CN103620028B - 具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 - Google Patents

具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽、催化域和纤维素结合域，以及编码所述多肽、催化域和纤维素结合域的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于产生和使用所述多肽、催化域或纤维素结合域的方法。

Description

具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
对于在联邦资助的研究和开发下完成的发明的权利的声明
本发明是部分地在由能源部授予的合作协议(Cooperative Agreement)DE-FC36-08GO18080下以政府支持完成的。政府在本发明中具有一定权利。
涉及序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。
涉及生物材料的保藏
本申请包含对生物材料的保藏的引用，该保藏通过提述并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及具有纤维二糖水解酶活性的多肽，催化域和纤维素结合域，和编码所述多肽、催化域或纤维素结合域的多核苷酸。本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽、催化域和纤维素结合域的方法。
背景技术
纤维素是简单糖葡萄糖通过β-1,4-键共价连接的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，使其暴露于纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序地释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的β-1,4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。
将含木素纤维素原料(lignocellulosic feedstock)转化为乙醇具有以下优势：大量原料现成可用，避免燃烧或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将木素纤维素转化成可发酵的糖例如葡萄糖，所述可发酵的糖容易地由酵母发酵成乙醇。
本发明提供了具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸。
发明内容
本发明涉及具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽，其选自下组：
(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85%序列同一性；
(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补物；
(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少85%序列同一性；
(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽在一个或多个(例如几个)位置包含取代、缺失和/或插入的变体；和
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有纤维二糖水解酶活性的片段。
本发明亦涉及分离的多肽，其包含催化域，所述催化域选自下组：
(a)催化域，其与SEQ ID NO:2的氨基酸98至456具有至少90%序列同一性；
(b)催化域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸397至1786，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补物；
(c)催化域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸397至1786，或其cDNA序列具有至少90%序列同一性；
(d)SEQ ID NO:2的氨基酸98至456在一个或多个(例如几个)位置包含取代、缺失和/或插入的变体；和
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的催化域的具有纤维二糖水解酶活性的片段。
本发明亦涉及分离的多肽，其包含纤维素结合域，所述纤维素结合域选自下组：
(a)纤维素结合域，其与SEQ ID NO:2的氨基酸20至56具有至少90%序列同一性；
(b)纤维素结合域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸58至273，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补物；
(c)纤维素结合域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸58至273或其cDNA序列具有至少90%序列同一性；
(d)SEQ ID NO:2的氨基酸20至56在一个或多个(例如几个)位置包含取代、缺失和/或插入的变体；和
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的纤维素结合域的具有纤维素结合活性的片段。
本发明亦涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞；和产生所述多肽的方法。
本发明亦涉及降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在本发明的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的存在下用酶组合物处理纤维素材料。
本发明亦涉及产生发酵产物的方法，其包括：(a)在本发明的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的存在下用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。
本发明亦涉及发酵纤维素材料的方法，其包括用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料在本发明具有纤维二糖水解酶活性的多肽的存在下用酶组合物糖化。
本发明亦涉及编码信号肽的多核苷酸，所述信号肽包含或组成为(consist of)SEQ ID NO:2的氨基酸1至19，其可操作地连接于编码蛋白的基因；包含所述多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞；和产生蛋白的方法。
附图说明
图1显示Talaromyces byssochlamydoides家族GH6纤维二糖水解酶在通过高温酶组合物(HTM)在50-65℃水解经磨制、未经洗涤的PCS中的作用。
图2显示Talaromyces byssochlamydoides GH6纤维二糖水解酶(Tb6)，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GH6A纤维二糖水解酶(Af6A)和嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)GH6A纤维二糖水解酶(Mt6A)在烟曲霉β-葡糖苷酶的存在下在50-65℃和pH4.0-5.0对经磨制、洗涤的PCS的水解的作用。
定义
乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01%TWEENTM20(聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯)的50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH5,25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。
等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化对α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本发明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积200μl中的每ml的100mM乙酸钠pH5中5mg的中等粘度小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme International Ireland,Ltd.,Bray,Co.Wicklow,Ireland)在40℃进行30分钟，接着通过HPX-87H柱层析(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析来确定的。
α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase)(EC3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据de Vries,1998,J.Bacteriol.180:243-249确定的。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH5，40℃每分钟释放1微摩尔葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶量。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，β-葡糖苷酶根据Venturi等,2002,Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and some biochemical properties,J.Basic Microbiol.42:55-66的方法使用对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷作为底物确定。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃,pH4.8，在含有0.01%20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D-木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃，pH5在含有0.01%20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。
催化域：术语“催化域”意指含有酶的催化机构(catalytic machinery)的酶的区域。
cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工包括剪接，然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase)(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维寡糖，或任何包含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystalline cellulose degradation:New insight into the function of cellobiohydrolases,Trends inBiotechnology15:160-167;Teeri等,1998,Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose?,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。根据Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279；van Tilbeurgh等,1982,FEBS Letters149:152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters187:283-288；以及Tomme等,1988,Eur.J.Biochem.170:575-581描述的方法确定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，Tomme等的方法可用于确定纤维二糖水解酶活性。
本发明的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的纤维二糖水解酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，或至少100%。
纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，β-葡糖苷酶，或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等,Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies,2006,Biotechnology Advances24:452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman No.1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatman No.1滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由International Union of Pure and AppliedChemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurement of cellulase activities,PureAppl.Chem.59:257-68)确立的。
就本发明而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS中纤维素(或其它经预处理的纤维素材料)在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃进行3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较。通常条件为：1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸钠pH5，1mM MnSO4，50℃、55℃或60℃，72小时，通过HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖分析。
纤维素结合域：术语“纤维素结合域”意指介导酶对纤维素底物的无定形区的结合的酶的区域。纤维素结合域(CBD)通常见于酶的N末端或C末端。
纤维素材料：术语“纤维素材料”意指包含纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，农业残余物、草本材料(包括能量作物)、城市固体废物、纸浆与造纸厂残余物、废纸和木材(包括林业残余物)(参见，例如，Wiselogel等,1995,于Handbook onBioethanol(Charles E.Wyman编),pp.105-118,Taylor&Francis,Washington D.C.;Wyman,1994,Bioresource Technology50:3-16;Lynd,1990,Applied Biochemistry andBiotechnology24/25:695-719;Mosier等,1999,Recent Progress in Bioconversion ofLignocellulosics,于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,T.Scheper主编,Volume65,pp.23-40,Springer-Verlag,New York)。在本文中应理解的是，纤维素可以是以木素纤维素的形式，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选的方面，纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选的方面，所述纤维素材料是木素纤维素，其包含纤维素、半纤维素和木质素。
在一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是草本材料(包括能量作物)。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是木材(包括林业残余物)。
在另一个方面，纤维素材料是芦竹(arundo)。在另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面，纤维素材料是竹材。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是芒草属。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一个方面，纤维素材料是麦杆。
在另一个方面，纤维素材料是白杨。在另一个方面，纤维素材料是桉树。在另一个方面，纤维素材料是枞树(fir)。在另一个方面，纤维素材料是松树。在另一个方面，纤维素材料是杨树。在另一个方面，纤维素材料是云杉。在另一个方面，纤维素材料是柳树。
在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉绒(cotton linter)。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是磷酸处理的纤维素。
在另一个方面，纤维素材料是水生生物质。如用于本文中，“水生生物质”意指在水生环境中由光合作用过程产生的生物质。水生生物质可为藻类、挺水植物(emergentplant)、浮叶植物(floating-leaf plant)或沉水植物(submerged plant)。
纤维素材料可以按原样(as is)使用或进行预处理，使用本领域已知的常规方法，如本文所述。在一个优选的方面，预处理纤维素材料。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，所述开放阅读框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指对编码本发明的成熟多肽的多核苷酸表达是必需的核酸序列。各个调控序列对于编码所述成熟多肽的多核苷酸可以是天然的(即，来自同一基因)或外源的(即，来自不同基因)，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等,2006,Biotechnology Advances24:452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40℃使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的调控序列可操作地连接。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”在本文中定义为根据Henrissat B.,1991,A classification of glycosyl hydrolases based onamino-acid sequence similarities,Biochem.J.280:309-316,及Henrissat B.和Bairoch A.,1996,Updating the sequence-based classification of glycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。该家族中的酶原先基于在一个家族成员测量到的非常弱的内切-1,4-β-D葡聚糖酶活性而归类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是非经典的，且它们无法视为真正的(bona fide)糖苷酶。然而，基于当与纤维素酶或纤维素酶的混合物一同使用时，其增强木素纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。
阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)”意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在“天然生物质”底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。就本发明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在pH5，25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子的酶量。
片段：术语“片段”意指从成熟多肽或者催化域或纤维素结合域的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如几个)氨基酸的多肽或域；其中所述片段具有纤维二糖水解酶或纤维素结合活性。在一个方面，所述片段含有至少375个氨基酸残基，例如至少395个氨基酸残基，或至少415个氨基酸残基。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如Shallom和Shoham(2003)Microbialhemicellulases.Current Opinion In Microbiology,2003,6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键成分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物，半纤维素，是支化和直链多糖的混杂集团，这些多糖通过氢键键合于植物细胞壁中的纤维素微纤维，将其交联为鲁棒(robust)的网络。半纤维素亦共价地附于木质素，与纤维素一同形成高度复杂的结构。半纤维素的可变的结构和组织形式需要许多酶的协同作用使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸侧基的酯连接的糖酯酶(CE)。这些催化模块，基于其一级结构的同源性，可指派为GH和CE家族。一些家族，具有总体上类似的折叠，可进一步归类为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。最具信息性和最新的这些和其他糖活性酶的分类可在Carbohydrate-Active Enzymes(CAZy)数据库获得。半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&Appl.Chem.59:1739-1752在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃，和pH，例如5.0或5.5进行测量。
高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在65℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖任何亲本细胞的后代，其由于在复制中发生的突变而不同于亲本细胞。
分离的：术语“分离的”意指以不在自然界出现的形式或环境存在的物质。分离的物质的非限定性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)任何至少部分地从一种或多种或全部与其天然结合的天然存在的成分移出的物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)任何相对于见于自然界的该物质经人工修饰的物质；或(4)任何通过相对于与其自然结合的其他组分增加该物质的量(例如，编码该物质的基因的多拷贝；比与编码该物质的基因自然结合的启动子更强的启动子的使用)而修饰的物质。本发明的多肽可以以发酵液产物的形式用于工业应用，即本发明的多肽是在工业应用(例如乙醇产生)中作为产物使用的发酵液的组分。所述发酵液产物除了本发明的多肽之外，还会包含其它用于发酵工艺的成分，如例如细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，其用于产生感兴趣的多肽)，细胞碎片，生物质，发酵培养基和/或发酵产物。可任选地对发酵液进行一个或多个纯化(包括过滤)步骤以去除或减少一种或多种发酵工艺的组分。相应地，分离的物质可在此种发酵液产物中存在。
低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和25%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在50℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面，根据预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序(Nielsen等,1997,ProteinEngineering10:1-6)，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸20至456。在本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有纤维二糖水解酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，根据预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序(Nielsen等,1997，见上)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸58至1786。
中等严格条件：术语“中等严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在55℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
中等-高严格条件：术语“中等-高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在60℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其经修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包含一个或多个调控序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。
具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。就本发明而言，通过测量来自由纤维素分解酶在下述条件下水解纤维素材料的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g PCS中纤维素，其中总蛋白包含50-99.5%w/w的纤维素分解酶蛋白，及0.5-50%w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质，在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃和pH，例如5.0或5.5历时1-7天，与用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中纤维素)所进行的对照水解相比。在一个优选的方面，使用在总蛋白重量的2-3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白质量的2-3%的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO2002/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的1.5L(Novozymes A/S,Denmark)的混合物作为纤维素分解活性的来源。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，例如至少1.05倍，至少1.10倍，至少1.25倍，至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少10倍，或至少20倍。
预处理的玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”意指通过用热和稀硫酸处理、碱预处理或中性预处理的源自玉米秸秆的纤维素材料。
