CN103608461A - 增加多肽的纤维素分解增强活性的方法 - Google Patents

增加多肽的纤维素分解增强活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及增加具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的活性的方法，其包括：将二价铜阳离子添加至包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的组合物，其中与没有所述二价铜阳离子的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽相比，所述二价铜阳离子和GH61多肽的存在增加酶组合物对所述纤维素材料的降解或转化。本发明亦涉及用于降解或转化纤维素材料的组合物，方法，和用于产生发酵产物的方法。

Description

增加多肽的纤维素分解增强活性的方法
涉及序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及用于增加和稳定具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的活性的方法和组合物。
背景技术
纤维素是单糖葡萄糖通过β-1,4-键共价键合的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，使其暴露于纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序地释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的β-1,4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。
将含纤维素原料(cellulosic feedstock)转化为乙醇具有以下优势：大量原料现成可用，避免燃烧或填埋材料是理想的，以及乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖容易地由酵母发酵成乙醇。
WO2005/074647，WO2008/148131，和WO2011/035027公开了来自土生梭孢霉(Thielavia terrestris)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。WO2005/074656和WO2010/065830公开了来自橙橘嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。WO2007/089290公开了来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。WO2009/085935，WO2009/085859，WO2009/085864，和WO2009/085868公开了来自嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。WO2010/138754公开了来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2011/005867公开了来自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2011/039319公开了来自嗜热子囊菌属菌种(Thermoascus sp)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2011/041397公开了来自青霉属菌种(Penicillium sp)(emersonii)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2011/041504公开了来自甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceous)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2008/151043公开了通过将可溶性活化二价金属阳离子添加至包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的组合物来增加该多肽的活性的方法。
在本领域中，改善具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的活性和稳定性会是优点。
本发明涉及增加和稳定具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的活性的方法和组合物。
发明内容
本发明涉及增加具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的活性的方法，其包括：将二价铜阳离子添加至包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的组合物，其中所述二价铜阳离子在纤维素材料的降解或转化中以约0.0001mM至约20mM的浓度存在。
本发明亦涉及增加具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的稳定性的方法，其包括：将二价铜阳离子添加至包含所述GH61多肽的组合物，其中所述二价铜阳离子以0.0001mM至约20mM的浓度存在。
本发明亦涉及增加具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的活性和稳定性的方法，其包括：将二价铜阳离子添加至包含所述GH61多肽的组合物，其中所述二价铜阳离子以0.0001mM至约20mM的浓度存在。
本发明亦涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，其包括：用包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和二价铜阳离子的酶组合物处理所述纤维素材料，其中所述二价铜阳离子以约0.0001mM至约20mM的浓度存在。
本发明亦涉及用于产生发酵产物的方法，其包括：(a)用包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和二价铜阳离子的酶组合物糖化所述纤维素材料，其中所述二价铜阳离子以约0.0001mM至约20mM的浓度存在；(b)用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收所述发酵产物。
本发明亦涉及发酵纤维素材料的方法，其包括用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料是用包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和二价铜阳离子的酶组合物糖化的，其中所述二价铜阳离子以约0.0001mM至约20mM的浓度存在。
本发明亦涉及包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和二价铜阳离子的组合物，其中所述二价铜阳离子在纤维素材料的降解或糖化中以约0.0001mM至约20mM的浓度存在，而且与不含二价铜阳离子的GH61多肽相比，所述二价铜阳离子和GH61多肽的存在增加酶组合物对纤维素材料的降解或转化。
附图说明
图1显示10mM乙酸钠缓冲液中1.0mM硝酸铜(II)的EPR谱(140K)。
图2显示脱金属(dematallated)的桔橙嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)GH61A多肽和土生梭孢壳(Thielavia terrestris)GH61E多肽的EPR谱(150K)。
图3A和3B显示下述(A)和(B)的EPR谱(140K)：(A)10-20%甘油和1mM乙酸钠中的铜(II)-桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽；和(B)10-20%甘油和1mM乙酸钠中的铜(II)-土生梭孢壳GH61E多肽。
图4A和4B显示(A)在用过量抗坏血酸和纤维素底物处理之后，Cu-桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的EPR谱(150K)，和(B)有机基团区域的放大(blow-up)。
图5显示(1)在GH61多肽不存在下1μM正铜(铜(II))离子对里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶组合物水解的作用(正铜离子作用(无 GH61)，白色条)，(2)在GH61多肽存在下正铜离子对里氏木霉纤维素酶组合物水解
Figure BDA0000411841600000032
的作用(正铜离子作用(+GH61)，灰色条)，和(3)在脱氢抗坏血酸存在的条件下，GH61多肽对里氏木霉纤维素酶组合物在正铜离子存在1、3和7日的条件下水解
Figure BDA0000411841600000041
