来自气态底物的3-HP的显著更高的滴度和产率。

在工程改造本公开的微生物中，本发明人出人意料地能够组合两个单独的CO₂固定路径，如图1中所说明。此提供可持续发酵以使用包含CO的底物和/或包含CO₂的底物产生3-HP。因此，连接固定CO₂的两个路径以产生所需产物。

在一个实施方案中，本公开描述通过组合两个单独的CO₂固定路径而将三个CO₂分子固定至一个3-HP分子中(图1)，产乙酸菌的伍德-永达尔路径允许固定两个CO₂分子，并且3-HP循环的初始碳固定步骤允许固定另一CO₂分子。CO₂也可用CO置换，作为伍德-永达尔路径中的关键酶，CO脱氢酶(CODH)能够将CO转化成CO₂和生物水煤气变换反应中的能量(CO+H₂O<->CO₂+H₂)。可使用CO和CO₂的任何混合物。当仅使用CO₂时，可需要供应呈氢或电形式的能量，而CO可充当碳源和能量源两者。

尽管本发明人已证明本公开在自产乙醇梭菌中的功效，但本公开适用于更广泛厌氧产乙酸微生物的群组和在包含CO和/或CO₂的底物上的发酵，如上文和本文中进一步所论述。

除非另外定义，否则如在整个本说明书中所使用的以下术语定义如下：

术语“增加效率”、“增加的效率”等在与发酵过程相关使用时包括但不限于以下中的一者或多者：增加催化发酵的微生物的生长速率、增加在较高产物浓度下的生长和/或产物产生速率、增加每体积消耗的底物所产生的所需产物的体积、增加所需产物的产生速率或产生水平、增加所产生的所需产物相比于发酵的其它副产物的相对比例、降低该过程所消耗的水的量，以及降低该过程所使用的能量的量。

术语“发酵”应解释为在底物中产生化学变化的代谢过程。举例来说，发酵过程接收一种或多种底物并且经由利用一种或多种微生物产生一种或多种产物。术语“发酵”、“气体发酵”等应解释为接收一种或多种底物，如通过气化产生的合成气，并且经由利用一种或多种固定C1的微生物产生一种或多种产物的过程。优选地，发酵过程包括使用一个或多个生物反应器。发酵过程可描述为“分批”或“连续”。“分批发酵”用于描述发酵过程，其中生物反应器填充有原材料(例如碳源)以及微生物，其中产物保留在生物反应器中直至发酵完成。在“分批”过程中，发酵完成后，萃取产物，并且在开始下一个“批次”之前清洁生物反应器。“连续发酵”用于描述其中发酵过程延长较长时间段，并且在发酵期间萃取产物和/或代谢物的发酵过程。优选地，发酵过程为连续的。

当用于提及微生物时，术语“非天然存在”意指微生物具有至少一种未发现于所提及物种的天然存在的菌株(包括所提及物种的野生型菌株)中的基因修饰。非天然存在的微生物通常在实验室或研究设施中开发。

术语“基因修饰”、“基因改变”或“基因工程改造”泛指人工操纵微生物的基因组或核酸。同样，术语“基因修饰”、“基因改变”或“基因工程改造”是指含有此基因修饰、基因改变或基因工程改造的微生物。这些术语可用于区分实验室产生的微生物与天然存在的微生物。基因修饰方法包括例如异源基因表达、基因或启动子插入或缺失、核酸突变、经改变的基因表达或失活、酶工程改造、定向进化、基于知识的设计、随机突变诱发方法、基因改组和密码子优化。

微生物(如梭菌纲(Clostridia))的代谢工程改造可极大地扩展其产生除天然代谢物(如乙醇)以外的许多重要燃料和化学分子的能力。然而，直到最近，梭菌纲被视为基因难处理的，并且因此通常禁止进行广泛的代谢工程改造工作。近年来，已经开发了若干种不同的梭菌纲基因组工程改造方法，包括基于内含子的方法(ClosTron)(Kuehne，StrainEng：Methods and Protocols，389-407，2011)、等位基因交换方法(ACE)(Heap，《核酸研究(Nucl Acids Res)》，40：e59，2012；Ng，PLoS One，8：e56051，2013)、三系杂交(Liew，《微生物学前沿(FrontiersMicrobiol)》，7：694，2016)、通过I-SceI介导的方法(Zhang，《微生物学方法杂志(Journal Microbiol Methods)》，108：49-60，2015)、MazF(Al-Hinai，《环境应用微生物学(Appl Environ Microbiol)》，78：8112-8121，2012)，或其它(Argyros，《环境应用微生物学》，77：8288-8294，2011)、Cre-Lox(Ueki，《分子生物技术(mBio)》，5：e01636-01614，2014)和CRISPR/Cas9(Nagaraju，《生物技术生物燃料(Biotechnol Biofuels)》，9：219，2016)。然而，由于缓慢而费力的循环时间以及对跨物种的这些基因技术的可转移性的限制，以迭代方式引入多个基因变化仍然极具挑战性。此外，我们尚未充分了解梭菌纲中的C1代谢，无法可靠地预测将最大化C1吸收、转化和碳/能量/氧化还原流向产物合成的修饰。因此，在梭菌纲中引入目标路径仍为一个乏味并且耗时的过程。

“重组”指示核酸、蛋白质或微生物为基因修饰、工程改造或重组的产物。通常，术语“重组”是指含有衍生自多个来源的遗传物质或由其编码的核酸、蛋白质或微生物，该等来源如两种或更多种不同的微生物菌株或物种。

“野生型”是指生物体、菌株、基因或自然界中存在的特性的典型形式，其区别于突变或变异体形式。

“内源的”是指存在于或表达于本公开的微生物所衍生自的野生型或亲本微生物中的核酸或蛋白质。举例来说，内源基因为天然存在于本公开的微生物所衍生自的野生型或亲本微生物中的基因。在一个实施方案中，内源基因的表达可通过如外源启动子的外源调节元件控制。

“外源的”是指源自本公开的微生物之外的核酸或蛋白质。举例来说，外源基因或酶可以人工方式或以重组方式产生并且引入或表达于本公开的微生物中。外源基因或酶也可从异源微生物分离并且引入或表达于本公开的微生物中。外源核酸可适于整合至本公开的微生物的基因组中或在本公开的微生物中保持在染色体外状态，例如在质粒中。

“异源的”是指不存在于本公开的微生物所衍生自的野生型或亲本微生物中的核酸或蛋白质。举例来说，异源基因或酶可衍生自不同的菌株或物种并且引入或表达于本公开的微生物中。异源基因或酶可以其存在于不同菌株或物种中的形式引入或表达于本公开的微生物中。或者，可以某种方式修饰异源基因或酶，例如通过对其在本公开的微生物中表达进行密码子优化或通过对其进行工程改造以改变功能，以便逆转酶活性的方向或改变底物特异性。

术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，该核苷酸为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或它们的类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可执行任何已知或未知的功能。以下为多核苷酸的非限制性示例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的基因座(基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含一种或多种经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸或核苷酸类似物。如果存在，则可在聚合物组装之前或之后赋予核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可能间杂有非核苷酸组分。可在聚合之后，如通过与标记组分结合而进一步修饰多核苷酸。

如本文中所使用，“表达”是指多核苷酸从DNA模板转录(如为mRNA或其它RNA转录物)的过程和/或转录mRNA随后翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和经编码多肽可统称为“基因产物”。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指代任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可为直链或支链，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可间杂有非氨基酸。该术语还涵盖经修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵，如与标记组分的缀合。如本文中所使用，术语“氨基酸”包括天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。

“酶活性”或简言之“活性”泛指酶促活性，包括但不限于酶的活性、酶的量或酶催化反应的可用性。因此，“增加”酶活性包括增加酶的活性、增加酶的量或增加酶催化反应的可用性。类似地，“降低”酶活性包括降低酶的活性、降低酶的量或降低酶催化反应的可用性。

“突变的”是指与本公开的微生物所衍生自的野生型或亲本微生物相比，在本公开的微生物中已经被修饰的核酸或蛋白质。在一个实施方案中，突变可为编码酶的基因中的缺失、插入或取代。在另一实施方案中，突变可为酶中一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代。

特定来说，“破坏性突变”为减少或去除(即“干扰”)基因或酶的表达或活性的突变。破坏性突变可使基因或酶部分失活、完全失活或缺失。破坏性突变可为减少、防止或阻断由酶产生的产物的生物合成的任何突变。破坏性突变可为敲除(KO)突变。破坏还可为敲减(KD)突变，其降低但不完全消除基因、蛋白质或酶的表达或活性。尽管KO通常能有效提高产物产率，但其有时会带来超过益处的生长缺陷或基因不稳定性的损失，特别是对于非生长偶合产物。破坏性突变可包括例如编码酶的基因中的突变，参与编码酶的基因表达的基因调节元件中的突变，引入产生蛋白质的核酸，该蛋白质减少或抑制酶的活性，或引入抑制酶表达的核酸(例如反义RNA、siRNA、CRISPR)或蛋白质。可使用所属领域已知的任何方法引入破坏性突变。

破坏性突变的引入导致本公开的微生物与本公开的微生物所衍生自的亲本微生物相比不产生目标产物或基本上不产生目标产物或目标产物的量减少。举例来说，本公开的微生物可不产生目标产物或比亲本微生物少至少约1％、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％目标产物。举例来说，本公开的微生物可产生小于约0.001g/L、0.01g/L、0.10g/L、0.30g/L、0.50g/L或1.0g/L目标产物。

“密码子优化”是指核酸(如基因)突变以用于优化或改进核酸在特定菌株或物种中的翻译。密码子优化可导致较快的翻译速率或较高的翻译准确性。在一实施方案中，本公开的基因针对梭菌属(Clostridium)、尤其自产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌中的表达进行密码子优化。在另一实施方案中，本公开的基因针对自产乙醇梭菌LZ1561中的表达进行密码子优化，自产乙醇梭菌LZ1561以DSMZ保藏编号DSM23693保藏。

“过度表达”是指与本公开的微生物所衍生自的野生型或亲本微生物相比，本公开的微生物中核酸或蛋白质的表达增加。过度表达可通过所属领域已知的任何方式实现，包括修改基因拷贝数、基因转录率、基因翻译率或酶降解率。

术语“变异体”包括序列不同于参考核酸和蛋白质的序列(如现有技术中所公开或本文中所例示的参考核酸和蛋白质的序列)的核酸的蛋白质。可使用执行与参考核酸或蛋白质基本上相同的功能的变异体核酸或蛋白质来实施本公开。举例来说，变异体蛋白质可执行与参考蛋白质基本上相同的功能或催化基本上相同的反应。变异体基因可编码与参考基因相同或基本上相同的蛋白质。变异体启动子可具有与参考启动子基本上相同的促进一种或多种基因表达的能力。

此类核酸或蛋白质在本文中可称为“功能等效变异体”。借助于示例，核酸的功能等效变异体可包括等位基因变异体、基因片段、突变基因、多态性等。来自其它微生物的同源基因也是功能等效变异体的示例。这些基因包括如丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)或扬氏梭菌的物种中的同源基因，其详情在如Genbank或NCBI的网站上公开可用。功能等效变异体还包括其序列因特定微生物的密码子优化而变化的核酸。核酸的功能等效变异体将优选与参考核酸具有至少约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％或更大核酸序列同一性(同源性百分比)。蛋白质的功能等效变异体将优选与参考蛋白质具有至少约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％或更大氨基酸同一性(同源性百分比)。变异体核酸或蛋白质的功能等效性可使用所属领域中已知的任何方法评估。

“互补性”是指核酸通过传统沃森-克里克(Watson-Crick)或其它非传统类型与另一核酸序列形成氢键的能力。互补性百分比指示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个中的5、6、7、8、9、10个为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完美互补”意指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数目的连续残基氢键结。如本文中所使用的“基本上互补”是指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多核苷酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的互补程度，或是指在严格条件下杂交的两种核酸。

如本文中所使用，用于杂交的“严格条件”是指与目标序列具有互补性的核酸主要与目标序列杂交并且基本上不与非目标序列杂交的条件。严格条件通常为序列依赖性的，并且取决于多种因素而变化。一般来说，序列越长，序列与其目标序列特异地杂交的温度越高。严格条件的非限制性示例为所属领域中所熟知(例如，Tijssen，生物化学中的实验室技术和与核酸探针的分子生物杂交(Laboratory techniques in biochemistry andmolecular biology-hybridization with nucleic acid probes)，第二章“杂交原理的概述和核酸探针分析的策略(Overview ofprinciples ofhybridization and the strategyofnucleic acid probe assay)”，Elsevier，N.Y，1993)。

“杂交”是指一个或多个多核苷酸反应以形成复合物的反应，该复合物经由核苷酸残基的碱基之间的氢键结而稳定化。可通过沃森克里克碱基配对、胡斯坦(Hoogsteen)结合或以任何其它序列特异方式进行氢键结。复合物可包含形成双螺旋体结构的两条链、形成多链复合物的三条链或更多链、单个自杂交链或这些的任何组合。杂交反应可构成如引发PCR或通过酶裂解多核苷酸的较广泛方法中的步骤。能够与给定序列杂交的序列称为给定序列的“互补序列”。

可使用所属领域中已知的任何方法将核酸递送至本公开的微生物。举例来说，核酸可作为裸核酸递送，或可与一种或多种试剂，如脂质体一起调配。若适当，核酸可为DNA、RNA、cDNA或它们的组合。在某些实施方案中可使用限制性抑制剂。额外载体可包括质粒、病毒、噬菌体、黏粒和人工染色体。在一实施方案中，使用质粒将核酸递送至本公开的微生物。借助于示例，转化(包括转导或转染)可通过电穿孔、超声波处理、聚乙二醇介导的转化、化学或天然感受态、原生质体转化、原噬菌体诱导或缀合来实现。在具有活性限制酶系统的某些实施方案中，可能有必要在将核酸引入微生物中之前将核酸甲基化。