序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,TrendsGenet.16:276-277)，优选5.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的参数为缺口打开罚分(gap open penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,见上文)，优选5.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的参数为缺口打开罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(例如几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有纤维二糖水解酶活性的片段。在一个方面，所述亚序列含有至少1125个核苷酸，例如至少1185个核苷酸，或至少1245个核苷酸，或它们的cDNA序列。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如几个)位置包含改变，即取代、插入和/或缺失的具有纤维二糖水解酶活性的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指在邻接并紧接着占据某位置的氨基酸之后添加氨基酸。
非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在70℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和25%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在45℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
含木聚糖材料：术语“含木聚糖材料”意指任何包含含有β-(1-4)连接的木糖残基骨架的植物细胞壁多糖的材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-吡喃木糖骨架的杂聚物，其由短的糖链分支。它们包含D-葡糖醛酸或其4-O-甲基醚，L-阿拉伯糖和/或多种包含D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖和D-葡萄糖的寡糖。木聚糖类型的多糖可分为均木聚糖(homoxylan)和杂木聚糖(heteroxylan)，后者包括葡糖醛酸木聚糖，(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖，(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖，阿拉伯木聚糖和复合杂木聚糖。参见，例如Ebringerova等,2005,Adv.Polym.Sci.186:1-67。
在本发明的方法中，可使用任何含有木聚糖的材料。在一个优选的方面，所述含木聚糖材料是木素纤维素。
木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括：(1)测定总木聚糖分解活性，和(2)测定单独的木聚糖分解活性(例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶(α-glucuronyl esterase))。最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely和Puchard,2006,Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes,Journal of the Science of Food和Agriculture86(11):1636-1647；Spanikova和Biely,2006,Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced bySchizophyllum commune,FEBS Letters580(19):4597-4601；Herrmann等,1997,The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylanxylohydrolase,Biochemical Journal321:375-381。
总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量，所述木聚糖包括例如燕麦小麦(oat spelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木(larchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey等,1992,Interlaboratory testing of methods for assay of xylanaseactivity,Journal of Biotechnology23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在37℃在0.01%X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)和200mM磷酸钠缓冲液pH6中来确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH6在200mM磷酸钠pH6缓冲液中从作为底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青蛋白(azurine)。
就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常条件下造成的桦木木聚糖(Sigma Chemical Co.,Inc.,St.Louis,MO,USA)水解的增加来确定的：1ml反应液，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠，pH5，50℃，24小时，如Lever,1972,A new reaction for colorimetric determination ofcarbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法进行糖分析。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解。就本发明而言，木聚糖酶活性是使用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH6在200mM磷酸钠pH6缓冲液中从作为底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青蛋白。
发明详述
具有纤维二糖水解酶活性的多肽
在一个实施方案中，本发明涉及分离的多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85%，例如至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性，其具有纤维二糖水解酶活性。在一个方面，所述多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差多至10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。
本发明的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位变体；或为其具有纤维二糖水解酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸20至456。
在另一个实施方案中，本发明涉及具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严格条件，低严格条件，中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补物(Sambrook等,1989,MolecularCloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,New York)。
SEQ ID NO:1的多核苷酸或其亚序列，以及SEQ ID NO:2的多肽或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少15，例如至少25，至少35，或至少70个核苷酸。优选地，所述核酸探针是至少100个核苷酸的长度，例如，至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少400个核苷酸，至少500个核苷酸，至少600个核苷酸，至少700个核苷酸，至少800个核苷酸，或至少900个核苷酸的长度。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。
可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其亚序列杂交的克隆或DNA，将所述载体材料用在Sounthern印迹中。
就本发明而言，杂交表示多核苷酸在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于下述：(i)SEQ ID NO:1，(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(iii)其cDNA序列，(iv)它们的全长互补物，或(v)它们的亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)或其他任何本领域中已知的检测手段检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
在一个方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸58至1786，或其cDNA序列。在另一个方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽或其成熟多肽，或它们的片段的多核苷酸。在另一个方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:1或其cDNA序列。在另一个方面，所述核酸探针是包含于质粒pAJ227的多核苷酸，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50474，其中所述多核苷酸编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽。在另一个方面，所述核酸探针是包含于质粒pAJ227的成熟多肽编码区，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50474。
在另一个实施方案中，本发明涉及具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少85%，例如至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。
在另一个实施方案中，本发明涉及SEQ ID NO:2的成熟多肽在一个或多个(例如几个)位置包含取代、缺失和/或插入的变体。在一个实施方案中，导入SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的数量是多至10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。氨基酸改变可为性质上较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。
保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
或者，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改善多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。
能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸扫描诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且就纤维二糖水解酶测试所得突变分子以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等,1992,Science255:306-312；Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的身份也能够从与相关多肽的同一性分析来推断。
可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57;Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156;WO95/17413;或者WO95/22625所公开的那些，进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等,1991,Biochemistry30:10832-10837;美国专利号5,223,409;WO92/06204)和区域定向诱变(region-directed mutagenesis)(Derbyshire等,1986,Gene46:145;等,1988,DNA7:127)。
诱变/改组方法可与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的经克隆、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology17:893-896)。编码活性多肽的经诱变的DNA分子可自宿主细胞回收并使用本领域标准方法迅速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
所述多肽可为杂合多肽，其中一个多肽的区域融合于另一个多肽的区域的N端或C端。
所述多肽可为融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽融合于本发明的多肽的N端或C端。通过将编码另一个多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们符合读框(in frame)，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。融合蛋白亦可使用内蛋白(intein)技术构建，其中融合物在翻译后产生(Cooper等,1993,EMBO J.12:2575-2583;Dawson等,1994,Science266:776-779)。
融合多肽还可以在两个多肽之间包含切割位点。在分泌融合多肽时，就切割所述位点，释放所述两个多肽。切割位点的实例包括，但不限于，公开于Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等,1995,Biotechnology13:498-503;和Contreras等,1991,Biotechnology9:378-381；Eaton等,1986,Biochem.25:505-512)；Collins-Racie等,1995,Biotechnology13:982-987；Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World4:35-48中的位点。
具有纤维二糖水解酶活性的多肽的来源
本发明的具有纤维二糖水解酶活性的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思应为由多核苷酸编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的菌株产生。在一个方面，从给定来源获得的多肽是胞外分泌的。
所述多肽可为细菌多肽。例如，所述多肽可为革兰氏阳性细菌多肽例如具有纤维二糖水解酶活性的芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)多肽。
在一个方面，所述多肽是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。
在另一个方面，所述多肽是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。
在另一个方面，所述多肽是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。
所述多肽亦可为真菌多肽。例如，所述多肽可为酵母多肽如具有纤维素分解增强活性的假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽；或丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽。
在另一个方面，所述多肽是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。
在另一个方面，所述多肽是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、Talaromyces byssochlamydoides、埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)、Talaromyces stipitatus、无色梭孢壳(Thielaviaachromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、绿色木霉(Trichoderma viride)或Trichophaea saccata多肽。
在另一个方面，所述多肽是Talaromyces byssochlamydoides多肽，例如从Talaromyces byssochlamydoides CBS413.71获得的多肽。
可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域技术人员将容易地识别适合的等同物的身份。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)(DSMZ)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau VoorSchimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern RegionalResearch Center)(NRRL)。
可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接获得自自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)的DNA样品鉴定和获得所述多肽。用于直接从天然生境(habitat)分离微生物和DNA的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来得到编码所述多肽的多核苷酸。一旦用探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以使用本领域普通技术人员已知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
催化域
在一个实施方案中，本发明亦涉及催化域，其与SEQ ID NO:2的氨基酸98至456具有至少90%，例如至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。在另一个实施方案中，所述催化域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸98至456相差多至10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。
在一个优选实施方案中，所述催化域优选包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸98至456或其等位变体；或为其具有纤维二糖水解酶活性的片段。
在另一个实施方案中，本发明亦涉及催化域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严格条件，低严格条件，中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件(如上所定义)下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸397至1786，(ii)其cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补物(Sambrook等,1989,见上文)。
在另一个实施方案中，本发明亦涉及催化域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸397至1786或其cDNA序列具有至少90%，例如至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。
在一个优选实施方案中，编码催化域的多核苷酸优选包含或组成为SEQ ID NO:1的核苷酸397至1786，或是包含于质粒pAJ227的序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50474。
在另一个实施方案中，本发明亦涉及SEQ ID NO:2的氨基酸98至456在一个或多个(例如几个)位置包含取代、缺失和/或插入的催化域变体。在另一个实施方案中，导入SEQID NO:2的氨基酸98至456的氨基酸取代、缺失和/或插入的数量是10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
结合域
在一个实施方案中，本发明亦涉及纤维素结合域，其与SEQ ID NO:2的氨基酸20至56具有至少90%，例如至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。在另一个实施方案中，所述纤维素结合域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸20至56相差多至10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。
在一个优选实施方案中，所述纤维素结合域优选包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸20至56或其等位变体；或为其具有纤维素结合活性的片段。
在另一个实施方案中，本发明亦涉及纤维素结合域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严格条件，低严格条件，中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件(如上所定义)下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸58至273，(ii)SEQ IDNO:1的核苷酸58至273的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补物(Sambrook等,1989,见上文)。
在另一个实施方案中，本发明亦涉及纤维素结合域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸58至273具有至少90%，例如至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。
在一个优选实施方案中，编码纤维素结合域的多核苷酸包含或组成为SEQ ID NO:1的核苷酸58至273，或是包含于质粒pAJ227的序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50474。
在另一个实施方案中，本发明亦涉及SEQ ID NO:2的氨基酸20至56在一个或多个(例如几个)位置包含取代、缺失和/或插入的纤维素结合域变体。在另一个实施方案中，导入SEQ ID NO:2的氨基酸20至56的氨基酸取代、缺失和/或插入的数量是10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
可操作地连接于结合域的催化域可来自水解酶、异构酶、连接酶、裂合酶、氧还酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶(chitinase)、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。编码催化域的多核苷酸可获得自任何原核、真核或其它来源。
多核苷酸
本发明亦涉及编码如本文中所述的本发明的多肽、催化域或纤维素结合域的分离的多核苷酸。
用于分离或克隆多核苷酸的技术在本领域中是已知的，并包括包括从基因组DNA或cDNA分离，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆多核苷酸。参见，例如，Innis等,1990,PCR:A Guide to Methods and Application,Academic Press,New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivated transcription；LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。可以从踝节菌属的菌株，或相关生物体克隆所述多核苷酸，因此，例如可为所述多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。
修饰编码本发明多肽的多核苷酸对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可为必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。可以在作为SEQ ID NO:1或cDNA的成熟多肽编码序列呈现的多核苷酸的基础上和/或通过引入如下核苷酸取代：所述取代不导致多肽氨基酸序列的改变，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子使用；或者通过导入可产生不同的氨基酸序列的核苷酸取代来构建变体。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford等,1991,Protein Expression andPurification2:95-107。
核酸构建体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。
可以用许多方式操作所述多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
调控序列可为启动子，其由用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的宿主细胞所识别的多核苷酸。启动子含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等,1988,Gene69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of theNational Academy of Sciences USA75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25)。另外的启动子在"Useful proteins fromrecombinant bacteria"于Gilbert等,1980,Scientific American,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,见上文中描述。串联启动子的实例公开于WO99/43835。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、里氏木霉翻译延伸因子，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自在曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。其它启动子描述于美国专利号6,011,147。
在酵母宿主中，有用的启动子从如下的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast8:423-488描述。
调控序列也可以是转录终止子，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。在本发明中，可使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
对于细菌宿主细胞优选的终止子从如下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定化区，其增加所述基因的表达。
合适的mRNA稳定化区的实例从如下的基因获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等,1995,Journal of Bacteriology177:3465-3471)。