的作用(GH61作用，黑色条)。
图6显示在正铜离子和脱氢抗坏血酸的存在下进行的1日水解中，GH61多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解
Figure BDA0000411841600000042
的作用(GH61作用，黑色条)。
图7显示(1)在GH61多肽不存在下100μM正铜离子对里氏木霉纤维素酶组合物水解
Figure BDA0000411841600000043
的作用(正铜离子作用(无GH61)，白色条)，(2)在GH61多肽存在下正铜离子对里氏木霉纤维素酶组合物水解
Figure BDA0000411841600000044
的作用(正铜离子作用(+GH61)，灰色条)，和(3)在脱氢抗坏血酸不存在的条件下，GH61多肽对里氏木霉纤维素酶组合物在正铜离子存在1、3和7日的条件下水解的作用(GH61作用，黑色条)。
图8显示在存在正铜离子，且不存在脱氢抗坏血酸的条件下进行的7日水解中，GH61多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解
Figure BDA0000411841600000046
的作用(GH61作用，黑色条)。
图9A和9B显示在氯化钙或硫酸铜存在下，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(Ta61A)的热稳定性。
图10显示在DTPA螯合剂的存在和不存在下,正铜离子添加对土生梭孢壳GH61E多肽的热稳定性的作用。
图11显示在pH5、7和9的条件下，100μM正铜离子添加对土生梭孢壳GH61E多肽的热稳定性的作用。
图12显示在pH5、7和9，1mM DTPA螯合剂的存在下，100μM正铜离子添加对烟曲霉GH61B多肽的热稳定性的作用。
图13显示在pH5、7和9，1mM DTPA螯合剂的存在下，100μM正铜离子添加对青霉属菌种(emersonii)GH61A多肽的热稳定性的作用。
图14显示在pH5、7和9，1mM DTPA螯合剂的存在下，100μM正铜离子添加对桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的热稳定性的作用。
图15显示在pH5、7和9，1mM DTPA螯合剂的存在下，100μM正铜离子添加对桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的热稳定性的作用。
图16显示CuSO4在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽和连苯三酚的存在下对亚甲蓝的转化的作用。
定义
乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01%TWEENTM20(聚氧乙烯山梨坦单月桂酸酯)的50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH5,25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。
等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化对α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本发明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用每ml100mM乙酸钠pH5中5mg的中等粘度小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme International Ireland,Ltd.,Bray,Co.Wicklow,Ireland)，总体积200μl，40℃30分钟，接着通过
Figure BDA0000411841600000051
HPX-87H柱层析(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析来确定的。
α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase)(EC3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据de Vries,1998,J.Bacteriol.180:243-249确定的。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH5，40℃每分钟释放1微摩尔葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶量。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucoside glucohydrolase)(E.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，β-葡糖苷酶根据Venturi等,2002,Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomiumthermophilum var.coprophilum:production,purification and some biochemicalproperties,J.Basic Microbiol.42:55-66的方法使用对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷作为底物确定。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃,pH4.8，在含有0.01%
Figure BDA0000411841600000061
20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃，pH5从1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷作为底物在含有0.01%
Figure BDA0000411841600000062
20的100mM柠檬酸钠中每分钟产生1.0μmol对硝基苯酚阴离子。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase)(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维寡糖，或任何包含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystalline cellulose degradation:New insight into the function ofcellobiohydrolases,Trends in Biotechnology15:160-167;Teeri等,1998,Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose?,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。根据Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279；van Tilbeurgh等,1982,FEBS Letters149:152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters187:283-288；以及Tomme等,1988,Eur.J.Biochem.170:575-581描述的方法确定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，Tomme等的方法可用于确定纤维二糖水解酶活性。
纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，β-葡糖苷酶，或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等,Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies,2006,Biotechnology Advances24:452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman1号滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatman1号滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由International Union of Pure andApplied Chemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurement of cellulase activities,Pure Appl.Chem.59:257-68)确立的。