此外，核酸可经设计以包含调节元件，如启动子，以提高或以其它方式控制特定核酸的表达。启动子可为组成性启动子或诱导性启动子。理想地，启动子为伍德-永达尔路径启动子、铁氧化还原蛋白启动子、丙酮酸：铁氧化还原蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合物操纵子启动子、ATP合成酶操纵子启动子或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。

“微生物”为微观生物体，尤其为细菌、古细菌、病毒或真菌。本公开的微生物通常为细菌。如本文中所使用，“微生物”的引述应理解为涵盖“细菌”。

“亲本微生物”为用于产生本公开的微生物的微生物。亲本微生物可为天然存在的微生物(即野生型微生物)或先前已经修饰的微生物(即突变或重组微生物)。本公开的微生物可经修饰以表达或过度表达一种或多种在亲本微生物中不表达或不过度表达的酶。类似地，本公开的微生物可经修饰以含有一个或多个亲本微生物所不含的基因。本公开的微生物还可经修饰以不表达或表达较少量的一种或多种表达于亲本微生物中的酶。在一个实施方案中，亲本微生物为自产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌。在一实施方案中，亲本微生物为自产乙醇梭菌LZ1561，其根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的条款和所授予的保藏编号DSM23693，在2010年6月7日保藏在位于Inhoffenstraβe 7B，D-38124Braunschweig，Germany的德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH；DSMZ)。此菌株描述于国际专利申请第PCT/NZ2011/000144号，其作为WO 2012/015317公开。

术语“衍生自”指示核酸、蛋白质或微生物由不同(例如，亲本或野生型)核酸、蛋白质或微生物修饰或调适，以便产生新核酸、蛋白质或微生物。此类修饰或调适通常包括核酸或基因的插入、缺失、突变或取代。一般来说，本公开的微生物衍生自亲本微生物。在一个实施方案中，本公开的微生物衍生自自产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌。在一实施方案中，本公开的微生物衍生自以DSMZ保藏编号DSM23693保藏的自产乙醇梭菌LZ1561。

本公开的微生物可基于功能特性进一步分类。举例来说，本公开的微生物可为或可衍生自固定C1的微生物、厌氧菌、产乙酸菌、产乙醇菌、一氧化碳氧化菌和/或甲烷氧化菌。表1提供微生物的代表性列表并且鉴别其功能特性。

¹伍氏醋酸杆菌可从果糖，但不从气体产生乙醇。

²尚未研究大梭菌是否可生长于CO上。

³已报道一种热醋酸穆尔氏菌菌株，即穆尔氏菌属HUC22-1从气体产生乙醇。

⁴尚未研究卵形鼠孢菌是否可生长于CO上。

⁵尚未研究银醋酸鼠孢菌是否可生长于CO上。

⁶尚未研究球形鼠孢菌是否可生长于CO上。

“伍德-永达尔”是指如例如通过Ragsdale，《生物化学与生物物理学学报(BiochimBiophys Acta)》，1784：1873-1898，2008所描述的碳固定的伍德-永达尔路径。“伍德-永达尔微生物”可预测是指含有伍德-永达尔路径的微生物。一般来说，本公开的微生物含有天然伍德-永达尔路径。本文中，伍德-永达尔路径可为天然未经修饰的伍德-永达尔路径，或者其可为具有一定程度的基因修饰(例如过度表达、异源表达、敲除等)的伍德-永达尔路径，只要其仍用以将CO、CO₂和/或H₂转化为乙酰基-CoA。

“C1”是指一碳分子，例如CO、CO₂、CH₄或CH₃OH。“C1-氧合物”是指还包含至少一个氧原子的一碳分子，例如CO、CO₂或CH₃OH。“C1-碳源”是指充当本公开的微生物的一部分或唯一碳源的一碳分子。举例来说，C1-碳源可包括CO、CO₂、CH₄、CH₃OH或CH₂O₂中的一者或多者。优选地，C1-碳源包括CO和CO₂中的一者或两者。“固定C1的微生物”为能够从C1碳源产生一种或多种产物的微生物。通常，本公开的微生物为固定C1的细菌。在一实施方案中，本公开的微生物衍生自表1中鉴别的固定C1的微生物。

“厌氧菌”为生长不需要氧气的微生物。如果氧气以高于某一阈值存在，则厌氧菌可能会消极反应或甚至死亡。然而，一些厌氧菌能够耐受低水平的氧(例如0.000001％至5％氧气)。通常，本公开的微生物为厌氧菌。在一实施方案中，本公开的微生物衍生自表1中鉴别的厌氧菌。

“产乙酸菌”为使用伍德-永达尔路径作为其能量守恒和合成乙酰基-CoA和乙酰基-CoA衍生产物(如乙酸酯)的主要机制的绝对厌氧细菌(Ragsdale，《生物化学与生物物理学学报》，1784：1873-1898，2008)。特定来说，产乙酸菌使用伍德-永达尔路径作为(1)从CO₂还原合成乙酰基-CoA的机制，(2)终端接受电子、能量守恒方法，(3)固定(同化)细胞碳的合成中的CO₂的机制(Drake，《产乙酸原核生物(Acetogenic Prokaryotes)》，《原核生物(TheProkaryotes)》，第3版，第354页，New York，NY，2006)。所有天然存在的产乙酸菌为固定C1、厌氧、自养和非甲烷氧化的。通常，本公开的微生物为产乙酸菌。在一实施方案中，本公开的微生物衍生自表1中鉴别的产乙酸菌。

“产乙醇菌”为产生或能够产生乙醇的微生物。通常，本公开的微生物为产乙醇菌。在一实施方案中，本公开的微生物衍生自表1中鉴别的产乙醇菌。

“自养生物”为能够在不存在有机碳的情况下生长的微生物。实际上，自养生物使用无机碳源，如CO和/或CO₂。通常，本公开的微生物为自养生物。在一实施方案中，本公开的微生物衍生自表1中鉴别的自养生物。

“一氧化碳氧化菌”为能够利用CO作为唯一碳来源和能量来源的微生物。通常，本公开的微生物为一氧化碳氧化菌。在一实施方案中，本公开的微生物衍生自表1中鉴别的一氧化碳氧化菌。

“甲烷氧化菌”为能够使用甲烷作为唯一碳源和能量来源的微生物。在某些实施方案中，本公开的微生物为甲烷氧化菌或衍生自甲烷氧化菌。在其它实施方案中，本公开的微生物并非甲烷氧化菌或并非衍生自甲烷氧化菌。

更广泛地，本公开的微生物可衍生自表1中鉴别的任何属或物种。举例来说，微生物可为选自由以下组成的群组的属的成员：醋杆菌属(Acetobacterium)、嗜碱菌属(Alkalibaculum)、布劳特氏菌属(Blautia)、丁酸杆菌属(Butyribacterium)、梭菌属(Clostridium)、真杆菌属(Eubacterium)、穆尔氏菌属(Moorella)、产醋杆菌属(Oxobacter)、鼠孢菌属(Sporomusa)和热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)。特定来说，微生物可衍生自选自由以下组成的群组的亲本细菌：伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、布劳特氏菌属、食甲基丁酸杆菌、醋酸梭菌、自产乙醇梭菌、嗜一氧化碳梭菌、科斯卡塔梭菌、德雷克氏梭菌、蚁酸醋酸梭菌、扬氏梭菌、大梭菌、拉氏梭菌、粪味梭菌、粘液真杆菌、热自养穆尔氏菌、热醋酸穆尔氏菌、普氏产醋杆菌、卵形鼠孢菌、银醋酸鼠孢菌、球形鼠孢菌和基伍嗜热厌氧菌。

在一实施方案中，本公开的微生物衍生自包含物种自产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌的梭菌属的簇。这些物种首先通过Abrini，《微生物学档案(Arch Microbiol)》，161：345-351，1994(自产乙醇梭菌)，Tanner，《国际系统细菌学杂志(Int J SystemBacteriol)》，43：232-236，1993(扬氏梭菌)和Huhnke，WO 2008/028055(拉氏梭菌)进行报道和表征。

这三个物种有许多相似之处。特定来说，这些物种全部为梭菌属的固定C1、厌氧、产乙酸、产乙醇和一氧化碳营养型成员。这些物种具有类似基因型和表型和能量守恒以及发酵代谢模式。此外，这些物种簇于16S rRNA DNA具有大于99％同一性的梭菌rRNA同源组I中，具有约22mol％-30mol％的DNA G+C含量，为革兰氏阳性的，具有类似形态和大小(0.5μm-0.7μm×3μm-5μm之间的对数生长细胞)，为嗜温性的(最优生长于30℃-37℃下)，具有约4-7.5的类似pH范围(其中最优pH为约5.5-6)，不具有细胞色素并且经由Rnf复合物使能量守恒。另外，已在这些物种中显示使羧酸还原为其对应醇(Perez，《生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng)》，110：1066-1077，2012)。重要的是，这些物种还全部显示在含有CO气体上的强自养生长，产生乙醇和乙酸酯(或乙酸)作为主要发酵产物，并且在某些条件下产生少量2，3-丁二醇和乳酸。

然而，这些三个物种还具有许多不同之处。这些物种分离自不同来源：自产乙醇梭菌分离自家兔肠道，扬氏梭菌分离自鸡舍废弃物，并且拉氏梭菌分离自淡水沉积物。这些物种不同之处在于利用不同的糖(例如鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如葡糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)以及其它底物(例如甜菜碱、丁醇)。此外，这些物种对某些维生素(例如硫胺素、生物素)的营养缺陷型不同。这些物种在伍德-永达尔路径基因和蛋白质的核酸和氨基酸序列方面具有差异，但已发现这些基因和蛋白质的一般组织和数目在所有物种中相同(

，《生物技术新见(Curr Opin Biotechnol)》，22：320-325，2011)。

因此，总的来说，自产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌的该等特性并非对该物种具有特异性，而是梭菌属的固定C1、厌氧、产乙酸、产乙醇和一氧化碳营养型成员的此簇的一般特性。然而，由于这些物种实际上不同，因此对这些物种中的一者的基因修饰或操纵可能不会对这些物种中的另一者产生相同影响。举例来说，可观察到生长、性能或产物产生的差异。

本公开的微生物还可衍生自自产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌的分离株或突变体。自产乙醇梭菌的分离株和突变体包括JA1-1(DSM10061)(Abrini，《微生物学档案》，161：345-351，1994)、LZ1560(DSM19630)(WO 2009/064200)和LZ1561(DSM23693)(WO 2012/015317)。扬氏梭菌的分离株和突变体包括ATCC 49587(Tanner，《国际系统细菌学杂志》，43：232-236，1993)、PETCT(DSM13528，ATCC 55383)、ERI-2(ATCC 55380)(US 5,593,886)、C-01(TCC 55988)(US 6,368,819)、O-52(ATCC 55989)(US 6,368,819)和OTA-1(Tirado-Acevedo，《使用扬氏梭菌从合成气产生生物乙醇(Production of bioethanol fromsynthesis gas using Clostridium ljungdahlii)》，PhD thesis，北卡罗来纳州立大学(North Carolina State University)，2010)。拉氏梭菌的分离株和突变体包括PI 1(ATCCBAA-622，ATCC PTA-7826)(WO 2008/028055)。

“底物”是指用于本公开的微生物的碳源和/或能量源。通常，底物为气态的，并且包含C1-碳源，例如CO、CO₂和/或CH₄。优选地，底物包含CO或CO+CO₂的C1-碳源。底物还可包含其它非碳组分，如H₂、N₂或电子。

底物通常包含至少一定量的CO，如约1mol％、2mol％、5mol％、10mol％、20mol％、30mol％、40mol％、50mol％、60mol％、70mol％、80mol％、90mol％或100mol％CO。底物可包含一定范围的CO，如约20mol％-80mol％、30mol％-70mol％或40mol％-60mol％CO。优选地，底物包含约40mol％-70mol％CO(例如轧钢厂或高炉气体)、约20mol％-30mol％CO(例如碱性氧气转炉气体)或约15mol％-45mol％CO(例如合成气)。在一些实施方案中，底物可包含相对较低量的CO，如约1mol％-10mol％或1mol％-20mol％CO。本公开的微生物通常将底物中的至少一部分CO转化为产物。在一些实施方案中，底物不包含或基本上不包含(＜1mol％)CO。

底物可包含一定量的H₂。举例来说，底物可包含约1mol％、2mol％、5mol％、10mol％、15mol％、20mol％或30mol％H₂。在一些实施方案中，底物可包含相对较高量的H₂，如约60mol％、70mol％、80mol％或90mol％H₂。在其它实施方案中，底物不包含或基本上不包含(＜1mol％)H₂。

底物可包含一些量的CO₂。举例来说，底物可包含约1mol％-80mol％或1mol％-30mol％CO₂。在一些实施方案中，底物可包含低于约20mol％、15mol％、10mol％或5mol％CO₂。在另一实施方案中，底物不包含或基本上不包含(＜1mol％)CO₂。

尽管底物通常为气态的，但底物还可以替代形式提供。举例来说，底物可使用微泡分散发生器溶解于含CO气体饱和液体中。借助于其它示例，底物可吸附至固体载体上。

底物和/或C1-碳源可为作为工业工艺的副产物获得或来自一些其它来源(如来自汽车排出的烟或生物质气化)的废气。在某些实施方案中，工业工艺选自由以下组成的群组：黑色金属产品制造(如轧钢厂制造)、有色金属产品制造、石油精炼、煤炭气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。在这些实施方案中，底物和/或C1-碳源可在其排放至大气中之前使用任何便利方法从工业工艺捕获。