调控序列还可以是合适的前导序列，其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.15:5983-5990描述。
调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N端相连的信号肽，并指导所述多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码所述多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews57:109-137描述。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子的基因获得前肽编码序列。
当信号肽和前肽序列二者均存在时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽的N端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。
同样理想的是添加调节序列，其相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节序列包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子和里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述多核苷酸的核酸构建体或多核苷酸来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的调控序列可操作地连接以供表达。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
所述载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于adeA(磷酸核糖氨基咪唑琥珀羧酰胺合酶，phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamide synthase)、adeB(磷酸核糖氨基咪唑合酶，phosphoribosyl-aminoimidazole synthase)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选用于木霉属细胞的是adeA、adeB、amdS、hph和pyrG基因。
选择性标记可为WO2010/039889中所述的双重选择性标记系统。在一个方面，所述双重选择性标记是hph-tk双重选择性标记系统。
所述载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可为任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可为非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸可操作地连接于一个或多个指导本发明多肽的产生的调控序列。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞，使所述构建体或载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。
可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，感受态细胞转化(参见，例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：原生质体转化，电穿孔(参见，例如，Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：电穿孔(参见，例如，Choi等,2006,J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
宿主细胞还可为真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可为真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)。
真菌宿主细胞可为酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,Passmore,和Davenport编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。
酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖构成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474以及Christensen等,1988,Bio/Technology6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology,Methods in Enzymology,Volume194,pp182-187,Academic Press,Inc.,NewYork；Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920。
产生方法
本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个方面，所述细胞是踝节菌属的细胞。在另一个方面，所述细胞是Talaromyces byssochlamydoides细胞。在另一个方面，所述细胞是Talaromyces byssochlamydoides CBS413.71。
本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。
所述细胞使用本领域已知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下的摇瓶培养，或实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法(enzymeassay)可用于确定多肽的活性。
多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,Janson和Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)。
在另一个方面，不回收多肽，而是使用表达所述多肽的本发明的宿主细胞作为所述多肽的来源。
植物
本发明还涉及分离的植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含本发明的多核苷酸，从而以可回收的量表达和产生所述多肽或域。多肽或域可从植物或植物部分回收。或者，可以按原样(as such)将含有该多肽或域的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheologicalproperties)，或用于破坏抗营养因子。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vascular tissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。
同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的后代。
表达多肽或域的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码多肽或域的一个或多个表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的经修饰的植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
表达构建体便利地是包含编码多肽或域的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定植物细胞有用的选择性标记，在所述植物细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。
调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽或域而确定。例如，编码多肽或域的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分如种子或叶。调节序列由例如Tague等,1988,PlantPhysiology86:506所述。
对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1或稻肌动蛋白1启动子(Franck等,1980,Cell21:285-294,Christensen等,1992,Plant Mo.Biol.18:675-689；Zhang等,1991,Plant Cell3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storagesink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等,1994,Plant Mol.Biol.24:863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等,1998,Plant Cell Physiol.39:885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Viciafaba)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等,1998,J.Plant Physiol.152:708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等,1998,Plant CellPhysiol.39:935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在WO91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等,1993,PlantPhysiol.102:991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adeninemethyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins,1994,Plant Mol.Biol.26:85-93)，来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等,1995,Mol.Gen.Genet.248:668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等,1993,Plant Mol.Biol.22:573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。
启动子增强子元件也可以用于实现多肽或域在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码多肽或域的多核苷酸之间。例如Xu等,1993,见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。
将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等,1990,Science244:1293；Potrykus,1990,Bio/Technology8:535；Shimamoto等,1989,Nature338:274)。
根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(gene transfer)，是一种产生转基因双子叶植物(其综述，参见Hooykas和Schilperoort,1992,PlantMol.Biol.19:15-38)，和用于转化单子叶植物的方法，虽然对于这些植物可使用其他的转化方法。一种产生转基因单子叶植物的方法是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou,1992,Plant J.2:275-281；Shimamoto,1994,Curr.Opin.Biotechnol.5:158-162；Vasil等,1992,Bio/Technology10:667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等,1993,Plant Mol.Biol.21:415-428所描述的。其它转化方法包括描述于美国专利号6,395,966和7,151,204中的那些(两者均通过提述以其整体并入本文)。
转化之后，根据本领域熟知的方法选择具有并入的表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
除了直接用本发明的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可通过将具有构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制备转基因植物。举例而言，可将编码多肽或域的构建体通过杂交而引入特定植物品种，而根本无需直接转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖从依照本发明经转化的细胞直接再生的植物，还包括此类植物的后代(progeny)。如用于本文，后代可指依照本发明制备的亲本植物任何世代的后裔(offspring)。此种后代可包含依据本发明制备的DNA构建体。杂交导致转基因通过将起始种系供体植物种系交叉授粉而引入植物种系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7,151,204。
植物通过回交转化方法生成。举例而言，该植物包括称作回交转化的基因型、种系、近交体(inbred)或杂交体(hybrid)的植物。
可使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景基因渗入(introgression)至另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可用于避免由表型变异导致的错误。进一步，遗传标记可在特定杂交的个体后代中提供有关良种种质相对程度的数据。举例而言，当本不(otherwise)具有非农艺学所需的遗传背景但具有所需性状的植物与良种亲本杂交时，可使用遗传标记来选择不仅具有目标性状，还具有相对较大比例所需种质的后代。以此方式，使一种或多种性状基因渗入特定遗传背景所需的世代数得到最小化。
本发明亦涉及产生本发明的多肽或域的方法，其包括：(a)在有助于产生所述多肽或域的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述植物或植物细胞包含编码多肽或域的多核苷酸；和(b)回收所述多肽或域。
去除或减少纤维二糖水解酶活性
本发明还涉及用于产生亲本细胞突变体的方法，其包括破坏或缺失编码本发明的多肽的多核苷酸或其部分，所述方法导致在相同条件下培养时，与亲本细胞相比突变的细胞产生较少的所述多肽。
可以使用本领域熟知的方法(例如，插入、破坏、替代或缺失)通过减少或消除多核苷酸的表达来构建突变细胞。在一个优选的方面，所述多核苷酸是失活的。待修饰或失活的多核苷酸可以是，例如，编码区或其对活性关键的部分，或表达编码区所需的调节元件。这种调节或调控序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即，足以影响多核苷酸表达的部分。用于可能的修饰的其它调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子和转录激活子。
可以通过向亲本细胞施以诱变，并且选择其中已将多核苷酸的表达减少或消除的突变细胞来进行多核苷酸的修饰或失活。诱变可能是特异性的或随机的，可以通过例如使用合适的物理或化学诱变剂进行，通过使用合适的寡核苷酸进行，或通过将所述DNA序列进行PCR产生的诱变。此外，可以通过使用这些诱变剂的任何组合来进行诱变。
适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethyl methanesulphonate)(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。
当使用这些试剂时，通常通过如下方法来进行所述诱变：在合适条件下存在优选的诱变剂时温育待诱变的亲本细胞，并筛选和/或选择显示基因表达减少的或无基因表达的突变体细胞。
通过插入、取代或缺失基因中的一个或多个核苷酸或其转录或翻译所需的调控元件可以实现多核苷酸的修饰或失活。例如，可以插入或去除核苷酸从而导致引入终止密码子，去除起始密码子，或改变开放阅读框。按照本领域已知的方法通过定位诱变或PCR产生的诱变可以实现这种修饰或失活。尽管在理论上所述修饰可以在体内进行，即，直接在表达待修饰的多核苷酸的细胞上进行，但优选如下面所示例的那样在体外进行所述修饰。
消除或减少多核苷酸表达的便利方式的例子是基于基因取代，基因缺失，或基因破坏的技术。例如，在基因破坏方法中，将相应于内源多核苷酸的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷性的核酸序列，然后将其转化入亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，所述缺陷性核酸序列替代了内源性多核苷酸。理想的是所述缺陷性多核苷酸还编码标记，其可用于选择其中多核苷酸被修饰或破坏的转化子。在一个方面，用可选择的标记(如本文所述的那些)来破坏所述多核苷酸。
本发明亦涉及在细胞中抑制具有纤维二糖水解酶活性的多肽的表达的方法，其包括向细胞施用或在细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本发明的多核苷酸的亚序列。在一个优选的方面，所述dsRNA长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链体核苷酸。
所述dsRNA优选为小干扰RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一个优选的方面，所述dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA。在另一个优选的方面，所述dsRNA是用于抑制翻译的微RNA。
本发明亦涉及这样的双链RNA(dsRNA)分子，其包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的一部分，以供在细胞中抑制所述多肽的表达。尽管本发明并不受任何具体作用机制的限制，但所述dsRNA可进入细胞并导致类似或相同序列的单链RNA(ssRNA)，包括内源mRNA的降解。当细胞暴露于dsRNA时，来自同源基因的mRNA通过称为RNA干扰(RNAi)的过程受选择性降解。
本发明的dsRNA可用于基因沉默。在一个方面，本发明提供了使用本发明的dsRNAi选择性降解RNA的方法。该方法可在体外、离体或体内实践。在一个方面，所述dsRNA分子可用于在细胞、器官或动物中生成功能丧失的突变。用于制备和使用dsRNA分子选择性降解RNA的方法是本领域中公知的，参见，例如美国专利号6,489,127；6,506,559；6,511,824；和6,515,109。
本发明进一步涉及亲本细胞的突变体细胞，其包含编码多肽的多核苷酸或其调控序列的破坏或缺失或编码所述多肽的基因的沉默，这导致与亲本细胞相比突变体细胞产生更少的多肽或不产生多肽。
多肽缺陷型突变细胞作为表达天然和异源多肽的宿主细胞特别有用。所以，本发明进一步涉及生产天然或异源多肽的方法，其包括：(a)在有助于生产多肽的条件下培养突变细胞;和(b)回收所述多肽。术语“异源多肽”意指对宿主细胞不是天然的多肽，例如，天然蛋白的变体。宿主细胞可包含超过一个拷贝的编码所述天然或异源多肽的多核苷酸。
用于培养和纯化感兴趣的产物的方法可以通过本领域已知的方法进行。
本发明用于产生基本上无纤维二糖水解酶活性的产物的方法在真核多肽，特别是真菌蛋白质例如酶的产生中是特别令人有兴趣的。纤维二糖水解酶缺陷细胞也可以用于表达在制药上感兴趣的异源蛋白质例如激素、生长因子、受体等。术语“真核多肽”不仅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通过氨基酸取代、缺失或添加或其它这样的修饰而被修饰以增强活性、热稳定性、pH耐受性等。
在另外的方面，本发明涉及基本上无纤维二糖水解酶活性的蛋白质产物，其通过本发明的方法产生。
组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，所述组合物富含此种多肽。术语“富含”表明所述组合物的纤维二糖水解酶活性以例如至少1.1的富集因子增加。
所述组合物可包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。或者，所述组合物可包含多种酶活性，如选自下组的一个或多个(例如几个)其它酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素(expansin)、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
所述组合物可依照本领域中已知的方法制备，并可为液体或干组合物的形式。所述组合物可依照本领域中已知的方法稳定化。
在一个实施方案中，所述组合物进一步包含一种或多种选自下组的酶：一种或多种(例如几种)木聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶、酯酶、蛋白酶、内切葡糖苷酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1,3(4)-葡聚糖酶、角质酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、漆酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、多酚氧化酶、木质素酶、普鲁兰酶(glucoamylase)、阿拉伯聚糖酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、果胶乙酰基酯酶、聚鼠李半乳糖醛酸(rhamnogalacturonan)乙酰基酯酶、聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonases)、聚鼠李糖聚半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonases)、半乳聚糖酶、果胶裂合酶、果胶甲基酯酶和转谷氨酰胺酶。
本发明可依照本领域已知方法制备，并可具有任何物理外观如液体、糊或固体。例如，所述多肽组合物可使用本领域中已知的配制酶和/或药品的方法来配制，例如配置为包被或未包被的颗粒或微颗粒。待包含于所述组合物的多肽可依照本领域中已知的方法稳定化，例如通过添加抗氧化剂或还原剂以限制氧化，或者，所述多肽可通过添加聚合物如PVP、PVA、PEG或其它已知对固体或液体组合物中的多肽的稳定性有益的合适聚合物来稳定化。
所述组合物可为发酵液配制物或细胞组合物，如本文中所述。因此，本发明亦涉及发酵液配制物和细胞组合物，其包含本发明的具有纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、纤维素分解增强或木聚糖酶活性的多肽。在一些实施方案中，所述组合物是含有机酸的细胞杀灭的全培养液，杀灭的细胞和/或细胞碎片，以及培养基。
术语“发酵液”用于本文中指由细胞发酵产生、不经历或仅经历最低限的回收和/或纯化的制备物。举例而言，当将微生物培养物生长至饱和，在限制碳的条件下温育以允许蛋白合成(例如由宿主细胞表达酶)，并分泌入细胞培养基时，产生发酵液。所述发酵液可含有在发酵终止时得到的发酵材料的未分级或分级的内含物。通常而言，发酵液是未分级的，并包含用过的培养基和例如通过离心去除微生物细胞(例如丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施方案中，所述发酵液含有用过的细胞培养基，胞外酶，和能成活的和/或不能成活的(viable and/or nonviable)微生物细胞。
在一个实施方案中，所述发酵液配制物和细胞组合物包含第一有机酸组分和第二有机酸组分，所述第一有机酸组分包含至少一个1-5碳的有机酸和/或其盐，而所述第二有机酸组分包含至少一个6个或更多个碳的有机酸和/或其盐。在一个具体实施方案中，所述第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述两个或更多个的混合物，而所述第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基缬草酸、苯乙酸、其盐，或前述两个或更多个的混合物。
在一个方面，所述组合物含有有机酸，并任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施方案中，从细胞杀灭的全培养液中移除所述杀灭的细胞和/或细胞碎片以提供不含这些组分的组合物。
所述发酵液配制物或细胞组合物可进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾和其它本领域中已知的。
所述细胞杀灭的全培养液或组合物可进一步包含一种或多种酶活性，如乙酰木聚糖酯酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、内切-β-1,3(4)-葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡糖水解酶、杂合过氧化物酶(其具有木质素过氧化物酶和锰依存性过氧化物酶的组合性质)、漆酶、木质素过氧化物酶、锰依存性过氧化物酶、甘露聚糖酶、甘露聚糖乙酰酯酶、甘露糖苷酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶裂合酶、果胶甲酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖裂合酶(rhamnogalacturonan lyase)、鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶(rhamnogalacturonanacetyl esterase)、鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)、木聚糖酶、木半乳糖醛酸糖苷酶(xylogalacturonosidase)、木半乳糖醛酸酶(xylogalacturonase)、木葡聚糖酶和木糖苷酶。
在一个实施方案中，所述细胞杀灭的全培养液或组合物包含纤维素分解酶，其包括但不限于(i)内切葡聚糖酶(EG)或1,4-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.4)，(ii)外切葡聚糖酶，其包括1,4-D-葡聚糖葡聚糖水解酶(亦称作纤维糊精酶)(EC3.2.1.74)和1,4-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(外切纤维二糖水解酶，CBH)(EC3.2.1.91)，和(iii)β-葡糖苷酶(BG)或β-葡糖苷葡糖水解酶(EC3.2.1.21)。
所述细胞杀灭的全培养液或组合物可含有在发酵终止时得到的发酵材料的未分级内含物。通常而言，所述细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的培养基和在将微生物细胞(例如丝状真菌细胞)生长至饱和，在限制碳的条件下温育以允许蛋白合成(例如纤维素酶和/或葡糖苷酶的表达)之后存在的细胞碎片。在一些实施方案中，所述细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基，胞外酶，和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施方案中，在细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞可使用本领域中已知的方法渗透和/或裂解。
如本文中所述的全培养液或细胞组合物通常为液体，但可含有不溶性组分，如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或不溶性酶。在一些实施方案中，可去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
本发明的全培养液配制物和细胞组合物可通过WO90/15861或WO2010/096673中描述的方法来产生。
下文中给出本发明的组合物的优选用途的实例。组合物的剂量和组合物使用的其它条件可给予本领域已知的方法来确定。
用途
本发明还涉及下述使用具有纤维二糖水解酶活性的多肽或其组合物的方法。
本发明还涉及降解纤维素材料的方法，其包括：在本发明的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的存在下，用酶组合物处理纤维素材料。在一个方面，所述方法进一步包括回收已降解或转化的纤维素材料。所述纤维素材料的降解或转化的可溶性产物可从不溶性纤维素材料使用本领域已知的方法分离，如例如离心、过滤或重力沉降。