就本发明而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS中纤维素(或其它经预处理的纤维素材料)在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃进行3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较。典型的条件为：1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸钠pH5，1mM MnSO4，50℃、55℃或60℃，72小时，通过
Figure BDA0000411841600000071
HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖分析。
纤维素材料：术语“纤维素材料”意指任何包含纤维素的材料。生物质的初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并由于与半纤维素的聚合木质素的共价交联而被加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有多种多样取代基的复杂分支结构。尽管纤维素通常是多形的，但植物组织中的纤维素主要是以平行葡聚糖链的不溶晶体基质的形式出现。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，这有助于稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，草本材料(包括能源作物)、农业残余物、木材(包括林业残余物)、城市固体废物、废纸、和纸浆与造纸厂残余物(参见，例如，Wiselogel等,1995,于Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman编),pp.105-118,Taylor&Francis,Washington D.C.;Wyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16;Lynd,1990,Applied Biochemistry and Biotechnology24/25:695-719;Mosier等,1999,Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics,于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,T.Scheper主编,Volume65,pp.23-40,Springer-Verlag,New York)。在本文中应理解的是，纤维素可以是木素纤维素的形式，木素纤维素一种植物细胞壁材料，包含由木质素、纤维素和半纤维素形成的混合基质。在一个优选的方面，纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选的方面，所述纤维素材料是木素纤维素，其包含纤维素、半纤维素和木质素。
在一个方面，纤维素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是木材(包括林业残余物)。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。
在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是麦秆。在另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switchgrass)。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是稻秆。在另一个方面，纤维素材料是芒草属(miscanthus)。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是杨树。在另一个方面，纤维素材料是松树。在另一个方面，纤维素材料是柳树。在另一个方面，纤维素材料是桉树。
在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头(cotton linter)。在另一个方面，纤维素材料是无定型的经磷酸处理的纤维素。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。
在另一个方面，纤维素材料是水生生物质。如用于本文中，“水生生物质”意指在水生环境中由光合作用过程产生的生物质。水生生物质可为藻类、沉水植物(submerged plant)、挺水植物(emergent plant)、或浮叶植物(floating-leaf plant)。
纤维素材料可以按原样(as is)使用，或进行预处理，使用本领域已知的常规方法，如本文所述。在一个优选的方面，预处理纤维素材料。
纤维素材料：术语“纤维素材料”意指任何包含纤维素的材料。生物质的初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有多种多样取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，农业残余物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆与造纸厂残余物、废纸和木材(包括林业残余物)(参见，例如，Wiselogel等,1995,于Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman编),pp.105-118,Taylor&Francis,Washington D.C.;Wyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16;Lynd,1990,Applied Biochemistry and Biotechnology24/25:695-719;Mosier等,1999,Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics,于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,T.Scheper主编,Volume65,pp.23-40,Springer-Verlag,New York)。在本文中应理解的是，纤维素可以是任何形式的木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选的方面，纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选的方面，所述纤维素材料是木素纤维素，其包含纤维素、半纤维素和木质素。
在一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是木材(包括林业残余物)。
在另一个方面，纤维素材料是芦竹(arundo)。在另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面，纤维素材料是竹材。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是芒草属。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷。在另一个方面，纤维素材料是麦杆。
在另一个方面，纤维素材料是白杨。在另一个方面，纤维素材料是桉树。在另一个方面，纤维素材料是枞树。在另一个方面，纤维素材料是松树。在另一个方面，纤维素材料是杨树。在另一个方面，纤维素材料是云杉。在另一个方面，纤维素材料是柳树。
在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头(cotton linter)。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是磷酸处理的纤维素。
在另一个方面，纤维素材料是水生生物质。如用于本文中，“水生生物质”意指在水生环境中由光合作用过程产生的生物质。水生生物质可为藻类、挺水植物(emergent plant)、浮叶植物(floating-leaf plant)或沉水植物(submerged plant)。
纤维素材料可以按原样(as is)使用或进行预处理，使用本领域已知的常规方法，如本文所述。在一个优选的方面，纤维素材料是经预处理的。
cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工包括剪接，然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA、或它们的组合。