底物和/或C1-碳源可为合成气，如通过煤炭或精炼厂残余物气化、生物质或木质纤维素材料气化或天然气重整所获得的合成气。在另一实施方案中，合成气可获自城市固体废物或工业固体废物的气化。底物和/或C1-碳源可在热解油的后续部分氧化存在或不存在下衍生自热解。

底物的组成可能对反应的效率和/或成本具有显著影响。举例来说，氧气(O₂)的存在可降低厌氧发酵过程的效率。取决于底物的组成，可能需要处理、洗涤或过滤底物以去除任何非所需杂质，如毒素、非所需组分或粉尘颗粒，和/或增加所需组分的浓度。

在特定实施方案中，氢的存在导致发酵过程的改进的总体效率。

可改进合成气组成以提供所需或最优H₂∶CO∶CO₂比率。合成气组成可通过调整进料至气化过程的原料来改进。所需H2∶CO∶CO₂比率取决于发酵过程的所需发酵产物。对于乙醇，最优H₂∶CO∶CO₂比率将为：

其中x＞2y，以便满足乙醇生产的化学计量

在氢存在的情况下操作发酵过程具有降低由发酵过程产生的CO₂量的附加益处。举例来说，包含最少H₂的气态底物将通常通过以下化学计量产生乙醇和CO₂：[6CO+3H₂O→C₂H₅OH+4CO₂]。随着固定C1的细菌所利用的氢气的量增加，所产生CO₂的量减少[例如，2CO+4H₂→C₂H₅OH+H₂O]。

当CO为用于乙醇生产的唯一碳源和能量源时，碳的一部分损失为CO₂，如下：

6CO+3H₂O→C₂H₅OH+4CO₂(ΔG°＝-224.90kJ/mol乙醇)

随着底物中可用H₂的量增加，所产生CO₂的量减少。在2∶1(H₂∶CO)的化学计量比率下，完全避免CO₂产生。

5CO+1H₂+2H₂O→1C₂H₅OH+3CO₂(ΔG°＝-204.80kJ/mol乙醇)

4CO+2H₂+1H₂O→1C₂H₅OH+2CO₂(ΔG°＝-184.70kJ/mol乙醇)

3CO+3H₂→1C₂H₅OH+1CO₂(ΔG°＝-164.60kJ/mol乙醇)

“流”是指能够例如从一个过程传递至另一过程、从一个模块传递至另一模块和/或从一个过程传递至碳捕获装置的任何底物。

如本文中所使用的“反应物”是指参与和经历化学反应期间变化的物质。在特定实施方案中，反应物包括但不限于CO和/或H₂。

如本文中所使用的“微生物抑制剂”是指减缓或防止特定化学反应或包括微生物的另一过程的一种或多种成分。在特定实施方案中，微生物抑制剂包括但不限于氧气(O₂)、氰化氢(HCN)、乙炔(C₂H₂)和BTEX(苯、甲苯、乙苯、二甲苯)。

如本文中所使用，“催化剂抑制剂”、“吸附剂抑制剂”等是指降低化学反应的速率或防止化学反应的一种或多种物质。在特定实施方案中，催化剂和/或吸附剂抑制剂可包括但不限于硫化氢(H₂S)和硫化羰(COS)。

“去除过程”、“去除模块”、“清除模块”等包括能够转化和/或从气流去除微生物抑制剂和/或催化剂抑制剂的技术。在特定实施方案中，必须通过上游去除模块去除催化剂抑制剂以便防止下游去除模块中一种或多种催化剂的抑制。

如本文中所使用，术语“成分”、“污染物”等是指可在气流中发现的微生物抑制剂和/或催化剂抑制剂。在特定实施方案中，该等成分包括但不限于硫化合物、芳香族化合物、炔烃、烯烃(alkenes)、烷烃、烯烃(olefins)、氮化合物、含磷化合物、颗粒物质、固体、氧、卤代化合物、含硅化合物、羰基、金属、醇、酯、酮、过氧化物、醛、醚和焦油。

术语“经处理气体”、“经处理流”等是指已通过至少一个去除模块并且已去除和/或转化一个或多个成分的气流。

术语“所需组成”用于指如气流(包括但不限于合成气)的物质中组分的所需水平和类型。更特定来说，如果气体含有特定组分(例如CO、H₂和/或CO₂)和/或含有特定比例的特定组分和/或不含有特定组分(例如，有害于微生物的污染物)和/或不含有特定比例的特定组分，则气体视为具有“所需组成”。超过一种组分可在测定气流是否具有所需组成时加以考虑。

如本文中所使用的术语“碳捕获”是指从包含CO₂和/或CO的流分离包括CO₂和/或CO的碳化合物，并且：

将CO₂和/或CO转化成产物；或

将CO₂和/或CO转化成适用于长期储存的物质；或

捕获适用于长期储存的物质中的CO₂和/或CO；

或这些过程的组合。

在某些实施方案中，发酵在不存在碳水化合物底物，如糖、淀粉、木质素、纤维素或半纤维素的情况下进行。

本公开的微生物可与气态底物一起培养以产生一种或多种产物。举例来说，本公开的微生物可产生或可经工程改造以产生乙醇(WO 2007/117157)、乙酸酯(WO 2007/117157)、1-丁醇(WO 2008/115080、WO 2012/053905和WO 2017/066498)、丁酸酯(WO 2008/115080)、2，3-丁二醇(WO 2009/151342和WO 2016/094334)、乳酸酯(WO 2011/112103)、丁烯(WO 2012/024522)、丁二烯(WO 2012/024522)、甲基乙基酮(2-丁酮)(WO 2012/024522和WO 2013/185123)、乙烯(WO 2012/026833)、丙酮(WO 2012/115527)、异丙醇(WO 2012/115527)、脂质(WO 2013/036147)、3-羟基丙酸酯(3-HP)(WO 2013/180581)、萜类，除了2-苯乙醇以外，还包括异戊二烯(WO 2013/180584)、脂肪酸(WO 2013/191567)、2-丁醇(WO2013/185123)、1，2-丙二醇(WO 2014/036152)、1-丙醇(WO 2017/066498)、1-己醇(WO2017/066498)、1-辛醇(WO 2017/066498)、分支酸衍生产物(WO 2016/191625)、3-羟基丁酸酯(WO 2017/066498)、1，3-丁二醇(WO 2017/066498)、2-羟基异丁酸酯或2-羟基异丁酸(WO2017/066498)、异丁烯(WO 2017/066498)、己二酸(WO 2017/066498)、1，3-己二醇(WO2017/066498)、3-甲基-2-丁醇(WO 2017/066498)、2-丁烯-1-醇(WO 2017/066498)、异戊酸酯(WO 2017/066498)、异戊醇(WO 2017/066498)和/或单乙二醇(WO 2019/126400)。在某些实施方案中，微生物生物质本身可视为产物。这些产物可进一步转化以产生柴油、喷气燃料和/或汽油的至少一种组分。在某些实施方案中，2-苯乙醇可用作芳香剂、精油、调味剂和皂类中的成分。另外，微生物生物质可进一步加工以产生单细胞蛋白质(SCP)。

“单细胞蛋白质”(SCP)是指可用于富含蛋白质的人类餐食和/或动物饲料中，通常替代蛋白质补充物的常规来源的微生物生物质，如豆粕或鱼粉。为产生单细胞蛋白质或其它产物，该过程可包括额外的分离、加工或处理步骤。举例来说，该方法可包括对微生物生物质进行灭菌，使微生物生物质离心和/或将微生物生物质干燥。在某些实施方案中，微生物生物质使用喷雾干燥或桨叶干燥来干燥。该方法还可包括使用所属领域中已知的任何方法降低微生物生物质的核酸含量，因为摄入高核酸含量的膳食可能导致核酸降解产物积聚和/或胃肠窘迫。单细胞蛋白质可适用于喂养动物，如家畜或宠物。特定来说，动物饲料可适用于喂养一头或多头肉牛、奶牛、猪、绵羊、山羊、马、骡子、驴、鹿、水牛/野牛、美洲驼、羊驼、驯鹿、骆驼、野牛、大额牛、牦牛、鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、珍珠鸡、雏鸟/鸽子、鱼、虾、甲壳动物、猫、狗和啮齿动物。动物饲料的组成可根据不同动物的营养要求调整。此外，该过程可包括将微生物生物质与一种或多种赋形剂掺合或组合。

“赋形剂”可指可添加至微生物生物质以增强或改变动物饲料的形式、属性或营养含量的任何物质。举例来说，赋形剂可包括以下中的一者或多者：碳水化合物、纤维、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质、水、香料、甜味剂、抗氧化剂、酶、防腐剂、益生菌或抗生素。在一些实施方案中，赋形剂可为干草、稻草、青贮料、谷物、油或脂肪或其它植物材料。赋形剂可为Chiba，第18节：《饮食调配和常见饲料成分(Diet Formulation and Common FeedIngredients)》，《动物营养手册(Animal Nutrition Handbook)》，第3修订版，第575-633页，2014中所确认的任何饲料成分。

“天然产物”为通过未经基因修饰的微生物产生的产物。举例来说，乙醇、乙酸酯和2，3-丁二醇为自产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌的天然产物。“非天然产物”为通过经基因修饰微生物产生而非通过衍生经基因修饰微生物的未经基因修饰微生物产生的产物。

“选择性”是指目标产物的产量与通过微生物产生的所有发酵产物的产量的比率。本公开的微生物可经工程改造而以一定选择性或最小选择性产生产物。在一个实施方案中，目标产物占由本公开的微生物产生的所有发酵产物的至少约5％、10％、15％、20％、30％、50％或75％。在一个实施方案中，目标产物占通过本公开的微生物产生的所有发酵产物的至少10％，使得本公开的微生物对至少10％的目标产物具有选择性。在另一实施方案中，目标产物占通过本公开的微生物产生的所有发酵产物的至少30％，使得本公开的微生物对至少30％的目标产物具有选择性。

“提高效率”、“提高的效率”等包括但不限于提高生长速率、产物产生速率或体积、消耗的每体积底物的产物体积或产物选择性。效率可相对于衍生本公开的微生物的亲本微生物的性能测量。

通常，在生物反应器中进行培养。术语“生物反应器”包括培养/发酵装置，其由一个或多个容器、塔或管道布置组成，如连续搅拌槽反应器(CSTR)、固定细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、气泡柱、气升式发酵罐、静态混合器或适用于气-液接触的另一容器或另一装置。在一些实施方案中，生物反应器可包括第一生长反应器和第二培养/发酵反应器。可将底物提供至这些反应器中的一者或两者。如本文中所使用，术语“培养”和“发酵”可互换使用。这些术语涵盖培养/发酵过程的生长阶段和产物生物合成阶段。

通常在含有足以准许微生物生长的营养物、维生素和/或矿物质的水性培养基中维持培养物。优选地，水性培养基为厌氧微生物生长培养基，如基本厌氧微生物生长培养基。合适的培养基为所属领域中所熟知。

培养/发酵期望应在适用于产生目标产物的条件下进行。通常，培养/发酵在厌氧条件下进行。应考虑的反应条件包括压力(或分压)、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电位、搅拌速率(如果使用连续搅拌槽反应器)、接种物水平、确保液相中的气体不会变成限制性的最大气体底物浓度和避免产物抑制的最大产物浓度。特定来说，可控制底物的引入速率以确保液相中的气体的浓度不会变成限制性的，因为在气体限制条件下，培养物可能消耗产物。

在高压下操作生物反应器允许增加从气相至液相的气体质量转移速率。因此，在高于大气压的压力下进行培养/发酵通常优选。此外，因为既定气体转化率部分为底物滞留时间的函数，并且滞留时间指示生物反应器的所需体积，所以使用加压系统可大大减小所需生物反应器的体积，并且因此降低培养/发酵设备的资金成本。此又意指当生物反应器维持在高压而非大气压下时，滞留时间(定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流动速率)可减少。最优反应条件将部分地取决于所用特定微生物。然而，一般来说，优选在高于大气压的压力下操作发酵。此外，因为既定气体转化率部分为底物滞留时间的函数，并且实现所需滞留时间又指示生物反应器的所需体积，所以使用加压系统可大大减小所需生物反应器的体积，并且因此降低发酵设备的资金成本。

在某些实施方案中，发酵在不存在光的情况下或在不存在足以满足光合微生物的能量需求的光量的情况下进行。在某些实施方案中，本公开的微生物为非光合微生物。

如本文中所使用，术语“发酵液”或“培养液”是指生物反应器中组分的混合物，其包括细胞和营养物培养基。如本文中所使用，“分离器”为适于从生物反应器接收发酵液并且使培养液通过过滤器以产生“渗余物”和“渗透物”的模块。过滤器可为薄膜，例如错流薄膜或中空纤维薄膜。术语“渗透物”用于指通过分离器的培养液的基本上可溶的组分。渗透物将通常含有可溶发酵产物、副产物和营养物。渗余物将通常含有细胞。如本文中所使用，术语“培养液渗出物”用于指从生物反应器去除并且不传递至分离器的发酵液的一部分。

目标产物可使用任何方法或所属领域中已知方法的组合从发酵培养液分离或纯化，该等方法包括例如分馏、蒸发、渗透蒸发、气提、相分离和萃取发酵，包括例如液-液萃取。在某些实施方案中，目标产物通过以下步骤从发酵培养液回收：从生物反应器连续去除培养液的一部分，分离微生物细胞与培养液(宜通过过滤进行)，以及从培养液回收一种或多种目标产物。醇和/或丙酮可例如通过蒸馏回收。酸可例如通过吸附于活性炭上回收。所分离微生物细胞优选地再循环回至生物反应器。在去除目标产物之后剩余的不含细胞的渗透物还优选地返回至生物反应器。可将额外营养物添加至不含细胞的渗透物中以在渗透物返回至生物反应器之前补充培养基。