本发明还涉及产生发酵产物的方法，其包括：(a)在本发明的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的存在下，用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。
本发明还涉及发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是在本发明的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的存在下用酶组合物糖化的。在一个方面，纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一个方面，所述方法进一步包括从发酵回收发酵产物。
本发明的方法可以用于将纤维素材料糖化成可发酵糖，并且将可发酵糖转化成很多有用的发酵产物，例如燃料、饮用乙醇和/或平台化学品(platform chemical)(例如酸、醇、酮、气体等)。从纤维素材料产生期望的发酵产物通常涉及预处理、酶水解(糖化)和发酵。
根据本发明的纤维素材料的处理可以使用本领域的常规方法完成。此外，本发明的方法能使用经配置以依照发明操作的任何常规生物质加工设备进行。
水解(糖化)和发酵，分别或同时，包括但不限于，分离的水解和发酵(SHF)、同步糖化和发酵(SSF)、同步糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、分离的水解和共发酵(SHCF)、混合的水解和共发酵(HHCF)，和直接微生物转化(DMC)，有时也称为合并的生物加工(consolidated bioprocessing，CBP)。SHF使用分离的处理步骤以首先将纤维素材料酶水解为可发酵糖，例如，葡萄糖，纤维二糖和戊糖单体，然后将可发酵糖发酵成为乙醇。在SSF中，纤维素材料的酶水解和糖变为乙醇的发酵在一个步骤中组合(Philippidis,G.P.,1996,Cellulose bioconversion technology,于Handbook on Bioethanol:Productionand Utilization,Wyman,C.E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多种糖的共发酵(Sheehan和Himmel,1999,Enzymes,energy and the environment:Astrategic perspective on the U.S.Department of Energy’s research anddevelopment activities for bioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF在同步糖化和水解步骤之外，还涉及单独的水解步骤，所述步骤可以在同一个反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度，即，高温酶法糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC在一个或多个(例如几个)步骤中组合了所有三个过程(酶产生、水解和发酵)，其中使用相同的生物体产生用于将纤维素材料转化成可发酵糖并将可发酵糖转化成终产物的酶(Lynd等,2002,Microbial cellulose utilization:Fundamentals andbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)。在本文可以理解的是，任何本领域中已知的方法，包括预处理、酶水解(糖化)、发酵，或它们的组合，可用于实施本发明的方法。
常规设备包括补料批式搅拌反应器、批式搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器和/或连续活塞流柱式反应器(Corazza等,2003,Optimal control in fed-batchreactor for the cellobiose hydrolysis,Acta Scientiarum.Technology 25:33-38;Gusakov和Sinitsyn,1985,Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose:1.Amathematical model for a batch reactor process,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、研磨反应器(Ryu和Lee,1983,Bioconversion of waste cellulose by using anattrition bioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65)，或者具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(Gusakov等,1996,Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis usinga novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagneticfield,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反应器类型包括：流化床、升流层(upflow blanket)、固定化和用于水解和/或发酵的挤出机型的反应器。
预处理。在本发明的方法的实施中，可以使用本领域已知的任何预处理过程破坏植物细胞壁的纤维素材料组分(Chandra等,2007,Substrate pretreatment:The key toeffective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics?Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:67-93;Galbe和Zacchi,2007,Pretreatment of lignocellulosicmaterials for efficient bioethanol production,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41-65;Hendriks和Zeeman,2009,Pretreatments to enhance thedigestibility of lignocellulosic biomass,Bioresource Technol.100:10-18;Mosier等,2005,Features of promising technologies for pretreatment oflignocellulosic biomass,Bioresource Technol.96:673-686;Taherzadeh和Karimi,2008,Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogasproduction:A review,Int.J.of Mol.Sci.9:1621-1651;Yang和Wyman,2008,Pretreatment:the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol,BiofuelsBioproducts and Biorefining-Biofpr.2:26-40)。
纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、筛分、预浸泡、润湿、洗涤和/或调理(conditioning)。
常规的预处理包括但不限于，蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱性预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理和生物预处理。其它预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧、离子性液体和γ辐射预处理。
可以在水解和/或发酵之前预处理纤维素材料。预处理优选在水解前进行。或者，预处理可以与酶水解同时进行以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身使一些生物质转化成可发酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。
蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素和纤维素，使酶可接触纤维素和其它级分，例如，半纤维素。将纤维素材料经过或通过反应容器，其中注入蒸汽以增加温度至需要的温度和压力，并且在其中保持期望的反应时间。蒸汽预处理优选在140-250℃，例如160-200℃，或170-190℃进行，其中最优的温度范围依赖于任何化学催化剂的添加。蒸汽预处理的停留时间优选1-60分钟，例如1-30分钟，1-20分钟，3-12分钟，或4-10分钟，其中最优的停留时间依赖于温度范围和化学催化剂的添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，使纤维素材料在预处理过程中通常仅仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的物质的爆炸放料(explosive discharge)组合，这称为蒸汽爆炸，即，快速闪变至大气压和物质的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff和Murray,1996,Bioresource Technology855:1-33;Galbe和Zacchi,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628;美国专利申请No.20020164730)。在蒸汽预处理过程中，切割半纤维素乙酰基团，并且得到的酸自催化半纤维素部分水解成为单糖和寡糖。去除木质素仅至有限的程度。
化学预处理：术语“化学处理”指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学处理。此种预处理可将晶体纤维素转化为无定形纤维素。合适的化学预处理工艺的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子性液体和有机溶剂预处理。
经常在蒸汽预处理之前加入催化剂如H2SO4或SO2(通常0.3至5%w/w)，其可减少时间，降低温度，增加回收率，并改进酶水解(Ballesteros等,2006,Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508;Varga等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:509-523;Sassner等.,2006,EnzymeMicrob.Technol.39:756-762)。在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(通常是H2SO4)和水混合以形成浆料，由蒸汽加热至期望的温度，并在一段停留时间后闪变至大气压。可以用很多反应器设计进行稀酸预处理，例如，活塞流反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray,1996,supra;Schell等,2004,Bioresource Technol.91:179-188;Lee等,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。
还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱预处理包括，但不限于，氢氧化钠、石灰、湿氧化、氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。
用氧化钙或氢氧化钙，在85-150℃的温度进行石灰预处理，停留时间从1小时到几天(Wyman等,2005,Bioresource Technol.96:1959-1966;Mosier等,2005,BioresourceTechnol.96:673-686)。WO2006/110891、WO2006/110899、WO2006/110900和WO2006/110901公开了使用氨的预处理方法。
湿法氧化是热预处理，通常在180-200℃进行5-15分钟，加入氧化剂如过氧化氢或过压氧(Schmidt和Thomsen,1998,Bioresource Technol.64:139-151;Palonen等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17;Varga等,2004,Biotechnol.Bioeng.88:567-574;Martin等,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。预处理以优选1-40%干物质，例如2-30%干物质，或5-20%干物质进行，并且由于加入碱如碳酸钠，初始pH常常会增加。
湿法氧化预处理方法的修改方法，称为湿爆炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)，能够处理高达30%的干物质。在湿爆炸中，在预处理过程中，在一定的停留时间后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而结束预处理(WO2006/032282)。
氨纤维爆炸(AFEX)涉及在温和温度如90-150℃和高压如17-20bar，用液体或气体氨将纤维素材料处理5-10分钟，其中干物质含量可以高达60%(Gollapalli等,2002,Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35;Chundawat等,2007,Biotechnol.Bioeng.96:219-231;Alizadeh等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141;Teymouri等,2005,Bioresource Technol.96:2014-2018)。在AFEX预处理过程中，纤维素和半纤维素保持相对完整。木质素-糖复合物受切割。
有机溶剂预处理通过用含水乙醇(40-60%乙醇)在160-200℃提取30-60分钟而将纤维素材料去木质素化(Pan等,2005,Biotechnol.Bioeng.90:473-481;Pan等,2006,Biotechnol.Bioeng.94:851-861;Kurabi等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:219-230)。经常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，去除大部分半纤维素和木质素。
合适的预处理方法的其他实例如Schell等,2003,Appl.Biochem andBiotechn.Vol.105-108:69-85,和Mosier等,2005,Bioresource Technology96:673-686,和美国公开申请2002/0164730所述。
在一个方面，化学预处理优选作为稀酸处理，并且更优选作为连续稀酸处理进行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物。弱酸(mild acid)处理在优选1-5，例如1-4，或1-2.5的pH范围进行。在一个方面，酸浓度在优选0.01至10wt%酸，例如0.05至5wt%酸或0.1至2wt%酸的范围。将酸与纤维素材料接触，并在优选140-200℃，例如165-190℃范围的温度保持1至60分钟的时间。
在另一个方面，预处理发生在含水浆料中。在优选的方面，在预处理过程中纤维素材料以优选10-80wt%，例如20-70wt%或30-60wt%，如约40wt%的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或者使用本领域任何已知的方法洗涤，例如，用水洗涤。
机械预处理或物理预处理：术语“机械预处理”或“物理预处理”指任何促进颗粒大小减少的预处理。举例而言，此种预处理可涉及各种类型的磨制(grinding)或粉碎(milling)(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。
纤维素材料可经物理(机械)和化学预处理。机械或物理预处理可与下述偶联：汽蒸/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射(例如微波辐射)，或其组合。在一个方面，高压指优选约100至约400psi，例如约150至约250psi的范围的压强。在另一个方面，高温指约100至300℃，例如约140至约200℃范围的温度。在一个优选的方面，机械或物理预处理在使用利用如上所定义的高温和高压的蒸汽枪水解器系统(例如来自Sunds Defibrator AB,Sweden的Sunds Hydrolyzer)的分批过程中进行。所述物理和化学预处理可视需要顺序进行或同时进行。
因此，在一个优选的方面，对纤维素材料进行物理(机械)或化学预处理，或者它们的任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
生物预处理：术语“生物预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木质素的微生物和/或酶(参见，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatment of biomass,于Handbook onBioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E编,Taylor& Francis,Washington,DC,179-212;Ghosh和Singh,1993,Physicochemical and biological treatments forenzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333;McMillan,J.D.,1994,Pretreating lignocellulosicbiomass:a review,于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production,Himmel,M.E.,Baker,J.O.,和Overend,R.P.,编,ACS Symposium Series566,AmericanChemical Society,Washington,DC,第15章;Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewable resources,于Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.,编,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241;Olsson和Hahn-Hagerdal,1996,Fermentation of lignocellulosichydrolysates for ethanol production,Enz.Microb.Tech.18:312-331;和Vallander和Eriksson,1990,Production of ethanol from lignocellulosic materials:State ofthe art,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。
糖化。在水解(也称作糖化)步骤中，将例如经预处理的纤维素材料水解以将纤维素和半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解由酶组合物以酶法在本发明具有纤维二糖水解酶活性的多肽的存在下进行。组合物的酶还可以同时或顺序加入。
酶水解优选在容易由本领域技术人员确定的条件下，在合适的含水环境中进行。在一个方面，水解在适于酶的活性，即对于酶最佳的条件下进行。水解可以以补料分批或连续的过程进行，其中将纤维素材料逐渐补入，例如，含酶的水解溶液中。
糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可持续长达200小时，但是通常进行优选约12至约120小时，例如约16至约72小时，或约24至约48小时。温度在优选约25℃至约70℃，例如约30℃至约65℃，约40℃至约60℃，或约50℃至55℃的范围。pH在优选约3至约8，例如约3.5至约7，约4至约6，或约5.0至约5.5的范围。干固体含量在优选约5至约50wt%，例如约10至约40wt%，或约20至约30wt%的范围。
酶组合物可包含任何可用于降解纤维素材料的蛋白。
在一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(例如几种)选自下组的蛋白：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。在另一个方面，所述纤维素酶为优选一种或多种(例如几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述半纤维素酶为优选一种或多种(例如几种)选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。
在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(例如几种)纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(例如几种)半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(例如几种)纤维素分解酶和一种或多种(例如几种)半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(例如几种)选自下组的酶：纤维素分解酶和半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。
在另一个方面，所述酶组合物包含乙酰甘露聚糖酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含乙酰木聚糖酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含阿拉伯聚糖酶(例如α-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含阿拉伯呋喃糖苷酶(例如α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含香豆酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含阿魏酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含半乳糖苷酶(例如α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含葡糖醛酸糖苷酶(例如α-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含葡糖醛酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含甘露聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含甘露糖苷酶(例如β-甘露糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含木聚糖酶。在一个优选的方面，所述木聚糖酶是家族10木聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含木糖苷酶(例如β-木糖苷酶)。
在另一个方面，所述酶组合物包含酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含棒曲霉素。在另一个方面，所述酶组合物包含漆酶。在另一个方面，所述酶组合物包含木质素分解酶。在另一个优选的方面，所述木质素分解酶是锰过氧化物酶。在另一个优选的方面，所述木质素分解酶是木质素过氧化物酶。在另一个优选的方面，所述木质素分解酶是产生H2O2的酶。在另一个方面，所述酶组合物包含果胶酶。在另一个方面，所述酶组合物包含过氧化物酶。在另一个方面，所述酶组合物包含蛋白酶。在另一个方面，所述酶组合物包含膨胀素。
在本发明的方法中，酶可在糖化，糖化和发酵，或发酵之前或过程中添加。
所述酶组合物的一种或多种(例如几种)组分可为野生型蛋白、重组蛋白或野生型蛋白和重组蛋白的组合。举例而言，一种或多种(例如几种)组分可为细胞的天然蛋白，其用作宿主细胞以重组表达酶组合物的一种或多种(例如几种)其他组分。酶组合物的一种或多种(例如几种)组分可作为单组分产生，然后将其组合以形成酶组合物。所述酶组合物可为多组分和单组分蛋白制备物的组合。
用于本发明方法中的酶可为任何适用于如例如发酵液配制物，细胞组合物，含或不含细胞碎片的细胞裂解液，半纯化或纯化的酶制备物，或宿主细胞，作为酶的来源。所述酶组合物可为干粉或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。液体酶制备物可根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有机酸来稳定化。
具有纤维二糖水解酶活性的酶和多肽的最适量取决于几个因素，其包括但不限于，组分纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合物、纤维素材料、纤维素材料的浓度、纤维素材料的预处理、温度、时间、pH和包括发酵生物体(例如，同步糖化和发酵的酵母)。
在一个方面，纤维素分解酶或半纤维素分解酶对于纤维素材料的有效量是约0.5至约50mg，例如约0.5至约40mg，约0.5至约25mg，约0.75至约20mg，约0.75至约15mg，约0.5至约10mg，或约2.5至约10mg每g纤维素材料。
在另一个方面，具有纤维二糖水解酶活性的多肽对于纤维素材料的有效量是约0.01至约50.0mg，例如约0.01至约40mg，约0.01至约30mg，约0.01至约20mg，约0.01至约10mg，约0.01至约5mg，约0.025至约1.5mg，约0.05至约1.25mg，约0.075至约1.25mg，约0.1至约1.25mg，约0.15至约1.25mg，或约0.25至约1.0mg每g纤维素材料。
在另一个方面，具有纤维二糖水解酶活性的多肽对于纤维素分解酶或半纤维素分解酶的有效量是约0.005至约1.0g，例如约0.01至约1.0g，约0.15至约0.75g，约0.15至约0.5g，约0.1至约0.5g，约0.1至约0.25g，或约0.05至约0.2g每g纤维素分解酶或半纤维素分解酶。
具有纤维素分解酶活性或半纤维素分解酶活性的多肽，以及其它可用于纤维素材料的降解的蛋白/多肽，例如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽(在本文中统称为具有酶活性的多肽)可源自或获得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物或哺乳动物来源。术语“获得”在本文中还意指该酶可在宿主生物中使用本文中所述的方法重组产生，其中经重组产生的酶对于宿主生物是天然的或外源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如，具有一个或多个(例如几个)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶，其为天然氨基酸序列的片段和/或突变体或通过本领域已知的氨基酸改组方法产生的酶。天然酶的含义中涵盖的是天然变体，而外来酶的含义中涵盖的是重组(如通过定位诱变或重排)获得的变体。
具有酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor)、热酸菌属(Acidothermus)、Thermobifidia或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有酶活性；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有酶活性。
在一个方面，所述多肽是具有酶活性的嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌或马链球菌兽瘟亚种多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌或浅青紫链霉菌多肽。