如本文中所提及，“穿梭微生物”为其中表达甲基转移酶的微生物，并且不同于目的微生物。

如本文中所提及，“目的微生物”为其中表达包括于表达构建体/载体上的基因的微生物，并且不同于穿梭微生物。这也称作宿主微生物。

术语“主要发酵产物”意指以最高浓度和/或产率产生的一种发酵产物。可存在一种或多种发酵产物。最普遍的可为或可不为在商业上最有价值的。

短语“包含一氧化碳的底物”和类似术语应理解为包括其中一氧化碳可用于一种或多种细菌菌株以用于例如生长和/或发酵的任何底物。

短语“包含一氧化碳的气态底物”以及类似短语和术语包括含有一定水平的一氧化碳的任何气体。在某些实施方案中，底物含有至少约20体积％至约100体积％CO、20体积％至70体积％CO、30体积％至60体积％CO和40体积％至55体积％CO。在特定实施方案中，底物包含约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或约40体积％、或约45体积％、或约50体积％CO，或约55体积％CO，或约60体积％CO。

尽管包含CO的底物不必含有任何氢气，但H₂的存在不应对根据本公开的方法的产物形成有害。在特定实施方案中，氢的存在导致乙醇产生的改进的总体效率。举例来说，在特定实施方案中，底物可包含大约2∶1、或1∶1、或1∶2比率的H₂∶CO。在一个实施方案中，底物包含约30体积％或更少H₂、20体积％或更少H₂、约15体积％或更少H₂或约10体积％或更少H₂。在其它实施方案中，底物流包含低浓度H₂，例如小于5％、或小于4％、或小于3％、或小于2％、或小于1％，或基本上不含氢。底物还可含有一些CO₂，例如约1体积％至约80体积％CO₂，或1体积％至约30体积％CO₂。在一个实施方案中，底物包含小于或等于约20体积％CO₂。在特定实施方案中，底物包含小于或等于约15体积％CO₂、小于或等于约10体积％CO₂、小于或等于约5体积％CO₂，或基本上不含CO₂。

短语“包含二氧化碳的底物”和类似术语应理解为包括其中二氧化碳可用于一种或多种细菌菌株以用于例如生长和/或发酵的任何底物。包含二氧化碳的底物可进一步包含氢和/或一氧化碳。

短语“包含二氧化碳和气态底物”以及类似短语和术语包括含有一定水平的二氧化碳的任何气体。在某些实施方案中，底物含有至少约10体积％至约60体积％CO₂、20体积％至50体积％CO₂、30体积％至60体积％CO₂和40体积％至55体积％CO₂。在特定实施方案中，底物包含约20体积％、或约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或约40体积％、或约45体积％、或约50体积％CO、或约55体积％CO、或约60体积％CO₂。

优选地，包含CO₂的底物还将含有一定水平的CO或H₂。在特定实施方案中，底物包含至少约1∶1、或至少约1∶2、或至少约1∶3、或至少约1∶4、或至少约1∶5的CO₂∶H₂比率。

在以下描述中，本公开的实施方案根据递送和发酵“含有CO和/或CO₂的气态底物”加以描述。然而，应了解，气态底物可以替代形式提供。举例来说，可提供溶解于液体中的含有CO和/或CO₂的气态底物。基本上，液体经含有一氧化碳的气体饱和，并且接着将该液体添加至生物反应器中。此可使用标准方法来实现。借助于示例，可使用微泡分散发生器(Hensirisak等人，用于好气发酵的微泡分散发生器的规模放大(Scale-up ofmicrobubble dispersion generator for aerobic fermentation)；应用生物化学与生物技术(Applied Biochemistry and Biotechnology)第101卷，第3册/2002年10月)。借助于另一示例，含有CO的气态底物可吸附至固体载体上。通过使用术语“含有CO和/或CO₂的底物”等涵盖此类替代方法。

在本公开的特定实施方案中，含CO的气态底物(或包含CO₂、或CO和CO₂、或CO₂和H₂以及CO的气态底物)为工业废气或废气。“工业废料或废气”应广泛地用以包括任何气体，该等气体包括通过工业工艺产生的CO和/或CO₂，并且包括由于黑色金属产品制造、有色金属产品制造、石油精炼过程、煤炭气化、生物质气化、电力生产、炭黑生产和焦炭制造而产生的气体。其它示例可提供于本文别处。

除非上下文另有要求，否则如本文中所使用，短语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等打算涵盖该过程的生长阶段和产物生物合成阶段。如本文中进一步描述，在一些实施方案中，生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因而，将金属或组合物添加至发酵反应应理解为包括添加至这些反应器中的任一者或两者。

术语“生物反应器”包括发酵装置，其由一个或多个容器和/或塔或管道布置组成，该装置包括连续搅拌槽反应器(CSTR)、固定细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、气泡柱、气升式发酵罐、静态混合器或适用于气-液接触的另一容器或另一装置。在一些实施方案中，生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因而，当提及将底物添加至生物反应器或发酵反应时，应理解为包括适当时添加至这些反应器中的任一者或两者。

应了解，本公开可使用序列与本文中具体例示的序列不同的核酸来实施，只要其执行基本上相同的功能。对于编码蛋白质或肽的核酸序列，此意指经编码的蛋白质或肽具有基本上相同的功能。对于表示启动子序列的核酸序列，变异体序列将具有促进一个或多个基因的表达的能力。此类核酸在本文中可称为“功能等效变异体”。借助于示例，核酸的功能等效变异体包括等位基因变异体、基因片段、包括突变(缺失、插入、核苷酸取代等)和/或多态性等的基因。来自其它微生物的同源基因也可视为本文中具体例示的序列的功能等效变异体的示例。

这些包括如扬氏梭菌、橙色绿屈挠菌、金属球菌属或硫化叶菌属的物种中的同源基因，其细节可在如Genbank或NCBI的网站上公开获得。短语“功能等效变异体”还应视为包括序列由于特定微生物的密码子优化而变化的核酸。本文中的核酸的“功能等效变异体”将优选地与所鉴别核酸具有至少约70％、优选地约80％、更优选地约85％、优选地约90％、优选地约95％或更大核酸序列同一性。

还应了解，本公开可使用序列与本文中具体例示的氨基酸序列不同的多肽来实践。这些变异体在本文中可称为“功能等效变异体”。蛋白质或肽的功能等效变异体包括与所鉴别的蛋白质或肽共享至少40％、优选地50％、优选地60％、优选地70％、优选地75％、优选地80％、优选地85％、优选地90％、优选地95％或更大氨基酸同一性并且具有与所关注的肽或蛋白质基本上相同的功能的那些蛋白质或肽。此类变异体在其范围内包括蛋白质或肽的片段，其中片段包含多肽的截短形式，其中缺失可为1至5、至10、至15、至20、至25个氨基酸，并且可在多肽的任一端从残基1至25延伸，并且其中缺失在区内可具有任何长度；或可处于内部位置。本文中的特定多肽的功能等效变异体还应视为包括由其它细菌物种中的同源基因表达的多肽，例如如先前段落中所例示。

本公开的微生物可使用所属领域中已知用于产生重组微生物的任何数目的技术由亲本微生物和一种或多种外源核酸制备。仅借助于示例，转化(包括转导或转染)可通过电穿孔、超声波处理、聚乙二醇介导的转化、化学或天然感受态或缀合来实现。合适的转化技术例如描述于Sambrook J，FritschEF，Maniatis T：分子克隆(Molecular Cloning)：实验室手册(A laboratoryManual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarbourLaboratory Press)，冷泉港(Cold Spring Harbour)，1989中。

在某些实施方案中，由于在待转化微生物中具有活性的限制系统，有必要将待引入微生物中的核酸甲基化。此可使用多种技术进行，包括下文所描述的那些技术，并且进一步例示于下文实施例部分中。

借助于示例，在一个实施方案中，本公开的重组微生物通过包括以下步骤的方法产生：将(i)如本文中所描述的表达构建体/载体和(ii)包含甲基转移酶基因的甲基化构建体/载体引入至穿梭微生物中；表达甲基转移酶基因；从穿梭微生物分离一个或多个构建体/载体；以及将一个或多个构建体/载体引入至目的微生物中。

在一个实施方案中，组成性表达步骤B的甲基转移酶基因。在另一实施方案中，诱导步骤B的甲基转移酶基因的表达。

穿梭微生物为促进构成表达构建体/载体的核酸序列的甲基化的微生物，优选地为限制阴性微生物。在特定实施方案中，穿梭微生物为限制阴性大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。

甲基化构建体/载体包含编码甲基转移酶的核酸序列。

一旦表达构建体/载体和甲基化构建体/载体引入穿梭微生物中，则诱导存在于甲基化构建体/载体上的甲基转移酶基因。诱导可通过任何合适的启动子系统实现，但在本公开的一个特定实施方案中，甲基化构建体/载体包含诱导性lac启动子并且通过添加乳糖或其类似物，更优选地为异丙基-β-D-硫代-半乳糖苷(IPTG)来诱导。其它合适的启动子包括ara、tet或T7系统。在本公开的另一实施方案中，甲基化构建体/载体启动子为组成性启动子。

在一个特定实施方案中，甲基化构建体/载体具有对穿梭微生物的同一性具有特异性的复制起点，使得存在于甲基化构建体/载体上的任何基因表达于穿梭微生物中。优选地，表达构建体/载体具有对目的微生物的同一性具有特异性的复制起点，使得存在于表达构建体/载体上的任何基因表达于目的微生物中。

甲基转移酶的表达导致存在于表达构建体/载体上的基因的甲基化。表达构建体/载体可接着根据多种已知方法中的任一者从穿梭微生物分离。仅借助于示例，下文所描述的实施例部分中所描述的方法可用于分离表达构建体/载体。

在一个特定实施方案中，两个构建体/载体同时分离。

可使用任何数目的已知方法将表达构建体/载体引入至目的微生物中。然而，借助于示例，可使用下文实施例部分中所描述的方法。由于表达构建体/载体经甲基化，因此存在于表达构建体/载体上的核酸序列能够并入至目的微生物中并且成功地表达。

据设想，可将甲基转移酶基因引入至穿梭微生物中并且过度表达。因此，在一个实施方案中，所得甲基转移酶可使用已知方法收集并且体外用于甲基化表达质粒。可接着将表达构建体/载体引入至目的微生物中以用于表达。在另一实施方案中，将甲基转移酶基因引入至穿梭微生物的基因组中，随后将表达构建体/载体引入至穿梭微生物中，从穿梭微生物分离一个或多个构建体/载体，并且接着将表达构建体/载体引入至目的微生物中。

据设想，如上文所定义的表达构建体/载体和甲基化构建体/载体可组合以提供物质组合物。此组合物在避开限制屏障机制以产生本公开的重组微生物方面具有特定效用。

所属领域的一般技术人员将了解用于产生本公开的微生物的多种合适的甲基转移酶。然而，借助于示例，可使用枯草芽孢杆菌噬菌体ΦT1甲基转移酶和本文实施例中所描述的甲基转移酶。考虑到所需甲基转移酶和基因密码的序列，将容易了解编码合适的甲基转移酶的核酸。

适于允许表达甲基转移酶基因的任何数目的构建体/载体可用于产生甲基化构建体/载体。

本公开提供一种通过微生物发酵产生3-HP和任选的一种或多种其它产物的方法，其包括使用本公开的重组微生物发酵包含CO和/或CO₂的底物。优选地，3-HP为主要发酵产物。本公开的方法可用于减少来自工业工艺的总大气碳排放。

优选地，发酵包括使用本公开的重组微生物在生物反应器中厌氧地发酵底物以产生至少3-HP的步骤。

在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：

(a)将包含CO和/或CO₂的底物提供至含有本公开的一种或多种微生物的培养物的生物反应器中；以及

(b)厌氧地发酵生物反应器中的培养物以产生至少3-HP。

在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：

(a)在将气体释放至大气中之前，捕获由于工业工艺产生的含CO和/或CO₂的气体；

(b)对含CO和/或CO₂气体进行厌氧发酵以通过含有本公开的一种或多种微生物的培养物产生至少3-HP。

在一个实施方案中，底物包含CO。在一个实施方案中，底物包含CO₂和CO。在另一实施方案中，底物包含CO₂和H₂。在另一实施方案中，底物包含CO₂和CO以及H₂。

在本公开的一个特定实施方案中，通过微生物发酵的气态底物为含有CO的气态底物。气态底物可为作为工业工艺的副产物获得或来自一些其它来源(如来自汽车排出的烟)的含CO废气。在某些实施方案中，工业工艺选自由以下组成的群组：黑色金属产品制造(如轧钢厂)、有色金属产品制造、石油精炼过程、煤炭气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。在这些实施方案中，含CO气体可在其排放至大气中之前使用任何便利方法从工业工艺捕获。CO可为合成气(包含一氧化碳和氢气的气体)的组分。从工业工艺产生的CO通常燃烧以产生CO₂，并且因此本公开在减少CO₂温室气体排放和产生用作生物燃料的丁醇方面具有特定效用。取决于含CO气态底物的组成，也可能需要在将其引入发酵之前对其进行处理以去除任何非所需杂质，如粉尘颗粒。举例来说，可使用已知方法过滤或洗涤气态底物。

在本公开的特定实施方案中，通过微生物发酵的气态底物为包含CO₂和H₂的气态底物。含CO₂/H₂的底物可为作为工业工艺的副产物获得的废气。在某些实施方案中，工业工艺选自由氢气生产组成的群组。在某些实施方案中，包含CO₂和H₂的气态底物可为掺合气流，其中气流的至少一部分衍生自一种或多种工业工艺，与CO₂或H₂的至少一部分掺合以优化气态底物的CO2∶H2比率。此可尤其有益于富含CO₂或H₂的工业气流。产生可用作CO₂和H₂底物或CO₂和H₂掺合底物的来源的副产物气流的工业工艺的示例包括焦炭制造、精炼过程、氨生产过程、甲醇生产过程、乙酸生产、天然气精炼厂和发电厂。