具有酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽如假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属多肽，其具有酶活性；或更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、Botryospaeria、拟蜡菌属、Chaetomidium、金孢子菌属、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属、Coptotermes、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、Filibasidium、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、蘑菇属、Leptospaeria、梨孢菌属、Melanocarpus、多孔菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、Pseudotrichonympha、根毛霉属、裂褶菌属、柱顶孢属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、包脚菇属或炭角菌属多肽，其具有酶活性。
在一个方面，所述多肽是具有酶活性的卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母多肽。
在另一个方面，所述多肽是具有酶活性的解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角质金孢子菌、Chrysosporiumlucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、灰腐质霉、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、绳状青霉、产紫青霉、黄孢平革菌、Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭孢壳、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳、卵孢梭孢壳、Thielaviaperuviana、瘤孢梭孢壳、毛梭孢壳、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉或褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)多肽。
还可以使用具有酶活性的多肽的经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。
所述纤维素分解酶组合物的一种或多种(例如几种)组分可以是重组组分，亦即，通过克隆编码所述单独组分的DNA序列并随后用该DNA序列转化细胞并在宿主中表达(参见，例如，WO91/17243和WO91/17244)产生。所述宿主优选是异源宿主(酶对宿主是外源的)，但该宿主在一定条件下也可以是同源宿主(酶对宿主是天然的)。单组分纤维素分解蛋白还可以通过从发酵液中提纯这样的蛋白质来制备。
在一个方面，所述一种或多种(例如几种)纤维素分解酶包含商业性纤维素分解酶制备物。适用于本发明的商业的纤维素分解酶制备物的实例包括，例如，CELLICTMCtec(Novozymes A/S)、CELLICTMCTec2(Novozymes A/S)、CELLUCLASTTM(Novozymes A/S)、NOVOZYMTM188(Novozymes A/S)、CELLUZYMETM(Novozymes A/S)、CEREFLOTM(Novozymes A/S)和ULTRAFLOTM(Novozymes A/S)，ACCELERASETM(Genencor Int.)、LAMINEXTM(GenencorInt.)、SPEZYMETMCP(Genencor Int.)，NL(DSM)、S/L100(DSM)，ROHAMENTTM7069W LDI(Dyadic International,Inc.)、LBR(DyadicInternational,Inc.)或150L(DyadicInternational,Inc.)。所述纤维素酶酶以固体的约0.001至约5.0wt%，例如固体的约0.025至约4.0wt%，或固体的约0.005至约2.0wt%的有效量添加。
可以用于本发明的方法的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO91/05039；WO93/15186;美国专利5,275,944；WO96/02551；美国专利5,536,655，WO00/70031，WO05/093050)；Thermobifidafusca内切葡聚糖酶III(WO05/093050)；和Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(WO05/093050)。
可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等,1986,Gene45:253-263，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GENBANKTM登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等,1988,Gene63:11-22)，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GENBANKTM登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等,1988,Appl.Environ.Microbiol.64:555-563；GENBANKTM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等,1994,Molecular Microbiology13:219-228；GENBANKTM登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等,1990,Nucleic Acids Research18:5884)；川地曲霉(Aspergillus kawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等,1995,Current Genetics27:435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等,1990,Gene90:9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号L29381)；灰腐质霉thermoidea变种内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号AB003107)；Melanocarpus albomyces内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V；嗜热毁丝霉CBS117.65内切葡聚糖酶；担子菌纲(basidiomycete)CBS495.95内切葡聚糖酶；担子菌纲CBS494.95内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6B内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7F内切葡聚糖酶；Cladorrhinum foecundissimum ATCC62373CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株No.VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号M15665)。
可用于本发明的纤维二糖水解酶的实例包括但不仅限于，棘孢曲霉纤维二糖水解酶II(WO2011/059740)，嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)纤维二糖水解酶I，嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II，特异腐质霉纤维二糖水解酶I，嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II，(WO2009/042871)，Thielavia hyrcanie纤维二糖水解酶II(WO2010/141325)，土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A，WO2006/074435)，里氏木霉纤维二糖水解酶I，里氏木霉纤维二糖水解酶II，以及褐孢长毛盘菌纤维二糖水解酶II(WO2010/057086)。
可用于本发明的β-葡糖苷酶的实例包括但不仅限于来自棘孢曲霉(Kawaguchi等,1996,Gene173:287-288)、烟曲霉(WO2005/047499)、黑曲霉(Dan等,2000,J.Biol.Chem.275:4973-4980)、米曲霉(WO2002/095014)、巴西青霉IBT20888(WO2007/019442和WO2010/088387)、土生梭孢霉(WO2011/035029)和褐孢长毛盘菌(WO2007/019442)的β-葡糖苷酶。
所述β-葡糖苷酶可以是融合蛋白。在一个方面，所述β-葡糖苷酶是WO米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白(WO2008/057637)或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(2008/057637)。
其它可用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶公开于使用根据Henrissat,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities,Biochem.J.280:309-316和Henrissat和Bairoch,1996,Updatingthe sequence-based classification of glycosyl hydrolases,Biochem.J.316:695-696的分类的许多糖基水解酶家族中。
其它可用于本发明的纤维素分解酶描述于WO98/13465、WO98/015619、WO98/015633、WO99/06574、WO99/10481、WO99/025847、WO99/031255、WO2002/101078、WO2003/027306、WO2003/052054、WO2003/052055、WO2003/052056、WO2003/052057、WO2003/052118、WO2004/016760、WO2004/043980、WO2004/048592、WO2005/001065、WO2005/028636、WO2005/093050、WO2005/093073、WO2006/074005、WO2006/117432、WO2007/071818、WO2007/071820、WO2008/008070、WO2008/008793、美国专利No.5,457,046、美国专利No.5,648,263和美国专利No.5,686,593。
在本发明的方法中，可使用任何具有纤维素分解增强活性的GH61多肽作为酶组合物的组分。
可用于本发明的方法的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的实例包括但不限于来自土生梭孢霉(WO2005/074647，WO2008/148131和WO2011/035027)；桔橙热子囊菌(WO2005/074656和WO2010/065830)，里氏木霉(WO2007/089290)，嗜热毁丝霉(WO2009/085935，WO2009/085859，WO2009/085864，WO2009/085868)，烟曲霉(WO2010/138754)的GH61多肽，来自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)(WO2011/005867)，嗜热子囊菌菌种(WO2011/039319)，青霉属菌种(WO2011/041397)，和Thermoascus crustaceous(WO2011/041504)的GH61多肽。
在一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在WO2008/151043中所述的可溶性活化二价金属阳离子，例如硫酸锰或硫酸铜的存在下使用。
在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在二氧化合物、二环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物或从经预处理的纤维素材料(如经预处理的玉米秸秆(PCS))获得的液体的存在下使用。
所述二氧化合物可包括任何含有两个或更多氧原子的合适化合物。在一些方面，所述二氧化合物含有如本文中所述的取代的芳基模块(moiety)。所述二氧化合物可包括一个或多个(几个)羟基和/或羟基衍生物，但亦包括缺乏羟基和羟基衍生物的取代的芳基模块。二氧化合物的非限定性实例包括邻苯二酚或儿茶酚；咖啡酸；3,4-二羟基苯甲酸；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯二酚；连苯三酚；没食子酸；甲基-3,4,5-三羟基苯甲酸；2,3,4-三羟基二苯甲酮；2,6-二甲氧基苯酚；芥子酸；3,5-二羟基苯甲酸；4-氯-1,2-苯二酚；4-硝基-1,2-苯二酚；鞣酸；没食子酸乙酯；羟乙酸甲酯；二羟基延胡索酸；2-丁炔-1,4-二醇；克酮酸；1,3-丙二醇；酒石酸；2,4-戊二醇；3-乙氧基-1,2-丙二醇；2,4,4’-三羟基二苯甲酮；顺-2-丁烯-1,4-二醇；3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮；二羟基丙酮；乙酰丙烯醛(acroleinacetal)；甲基-4-羟基苯甲酸；4-羟基苯甲酸；和甲基-3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸；或它们的盐或溶剂合物(solvate)。
所述二环化合物可包括任何如本文中所述的合适的取代稠环系统。所述化合物可包含一个或多个(例如几个)另外的环，且除非另行说明，不限于具体的环数。在一个方面，所述二环化合物是类黄酮。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的异类黄酮(isoflavonoid)。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的花色离子(flavyliumion)，如任选取代的花色素或任选取代的花色苷，或其衍生物。二环化合物的非限定性实例包括表儿茶素(epicatechin)；槲皮素(quercetin)；杨梅黄酮(myricetin)；黄杉素(taxifolin)；山奈酚(kaempferol)；桑素(morin)；金合欢素(acacetin)；柚皮素(naringenin)；异鼠李黄素(isorhamnetin)；芹菜苷配基(apigenin)；花青素(cyanidin)；花色素苷(cyanin)；kuromanin；花青素鼠李葡糖苷(keracyanin)；或它们的盐或溶剂合物。
所述杂环化合物可为任何合适的化合物，如本文中所述的任选取代的包含杂原子的芳环或非芳环。在一个方面，所述杂环是包含任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块的化合物。在另一个方面，所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的五元杂环烷基或任选取代的五元杂芳基模块。在另一个方面，任选取代的杂环烷基或任选取代的杂芳基模块是选自如下的任选取代的模块：吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基(thienyl)、二氢噻吩-吡唑基(dihydrothieno-pyrazolyl)、硫茚基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基(benzothienyl)、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基(benzooxazolyl)、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、苯并异噁唑基(benzoisazolyl)、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吗啉基、吲哚基、二氮杂环庚三烯基(diazepinyl)、氮杂环庚三烯基(azepinyl)、硫杂环庚三烯基(thiepinyl)、哌啶基和氧杂环庚三烯基(oxepinyl)。在另一个方面所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的呋喃基。杂环化合物的非限定性实例包括(1,2-二羟乙基)-3,4-二氢呋喃-2(5H)-酮；4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮；5-羟基-2(5H)-呋喃酮；[1,2-二羟乙基]呋喃-2,3,4(5H)-三酮；α-羟基-γ-丁内酯；核糖酸γ-内酯；己醛糖酸γ-内酯(aldohexuronicaldohexuronic acidγ-lactone)；葡糖酸δ-内酯；4-羟基香豆素；二氢苯并呋喃；5-(羟甲基)糠醛；糠偶姻(furoin)；2(5H)-呋喃酮；5,6-二氢-2H-吡喃-2-酮；和5,6-二氢-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮；或它们的盐或溶剂合物。
所述含氮化合物可为任何具有一个或多个氮原子的合适化合物。在一个方面，所述含氮化合物包含胺、亚胺、羟胺或氧化亚氮(nitroxide)模块。含氮化合物的非限定性实例包括丙酮肟；紫尿酸；吡啶-2-醛肟；2-氨基苯酚；1,2-苯二胺；2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧(piperidinyloxy)；5,6,7,8-四氢生物蝶呤；6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢蝶呤；和马来酰胺酸；或它们的盐或溶剂合物。
所述醌化合物可为任何本文中所述的包含醌模块的合适的化合物。醌化合物的非限定性实例包括1,4-苯醌；1,4-萘醌；2-羟基-1,4-萘醌；2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌或辅酶Q0；2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或四甲基对苯醌；1,4-二羟基蒽醌；3-羟基-1-甲基-5,6-二氢吲哚二酮或肾上腺色素；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌；吡咯并喹啉醌(pyrroloquinoline quinone)；或它们的盐或溶剂合物。
所述含硫化合物可为任何包含一个或多个硫原子的合适的化合物。在一个方面，所述含硫化合物包含选自如下的模块：亚硫酰，硫醚，亚磺酰，磺酰，磺酰胺(sulfamide)，磺酰胺(sulfonamide)，磺酸和磺酸酯。含硫化合物的非限定性实例包括乙硫醇；2-丙硫醇；2-丙烯-1-硫醇；2-巯基乙磺酸；苯硫醇；苯-1,2-二硫醇；半胱氨酸；甲硫氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或它们的盐或溶剂合物。
在一个方面此种如上所述的化合物对纤维素材料的有效量，作为对纤维素糖单元的摩尔比例为约10-6至约10，例如约10-6至约7.5，约10-6至约5，约10-6至约2.5，约10-6至约1，约10-5至约1，约10-5至约10-1，约10-4至约10-1，约10-3至约10-1，或约10-3至约10-2。在另一个方面，此种如上所述的化合物的有效量为约0.1μM至约1M，例如约0.5μM至约0.75M，约0.75μM至约0.5M，约1μM至约0.25M，约1μM至约0.1M，约5μM至约50mM，约10μM至约25mM，约50μM至约25mM，约10μM至约10mM，约5μM至约5mM，或约0.1mM至约1mM。
术语“液剂(liquor)”意指在本文中所述的条件下，通过处理浆料中的木素纤维素和/或半纤维素材料，或其单糖例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖等，所产生的溶液相，即水相、有机相或其组合，及其可溶性内含物。用于GH61多肽的纤维素分解增强的液剂可通过，任选在催化剂例如酸的存在下，任选在有机溶剂的存在下，且任选与所述材料的物理破坏相组合来藉由施加热和/或压力来处理纤维素材料或半纤维素材料(或原料)，然后将溶液与残余固体分离来产生。此类条件决定在通过纤维素酶制备物水解纤维素材料过程中，通过液剂和GH61多肽的组合可获得的纤维素分解增强的程度。所述液剂可使用本领域中的标准方法如过滤、沉积或离心从经处理的材料分离。
在一个方面，所述液剂对纤维素的有效量为约10-6至约10g每g纤维素，例如约10-6至约7.5g，约10-6至约5，约10-6至约2.5g，约10-6至约1g，约10-5至约1g，约10-5至约10-1g，约10-4至约10-1g，约10-3至约10-1g，或约10-3至约10-2g每g纤维素。
在一个方面，所述一种或多种(例如几种)半纤维素分解酶包含商业性半纤维素分解酶制备物。适用于本发明的商业性半纤维素分解酶制备物的实例包括，例如SHEARZYMETM(Novozymes A/S)、HTec(Novozymes A/S)、Htec2(Novozymes A/S)、(Novozymes A/S)、(Novozymes A/S)、HC(Novozymes A/S)、Xylanase(Genencor)、XY(Genencor)、XC(Genencor)、TX-200A(AB Enzymes)、HSP6000Xylanase(DSM)、DEPOLTM333P(Biocatalysts Limit,Wales,UK)、DEPOLTM740L(Biocatalysts Limit,Wales,UK)和DEPOLTM762P(Biocatalysts Limit,Wales,UK)。
可用于本发明方法的木聚糖酶的实例包括但不限于来自棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)(GeneSeqP:AAR63790;WO94/21785)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(WO2006/078256)、嗜松青霉(WO2011/041405)、青霉属菌种(WO2010/126772)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)NRRL8126(WO2009/079210)和褐孢长毛盘菌GH10(WO2011/057083)的木聚糖酶。
可用于本发明方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于来自粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(SwissProt登录号Q7SOW4)、里氏木霉(Trichoderma reesei)(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)和埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)(SwissProt登录号Q8X212)的β-木糖苷酶。
可用于本发明方法的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于来自棘孢曲霉(WO2010/108918)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)(Uniprot登录号Q2GWX4)、细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)(GeneSeqP登录号AAB82124)、特异腐质霉(Humicola insolens)DSM1800(WO2009/073709)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)(WO2005/001036)、嗜热毁丝霉(Wo2010/014880)、粗糙脉孢菌(UniProt登录号q7s259)、颖枯壳针孢(Phaeosphaerianodorum)(Uniprot登录号Q0UHJ1)和土生梭孢霉NRRL8126(WO2009/042846)的乙酰木聚糖酯酶。
可用于本发明方法的阿魏酸酯酶的实例包括但不限于来自特异腐质霉DSM1800(WO2009/076122)、费希新萨托菌(Neosartorya fischer)(UniProt登录号A1D9T4)、粗糙脉孢菌(UniProt登录号Q9HGR3)、橘灰青霉(WO2009/127729)和土生梭孢壳(WO2010/053838和WO2010/065448)的阿魏酸酯酶。
可用于本发明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于来自黑曲霉(Aspergillus niger)(GeneSeqP登录号AAR94170)、特异腐质霉(Humicola insolens)DSM1800(WO2006/114094和WO2009/073383)和M.giganteus(WO2006/114094)的阿拉伯呋喃糖苷酶。
可用于本发明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于来自棒曲霉(Aspergillus clavatus)(UniProt登录号alcc12)、烟曲霉(SwissProt登录号Q4WW45)、黑曲霉(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉(Aspergillus terreus)(SwissProt登录号Q0CJP9)、特异腐质霉(WO2010/014706)、橘灰青霉(WO2009/068565)、埃默森踝节菌(UniProt登录号Q8X211)和里氏木霉(Uniprot登录号Q99024)的α-葡糖醛酸糖苷酶。
用于本发明方法的具有酶活性的多肽可通过在含有合适碳源和氮源和无机盐的营养培养基上，使用本领域已知方法(参见，例如Bennett,J.W.和LaSure,L.(编),MoreGene Manipulations in Fungi,Academic Press,CA,1991)发酵上述指出的微生物菌株来产生。合适的培养基可从供应商获得，或可根据已公开组合物制备(例如美国典型培养物保藏中心的目录)。适于生长和酶产生的温度范围和其他条件在本领域是已知的(参见，例如Bailey,J.E.和Ollis,D.F.,Biochemical Engineering Fundamentals,McGraw-Hill BookCompany,NY,1986)。
所述发酵可以是任何其结果为酶或蛋白表达或分离的培养细胞的方法。因此，发酵可以理解为包括在合适的培养基中并在允许所述酶得以表达或分离的条件下进行的摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中的小-或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)。通过上述方法产生的所得的酶可从发酵培养基回收并通过常规方法纯化。
发酵。可通过一种或多种(例如几种)能将糖直接或间接发酵成所需发酵产物的发酵微生物发酵自经水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费品醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如，发酵乳产品)、皮革业和烟草业的发酵方法。发酵条件依赖于期望的发酵产物和发酵生物体，并且能由本领域的技术人员容易地确定。
在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖，通过发酵生物体(如酵母)发酵成为产物，例如，乙醇。如本文中所述，水解(糖化)和发酵可以是单独或同时的。
在实施本发明的发酵步骤中可以使用任何合适的经水解的纤维素材料。通常根据所需发酵产品(即，要从发酵获得的物质)和使用的方法来选择所述材料，如本领域中所公知的。
术语“发酵培养基”在本文中可理解为指加入发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及同步的糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。
“发酵微生物”指适用于理想的发酵方法产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是己糖和/或戊糖发酵生物体，或它们的组合。己糖和戊糖发酵生物体均在本领域公知。合适的发酵微生物能将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖和/或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所需的发酵产品。可产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例如Lin等,2006,Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。
能发酵己糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括假丝酵母属、克鲁维酵母属和酵母属，例如Candida sonorensis、马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母的菌株。
以其天然状态能发酵戊糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如一些酵母。优选的木糖发酵酵母包括假丝酵母属，优选休哈塔假丝酵母(Candida sheatae)或Candida sonorensis；和毕赤酵母属，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS5773的菌株。优选的戊糖发酵酵母包括管囊酵母属(Pachysolen)，优选嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)的菌株。不能够发酵戊糖如木糖和阿拉伯糖的生物通过本领域已知方法可经遗传修饰而发酵戊糖。
能有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)、Clostridium phytofermentans、地芽孢杆菌属菌种、解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)(Philippidis,1996,见上文)。
其它发酵生物包括芽孢杆菌属，如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，如Candidasonorensis、C.methanosorbosa、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、C.naedodendra、C.blankii、C.entomophilia、芸薹假丝酵母(C.brassicae)、假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、产朊假丝酵母(Candida utilis)和休哈塔假丝酵母(C.scehatae)；梭菌属，如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌和C.phytofermentans；大肠杆菌，特别是经遗传修饰促进乙醇产生的大肠杆菌菌株；地芽孢杆菌属菌种；汉逊酵母属，如异常汉逊酵母(Hansenulaanomala)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，如产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)；克鲁维酵母属，如马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、K.thermotolerans和脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)，如解糖热厌氧杆菌，和发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌的菌株。
在一个优选的方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在一个更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)。在另一个更优选的方面，酵母是假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida sonorensis。在另一个更优选的方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida blankii。在另一个更优选的方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida entomophiliia。在另一个更优选的方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是休哈塔假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选的方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一个优选的方面，酵母是克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Kluyveromyces thermotolerans。在另一个优选的方面，酵母是管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母。在另一个优选的方面，酵母是毕赤酵母。在另一个更优选的方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，酵母是酵母属菌种。在另一个优选的方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。
在一个优选的方面，细菌是芽孢杆菌属。在一个更优选的方面，细菌是凝结芽孢杆菌。在另一个更优选的方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选的方面，细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一个更优选的方面，细菌是Clostridium phytofermentans在另一个更优选的方面，细菌是热纤维梭菌。在另一个更优选的方面，细菌是地芽孢杆菌属菌种。在另一个更优选的方面，细菌是热厌氧杆菌属。在另一个更优选的方面，细菌是解糖热厌氧杆菌。在另一个更优选的方面，细菌是发酵单胞菌属。在另一个更优选的方面，细菌是运动发酵单胞菌。
商业上可得到的适合乙醇产生的酵母包括，例如BIOFERMTMAFT和XR(NABC-NorthAmerican Bioproducts Corporation,GA,USA)，ETHANOL REDTM酵母(Red Star/Lesaffre,USA)、FALITM(Fleischmann’s Yeast,Burns Philp Food Inc.,USA)，FERMIOLTM(DSMSpecialties)，GERT STRANDTM(Gert Strand AB,Sweden)以及SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(Ethanol Technology,WI,USA)。
在一个优选的方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，提供发酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
通过将异源基因克隆入多种发酵微生物已经构建了能将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho,1993,Cloning and improving the expression of Pichiastipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147;Ho等,1998,Genetically engineeredSaccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859;Kotter和Ciriacy,1993,Xylose fermentationby Saccharomyces cerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783;Walfridsson等,1995,Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressingthe TKL1and TAL1genes encoding the pentose phosphate pathway enzymestransketolase and transaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190;Kuyper等,2004,Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficientanaerobic xylose fermentation:a proof of principle,FEMS Yeast Research4:655-664;Beall等,1991,Parametric studies of ethanol production from xylose andother sugars by recombinant Escherichia coli,Biotech.Bioeng.38:296-303;Ingram等,1998,Metabolic engineering of bacteria for ethanol production,Biotechnol.Bioeng.58:204-214;Zhang等,1995,Metabolic engineering of a pentosemetabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis,Science267:240-243;Deanda等,1996,Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strainby metabolic pathway engineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470;WO2003/062430,xylose isomerase)。
在一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是Candida sonorensi。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是马克斯克鲁维酵母。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。
本领域中公知的是，上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。
通常向降解的纤维素材料或水解物加入发酵微生物，并进行约8至约96小时，例如约24至约60小时发酵。温度通常为约26℃至约60℃，例如约32℃或50℃，并且在约pH3至约pH8，例如约pH4-5、6或7。
在一个方面，对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物，并进行约12至约96小时，如通常为24-60小时发酵。在另一个方面，温度优选为约20℃至约60℃，例如约25℃至约50℃，并且约32℃至约50℃，约32℃至约50℃，并且pH通常为约pH3至约pH7，例如约pH4至约pH7。然而，一些发酵生物体例如细菌，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以约105-1012，优选约107-1010，特别是约2x108活细胞计数每ml发酵液的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可见于例如“The Alcohol Textbook”(K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall编,Nottingham University Press,United Kingdom1999)，其通过提述并入本文。
发酵刺激剂可以与本文所述的任何方法组合使用，以进一步改进发酵工艺，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。优选的用于生长的发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore等,Improving ethanol production and viability of Saccharomycescerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process,Springer-Verlag(2002)，其通过提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。
发酵产物：发酵产物可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨醇和木糖醇)；烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；环烷烃(例如环戊烷、环己烷、环庚烷、和环辛烷)；烯烃(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))；异戊二烯；酮(例如，丙酮)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；和聚酮化合物。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。
在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”包括包含一个或多个羟基基团的物质。在更优选的方面，所述醇是正丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是异丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甲醇。在另一个更优选的方面，所述醇是阿拉伯糖醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丁二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丙三醇(glycerin)。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油(glycerol)。在另一个更优选的方面，所述醇是1,3-丙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是山梨醇。在另一个更优选的方面，所述醇是木糖醇。参见，例如，Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanol productionfrom renewable resources,于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,Scheper,T.编,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241;Silveira,M.M.,和Jonas,R.,2002,The biotechnological production of sorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408;Nigam和Singh,1995,Processes forfermentative production of xylitol–a sugar substitute,Process Biochemistry30(2):117-124;Ezeji等,2003,Production of acetone,butanol and ethanol byClostridium beijerinckii BA101and in situ recovery by gas stripping,WorldJournal of Microbiology and Biotechnology19(6):595-603。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是烷烃。所述烷烃是未支化或支化的烷烃。在另一个更优选的方面，所述烷烃是戊烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是己烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是庚烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是辛烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是壬烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是癸烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十一烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十二烷。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是环烷烃。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环戊烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环己烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环庚烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环辛烷。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是烯烃。所述烯烃可为未支化或支化的烯烃。在另一个更优选的方面，所述烯烃是戊烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是己烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是庚烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是辛烯。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是氨基酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard和Margaritis,2004,Empirical modeling of batch fermentation kineticsfor poly(glutamic acid)production and other microbial biopolymers,Biotechnology and Bioengineering87(4):501-515。
在另一个优选的方面，所述物质是气体。在另一个更优选的方面，所述气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见，例如，Kataoka等,1997,Studies on hydrogenproduction by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobicbacteria,Water Science and Technology36(6-7):41-47；和Gunaseelan,1997,Biomassand Bioenergy,13(1-2):83-114,1997,Anaerobic digestion of biomass for methaneproduction:A review。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是异戊二烯。
在另一个优选的方面，所述发酵产物似乎酮。应理解的是，术语“酮”涵盖了含有一个或多个酮模块的酮。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如Qureshi和Blaschek,2003,见上文。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是有机酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen和Lee,1997,Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acidproduction from cellulosic biomass,Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435-448。
在另一个优选的方面，所述物质是聚酮化合物。
回收可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基回收发酵产物，所述方法包括，但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料分离并纯化醇。可以获得纯度高达约96vol.%的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇(即，可饮用的中性含酒精饮料)，或工业乙醇。
信号肽
本发明还涉及编码信号肽的分离的多核苷酸，所述信号肽包含或组成为SEQ IDNO:2的氨基酸1至19。所述多核苷酸可进一步包含编码蛋白的基因，其可操作地连接于信号肽。所述蛋白优选对于所述信号肽是外源的。在一个方面，对于所述信号肽，所述多核苷酸是SEQ ID NO:1的核苷酸1至57。
本发明还涉及包含此种多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞。
本发明还涉及用于产生蛋白质的方法，包括：(a)培养包含此种多核苷酸的重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。
所述蛋白质对于宿主细胞可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在本文的意思不是指特定长度的编码产物，并且因此涵盖肽、寡肽和多肽。术语“蛋白质”还涵盖经组合以形成编码产物的两种以上多肽。所述蛋白质还包括杂合多肽和融合多肽。
优选蛋白质是激素、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报告蛋白(reporter)。例如，所述蛋白质可为水解酶、异构酶、连接酶、裂合酶(lyase)、氧化还原酶或转移酶，如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
基因可以从任何原核、真核或其它来源获得。
通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
实施例
培养基
COVE N培养基包含218g的山梨醇，50ml的COVE盐溶液，10g的右旋糖，2.02g的KNO3，25g的琼脂，和去离子水加至1升。
COVE盐溶液包含26g的MgSO4·7H2O，26g的KCl，76g的KH2PO4，50ml的COVE微量金属溶液，和去离子水加至1升。
COVE微量金属溶液包含0.04g Na2B4O7·10H2O，0.4g的CuSO4·5H2O，1.2g的FeSO4·7H2O，0.7g的MnSO4·H2O，0.8g的Na2MoO4·2H2O，10g的ZnSO4·7H2O，和去离子水加至1升。
DAP4C-1培养基包含11g的MgSO4·7H2O，1g KH2PO4，2g的柠檬酸一水合物，20g的右旋糖，10g的麦芽糖，6g的K3PO4·3H2O，0.5g的酵母提取物，0.5ml的微量金属溶液，1ml的Pluronic，和去离子水加至1升。将培养基分配至烧瓶中，对每个150ml部分添加250mgCaCO3。将培养基在高压灭菌中进行灭菌。在冷却之后，将下述添加至150ml的培养基：3.5ml的经过滤灭菌的50%w/v(NH4)2HPO4，和5.0ml的经过滤灭菌的20%乳酸。
DAP4C-1培养基微量金属溶液包含6.8g的ZnCl2，2.5g的CuSO4·5H2O，0.24g的NiCl2·6H2O，13.9g的FeSO4·7H2O，8.45g的MnSO4·H2O，3g的柠檬酸一水合物，和去离子水加至1升。
MDU2BP培养基包含每升45g的麦芽糖，1g的MgSO4·7H2O，1g的NaCl，2g的K2SO4，12g的KH2PO4，7g的酵母提取物，2g的尿素，0.5ml的AMG微量金属溶液，和去离子水加至1升;pH5.0。
AMG微量金属溶液包含14.3g的ZnSO4·7H2O，2.5g的CuSO4·5H2O，0.5g的NiCl2·6H2O，13.8g的FeSO4·7H2O，8.5g的MnSO4·7H2O，3g的柠檬酸，和去离子水加至1升。
MY25培养基包含每升25g的麦芽糊精，2g的MgSO4·7H2O，10g的KH2PO4，2g的柠檬酸，2g的K2SO4，2g的尿素，10g的酵母提取物，1.5ml的AMG微量金属溶液，和去离子水加至1升；调整至pH6。
SY50培养基包含50g的蔗糖，2g的MgSO4·7H2O，10g的无水KH2PO4，2g的K2SO4，2g的柠檬酸，10g的酵母提取物，2g的尿素，0.5g的CaCl2·2H2O，和0.5g的200X AMG微量金属溶液，和去离子水加至1升；pH6.0。
200X AMG微量金属溶液包含3g的柠檬酸，14.3g的ZnSO4·7H2O，2.5g的CuSO4·5H2O，13.8g的FeSO4·7H2O，8.5g的MnSO4·H2O，和去离子水加至1升。
实施例1：从Talaromyces byssochlamydoides CBS413.71的基因组DNA PCR扩增纤维二糖水解酶基因
将纤维二糖水解酶编码基因从Talaromyces byssochlamydoides CBS413.71的基因组DNA以两步工艺进行PCR扩增。首先，将所述基因的中央片段使用简并引物进行PCR扩增，所述简并引物设计为匹配编码已知的家族GH6纤维二糖水解酶的基因中序列的两个保守区。在扩增了内部片段之后，确定了片段的序列，并用其设计基因特异性引物以供在5’和3’两个方向均进行基因巡查(gene walking)以获得整个编码序列。
将所述内部基因片段使用下示的简并引物859和860在降落(touch-down)PCR实验方案中进行PCR扩增，在该实验方案中，67℃起始退火温度在每个后续循环中降低1℃，总共10个循环，直至达到57℃的退火温度。然后再进行29个使用57℃退火温度的循环完成该PCR扩增。
引物859:
TKCCYGAYCGYGAYTGYGC(SEQ ID NO:3)
引物860：
TCRCCACCKGGCTTKAYCCA(SEQ ID NO:4)
扩增反应使用REDDYMIXTMPCR Master Mix(ABgene Ltd，Epsom，UK)进行。所述扩增反应物包含1μl的作为模板的T.byssochlamydoides CBS413.71基因组DNA，各50pmol的引物859和860，和12.5μl的REDDYMIXTMPCR Master Mix，终体积为25μl。将T.byssochlamydoides基因组DNA从新鲜菌丝体使用SPIN实验方案(Qbiogene，Inc.，Carlsbad，CA，USA)进行提取。扩增在热循环仪中进行，其程序如下：在94℃进行起始模板变性2分钟；11个循环，每个循环在94℃变性45秒，在67℃退火45秒，其中每个后续循环降低1℃，和在72℃延伸1分钟；和29个循环，每个循环在94℃变性45秒，在57℃退火45秒，和在72℃延伸1分钟。在72℃进行最终延伸7分钟。
将反应产物通过1%琼脂糖凝胶电泳解析，其中观察到大约700-800bp的PCR产物条带。将条带从凝胶切出，并将DNA使用ILLUSTRATMGFXTMPCR DNA And Gel BandPurification Kit(GE Healthcare，Little Chalfont，UK)纯化。将纯化的PCR片段使用Kit(Invitrogen，Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)依照生产商的指示克隆入载体(Invitrogen，Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)，然后依照生产商的指示转化入TOP10Chemically Competent大肠杆菌细胞(Invitrogen，Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)。
PCR产物的序列用引物859和860直接确定，和通过用下式的M13正向和M13反向载体引物对PCR产物的4个单独克隆进行测序来确定。
M13正向：
TGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO:5)