应了解，对于进行细菌的生长和气体至包含3-HP的产物的转化，将需要将除了含CO和/或CO₂的底物气体以外的合适的液体培养基馈入生物反应器中。底物和培养基可以连续、分批或分批进料方式馈入生物反应器中。营养培养基将含有足以准许所用微生物生长的维生素和矿物质。适用于发酵以使用CO和/或CO₂产生一种或多种产物的厌氧培养基为所属领域中已知的。举例来说，合适的培养基描述为Biebel(2001)。在本公开的一个实施方案中，培养基如下文实施例部分中所描述。

发酵应理想地在适当条件下进行以用于支持进行气体转化为包含3-HP的产物的发酵。应考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电位、搅拌速率(如果使用连续搅拌槽反应器)、接种物水平、确保液相中的CO和/或CO₂不会变成限制性的最大气体底物浓度和避免产物抑制的最大产物浓度。

另外，常常需要增加底物流的CO和/或CO₂浓度(或气态底物中的CO和/或CO₂分压)，并且因此提高CO和/或CO₂为底物的发酵反应的效率。在增加的压力下操作允许CO和/或CO₂从气相转移至液相的速率显著增加，其中其可由微生物吸收作为碳源以制造包含3-HP的产物。此又意指当生物反应器维持在高压而非大气压力下时，滞留时间(定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流动速率)可减少。最优反应条件将部分地取决于所使用的本公开的特定微生物。然而，一般来说，优选的是在高于环境压力的压力下进行发酵。此外，因为既定CO和/或CO₂与至少3-HP转化率部分为底物滞留时间的函数，并且实现所需滞留时间又指示生物反应器的所需体积，所以使用加压系统可大大减小所需生物反应器的体积，并且因此降低发酵设备的资金成本。根据美国专利第5,593,886号中给出的示例，反应器体积可与反应器操作压力的增加成线性比例地减小，即在10个大气压下操作的生物反应器仅需要为在1个大气压下操作的那些生物反应器的体积的十分之一。

借助于示例，已描述在高压下进行气体至乙醇发酵的益处。举例来说，WO 02/08438描述在30psig和75psig的压力下进行的气体至乙醇发酵，分别得到150g/l/天和369g/1/天的乙醇产率。然而，发现在大气压下使用类似培养基和输入气体组合物进行的示例性发酵每天每升产生少10倍与20倍之间的乙醇。

还需要含CO和/或CO₂的气态底物的引入速率为此以便确保液相中的CO和/或CO₂的浓度不变成限制性的。这是因为CO和/或CO₂受限条件的结果可为一种或多种产物由培养物消耗。

用于馈入发酵反应的气流的组成可对该反应的效率和/或成本具有显著影响。举例来说，O₂可降低厌氧发酵过程的效率。在发酵之前或之后的发酵过程阶段中对非所需或不必要的气体的加工可增加该等阶段的负担(对于包含其中气流在进入生物反应器之前经压缩的产物，可使用不必要的能量来压缩在发酵中非所需的气体)。因此，可能需要处理底物流，尤其衍生自工业来源的底物流，以去除非所需组分并且增加所需组分的浓度。

在某些实施方案中，本公开的细菌的培养物维持于水性培养基中。优选地，水性培养基为基本厌氧微生物生长培养基。合适的培养基为所属领域中已知的并且描述于例如美国专利第5,173,429号和第5,593,886号以及WO 02/08438中，并且如下文实施例部分中所描述。

3-HP或含有3-HP和/或一种或多种其它产物的混合流可通过所属领域中已知的方法从发酵培养液回收，该等方法如分馏或蒸发、渗透蒸发、气提和萃取发酵，包括例如液-液萃取。

在本公开的某些实施方案中，3-HP和一种或多种产物通过以下步骤从发酵培养液回收：从生物反应器连续去除培养液的一部分，分离微生物细胞与培养液(宜通过过滤进行)，以及从培养液回收一种或多种目标产物。醇可适宜地例如通过蒸馏回收。丙酮可例如通过蒸馏回收。所产生的任何酸可例如通过吸附于活性炭上来回收。所分离微生物细胞优选地返回至发酵生物反应器。在去除任何醇和酸之后剩余的不含细胞的渗透物还优选地返回至发酵生物反应器中。可将额外营养物(如B族维生素)添加至不含细胞的渗透物中以在渗透物返回至生物反应器之前补充营养培养基。

此外，如果如上文所描述调节培养液的pH以增强乙酸对活性炭的吸附，则在返回至生物反应器之前，应将pH重新调节至与发酵生物反应器中的培养液的pH类似的pH。

3-HP可在发酵之后使用任何适当方法回收，该方法包括但不限于渗透蒸发、反渗透和液体萃取技术。

一个实施方案针对一种能够从碳源产生3-羟基丙酸酯(3-HP)的重组固定C1的细菌，所述细菌包含编码包括β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶和丙二酸半醛还原酶的外源酶的群组的核酸。

根据一实施方案的细菌，所述细菌进一步包含编码包括丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和天冬氨酸脱羧酶的外源酶的群组的核酸，其中所述核酸可操作地连接至启动子。

根据一实施方案的细菌，所述细菌进一步包含编码包括丙氨酸脱氢酶和2，3-丙氨酸氨基变位酶的外源酶的群组的核酸，其中所述核酸可操作地连接至启动子。

根据一实施方案的细菌，所述细菌选自由以下组成的群组：自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、嗜一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、布劳特氏菌属、粘液真杆菌、热醋酸穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、银醋酸鼠孢菌、球形鼠孢菌、普氏产醋杆菌和基伍嗜热厌氧菌。

根据一实施方案的细菌，所述细菌为选自由扬氏梭菌和自产乙醇梭菌组成的群组的梭菌属物种。

根据一实施方案的细菌，所述细菌进一步包含编码乙酰辅酶A羧化酶的核酸，其中所述核酸经密码子优化以表达于所述细菌中。

根据一实施方案的细菌，其中所述乙酰辅酶A羧化酶衍生自梭菌属、金属球菌属、硫化叶菌属或绿屈挠菌属的成员。

根据一实施方案的细菌，其中编码包括β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶和丙二酸半醛还原酶的外源酶的群组的所述核酸经密码子优化以表达于所述细菌中。

根据一实施方案的细菌，所述细菌进一步包含编码包括醛：：铁氧还蛋白氧化还原酶和乙醇脱氢酶的外源酶的群组的核酸，其中所述核酸可操作地连接至启动子。

根据一实施方案的细菌，其中编码外源酶的群组的所述核酸能够产生1，3-丙二醇。

根据一实施方案的细菌，所述细菌进一步包含编码选自醛：：铁氧还蛋白氧化还原酶、乙醇脱氢酶或它们的任何组合的酶的基因中的至少一个破坏性突变。

根据一实施方案的细菌，其中3-HP被转化成选自由以下组成的群组的材料：丙烯酸、丙烯腈、油漆、纸、粘合剂、纺织物、专用涂料、油墨、超吸收性聚合物聚丙烯酸酯、1，3-丙二醇、溶剂、粘合剂、化妆品、聚对苯二甲酸丙二醇酯、3-羟基丙醛、食品、饲料添加剂以及它们的任何组合。

一种将CO和/或CO₂转化成3-羟基丙酸酯(3-HP)的方法，所述方法包括：将含CO和/或含CO₂的气态底物传递至含有根据权利要求1所述的重组固定C1的细菌的培养物的生物反应器中，在培养基中，使得所述细菌将所述CO和/或CO₂转化成3-HP；以及从所述生物反应器回收所述3-HP。

一种培养根据一实施方案的细菌的方法，所述方法包括使所述细菌在包含气态碳源的培养基中生长，其中所述碳源包含CO和/或CO₂。

一种培养根据一实施方案的细菌的方法，所述方法包括使所述细菌在包含能量源的培养基中生长，其中所述能量源包含CO和/或CO₂。

根据一实施方案的方法，其中所述培养为严格厌氧的。

根据一实施方案的方法，其中所述碳源包含工业废料产物或废气。

根据一实施方案的方法，其中所述能量源包含工业废料产物或废气。

根据一实施方案的方法，其中3-HP被转化成选自由以下组成的群组的材料：丙烯酸、丙烯腈、油漆、纸、粘合剂、纺织物、专用涂料、油墨、超吸收性聚合物聚丙烯酸酯、1，3-丙二醇、溶剂、粘合剂、化妆品、聚对苯二甲酸丙二醇酯、3-羟基丙醛、食品、饲料添加剂以及它们的任何组合。

实施例

以下实施例进一步说明本公开的方法和组成，但当然不应视为以任何方式限制其范围。

在此操作中，在固定C1的细菌中执行天冬氨酸-1-脱羧酶(PAND)、β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶(BAPAT)、γ-氨基丁酸转氨酶(GABT)、丙二酸半醛还原酶(MSR)、2，3-丙氨酸氨基变位酶(AAM)、丙氨酸转氨酶(AT)和丙氨酸脱氢酶(ALADH)的组合分析以改进3-HP选择性和产量。3-HP生物合成路径和在以下实施例中异源表达的基因突出显示于图1中。

实施例1.肖特瓶中自产乙醇梭菌的3-HP耐受性

3-HP已展示为对如细长聚球藻的微生物具有毒性，其最小抑制浓度为180mg/L(Begemann等人，PLoS One.2013；8：e76594)。为了研究3-HP对自产乙醇梭菌的自养生长的毒性，使用具有醛：：铁氧化还原蛋白氧化还原酶(AOR)酶缺失的菌株在具有合成气体掺合物(50％CO、10％H₂、30％CO₂和10％N₂)的肖特瓶中进行3-HP激发试验(在0g/L、0.2g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L、5g/L和10g/L下)(图2)。与未攻击培养物相比，5g/L的3-HP使生长速率降低并且使峰值OD600nm降低22％。在10g/L 3-HP处，观察到峰值OD600nm降低40％并且伴随更明显的生长速率降低。图2A展示生长曲线；图2B展示峰值生物质。Unc＝未攻击；N＝2；误差条＝S.D.。

实施例2.在自产乙醇梭菌中将外源添加的3-HP转化为1，3-丙二醇(1，3-PDO)

自产乙醇梭菌的基因组编码两种AOR酶变异体，并且其展示为将一系列羧酸(包括丙酸和丁酸)还原为对应醛，随后为产生醇的天然醇脱氢酶活性(Liew等人，《代谢工程(Metabolic Engineering)》，2017：104-114)。为了测试自产乙醇梭菌是否能够经由3-羟基丙醛将3-HP转化为1，3-丙二醇(1，3-PDO)，外源3-HP以25mM(2.25g/L)浓度添加至自产乙醇梭菌的生长培养基并且在肖特瓶中经历自养生长。如图3中所展示，自产乙醇梭菌野生型(WT)菌株能够以类似摩尔浓度将一些添加的3-HP转化为1，3-PDO。相比之下，aor缺失菌株无法在相同生长条件下产生任何1，3-PDO。

实施例3.3-HP路径的组合分析

为了测定3-HP生物合成的最优通量和基因变异体，在转化为利用C1的微生物之前，首先在大肠杆菌(Escherichia coli)(图4)中进行使用金门(GG)方法的3-HP路径基因与启动子的组合组装。为促进组装的筛选，首先将通过金门位点GG1和GG6的ccdB毒素-抗毒素反选择标记克隆至梭菌-大肠杆菌穿梭载体pMTL8225(Heap，《微生物学方法杂志》，78：79-85，2009)中。这些穿梭载体具有预克隆梭菌启动子(图4中展示为P₁)和终止子(图4中展示为T₃)。编码天冬氨酸-1-脱羧酶(PAND)、β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶(BAPAT)、γ-氨基丁酸转氨酶(GABT)、丙二酸半醛还原酶(MSR)和2，3-丙氨酸氨基还原酶(AAM)的基因与提供终止子和启动子的两种供体载体(pDonor2和pDonor4)一起添加至穿梭载体以用于GG组装。启动子序列、金门位点和组装工作流程描述于Karim等人，《合成生物学(SyntheticBiology)》中。2020；5(1)：ysaa019中。具有ermB抗生素选择标记的所得组合质粒具有启动子和终止子，从而以绝缘方式表达MSR、PAND/AAM和BAPAT/GABT中的每一者。包括于组合分析中的基因变异体(7xMSR(SEQ ID NO：1-7)、5x PAND(SEQ ID NO：8-12)、4x BAPAT/GABT(SEQ ID NO：13-16)和2x AAM(SEQ ID NO：17-18))展示于表2中。当与每基因三个梭菌启动子的选择组合时，此组合文库的总排列为5292(从3×7×3×7×3×4)。

表2.用于组合分析的3-HP路径基因变异体。

为了测定大肠杆菌中组合质粒的组装效率，并且为了研究启动子和基因变异体组合，从经转化大肠杆菌菌株NEB10-β提取192个质粒并且对其进行测序。测序结果的分析展示99％的组装率，并且采用的所有启动子和基因变异体在无显著偏差的情况下表示。在将这些序列验证组合质粒转化为自产乙醇梭菌之后，在12孔培养板中对总共111个组合菌株进行自养生长。

在12孔培养板中用2mL基本培养基和200kPa合成气体混合物(50％CO、10％H₂、30％CO₂和10％N₂)在37℃下进行生长实验8天(图5A至图5C)。接着获取培养液样品用于生物质测量和LC-MS分析以测定3-HP滴度。

培育8天之后，3-HP组合菌株达到0.5gDCW/L-1.2gDCW/L的生物质浓度(图5B)。在这111个组合菌株中，33个菌株产生>1mg/L 3-HP。七个菌株产生超过10mg/L 3-HP(17mg/L最高)(图5A)。前20个产生3-HP的菌株的基因型展示于表3中。通过生物质浓度归一化的3-HP滴度展示于图5C中。