M13反向：
AGCGGATAACAATTTCACACAGG(SEQ ID NO:6)
将序列使用BLAST检索工具(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403–410)与已知序列相比较，并确认其类似于已知的纤维二糖水解酶编码基因。
使用Talaromyces byssochlamydoides纤维二糖水解酶编码基因的部分序列设计下示的基因特异性引物934，935，1044，和1045以使得从序列的两端均能够进行基因巡查。
引物934：
AGAGTCTCGTCTCAGTACATG(SEQ ID NO:7)
引物935：
CGAATACGTCACCAGCCAC(SEQ ID NO:8)
引物1044：
AATTGCTGAGCTGTTTCAGC(SEQ ID NO:9)
引物1045：
TGACTGGTGCAACGTGATCG(SEQ ID NO:10)
基因巡查使用DNA Walking SPEEDUPTMPremix Kit(Seegene，Seoul，Korea)基于生产商的实验方案进行，但有一些次要的差异。仅使用了实验方案中所述的头两组PCR反应，其含有一个用基因特异性引物和四种不同返回引物(return primer)扩增的起始组，和一组用第二基因特异性引物的套式反应(nested reaction)。对于第一组反应使用推荐的反应体积的一半。
对于在5’方向的巡查，第一组PCR反应用基因特异性引物934进行。在扩增之后，用150μl的水稀释反应物，并将5μl的稀释物在用基因特异性引物935进行第二组套式PCR反应中用作模板。所述第二扩增如所述通过DNA Walking SPEEDUPTMPremix Kit实验方案以58℃退火温度进行。反应产物通过1%琼脂糖凝胶电泳来解析，其中在四个套式反应之一中观察到大约1000bp的暗淡的单个条带。将该1000bp片段重新扩增两次，第一次通过使用1μl含有作为模板的所述1000bp产物的反应物重复套式PCR反应。反应产物通过1%琼脂糖凝胶电泳解析，而从该反应物进行第二次重新扩增：用移液尖从凝胶移取小块的1000bp条带，将其在相同条件下的PCR反应中用作模板。反应产物通过使用40mM Tris碱-20mM乙酸钠-1mM EDTA二钠盐(TAE)缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳解析，并将所述1000bp条带从凝胶切出，并使用ILLUSTRATMGFXTMPCR DNA And Gel Band Purification Kit纯化DNA。PCR产物的序列使用引物935确定。
对于在3’方向的巡查，第一组PCR反应用基因特异性引物1044进行。在扩增之后，用150μl的水稀释反应物，并将5μl的稀释物在用基因特异性引物1045进行第二组套式PCR反应中用作模板。所述第二扩增如所述通过DNA Walking SPEEDUPTMPremix Kit实验方案以56℃退火温度进行。将反应产物从PCR反应组分使用ILLUSTRATMGFXTM PCR DNA And GelBand Purification Kit纯化，并通过在试剂盒供应的10μl洗脱缓冲液中洗脱来浓缩。分析产物，即首先将各4μl的纯化的PCR反应物使用TOPO TAKit反应直接克隆入并将TOPO TAKit反应物根据生产商的指示转化入TOP10Chemically Competent大肠杆菌细胞(Invitrogen，Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)。对获得的克隆通过选择性消化筛选插入，并将含有插入物的那些用M13正向(SEQID NO:5)和M13反向(SEQ ID NO:6)载体引物进行测序。四个各大约800bp的单独的克隆提供T.byssochlamydoides纤维二糖水解酶编码基因的3’序列。将所有序列装配入单个重叠群(contig)。
Talaromyces byssochlamydoides纤维二糖水解酶编码序列的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。1789bp的基因组DNA序列(含有终止密码子)含有位于SEQ ID NO:1的80至131，201至253，540至592，847至897，1036至1095，1354至1443，和1686至1744的8个内含子。基因组DNA片段编码456个氨基酸的多肽。成熟多肽编码序列的%G+C含量是56%。使用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，预测了19个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有437个氨基酸，具有46kDa的预测分子量和4.0的等电点。该蛋白在N端含有CBM1类型的纤维素结合模块(SEQ IDNO:2的氨基酸20至56)。催化域是氨基酸98至456。
不具信号肽的成熟纤维二糖水解酶氨基酸序列的比较性比对，使用如EMBOSS的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)以缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62矩阵来确定。比对显示Talaromyces byssochlamydoides纤维二糖水解酶(成熟多肽)的推导的氨基酸序列与来自埃默森踝节菌的纤维二糖水解酶的推导的氨基酸序列(UNIPROT:Q8NIB5)分享84%同一性(排除缺口)。
实施例2：将Talaromyces byssochlamydoides纤维二糖水解酶编码基因克隆入曲霉属表达载体
将T.byssochlamydoides纤维二糖水解酶编码基因通过用两个下示的合成寡核苷酸引物从基因组DNA PCR扩增蛋白编码序列来克隆入曲霉属表达载体pMStr57(WO2004/032648)。载体pMStr57含有用于在大肠杆菌中选择和繁殖，和在曲霉属中选择和表达的序列。在曲霉属中的选择通过构巢曲霉的amdS促进，该基因允许使用乙酰胺作为唯一的氮源。在曲霉属中的表达通过来自黑曲霉的修饰的中性淀粉酶II(NA2)启动子来介导，所述启动子融合于来自构巢曲霉的丙糖磷酸异构酶(tpi)编码基因的5’前导序列，和来自黑曲霉的淀粉葡糖苷酶编码基因的终止子。
引物1167：
ACACAACTGGGGATCCTCACCATGCGAAATATTCTTG(SEQ ID NO:11)
引物1168：
CCCTCTAGATCTCGAGCTAGAATGACGGATTGGCGTT(SEQ ID NO:12)
扩增反应使用IPROOFTMHigh Fidelity2X Master Mix(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)遵循生产商的指示来进行。所述扩增反应物包含作为模板的T.byssochlamydoides CBS413.71基因组DNA，各25pmol的引物1167和1168，和25μl的IPROOFTMHigh Fidelity2X Master Mix，终体积为50μl。扩增反应在热循环仪中进行，其程序如下：在98℃进行起始模板变性2分钟；5个循环，每个循环在98℃变性10秒，在65℃退火10秒，和在72℃延伸1分钟；和30个循环，每个循环在98℃变性10秒，和在72℃合并退火延伸1分钟。在72℃进行最终延伸10分钟。
将大约2000bp的PCR产物使用PCR DNA And Gel Band Purification Kit根据生产商的指示从剩余的反应物组分分离。对纯化的PCR片段进行测序，且所述序列与SEQ ID NO:1的序列完全一致。
将PCR片段使用IN-FUSIONTMDry-Down PCR Cloning Kit(ClontechLaboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)根据生产商的指示克隆入Bam HI和Xho I消化的pMStr57。对所得的曲霉属表达构建体pMStr215的Talaromyces byssochlamydoides纤维二糖水解酶编码DNA进行测序，且所述序列与SEQ ID NO:1的序列完全一致。
实施例3：Talaromyces byssochlamydoides纤维二糖水解酶编码基因在米曲霉MT3568中的表达
将真菌表达宿主米曲霉菌株MT3568根据Christensen等，1988，Biotechnology6，1419-1422和WO2004/032648用pMStr215进行转化。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)基因破坏的衍生物(WO2002/40694)，其中在敲除米曲霉amdS基因的过程中恢复了pyrG营养缺陷。将八个转化体在30℃在750μl的DAP2C-1培养基(WO2004/032648)中培养4日。将样品通过SDS-PAGE使用E-PAGE488%凝胶以SeeBlue Plus2分子量标准(Invitrogen，Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)根据生产商的指示进行监视。将凝胶用INSTANTBLUETM(Expedeon Protein Solutions，Cambridge，UK)染色。六个转化体产生了大约55kDa的新颖蛋白条带。
将这些转化体中的两个，其命名为米曲霉MStr390和MStr391，通过将分生孢子在含有0.01%X-100的选择性培养基(amdS)上稀释划线(以限制菌落大小)来分离两次。
实施例4：对重组米曲霉MStr391进行摇瓶培养以产生Talaromycesbyssochlamydoides纤维二糖水解酶
将来自两个汇合的COVE N斜面的米曲霉MStr391的孢子(命名为EXP03666)，用0.01%20的溶液收集，并用于接种十个各含有150ml的DAP4C-1培养基的摇瓶。将烧瓶在30℃在200rpm的恒定振荡下温育4日。真菌菌丝体和孢子在收获时通过首先将发酵液穿过3个具有增加的颗粒保留大小(particle retention size)(1.6μm，1.2μm和0.7μm)的玻璃微纤维过滤器的层叠(sandwich)过滤，然后穿过0.45μm地下水过滤器(groundwaterfilter)过滤来去除。
将经过滤的培养液添加至1.8M硫酸铵并调整至pH5.6。在0.22μm PES过滤器(Nalge Nunc International，Rochester，NY，USA)上过滤之后，将滤过物加载于用1.8M硫酸铵pH5.6平衡的Phenyl SepharoseTM6Fast Flow柱(high sub)(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)上，并将结合的蛋白用25mM HEPES pH7.0洗脱。将级分汇集，并施于在50mM HEPES pH7.0中平衡的EPHADEXTMG-25(medium)(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)柱。将级分施于在50mM HEPES pH7.0中平衡的SOURCETM15Q(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)柱，并将结合的蛋白用0-1000mM氯化钠的线性梯度洗脱。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProtein Assay Kit(Thermo Fischer Scientific，Waltham，MA，USA)确定，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白标样。
实施例5：预处理的玉米秸秆水解测定
将玉米秸秆在U.S.Department of Energy National Renewable EnergyLaboratory(美国能源部国家可再生能源实验室)(NREL)使用1.4wt%硫酸在165℃和107psi预处理8分钟。预处理的玉米秸秆(PCS)中的不溶于水的固体含有56.5%纤维素，4.6%半纤维素和28.4%木质素。通过两阶段硫酸水解，接着通过使用NREL Standard AnalyticalProcedure#002的高效液相色谱分析糖来确定纤维素和半纤维素。木质素在用硫酸水解纤维素和半纤维素级分之后使用NREL Standard Analytical Procedure#003以重量分析法确定。
未经磨制、未经洗涤的PCS(全浆料PCS)通过藉由添加10M NaOH与充分混合将PCS的pH调整至5.0，然后在120℃蒸汽灭菌20分钟来制备。全浆料PCS的干重量是29%。经磨制、未经洗涤的PCS(干重量32.35%)通过在Cosmos ICMG40湿式多用途研磨机(EssEmmCorporation，Tamil Nadu，India)中磨制全浆料PCS来制备。经磨制、洗涤的PCS(干重量32.35%)以相同方式制备，并接着用去离子水洗涤和反复倾去上清级分。
PCS的水解使用2.2ml深孔板(Axygen，Union City，CA，USA)在1.0ml的总反应体积中进行。水解用50mg的不溶性PCS固体每ml的含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液和多种蛋白加载量的多种酶组合物(表示为mg蛋白每克纤维素)进行。制备酶组合物，然后以50μl至200μl范围的体积同时添加至所有孔，至每个反应中1ml的终体积。然后使用ALPS-300TM平板热密封器(Abgene，Epsom，United Kingdom)密封平板，充分混合，并在特定温度温育72小时。所有报道的反应重复三次进行。
在水解之后，使用0.45μm96孔过滤板(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤样品，然后如下所述就糖含量分析滤过物。当不立即使用时，将过滤的等分试样冻结于-20℃。稀释于0.005M H2SO4的样品的糖浓度使用4.6x250mmHPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)通过在65℃用0.05%w/w苯甲酸-0.005M H2SO4以0.6ml每分钟的流速洗脱，和通过从由纯糖样品校正的折光率检测1100HPLC，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)所得的葡萄糖、纤维二糖和木糖信号的积分的定量来进行测量。使用所得的葡萄糖和纤维二糖当量对于每个反应计算纤维素转化的百分比。
分别测量葡萄糖、纤维二糖和木糖。就合适的稀释因子调整测得的糖浓度。来自未洗涤的PCS的酶法产生的糖的净浓度通过就在零时点未洗涤的PCS中相应的背景糖浓度调整测得的糖浓度来确定。所有HPLC数据处理使用MICROSOFT EXCELTM软件(Microsoft，Richland，WA，USA)进行。
使用下式计算纤维素转化为葡萄糖的程度：%转化=(葡萄糖浓度/限制消化中的葡萄糖浓度)x100。为了计算总转化，将葡萄糖和纤维二糖值合并。将纤维二糖浓度乘以1.053以转化为葡萄糖当量，并加至葡萄糖浓度。总纤维素转化的程度使用下式计算：%转化=([葡萄糖浓度+1.053x(纤维二糖浓度)]/[(葡萄糖浓度+1.053x限制消化中的(纤维二糖浓度)])x100。对于纤维二糖，该1.053因子考虑了当纤维二糖转化为葡萄糖时质量的增加。为了计算%转化，基于纤维素酶对照(50-100mg的里氏木霉纤维素酶每克纤维素)设定100%转化点，并将所有值除以该数值并接着乘以100。将三次重复数据点取平均值，并计算标准偏差。
实施例6：烟曲霉NN055679Cel7A纤维二糖水解酶I的制备
对烟曲霉部分基因组序列(The Institute for Genome Research，Rockville，MD)的tfasty检索(Pearson等，1997，Genomics46:24-36)使用来自里氏木霉的Cel7纤维二糖水解酶蛋白序列(登录号P00725)作为查询序列来进行。基于在氨基酸水平与查询序列的高类似性程度，数个基因鉴定为推定的家族GH7同源物。选择一个与查询序列具有显著同一性的基因组区进行进一步研究，并将相应基因命名为cel7A。
设计了下示的两个合成的寡核苷酸引物以从WO2005/047499中所述的烟曲霉的基因组DNA PCR扩增烟曲霉NN055679cel7A纤维二糖水解酶I基因(SEQ ID NO:13[DNA序列]和SEQ ID NO:14[推导的氨基酸序列])。
正向引物：5'-gggcATGCTGGCCTCCACCTTCTCC-3'(SEQ ID NO:15)
反向引物：5'-gggttaattaaCTACAGGCACTGAGAGTAA-3’(SEQ ID NO:16)
大写字母代表编码序列。剩余序列分别在正向和反向序列中提供对于Sph I和PacI的限制性内切核酸酶位点。使用这些引物，使用标准PCR方法扩增烟曲霉cel7A基因，并将反应产物通过使用TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳分离，并使用GelExtraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)根据生产商的指示来纯化。
用Sph I和Pac I消化片段，并根据标准步骤将其连接入亦用Sph I和Pac I消化的表达载体pAlLo2。将连接产物根据生产商的指示转化入大肠杆菌细胞(Stratagene,La Jolla,CA,USA)。通过限制性消化检测出含有正确大小的质粒的大肠杆菌转化体，并使用9600(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)制备质粒DNA。来自该质粒的插入基因的DNA测序用Applied Biosystems Model377XL Automated DNASequencer(Perkin-Elmer/Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA，USA)使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，Journal of Virology Methods38:47-60)和引物步移策略进行。审视核苷酸序列数据的品质，并将所有序列在PHRED/PHRAP软件(University ofWashington，Seattle，WA，USA)的协助下彼此比较。核苷酸序列显示为匹配通过TIGR确定的基因组序列(SEQ ID NO:13[DNA序列]和SEQ ID NO:14[推导的氨基酸序列])。所得的质粒命名为pEJG93。
米曲霉JaL250原生质体(WO99/61651)根据Christensen等，1988，见上文的方法来制备，并将5μg的pEJG93(以及作为载体对照的pAlLo2)用于转化米曲霉JaL250。转化得到100个转化体。将十个转化体分离至单个PDA平板。
将十个转化体中的五个的汇合PDA平板用5ml的0.01%20洗涤，并分别接种入125ml玻璃烧瓶中的25ml的MDU2BP培养基，并在34℃，250rpm温育。在温育之后五日，将来自每个培养物的0.5μl的上清使用8-16%Tris-Glycine SDS-PAGE凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)根据生产商的指示来进行分析。培养物的SDS-PAGE概貌显示一个转化体具有大约70kDa的主要条带。将该转化体命名为米曲霉JaL250EJG93。
将五百ml的摇瓶培养基添加至2800ml摇瓶。所述摇瓶培养基包含45g的麦芽糖，2g的K2HPO4，12g的KH2PO4，1g的NaCl，1g的MgSO4·7H2O，7g的酵母提取物，2g的尿素，0.5ml的微量元素溶液，和去离子水加至1升。所述微量元素溶液包含13.8g的FeSO4·7H2O，14.3g的ZnSO4·7H2O，8.5g的MnSO4·H2O，2.5g的CuSO4·5H2O，0.5g的NiCl2·6H2O，3g的柠檬酸，和去离子水加至1升。将两个摇瓶用含0.01%80的米曲霉JaL250EJG93的PDA平板的悬液接种，并在定轨振荡器上在34℃在200rpm下培养120个小时。将培养液使用0.7μmWhatman玻璃过滤器r GF/F(Whatman，Piscataway，NJ，USA)接着用0.22μm EXPRESSTMPlusMembrane(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤。
将过滤的培养液使用配置有10kDa聚醚砜膜(Pall Filtron，Northborough，MA，USA)的切向流浓缩器(Pall Filtron，Northborough，MA，USA)浓缩并用20mM Tris-HCl pH8缓冲液交换。蛋白浓度使用Microplate BCATMProtein Assay Kit确定，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白标样。
实施例7：桔橙嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)CGMCC0670Cel5A内切葡聚糖酶II的制备
根据下述步骤克隆编码Cel5A内切葡聚糖酶II的桔橙嗜热子囊菌CGMCC0670cDNA(SEQ ID NO:17[DNA序列]和SEQ ID NO:18[推定的氨基酸序列])。将桔橙嗜热子囊菌菌株在500ml Erlenmeyer带挡板的烧瓶中的80ml的CBH1培养基0.5%葡萄糖，0.14%(NH4)2SO4)中在45℃以165rpm振荡进行生长3日。通过在7000rpm进行离心30分钟收获菌丝体，并在用于RNA提取之前储藏于-80℃。从100mg的菌丝体使用PlantMini Kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)分离RNA。
使用3’RACE系统和5’RACE系统和如下文所示的N端氨基酸的引物BG025-1，BG025-2，BG025-3，和BG025-4通过RT PCR分离桔橙嗜热子囊菌内切葡聚糖酶的cDNA。
引物BG025-1：
5’-AA(T/C)GA(A/G)TC(T/C/A/G)GG(T/C/A/G)GC(T/C/A/G)GAATT-3’(SEQ ID NO:19)
引物BG025-2：
5’-AA(T/C)GA(A/G)TC(T/C/A/G)GG(T/C/A/G)GC(T/C/A/G)GAGTT-3’(SEQ ID NO:20)
引物BG025-3：
5’-AA(T/C)GA(A/G)AG(T/C)GG(T/C/A/G)GC(T/C/A/G)GAATT-3’(SEQ ID NO:21)
引物BG025-4：
5’-AA(T/C)GA(A/G)AG(T/C)GG(T/C/A/G)GC(T/C/A/G)GAGTT-3’(SEQ ID NO:22)
将RT PCR产物使用Vector System(Promega,Madison,WI,USA)连接入质粒并转化入大肠杆菌菌株JM109。分离了单个克隆，其携带含有内切葡聚糖酶cDNA的称为pBGC1009的质粒。
设计PCR引物以从质粒pBGC1009扩增编码桔橙嗜热子囊菌内切葡聚糖酶的cDNA。并入限制性酶位点Bsp HI和Pac I以供符合读框地克隆入米曲霉表达质粒pBM120a(WO2006/039541)。
引物996261：
5'-GATCTCATGAAGCTCGGCTCTCTCGT-3’(SEQ ID NO:23)
BspHI
引物996167：
5'-TTAATTAATCAAAGATACGGAGTCAAAATAGG-3’(SEQ ID NO:24)
PacI
将感兴趣的片段通过PCR使用EXPANDTMHigh Fidelity PCR System扩增。PCR扩增反应混合物含有1μl的0.09μg/μl pBGC1009，1μl的引物996261(50pmol/μl)，1μl的引物996167(50pmol/μl)，5μl的含15mM MgCl2的10X PCR缓冲液，1μl的dNTP混合物(各10mM)，37.25μl的水，和0.75μl(3.5U/μl)的DNA聚合酶混合物。使用热循环仪(Eppendorf Scientific,Inc.,Westbury,NY,USA)以扩增片段，其程序如下：1个循环，在94℃进行2分钟；10个循环，每循环在94℃进行15秒，55℃进行30秒，72℃进行1.5分钟；15个循环，每循环在94℃进行15秒，55℃进行30秒，和72℃进行1.5分钟，在每个后续循环加上5秒延伸；1个循环，在72℃进行7分钟；和4℃维持。
通过使用TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳纯化1008bp的PCR产物，从凝胶切出，并使用Gel Purification Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)纯化。将纯化产物根据生产商的指示直接连接入将所得质粒命名为pBM124a。
用Bsp HI和Pac I消化质粒pBM124a，通过使用TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用Gel Purification Kit纯化。将质粒片段连接于载体pBM120a，用Nco I和Pac I消化。将所得表达质粒命名为pBM123a。质粒pBM123a含有驱动桔橙嗜热子囊菌内切葡聚糖酶cDNA克隆的表达的二重NA2-TPI启动子，AMG终止子，和作为选择性标记的amdS。
米曲霉BECh2(WO2000/139322)原生质体根据Christensen等，1988，见上文的方法制备并用六μg的pBM123a来转化。在COVE平板上选择初级转化体5日。在摇瓶分析之前将转化体孢子纯化两次。
将转化体的孢子接种入125ml摇瓶中25ml的MY25培养基。将培养物在34℃，200rpm在平台振荡器上温育五日。在第3和第5日，收获培养上清，并通过离心澄清以去除菌丝体。使用无染色，10-20%梯度SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)根据生产商的指示分析来自三个转化体的二十微升的上清。培养物的SDS-PAGE概貌显示所有的转化体具有大约32kDa的新的主要条带。选择一个转化体并命名为米曲霉EXP00858。
用0.1ml的米曲霉EXP00858的孢子储备接种含有100ml的SY50培养基的塑料不带挡板的500ml摇瓶，并在34℃，200rpm温育24小时以产生种子培养物。将五十ml的种子培养物接种入含有2升的培养基的2升发酵罐，所述培养基包含每升的0.5g的Pluronic acid，30g的蔗糖，2g的MgSO4·7H2O，2g的无水KH2PO4，1g的柠檬酸·，2g的(NH4)2SO4，1g的K2SO4，20g的酵母提取物，和0.5g的200X AMG痕量金属溶液，pH5.0。用麦芽糖给料对发酵进行补料。使用5N H3PO4和15%NH4OH控制pH并保持在5.0，然后增加至5.25。温度保持在34.0℃+/-1.0℃。搅拌为1000rpm。空气流为1.0vvm。
将200ml体积的不含细胞的上清用去离子水稀释至1升。将pH调整至8，并使用0.22μm聚醚砜(PES)过滤器对样品进行过滤灭菌。将经过滤灭菌的样品加载于用25mM Tris pH8预平衡的250ml Q SEPHAROSETMFast Flow柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)。用在相同的缓冲液中的0至1M NaOH梯度从柱洗脱酶。汇集含有β-葡糖苷酶活性的级分(400ml)，并根据理论消光系数和样品在280nm的吸光度来计算酶浓度。
实施例8：具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌CGMCC0583GH61A多肽的制备
根据WO2005/074656使用米曲霉JaL250作为宿主重组制备具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌CGMCC0583GH61A多肽(SEQ ID NO:25[DNA序列]和SEQ ID NO:26[推定的氨基酸序列])。将重组产生的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽首先通过使用10kDa膜超滤来浓缩，缓冲液交换至20mM Tris-HCl pH8.0，然后使用100ml QBig Beads柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)以在相同的缓冲液中的600ml的0-600mM NaCl线性梯度纯化。收集10ml的级分，并基于SDS-PAGE汇集。
然后将汇集级分(90ml)使用20ml柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)以在相同的缓冲液中的500ml的0-500mM NaCl线性梯度进一步纯化。收集6ml的级分，并基于SDS-PAGE汇集。将汇集级分(24ml)通过使用10kDa膜的超滤来浓缩，并使用320ml75SEC柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)以大约1.3升的150mMNaCl-20mM Tris-HCl pH8.0的等度洗脱进行层析。收集20m l的级分，并基于SDS-PAGE汇集。使用Microplate BCATMProtein Assay Kit确定蛋白浓度，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例9：烟曲霉NN055679Cel3Aβ-葡糖苷酶的制备