表3. 12孔培养板生长分析中前20个产生3-HP的组合菌株的基因型。

在250mL肖特瓶中用10mL基本培养基于150kPa合成气体混合物(50％CO、10％H₂、30％CO₂和10％N₂)的存在下在37℃下使十八个3-HP组合菌株进一步经历自养生长14天，其中常规取样用于生物质测量和3-HP分析。与WT对照中仅0.23mg/L±0.02mg/L 3-Hp相比，在这些组合菌株中检测到至多24.09mg/L±7.95mg/L 3-HP(图6)。

实施例4.从CSTR中合成气发酵产生3-HP和1，3-PDO

在CSTR中在分批模式下表征3-HP组合菌株“A59B”、“B2A”和“A63B”(表3)以比较其3-HP产生与WT自产乙醇梭菌。来自肖特瓶的积极生长(早期指数)培养物用作2L CSTR的接种物，其在大气压下具有合成气体掺合物(50％CO、10％H₂、30％CO₂和10％N₂)。还在CSTR中在连续模式下表征3-HP组合菌株“A59B”(表3)。

菌株A59B实现3.8gDCW/L的峰值生物质浓度(图7A)并且达到3260mmol/L/d的峰值CO吸收(图7B)。除了50g/L的峰值乙醇浓度(图7A)以外，此菌株还达到278.5mg/L的峰值3-HP滴度和99.5mg/L的峰值1，3-PDO滴度(图7C)。

菌株B2A生长至2.7gDCW/L的峰值生物质浓度(图8A)并且实现2497mmol/L/d的峰值CO吸收(图8B)，同时产生16.6g/L的最大乙醇滴度(图8A)。在稳定生长阶段中，分别使用LC-MS和GC-MS测量144.2mg/L的峰值3-HP滴度和148mg/L的峰值1，3-PDO滴度(图8C)。

菌株A63B达到1.3gDCW/L的峰值生物质浓度(图9A)并且达到880mmol/L/d的峰值CO吸收(图9B)。不管较低峰值CO气体吸收，此菌株能够产生23.5g/L的最大乙醇滴度(图9A)、99.2mg/L的峰值3-HP滴度和40.2mg/L的峰值1，3-PDO浓度(图9C)。

在使用菌株A59B的连续CSTR条件下，在第1.2天开始0.5/天的稀释(D)速率，随后在第2.2天增加至0.75/天D，最终在第3.9天与第12天之间达到1/天D。生物质浓度累积至4.6gDCW/L的峰值浓度(图10A)，并且CO气体吸收达到3574mmol/L/d的峰值(图10B)。在转换为1/天D之后，此菌株在第5天实现358mg/L/d 3-HP的峰值产率并且在第7天实现82.2mg/L/d 1，3-PDO的峰值产率(图10C)。

本文中所引用的所有参考文献，包括公开、专利申请和专利均特此以引用的方式并入，该引用程度就如同个别并且具体地指示各参考文献以引用的方式并入并且全文阐述于本文中一般。在本说明书中对任何现有技术的参考并非并且不应视为承认现有技术形成任何国家所致力领域的公共常识的一部分。

除非本文中另外规定或明显地与上下文相矛盾，否则在描述公开内容的上下文中(尤其在以下权利要求书的上下文中)使用术语“一(a/an)”和“所述”以及类似参考物解释为涵盖单数和复数两者。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应理解为开放性术语(即，意指“包括但不限于”)。术语“基本上由……组成”将组成、工艺或方法的范围限制于指定材料或步骤，或基本上不影响该组成、工艺或方法的基本和新颖特性的材料或步骤。使用替代物(例如“或”)应理解为意指替代物的一者、两者或其任何组合。如本文中所使用，除非另外规定，否则术语“约”意指指定范围、值或结构的±20％。

除非另外规定，否则本文中值范围的叙述仅打算充当个别提及属于该范围内的各独立值的简写方法，并且各独立值并入至本说明书中，如同在本文中个别列举一般。举例来说，除非另外规定，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围、整数范围、大小范围或厚度范围将理解为包括所列举范围内的任何整数值，并且适当时包括其分数(如，整数的十分之一和百分之一)。

除非本文中另外规定或另外明显与上下文矛盾，否则本文中所描述的所有方法可以任何合适的次序执行。除非另外要求，否则使用本文中所提供的任何和所有示例或例示性语言(例如，“如”)仅打算更好地阐明本公开，并且不对本公开的范围造成限制。本说明书中的语言均不应解释为指示任何非要求保护的要素对于本公开的实践为必不可少的。

本文中描述本公开的实施方案。在阅读前述描述之后，那些实施方案的变化对于所属领域的一般技术人员来说可变得显而易见。本发明者期望所属领域的技术人员适当时采用此类变化，并且本发明者打算以不同于本文中特定描述的其它方式来实施本公开。相应地，本公开包括如适用法律准许的随附于本文的权利要求书中所陈述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文中另外规定或另外明显与上下文矛盾，否则本公开涵盖上述要素在其所有可能变化中的任何组合。

序列表

<110> 朗泽科技有限公司（LanzaTech, Inc.）

<120> 重组微生物及其用途

<130> LT198WO1

<150> 63/147,108

<151> 2021-02-08

<160> 18

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 879

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> bcMSR的经LZ1561密码子改编的核苷酸序列

<400> 1

atggaacata aaactttatc aatcggattt ataggaatag gagtaatggg aaaatcaatg 60

gtttatcatt taatgcagga tggacataaa gtatatgtat acaacagaac taaagcaaaa 120

actgactcat tagttcaaga tggtgccaac tggtgcaata ctcctaaaga gctagttaaa 180

caagtggata tagttatgac tatggtagga taccctcacg atgtcgagga agtatatttt 240

ggtatagagg gtataattga acatgctaaa gagggaacaa ttgctataga cttcacaaca 300

agtactccta cattggcaaa gagaattaat gaagtagcaa agagaaaaaa tatttatact 360

cttgatgctc ctgtttcagg cggcgatgta ggagctaaag aagctaaact tgctataatg 420

gttggcggcg aaaaagaaat ttatgataga tgcttaccat tattagaaaa gctaggaaca 480

aatatacagc ttcaaggacc agctggaagc ggccagcata ctaaaatgtg taatcaaatt 540

gcaatagcct ctaacatgat aggtgtatgt gaggccgtag cttacgcaaa aaaagcagga 600

ttaaatcctg ataaagtact tgaaagtata tctacaggag cagcaggatc ttggagtttg 660

tctaacctag caccacgtat gttgaaaggt gactttgaac caggattcta tgttaagcat 720

tttatgaaag atatgaaaat agcattagag gaagctgaaa gacttcagtt acctgtacct 780

ggattatctt tagctaaaga attatatgaa gaactaataa aagatggcga ggaaaattct 840

ggaacacaag tattatataa gaaatatata agaggataa 879

<210> 2

<211> 876

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pdMSR的经LZ1561密码子改编的核苷酸序列

<400> 2

atgaggatag gatttatagg attgggaaac atgggcggcc caatggcagc aaatttacta 60

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tcaatgatag gagtagcaga agcaatgagc ttaggtgtga agttaggcat ggatgctgat 600

gtactagctg gtataataaa tacatcaagt ggaagatgtt ggtcgtcaga agttaataat 660

cctttgaccg gagctccagc tgctaggggc tattctggcg gctttggtac agatttgatg 720

ttaaaagatc ttggacttgc atctgaagca gcaagacagg taagacaacc agtattatta 780

ggtgctcttg cacaacaatt atttcaaact ttttcaaatc agggaaatgg acaattagac 840

tttagcgcta ttgttaagct ttatgaacag ggataa 876

<210> 3

<211> 945

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> nmMSR的经LZ1561密码子改编的核苷酸序列

<400> 3

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gaatatccaa aaaatgcact agtagtaact acagtacctc ctgaactaag tgataaatgg 120

ttggcaaaaa tgggtattca agattatatg ttgtacgata aggtaaaacc agaaccatct 180

atagatgatg taaacacatt aataagtgag ttcaaagaaa agaaaccatc tgtgcttata 240

ggattaggcg gcggctcttc tatggatgtg gtaaaatatg cagcacagga ttttggagtt 300

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gttgtagata gttattttat ggatggaact cctgaacagg taataaaaaa ttcagtatgt 480

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ggccatgctt tatcttacgt attcagtaat gaaggtgtac ctcacggata ttctttaagc 720

agctgtacta ctgtagctca taagcataat aaaagcattt tttacgacag attcaaagag 780

gctatggata aacttggctt tgataagtta gaattaaagg ctgacgtcag tgaagcagca 840

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gatgtagtta aatgcttaga agatataaaa gcaggaaatc tctaa 945

<210> 4

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ecMSR的经LZ1561密码子改编的核苷酸序列

<400> 4

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aatgctggtc ttgcccttgg catggagcct gcccataagg cttccgtaga ggactgggag 300

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atggtggagc gcaaccacgg acatataata aatataggat caacagcggg ttcctggcct 420

tatgctggcg gcaatgttta tggtgctact aaagcatttg taagacaatt ttctttaaat 480

cttagaacag accttcatgg tactgctgtt agagttacag atattgagcc aggattggta 540

ggcggcactg aatttagtaa tgttagattt aagggagatg atggtaaggc tgaaaaaaca 600

taccaaaata ctgttgcttt aactcctgaa gatgtaagtg aagcagtttg gtgggtaagc 660

actttaccag ctcatgtaaa cataaataca ctagaaatga tgcctgttac tcaaagttat 720

gcaggattaa atgttcatag acagtaa 747

<210> 5

<211> 804

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scMSR的经LZ1561密码子改编的核苷酸序列

<400> 5

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gcatcagcag gaataggaaa agctactgca cttgagtatc ttgaagcttc aaatggagat 120

atgaaattaa tattggcagc aagaaggctt gaaaaacttg aggaacttaa aaaaacaatt 180

gatcaagaat tccctaatgc taaagttcac gttgctcagc ttgatataac ccaggcagaa 240

aaaataaaac cattcattga aaacttacct caagaattca aagatattga tatactggtt 300

aataatgcag gcaaggcttt aggttcagat agggtaggtc agatagctac tgaggatata 360

caagacgttt ttgatactaa tgtcacagct ctcattaata taacacaagc tgtgttacct 420

atatttcaag caaagaactc aggagatata gttaatctag gatcaatagc aggaagagat 480

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> msMSR的经LZ1561密码子改编的核苷酸序列

<400> 6

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ggtattgaaa aactaagaaa ttatgttcag gttatgaaga acaacagtca gataactgaa 180

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ggtgctaact ttgttataga ggctgtaatt gaagattatg atgctaaaaa gaaaattttt 300

ggatacttgg attcagtatt agataaagaa gttatactag catcttcaac atctggactt 360

cttataaccg aagtacagaa agcaatgtct aagcatccag aaagggcagt aatagcacat 420

ccttggaatc caccacattt attacctttg gtagaaatag taccaggaga aaaaactagt 480

atggaagtag tagagagaac taaatctctt atggaaaaat tagatagaat agtagtagtt 540

ttaaagaaag aaattcctgg ttttatagga aatagacttg catttgcgct ttttagagag 600

gctgtttatt tagttgatga aggagttgcg acggtagaag atattgataa ggtaatgact 660

gcagctatag gtcttagatg ggcttttatg ggtccttttc ttacctacca tttaggcggc 720

ggcgaaggcg gcttggaata tttcttcaac agaggatttg gatatggtgc gaatgaatgg 780

atgcatacat tggcaaaata tgataaattt ccttatactg gagttacaaa ggctattcaa 840

caaatgaaag aatattcatt tataaaggga aagaccttcc aggaaataag taaatggaga 900

gatgaaaaat tattaaaagt gtataaactt gtttgggaaa agtaa 945

<210> 7

<211> 1650

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> caMSR-N的经LZ1561密码子改编的核苷酸序列

<400> 7

atgagtggaa caggaagatt ggcaggaaaa atagcactaa taacaggcgg cgcaggaaat 60

ataggctcag aacttacaag aagattcctt gcagaaggtg ctacagtaat tatttcagga 120

agaaaccgtg ccaaattaac tgctttagct gaaagaatgc aggctgaagc aggagttcca 180

gcaaaaagaa tagatttgga agtaatggac ggatctgacc ctgttgcagt aagggcagga 240

atagaagcaa tagttgcaag acatggacaa attgacattc tagtaaacaa tgcaggaagt 300

gcaggagccc agagaagatt agctgaaatc ccattgactg aagcagaact tggaccaggt 360

gctgaagaaa cccttcatgc atctattgcc aatctattag gtatgggctg gcatcttatg 420

agaatagcag ctccacacat gccagttggt tctgcagtaa taaatgtgtc tactatattt 480

tcaagggctg aatattacgg aaggattcct tatgttacgc ctaaggctgc attaaatgcc 540

ctatcacagc ttgcagctag agaattaggg gcaagaggta ttagggtaaa tactattttc 600

ccaggaccaa ttgagtcgga taggattaga acagtatttc agagaatgga tcagttaaaa 660

ggtcgtcctg agggtgatac agcccatcac tttttaaata caatgaggct ttgtagagca 720

aatgatcaag gtgcactaga aagaagattt cctagtgtag gagatgttgc agatgctgca 780

gtatttctgg catctgctga gtctgcagct ctcagcggtg aaactattga agtaactcat 840

ggtatggagt taccagcatg ttcagaaacc agcttacttg ccagaactga tcttagaact 900

atagatgcat ctggaagaac cactttaata tgtgctggtg atcagataga agaagtaatg 960

gctctaacag gaatgttaag aacctgtgga tcagaagtta taataggttt tagatcagca 1020

gcagctcttg cacaatttga acaggctgtt aatgagtcaa gaagattagc tggtgcggat 1080

tttactcctc ctattgcact tcctcttgat ccaagagatc cagcaactat cgatgctgta 1140

tttgattggg ctggtgaaaa tactggcggc attcatgctg ctgtaatact tccagcaact 1200

tcacatgagc cagcaccatg tgtaatagaa gtagatgatg aaagagtatt aaatttttta 1260

gcagatgaaa taactggtac tatcgttata gcatcaagat tagctagata ttggcagagc 1320

cagagactta ccccaggggc aagggcaaga ggaccaagag taatattcct ttcaaatgga 1380

gcagatcaga acggtaatgt ttatggaagg attcaatcag ctgcaatagg tcagcttata 1440

agagtatgga gacatgaagc agagttggat tatcaaaggg cttcagcagc tggtgatcac 1500

gtacttcccc ctgtatgggc aaaccaaata gttagatttg caaacagatc tttagaagga 1560

ttagaatttg cttgtgcctg gacagctcaa ttgttgcatt ctcaaagaca tataaatgaa 1620

ataactttaa atattcccgc caacatctaa 1650

<210> 8

<211> 411

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cgPAND的经LZ1561密码子改编的核苷酸序列

<400> 8

atgttaagaa ctatactagg cagtaaaata cacagggcaa cagttacaca agcagattta 60

gattatgtag gaagtgttac tatagatgca gatttggttc atgctgctgg gcttatagaa 120

ggagaaaaag ttgctattgt ggatattact aatggtgcta gactggaaac ttatgtaata 180

gtaggagatg caggaacagg aaatatatgt attaatggtg ctgctgcaca tcttattaat 240

ccaggagatc ttgtaataat aatgtcctac cttcaggcaa cagatgcaga agcaaaggca 300

tacgaaccta aaatagttca tgtagatgcc gataatagaa tagtagcatt gggaaatgat 360

ttagctgaag cactaccagg aagtggcctc cttacttcaa ggagtatcta a 411

<210> 9

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> caPAND的经LZ1561密码子改编的核苷酸序列

<400> 9

atgcatttaa atatgttaaa aagtaaaata cacagagcaa cggtagtaca agcagatcta 60

aactatgtag gaagtataac tatagataga aatcttatgg ataaagcaaa tatattggaa 120

tatgaaaaag tagaaattgc aaacattaac aatggagcaa gatttgagac ttatgtaata 180

gctggagaag caggctcagg aataatatgc ttaaatggtg cagcagcccg ctgtgcacag 240

gctggggata aagttattat aatgtgttat tgttctttaa caccagaaga ggcttcagaa 300

catagaccaa aagtagtatt tgtaaacgat gataacagta tttctaatgt aacagaatat 360

gaaaagcatg gcactatagg ataa 384

<210> 10

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ecPAND的经LZ1561密码子改编的核苷酸序列

<400> 10

atgataagaa caatgttaca aggaaaacta catagggtaa aggtaacaca cgcagatcta 60

cattatgaag gaagctgtgc aattgatcag gatttcctag atgccgctgg tatacttgaa 120

aatgaagcaa tagatatttg gaatgtaaca aacggaaaaa gatttagtac ctatgctatt 180

gctgctgaaa gaggaagcag aataatatct gtaaatggtg ctgctgcgca ttgtgcaagt 240

gttggagata ttgttataat tgcatcattt gttactatgc ctgatgaaga ggctagaacc 300

tggcgaccta acgtagctta ttttgaaggt gataatgaaa tgaaacgcac ggcaaaagca 360

attccagtac aagttgccta a 381

<210> 11

<211> 1623

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tcPAND的经LZ1561密码子改编的核苷酸序列

<400> 11

atgcctgcta caggagaaga tcaagattta gtacaagact taatagaaga accagcaaca 60

tttagtgacg cagtactaag ctctgatgaa gaacttttcc accagaaatg tcctaaacct 120

gctcctattt atagtccagt aagtaaacct gtatcctttg aatcattacc aaacagaaga 180

ttgcatgaag agttccttag aagcagtgtt gatgtacttc tccaagaggc tgtatttgaa 240

ggaactaata ggaaaaatag agttttacaa tggagagaac ctgaagaact tcgtagatta 300

atggactttg gggtaagatc agctccttct actcatgaag aattgcttga agtactcaaa 360

aaagttgtta cctacagtgt taaaacagga catccttatt ttgtaaatca gttattttca 420

gcagtagatc cttatggatt agtagcacag tgggctacag atgcgttaaa tccatctgta 480

tatacttatg aagtaagccc tgtatttgta cttatggaag aagttgtttt gagagaaatg 540

agggctattg taggatttga aggcggcaaa ggtgacggaa tattctgccc aggcggcagt 600

atagctaatg gttatgctat atcctgtgct agatatcgtt ttatgcctga tataaagaag 660

aaaggattac attcattacc aagacttgta ttatttacaa gtgaagatgc tcattattct 720

ataaaaaaac ttgcttcctt ccagggtata ggtactgaca atgtttatct tataagaaca 780

gatgcaagag gaagaatgga tgtgtctcat ctggtagaag aaatagaaag aagtcttaga 840

gaaggtgctg caccgttcat ggtaagtgct acagcaggaa caactgtaat aggagcattt 900

gacccaatag aaaaaattgc ggatgtttgc caaaaatata agttatggct tcatgttgat 960

gctgcatggg gcggcggcgc acttgtatca gcaaaacata gacatctttt gaagggaata 1020

gaacgtgcag attctgtaac ttggaatcca cataaattac ttacagctcc tcagcaatgc 1080

tcaactttat tgttaagaca tgagggagta cttgctgagg ctcattctac taatgcagct 1140

tatcttttcc aaaaagataa attttatgat acaaaatacg atacaggaga taagcatatc 1200

caatgtggaa gaagagcaga tgtacttaaa ttctggttca tgtggaaagc aaaaggaaca 1260

tctggacttg aaaaacatgt agataaagta tttgaaaatg ctagattctt tacggattgt 1320

ataaaaaata gagaaggatt tgaaatggtt atagcagaac ctgaatatac aaatatttgt 1380

ttctggtatg tacctaaatc tctcagaggt agaaaggatg aagcagatta taaagacaaa 1440

ttacataaag tagcaccaag aataaaggag agaatgatga aagagggaag tatgatggta 1500

acttatcagg ctcaaaaggg acacccaaac ttctttagaa tagtatttca aaatagtgga 1560

ctggataaag cagatatggt tcatcttgtt gaagaaatcg agagattagg ctcagatctc 1620

taa 1623

<210> 12

<211> 1191

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mjPAND的经LZ1561密码子改编的核苷酸序列

<400> 12

atgagaaata tgcaagaaaa gggagtatca gaaaaagaaa tattggaaga attaaaaaaa 60

tacagaagtt tggatttgaa gtatgaagat ggaaatatat ttggaagtat gtgtagtaat 120

gttcttccaa taacacgtaa aatagtagat atatttttag aaacaaatct tggtgatcca 180

ggactattca aaggaactaa gttactggaa gaaaaggcag tagcgttgct tggttcctta 240

ttaaataata aagatgccta tggacatata gtttctggcg gcactgaagc aaatttgatg 300

gcacttagat gtataaaaaa tatctggaga gaaaagagaa gaaagggatt aagtaaaaat 360

gaacatccta aaataatagt tcctataact gcacattttt catttgaaaa aggaagagaa 420

atgatggact tagaatacat ttatgcaccg atcaaagaag attataccat agatgaaaaa 480

tttgttaaag atgccgtaga agattatgat gttgacggta ttataggtat agcaggcaca 540

actgaacttg gaactataga caatatagag gaattatcca aaatcgctaa agaaaataat 600

atatatatcc atgtagatgc tgcatttggc ggcttagtaa taccattcct tgatgacaaa 660

tacaagaaaa agggagttaa ctataaattt gacttttcac ttggagtaga ttctataacc 720

atagatccac acaagatggg acattgtcct attccatcag gcggcatatt gttcaaagat 780

ataggttata aaagatatct ggatgttgat gctccttatc tcactgagac tagacaggct 840

actattttag gaacacgtgt aggttttggc ggcgcttgta cctatgcagt tcttagatat 900

cttggaagag aaggacagag aaaaatagtt aatgaatgta tggagaatac actatatctc 960

tacaaaaaac ttaaagaaaa taatttcaaa ccagttatag aacctatatt aaatatagtt 1020

gctatagaag atgaggatta taaagaagtt tgcaaaaagt taagagatcg tggaatatat 1080

gtaagtgttt gtaattgtgt aaaggcttta aggattgttg taatgcctca catcaagaga 1140

gaacatattg ataatttcat tgaaatctta aattccataa aaagggacta g 1191

<210> 13

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> paBAPAT的经LZ1561密码子改编的核苷酸序列

<400> 13

atgaatcagc cactaaatgt tgccccacca gtttcatcag aacttaattt aagagcccat 60

tggatgccat tttcagccaa tagaaacttt caaaaagatc caaggattat agtagcagct 120

gaaggttctt ggcttactga tgacaagggt agaaaagtat acgattcact ttcaggacta 180

tggacatgcg gtgctggtca ttcaagaaaa gaaatacagg aagcagttgc tagacagctt 240

ggtactttgg attatagtcc tggatttcaa tatggacacc cactttcctt tcaactggca 300

gaaaaaatag ctggattact tcctggtgag ctgaaccatg tattctttac aggtagcggt 360

tcagaatgtg cagatacttc aataaaaatg gcaagggctt attggagact caaaggtcag 420

cctcaaaaaa ctaaacttat aggacgtgcc agaggatatc atggtgtaaa tgtggcagga 480

acatctttag gcggcatagg cggcaataga aaaatgttcg gtcaattaat ggatgtagat 540

catttaccac atacacttca gccaggtatg gcatttacta gaggaatggc acagacaggc 600

ggcgtagaat tagctaatga attattgaaa ttgatagaac tccatgatgc ttctaacata 660

gcagctgtca ttgtagaacc tatgtctggt tcagctgggg tccttgttcc tccagtagga 720

tatttgcaaa gactacgtga aatttgtgat caacacaata tattgctaat atttgatgag 780

gtaataactg cttttggaag gctaggaact tattcaggag cagagtactt tggagtaact 840

cctgatctta tgaatgtagc aaaacaagta acgaatggtg ctgtacctat gggtgctgtc 900

atagcatcat cagaaattta cgatacattc atgaaccaag cactgcctga acatgcagta 960

gaattttcac atggttatac ttatagtgcc catccagtag catgtgcagc tggactggca 1020

gcattagata ttcttgcaag ggacaatctt gtacaacaaa gtgctgaatt agctcctcac 1080

tttgaaaagg gacttcatgg acttcaaggt gcaaaaaatg tcatagatat aagaaactgt 1140

ggacttgctg gtgctataca aattgcacca agagatggtg accctacagt aagacctttt 1200

gaagcaggaa tgaaactttg gcaacaggga ttctatgtaa gatttggcgg cgatacttta 1260

caatttggac ctacatttaa tgctagacca gaggaattag atagattatt tgatgcagtt 1320

ggagaggcat taaatggtat agcctaa 1347

<210> 14

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> bcBAPAT的经LZ1561密码子改编的核苷酸序列