根据WO2005/047499使用里氏木霉RutC30作为宿主重组制备烟曲霉NN055679Cel3Aβ-葡糖苷酶(SEQ ID NO:27[DNA序列]和SEQ ID NO:28[推定的氨基酸序列])。
将过滤的培养液浓缩和并使用配置有10kDa聚醚砜膜的切线流浓缩器用20mMTris-HCl pH8.5进行缓冲液交换。将样品加载于在20mM Tris pH8.5中平衡的QHigh Performance柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)，并用0-600mM氯化钠的线性梯度洗脱结合蛋白。将级分浓缩，并加载于用20mM Tris-150mM氯化钠，pH8.5平衡的75HR26/60柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)上。使用Microplate BCATMProtein Assay Kit确定蛋白浓度，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例10：烟曲霉NN055679GH10木聚糖酶的制备
根据WO2006/078256使用米曲霉BECh2作为宿主重组制备烟曲霉NN055679GH10木聚糖酶(xyn3)(SEQ ID NO:29[DNA序列]和SEQ ID NO:30[推定的氨基酸序列])。
使用26/10脱盐柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)根据生产商的指示将过滤的培养液脱盐和缓冲液交换入20mM Tris-150mM NaCl pH8.5。使用Microplate BCATMProtein Assay Kit以牛血清白蛋白作为蛋白标样确定蛋白浓度。
实施例11：Talaromyces byssochlamydoides家族GH6纤维二糖水解酶在通过高温酶组合物在50-65℃水解经磨制、未经洗涤的PCS中的作用。
在50℃，55℃，60℃，和65℃使用经磨制、未经洗涤的PCS作为底物在高温酶组合物中评估Talaromyces byssochlamydoides家族GH6纤维二糖水解酶。所述高温酶组合物含有40%烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I，25%Talaromyces byssochlamydoides家族GH6多肽纤维二糖水解酶，10%桔橙嗜热子囊菌Cel5A内切葡聚糖酶II，15%具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，5%烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，和5%烟曲霉GH10木聚糖酶(xyn3)。将所述高温酶组合物以3.0mg总蛋白每g纤维素添加至PCS水解反应，并将水解结果与对于不含T.byssochlamydoides GH6纤维二糖水解酶的类似的高温酶组合物(2.25mg蛋白每g纤维素)的结果相比较。
测定如实施例5中所述进行。用经磨制、未经洗涤的PCS(5%不溶性固体)进行的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0中进行72小时。所有反应进行一式三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
示于图1的结果说明在50℃，55℃，60℃，和65℃，含有25%T.byssochlamydoides家族GH6纤维二糖水解酶的高温酶组合物与不含所述T.byssochlamydoides纤维二糖水解酶的酶组合物相比，性能显著更佳。
实施例12：烟曲霉纤维二糖水解酶的制备
如WO2011/057140中所述在米曲霉中重组制备烟曲霉NN055679纤维二糖水解酶(SEQ ID NO:31[DNA序列]和SEQ ID NO:32[推导的氨基酸序列])。将烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶的过滤的培养液使用400ml SEPHADEXTMG-25柱(GE Healthcare，United Kingdom)根据生产商的指示缓冲液交换入20mM Tris pH8.0。将级分汇集并调整至1.2M硫酸铵-20mMTris pH8.0。将经平衡的蛋白加载于在含1.2M硫酸铵的20mM Tris pH8.0中平衡的PHENYLSEPHAROSETM6Fast Flow柱(high sub)(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)之上，并将结合的蛋白用不含硫酸铵的20mM Tris pH8.0洗脱。将级分汇集。蛋白浓度使用MicroplateBCATMProtein Assay Kit以牛血清白蛋白作为蛋白标样来确定。
实施例13：嗜热毁丝霉CBS202.75GH6A纤维二糖水解酶的制备
如WO2011/057140中所述在米曲霉中重组制备嗜热毁丝霉CBS202.75GH6A纤维二糖水解酶(SEQ ID NO:33[DNA序列]和SEQ ID NO:34[推导的氨基酸序列])。将嗜热毁丝霉GH6A纤维二糖水解酶的过滤的培养液使用400ml SEPHADEXTMG-25柱(GE Healthcare，United Kingdom)根据生产商的指示缓冲液交换入20mM Tris pH8.0。将经缓冲液交换的培养液用1.2M硫酸铵调整至20mM Tris pH8.0，并施于用含1.2M硫酸铵的20mM Tris pH8.0平衡的PHENYL SEPHAROSETM6Fast Flow柱(high sub)(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)。结合的蛋白用不含硫酸铵的20mM Tris pH8.0洗脱并汇集级分。将汇集的级分使用10kDaMWCO Amicon Ultra离心浓缩器(Millipore，Bedford，MA，USA)浓缩并缓冲液交换入20mMTris pH8.0。蛋白浓度使用Microplate BCATMProtein Assay Kit以牛血清白蛋白作为蛋白标样来确定。
实施例14：三种纤维二糖水解酶对经磨制、洗涤的PCS在50-65℃的评估
将三种纤维二糖水解酶(Talaromyces byssochlamydoides GH6纤维二糖水解酶，烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶，和嗜热毁丝霉GH6A纤维二糖水解酶)以1mg蛋白每g纤维素在50℃，55℃，60℃，和65℃使用经磨制、洗涤的PCS作为底物与1mg蛋白每克纤维素的烟曲霉β-葡糖苷酶进行评估。
测定如实施例5中所述进行。用经磨制、洗涤的PCS(5%不溶性固体)进行的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH4.0，4.5，和5.0缓冲液中进行72小时。所有反应进行一式三次，并涉及在水解开始时的单次混合。
图2中所示的结果说明在50℃，55℃，60℃，和65℃以及pH4.0，4.5，和5.0，所述Talaromyces byssochlamydoides GH6纤维二糖水解酶(Tb6)与烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶(Af6A)或嗜热毁丝霉GH6A纤维二糖水解酶(Mt6A)当在相同的温度和pH条件下比较时，产生更高的经磨制、洗涤的PCS的转化。
实施例15：通过差示扫描量热法确定Td
Talaromyces byssochlamydoides GH6纤维二糖水解酶的热稳定性通过差示扫描量热法(DSC)使用VP-Capillary Differential Scanning Calorimeter(MicroCal Inc.，Piscataway，NJ，USA)确定。热变性温度Td(℃)取为在以200K/hr的恒定程序的加热速率在50mM乙酸钠pH5.0中加热酶溶液之后获得的热分析图(Cp对T)中变性峰(主要吸热峰)的顶部。将样品和参照溶液(大约0.2ml)从10℃的储藏条件加载于量热器(参照：不含酶的缓冲液)，并从20℃至110℃进行DSC扫描之前在20℃热预平衡20分钟。对于Talaromycesbyssochlamydoides GH6纤维二糖水解酶的Td在pH5.0确定为74℃+/-1℃。
生物材料的保藏
下述的生物材料已经依据布达佩斯条约的条款保藏于农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection(NRRL),Northern Regional Research Center,1815University Street,Peoria,IL,USA)，并给予下述的登录号：
保藏 登录号 保藏日期
大肠杆菌(pAJ227) NRRL B-50474 2011年3月1日
所述菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，依据该外国专利法律的授权的人能够获得所述培养物。所述保藏物为所保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了该申请的副本，或其后续文本的国家，依据该外国专利法律可以获得所述保藏物。然而，应当理解，保藏物的获得并不构成对实施本发明的许可，实施本发明是对政府行为所授予的专利权的侵犯。
通过下述编号段落进一步描述本发明：
[1]具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽，其选自下组：(a)多肽，其与SEQ IDNO:2的成熟多肽具有至少85%，例如至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补物；(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少85%，例如至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的包含在一个或多个位置的取代、缺失和/或插入的变体；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的具有纤维二糖水解酶活性的片段。
[2]段1的多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85%，例如至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[3]段1或2的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补物。
[4]段1-3任一项的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少85%，例如至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[5]段1-4任一项的多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的成熟多肽。
[6]段5的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸20至456。
[7]段1-4任一项的多肽，其为SEQ ID NO:2的成熟多肽的包含在一个或多个位置的取代、缺失和/或插入的变体。
[8]段1的多肽，其为SEQ ID NO:2的片段，其中所述片段具有纤维二糖水解酶活性。
[9]段5的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与包含于质粒pAJ227的多核苷酸相同，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50474。
[10]段5的多肽，其与由包含于质粒pAJ227的多核苷酸所编码的多肽相同，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50474。
[11]一种分离的多肽，其包含催化域，所述催化域选自下组：(a)催化域，其与SEQID NO:2的氨基酸98至456具有至少90%，例如至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性；(b)催化域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸397至1786，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补物；(c)催化域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸397至1786或其cDNA序列具有至少90%，例如至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性；(d)SEQ ID NO:2的氨基酸98至456在一个或多个位置包含取代、缺失和/或插入的变体；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的催化域的片段，其具有纤维二糖水解酶活性。
[12]段11的多肽，进一步包含纤维素结合域。
[13]一种分离的多肽，其包含可操作地连接于催化域的纤维素结合域，其中所述纤维素结合域选自下组：(a)纤维素结合域，其与SEQ ID NO:2的氨基酸20至56具有至少90%，例如至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性；(b)纤维素结合域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸58至273，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补物；(c)纤维素结合域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸58至273具有至少90%，例如至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性；(d)SEQ ID NO:2的氨基酸20至56在一个或多个位置包含取代、缺失和/或插入的变体；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的片段，其具有纤维素结合活性。
[14]段13的多肽，其中所述催化域获得自水解酶、异构酶、连接酶、裂合酶、氧还酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶(chitinase)、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
[15]一种组合物，其包含段1-14任一项的多肽。
[16]一种分离的多核苷酸，其编码段1-14任一项的多肽。
[17]一种核酸构建体或表达载体，其包含段16的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个调控序列，所述调控序列指导所述多肽在表达宿主中的产生。
[18]一种重组宿主细胞，其包含段16的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个调控序列，所述调控序列指导多肽的产生。
[19]一种产生段1-14中任一项的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。
[20]一种产生具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养段18的宿主细胞；和(b)回收所述多肽。
[21]一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其用编码段1-14任一项的多肽的多核苷酸转化。
[22]一种产生具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养段21的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述多肽。
[23]一种产生亲本细胞的突变体的方法，所述方法包括失活编码段1-14中任一项的多肽的多核苷酸，其导致突变体与亲本细胞相比产生较少的所述多肽。
[24]由段23的方法产生的突变细胞。
[25]段24的突变细胞，其进一步包含编码天然或异源蛋白的基因。
[26]一种产生蛋白的方法，其包括：(a)在有助于所述蛋白产生的条件下培养段24或25的突变细胞；和(b)回收所述蛋白。
[27]一种双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含段16的多核苷酸的亚序列，其中dsRNA任选地为siRNA或miRNA分子。
[28]段27的双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其为长约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更长的双链体核苷酸。
[29]一种抑制具有纤维二糖水解酶的多肽在细胞中表达的方法，其包括对细胞施用或者在细胞中表达段27或28的双链抑制性RNA(dsRNA)分子。
[30]由段29的方法产生的细胞。
[31]段30的细胞，其进一步包含编码天然或异源蛋白的基因。
[32]一种产生蛋白的方法，其包括：(a)在有助于所述蛋白产生的条件下培养段30或31的细胞；和(b)回收所述蛋白。
[33]一种分离的多核苷酸，其编码信号肽，所述信号肽包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸1至19。
[34]一种核酸构建体或表达载体，其包含编码蛋白的基因，所述基因可操作地连接于段33的多核苷酸，其中所述基因对于编码所述信号肽的多核苷酸是外源的。
[35]一种重组宿主细胞，其包含编码蛋白的基因，所述基因可操作地连接于段33的多核苷酸，其中所述基因对于编码所述信号肽的多核苷酸是外源的。
[36]一种产生蛋白的方法，其包括：(a)在有助于所述蛋白产生的条件下培养重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含编码蛋白的基因，所述基因可操作地连接于段33的多核苷酸，其中所述基因对于编码所述信号肽的多核苷酸是外源的；和(b)回收所述蛋白。
[37]一种降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在段1-14中任一项的具有纤维二糖水解酶活性的多肽存在下用酶组合物处理所述纤维素材料。
[38]段37的方法，其中所述纤维素材料经过预处理。
[39]段37或38任一项的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
[40]段39的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[41]段39的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
[42]段37-41中任一项的方法，进一步包括回收经降解的纤维素材料。
[43]段42的方法，其中经降解的纤维素材料是糖。
[44]段43的方法，其中所述糖选自下组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖，和阿拉伯糖。
[45]一种产生发酵产物的方法，其包括：(a)在段1-14中任一项的具有纤维二糖水解酶活性的多肽存在下，用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。
[46]段45的方法，其中所述纤维素材料经预处理。
[47]段45或46的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
[48]段47的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[49]段47的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
[50]段45-49中任一项的方法，其中步骤(a)和(b)在同步糖化和发酵中同时进行。
[51]段45-50中任一项的方法，其中发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸或聚酮化合物。
[52]一种发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是在段1-14中任一项的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的存在下用酶组合物糖化的。
[53]段52的方法，其中所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。
[54]段53的方法，进一步包括从发酵回收发酵产物。
[55]段52-54任一项的方法，其中所述纤维素材料在糖化前经过预处理。
[56]段52-55任一项的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
[57]段56的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[58]段56的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
[59]段53-58任一项的方法，所述发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸或聚酮化合物。
[60]一种全培养液配制物或细胞培养组合物，其包含段1-14任一项的多肽。
本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体方面的范围内，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的方面包含于本发明的范围内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也旨在落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。

Claims (46)

1.具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少99％序列同一性，且所述多肽是Talaromyces byssochlamydoides多肽。
2.具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽，其由SEQ ID NO:2的氨基酸20-456的序列组成。
3.一种组合物，其包含权利要求1或2的多肽。
4.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1或2的多肽。
5.一种核酸构建体或表达载体，其包含权利要求4的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个调控序列，所述调控序列指导所述多肽在表达宿主中的产生。
6.一种重组宿主细胞，其包含权利要求4的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个调控序列，所述调控序列指导多肽的产生，其中所述重组宿主细胞不是植物细胞。
7.一种产生权利要求1或2的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。
8.一种产生具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养权利要求6的宿主细胞；和(b)回收所述多肽。
9.一种产生具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养用编码权利要求1或2所述多肽的多核苷酸转化的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述多肽。
10.一种产生亲本细胞的突变体的方法，所述方法包括灭活编码权利要求1或2的多肽的多核苷酸，其导致突变体不产生所述多肽。
11.由权利要求10的方法产生的突变细胞，其中所述突变细胞不是植物细胞。
12.权利要求11的突变细胞，其进一步包含编码原生(native)或异源蛋白的基因。
13.一种产生蛋白的方法，其包括：(a)在有助于所述蛋白产生的条件下培养权利要求11或12的突变细胞；和(b)回收所述蛋白。
14.一种降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在权利要求1或2的具有纤维二糖水解酶活性的多肽存在下用酶组合物处理所述纤维素材料。
15.权利要求14的方法，其中所述纤维素材料经过预处理。
16.权利要求14或15的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、酯酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶和蛋白酶。
17.权利要求16的方法，其中所述木质素分解酶是漆酶。
18.权利要求16的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
19.权利要求16的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
20.权利要求16-19中任一项的方法，其中所述酶组合物进一步包含棒曲霉素和/或膨胀素。
21.权利要求14-20中任一项的方法，进一步包括回收经降解的纤维素材料。
22.权利要求21的方法，其中经降解的纤维素材料是糖。
23.权利要求22的方法，其中所述糖选自下组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖，和阿拉伯糖。
24.一种产生发酵产物的方法，其包括：(a)在权利要求1或2的具有纤维二糖水解酶活性的多肽存在下，用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。
25.权利要求24的方法，其中所述纤维素材料经预处理。
26.权利要求24或25的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、酯酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶和蛋白酶。
27.权利要求26的方法，其中所述木质素分解酶是漆酶。
28.权利要求26的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
29.权利要求26的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
30.权利要求26-29任一项的方法，其中所述酶组合物进一步包含棒曲霉素和/或膨胀素。
31.权利要求24-30中任一项的方法，其中步骤(a)和(b)在同步糖化和发酵中同时进行。
32.权利要求24-31中任一项的方法，其中发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、气体、酮、有机酸或聚酮化合物。
33.权利要求32的方法，其中所述烯烃是异戊二烯。
34.权利要求32的方法，其中所述有机酸是氨基酸。
35.一种发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是在权利要求1或2的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的存在下用酶组合物糖化的。
36.权利要求35的方法，其中所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。
37.权利要求36的方法，进一步包括从发酵回收发酵产物。
38.权利要求35-37任一项的方法，其中所述纤维素材料在糖化前经过预处理。
39.权利要求35-38任一项的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、酯酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶和蛋白酶。
40.权利要求39的方法，其中所述木质素分解酶是漆酶。
41.权利要求39的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
42.权利要求39的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
43.权利要求39-42任一项的方法，其中所述酶组合物进一步包含棒曲霉素和/或膨胀素。
44.权利要求35-43任一项的方法，所述发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、气体、酮、有机酸或聚酮化合物。
45.权利要求44的方法，其中所述烯烃是异戊二烯。
46.权利要求44的方法，其中所述有机酸是氨基酸。
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