<400> 14

atggaattaa tgatagtaca ggtaacagaa cagactcaat cacttaaaaa gacagacgaa 60

aaatatttat ggcatgctat gcgtggtgct gctccttcac caacaaatct tataattaca 120

aaggctgaag gtgcgtgggt tacggatatt gacggaaaca gatatttaga tggaatgagt 180

ggactttggt gcgtaaatgt tggttatgga agaaaggaat tggctagagc agcattcgaa 240

cagttagaag aaatgcctta ttttcctctt actcaatctc atgtacctgc tataaaatta 300

gctgaaaaat tgaatgaatg gcttgatgat gaatatgtaa tattcttttc aaattcaggt 360

tctgaagcaa acgaaacagc ctttaagata gcaagacaat atcatcaaca aaaaggagat 420

catggaagat ataaatttat aagcagatat agggcttatc atggtaattc tatgggagcc 480

ttggcagcta caggccaagc ccagagaaag tacaaatatg aaccacttgg acaaggattt 540

cttcacgttg ctcctcctga tacttataga aatcctgaag atgttcacac acttgcgtct 600

gctgaagaaa tcgacagagt tatgacttgg gaattatctc aaacagttgc tggtgttatt 660

atggaaccta taataacagg cggcggcatt ttaatgccac cagatggtta tatggaaaaa 720

gttaaagaga tatgtgaaaa acatggtgct ttattaatct gcgatgaagt aatatgtgga 780

tttggaagaa ctggaaagcc ttttggcttt atgaactatg gagttaaacc agatataata 840

acaatggcaa aaggtattac aagtgcctat cttcctttat ctgctacagc agtaagaaga 900

gaagtatatg aagcatttgt aggaagcgat gattatgata gatttagaca tgtaaatact 960

tttggcggca atcctgctgc atgtgcttta gctttaaaaa atttagaaat tatggaaaac 1020

gaaaaactca ttgaaagatc aaaggaatta ggcgaaagac tcctttacga gcttgaggat 1080

gtaaaagaac acccaaatgt tggggatgtt agaggaaaag gacttttgct aggtatagaa 1140

ctagtagagg acaagcaaac taaagaacct gcttctatag agaaaatgaa taaagtaata 1200

aatgcgtgca aagaaaaagg gcttataatt ggtaaaaatg gtgacactgt tgctggatat 1260

aacaatatat tgcaattagc accaccatta tccataaccg aagaagattt tacatttata 1320

gttaagacaa tgaaagagtg ccttgcacag ctctaa 1356

<210> 15

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ppBAPAT的经LZ1561密码子改编的核苷酸序列

<400> 15

atgaacatgc cagagacagg accagcagga atagcaagcc aattaaaact agatgcacat 60

tggatgcctt atacagctaa tagaaacttt caaagagatc caagacttat agtagctgca 120

gaaggaaact atttagtaga tgatcatgga agaaaaatat ttgatgcact aagtgggctt 180

tggacttgtg gagcaggaca cacaagaaag gaaatagctg atgcagtaac aagacaattg 240

tcaacactag attattctcc agcatttcaa tttggacatc ctttgtcttt ccagcttgca 300

gaaaaaattg ctgaattagt tcccggtaat ttaaatcatg tattttacac taacagtgga 360

tcagaatgtg ctgatacagc actaaaaatg gtaagggctt attggagact taaaggtcag 420

gctactaaga ccaagataat cggaagggct agagggtatc atggagtaaa tatagcagga 480

acttccttag gcggcgtgaa tggcaataga aaaatgttcg gacaattatt agatgttgac 540

catctgccac atacagtttt gccagtaaat gcattttcaa aaggcttacc agaagaaggc 600

ggcatagcac tagcagatga aatgctaaaa ttaattgaat tacatgatgc atctaacatt 660

gcagctgtta tagtggaacc acttgctgga tcagcaggag ttcttcctcc tcctaaggga 720

tacttaaaga ggttaagaga aatatgtact cagcacaata ttttacttat atttgacgaa 780

gttataacag gatttggaag aatgggagca atgacaggaa gtgaggcttt tggtgtaact 840

cctgatttaa tgtgcattgc aaagcaagtt acaaacggtg ctataccaat gggtgctgta 900

atagcatctt cagagatcta ccaaacattt atgaaccaac caactcctga gtatgcagta 960

gagttccctc atggatacac ttactcagct catcctgttg cttgtgcagc tgggcttgca 1020

gcacttgatc ttctgcaaaa agaaaattta gttcaaagtg cagcagaact tgccccacat 1080

tttgaaaaat tactacatgg tgtaaaagga acaaaaaata ttgttgacat tagaaactat 1140

ggattagctg gggcaataca gatagctgct agagatggag atgcaatagt aaggccatac 1200

gaggctgcaa tgaaattatg gaaggcagga ttctatgtta gatttggcgg cgatacatta 1260

caatttggac caactttcaa tactaaacca caggaactag atcggttatt tgatgctgtt 1320

ggagagactt tgaaccttat tgactag 1347

<210> 16

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> skGABT的经LZ1561密码子改编的核苷酸序列

<400> 16

atgccaagtt acagtgttgc agaactatat tatccagatg aaccaacaga accaaaaata 60

tctactagct cttaccctgg tccaaaggct aagcaagaac ttgaaaaatt aagtaatgtt 120

ttcgatacta gagctgctta tttactagca gattattata agagtagggg caattatatt 180

gttgatcagg atggaaatgt acttcttgat gtttatgccc aaatatcttc tatagcttta 240

ggctataaca atccagaaat cttaaaagtt gctaagtctg atgcaatgtc tgttgcctta 300

gccaatagac cagcacttgc ttgtttccca tctaatgatt atggtcagct cttggaagat 360

ggacttctta aagctgcacc acaaggacaa gataagattt ggactgcttt atctggaagt 420

gatgccaatg aaactgcatt taaggcatgc tttatgtacc aagcagctaa aaagaggaat 480

ggaagaagtt tttcaacaga agaacttgaa agcgttatgg ataatcagct ccctggtact 540

tctgaaatgg taatttgttc ttttgaaaag ggattccatg gaaggctttt tggaagctta 600

tccactacta gaagtaaacc aattcacaaa ttagacatac ctgctttcaa ctggcctaaa 660

gctcctttcc cagatttaaa atatcctcta gaagaaaata aggaagccaa taaggcagaa 720

gaatcaagtt gtatagaaaa attttctcaa atagttcaag aatggcaagg taaaatagca 780

gctgttataa tagagcctat acagagtgaa ggcggcgata atcatgcatc aagtgatttt 840

tttcaaaagc ttagagaaat tacaattgaa aatggtatat tgatgatagt agacgaagtt 900

caaaccggtg taggagcaac aggtaaaatg tgggctcatg agcactggaa tctttcaaac 960

cccccagatt tagttacctt ttcaaaaaaa ttccaagctg ctggttttta ctatcatgat 1020

cctaaattac aacctgatca gcctttcaga caatttaata cctggtgtgg tgacccatca 1080

aaggcactta tagctaaggt tatttatgaa gaaattgtaa aacatgactt agttacaagg 1140

acagctgaag taggaaatta tctatttaat aggttagaaa agttatttga aggaaagaac 1200

tatattcaaa atttgagagg aaagggacag ggaacttata tagcatttga ttttggtact 1260

tcatctgaaa gggattcttt cctatcaaga ttaagatgta acggtgctaa tgtagctggg 1320

tgtggagatt cagctgtaag attgaggcct tcacttacct ttgaagaaaa gcatgcagat 1380

gttttagttt ctatatttga taaaactctt agacaattgt atggataa 1428

<210> 17

<211> 1251

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pgAAM的经LZ1561密码子改编的核苷酸序列

<400> 17

atggcagaat caagaagaaa gtattatttc cctgatgtaa ctgatgaaca atggtatgat 60

tggcactggc aagttctaaa tagaatcgag acactagatc aattaaaaaa atatgttact 120

ttaactgcag aagaagaaga aggagtaaaa gaaagcccta aagtactcag gatggctata 180

actccttatt atctatcatt aatagatcca gaaaacccaa attgtccaat tagaaagcaa 240

gcaataccta ctcagcaaga acttgtacgt gcccctgaag atcaagtaga tcctctaagt 300

gaagatgacg attcaccagt accagggtta actcatagat atcctgatag ggtactgttc 360

cttattactg ataaatgctc aatgtattgt agacattgta caagaagaag atttgctggt 420

caaaaagatg cttcttcacc aagtgaaagg atagatagat gcatagatta tatagcaaat 480

accccaaccg ttagagatgt tttattgtct ggcggcgatg ctttacttgt atctaatgaa 540

agacttgaat acattttaaa gagattaaga gagatacctc atgtagaaat aataagaata 600

ggttcaagaa ctcctgtagt acttcctcaa agaataactc cacagttagt ggatatgtta 660

aaaaagtatc atccagtatg gcttaatact cactttaacc acccaaatga agtaacagaa 720

gaggctgtag aggcatgtga gagaatggct aatgctggca ttccattagg caatcagaca 780

gttttgctca ggggaataaa tgactgtact catgttatga aaagattagt tcatcttttg 840

gttaaaatga gagtgaggcc ttattatata tatgtatgtg atctttcact tggaataggc 900

cattttagaa ctcctgtatc aaaaggcata gaaattattg aaaatcttcg tggtcatact 960

agtggatatg ccgtacctac atttgtagtt ggggcaccag gcggcggcgg caaaattcct 1020

gttactccaa attatgtagt aagtcagtca ccaagacatg tagttttaag aaattatgaa 1080

ggtgttataa ctacttacac agaaccagaa aactatcatg aagaatgtga ttgtgaagat 1140

tgtagggctg gaaaacataa ggaaggagtt gctgcattga gtggcggcca acagcttgca 1200

atagaaccat ctgatttagc caggaagaag agaaaatttg ataaaaacta g 1251

<210> 18

<211> 1416

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> bsAAM的经LZ1561密码子改编的核苷酸序列

<400> 18

atgaaaaata aatggtataa acctaaaaga cactggaagg aaattgaatt atggaaagat 60

gtacctgagg aaaagtggaa tgattggttg tggcaattga cccacacagt gaggacatta 120

gatgatttaa aaaaggtaat taatcttaca gaagatgaag aagaaggtgt aaggattagt 180

accaagacaa tacctttaaa tataactcct tattatgcaa gccttatgga ccctgacaat 240

ccaagatgtc cagtgagaat gcaatcagta ccattaagtg aagaaatgca taaaactaaa 300

tatgatatgg aagatcctct tcatgaagat gaagatagtc ctgttcctgg attaactcat 360

agatatcctg acagagtttt attcctcgta acaaaccaat gttcagtata ttgtagatat 420

tgtactagaa gaagattttc tggacaaata ggaatgggag ttcctaaaaa acaattagat 480

gcagctatag catacataag agaaactcca gaaatacgcg actgcctcat atcaggcggc 540

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acagatcatc tgtgtgacat attaaagaaa tatcatccag tctggttaaa tacacatttt 720

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ggtgtacctg ttggtaatca ggcagttgta cttgcgggca ttaacgattc agtaccaata 840

atgaagaaat taatgcatga tttggtaaaa ataagggtaa gaccttatta tatatatcag 900

tgtgatcttt cagaaggcat aggacacttt agggcaccag tatcaaaggg cttagagatt 960

attgaaggat taagaggaca cacttcagga tatgcagtac caacttttgt agtccatgca 1020

ccaggcggcg gcggcaaaat tgcattacag ccaaattatg tattgtcaca gtcaccagat 1080

aaagttatat tgagaaactt cgaaggtgta ataacaagtt acccagagcc agaaaattat 1140

attcctaatc aggcagatgc atactttgaa tctgtattcc cagaaactgc tgataagaaa 1200

gaaccaattg gcttaagtgc tatatttgct gataaagaag tatcttttac tccagaaaat 1260

gtagatagaa taaaaagaag agaggcatac atagctaatc cagaacatga aactctaaag 1320

gatagaagag aaaaaagaga tcaattaaaa gaaaagaagt tccttgcaca acaaaaaaaa 1380

caaaaggaaa ctgaatgcgg cggcgattcc tcctaa 1416

Claims

1.一种能够从碳源产生3-羟基丙酸酯(3-HP)的重组固定C1的细菌，所述细菌包含编码包括β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶和丙二酸半醛还原酶的外源酶的群组的核酸。

2.根据权利要求1所述的细菌，所述细菌进一步包含编码包括丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和天冬氨酸脱羧酶的外源酶的群组的核酸，其中所述核酸可操作地连接至启动子。

3.根据权利要求1所述的细菌，所述细菌进一步包含编码包括丙氨酸脱氢酶和2，3-丙氨酸氨基变位酶的外源酶的群组的核酸，其中所述核酸可操作地连接至启动子。

4.根据权利要求1所述的细菌，所述细菌选自由以下组成的群组：自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、嗜一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、布劳特氏菌属、粘液真杆菌、热醋酸穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、银醋酸鼠孢菌、球形鼠孢菌、普氏产醋杆菌和基伍嗜热厌氧菌。

5.根据权利要求4所述的细菌，所述细菌为选自由扬氏梭菌和自产乙醇梭菌组成的群组的梭菌属物种。

6.根据权利要求1所述的细菌，所述细菌进一步包含编码乙酰辅酶A羧化酶的核酸，其中所述核酸经密码子优化以表达于所述细菌中。

7.根据权利要求6所述的细菌，其中所述乙酰辅酶A羧化酶衍生自梭菌属、金属球菌属、硫化叶菌属或绿屈挠菌属的成员。

8.根据权利要求1所述的细菌，其中编码包括β-丙氨酸丙酮酸氨基转移酶和丙二酸半醛还原酶的外源酶的群组的所述核酸经密码子优化以表达于所述细菌中。

9.根据权利要求1所述的细菌，所述细菌进一步包含编码包括醛：：铁氧还蛋白氧化还原酶和乙醇脱氢酶的外源酶的群组的核酸，其中所述核酸可操作地连接至启动子。

10.根据权利要求9所述的细菌，其中编码外源酶的群组的所述核酸能够产生1，3-丙二醇。

11.根据权利要求1所述的细菌，其中3-HP被转化成选自由以下组成的群组的材料：丙烯酸、丙烯腈、油漆、纸、粘合剂、纺织物、专用涂料、油墨、超吸收性聚合物聚丙烯酸酯、1，3-丙二醇、溶剂、粘合剂、化妆品、聚对苯二甲酸丙二醇酯、3-羟基丙醛、食品、饲料添加剂以及它们的任何组合。

12.一种将CO和/或CO₂转化成3-羟基丙酸酯(3-HP)的方法，所述方法包括：将含CO和/或含CO₂的气态底物传递至含有根据权利要求1所述的重组固定C1的细菌的培养物的生物反应器中，在培养基中，使得所述细菌将所述CO和/或CO₂转化成3-HP；以及从所述生物反应器回收所述3-HP。

13.一种培养根据权利要求1所述的细菌的方法，所述方法包括使所述细菌在包含气态碳源的培养基中生长，其中所述碳源包含CO和/或CO₂。

14.一种培养根据权利要求1所述的细菌的方法，所述方法包括使所述细菌在包含能量源的培养基中生长，其中所述能量源包含CO和/或CO₂。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述培养为严格厌氧的。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述培养为严格厌氧的。

17.根据权利要求13所述的方法，其中所述碳源包含工业废料产物或废气。

18.根据权利要求14所述的方法，其中所述能量源包含工业废料产物或废气。

19.根据权利要求13所述的方法，其中3-HP被转化成选自由以下组成的群组的材料：丙烯酸、丙烯腈、油漆、纸、粘合剂、纺织物、专用涂料、油墨、超吸收性聚合物聚丙烯酸酯、1，3-丙二醇、溶剂、粘合剂、化妆品、聚对苯二甲酸丙二醇酯、3-羟基丙醛、食品、饲料添加剂以及它们的任何组合。

20.根据权利要求14所述的方法，其中3-HP被转化成选自由以下组成的群组的材料：丙烯酸、丙烯腈、油漆、纸、粘合剂、纺织物、专用涂料、油墨、超吸收性聚合物聚丙烯酸酯、1，3-丙二醇、溶剂、粘合剂、化妆品、聚对苯二甲酸丙二醇酯、3-羟基丙醛、食品、饲料添加剂以及它们的任何组合。