调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指对编码本发明的成熟多肽的多核苷酸表达而言为必需的核酸序列。各个调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是天然的(即，来自同一基因)或外源的(即，来自不同基因)，或者，各个调控序列对于彼此而言可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以配备有接头，用于引入促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接的特异性限制位点。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内切水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等,2006,Biotechnology Advances24:452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40℃使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的调控序列可操作地连接。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”在本文中定义为根据Henrissat B.,1991,A classification of glycosyl hydrolasesbased on amino-acid sequence similarities,Biochem.J.280:309-316,及HenrissatB.,和Bairoch A.,1996,Updating the sequence-based classification of glycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。该家族中的酶最初是基于在一个家族成员测量到的非常弱的内切-1,4-β-D葡聚糖酶活性而被归类为糖苷水解酶家族的。这些酶的结构和作用模式是非经典的，且它们无法视为真正的(bona fide)糖苷酶。然而，基于它们与纤维素酶或纤维素酶的混合物一同使用时增强木素纤维素分解的能力，将它们保留在CAZy分类中。
阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)”意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在天然生物质底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。就本发明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在pH5，25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子的酶量。
片段：术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有作为其成熟多肽的活性。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如Shallom,D.和Shoham,Y.Microbial hemicellulases.Current Opinion In Microbiology,2003,6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键成分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物，半纤维素，是一种由支化和直链多糖构成的异质集团，这些多糖通过氢键键合于植物细胞壁中的纤维素微纤维，将其交联为一个鲁棒(robust)的网络。半纤维素亦共价地附接于木质素，与纤维素一同形成高度复杂的结构。半纤维素的可变的结构和组织形式需要许多酶的协同作用使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸侧基的酯连接的糖酯酶(CE)。这些催化模块，基于其一级结构的同源性，可指派为GH和CE家族。一些家族，具有总体上类似的折叠，可进一步归类为以字母标记的宗族(clan)(例如，GH-A)。这些和其他糖活性酶的一种最具信息性和最新的分类可在Carbohydrate-Active Enzymes(CAZy)数据库获得。半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&Appl.Chem.59:1739-1752在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃，和pH，例如5.0或5.5进行测量。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖任何亲本细胞的后代，其由于在复制中发生的突变而不同于亲本细胞。
增加的热稳定性：术语“增加的热稳定性”意指，在某温度温育一定时间之后，GH61多肽在二价铜阳离子存在下与二价铜阳离子不存在下相比，纤维素分解增强活性的更高的保留。GH61多肽的增加的热稳定性可例如在一个或多个(例如几个)温度的条件下评估。例如，所述一个或多个(例如几个)温度可为任何温度或45℃至95℃范围的温度，例如45，50，55，60，65，70，75，80，85，或95℃(或在此之间，如62℃，68℃等)，一个或多个(例如几个)pH为3至9的范围，例如3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，或9.0(或在此之间)，进行合适时间的温育，例如1分钟，5分钟，10分钟，15分钟，30分钟，45分钟，或60分钟，使得所述GH61多肽保留剩余活性。不过，也可以使用更长的温育时间。
GH61多肽的增加的热稳定性可通过差示扫描量热法(DSC)使用本领域中的标准方法(参见，例如Sturtevant,1987,Annual Review of Physical Chemistry38:463-488)来确定。GH61多肽的热稳定性可使用任何本领域中已知的对于具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的酶测定法来确定。参见例如WO2005/074647，WO2008/148131WO2005/074656，WO2010/065830，WO2007/089290，WO2009/085935，WO2009/085859，WO2009/085864，WO2009/085868和WO2008/151043，将它们通过提述并入本文。或者，GH61多肽的增加的热稳定性可以使用任何将GH61多肽在二价铜阳离子存在下和不存在下的性能进行比较的应用测定法来确定。举例而言，可使用本文中实施例中所述的应用测定法。
分离的：术语“分离的”意指以不在自然界出现的形式或环境存在的物质。分离的物质的非限定性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)任何至少部分地与一种或多种或所有与其天然伴随的天然存在的成分分开的物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)任何这样的物质：相对于在自然界存在的该物质，其经过人工修饰；或(4)任何这样的物质：该物质经过增加该物质相对于与其自然伴随的其他成分的量的修饰(例如，宿主细胞中编码该物质的基因的多重拷贝；和与编码该物质的基因自然结合的启动子更强的启动子的使用)。
低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和25%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在50℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。本领域中亦已知不同的宿主细胞以不同方式加工多肽，并因此一种表达多核苷酸的宿主细胞可能与另一种表达相同多核苷酸的宿主细胞相比产生不同的成熟多肽(例如具有不同的C端和/或N端氨基酸)。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
中等严格条件：术语“中等严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在55℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
中等-高严格条件：术语“中等-高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在60℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其经修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包含一个或多个调控序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。
具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。就本发明而言，通过测量来自由纤维素分解酶在下述条件下水解纤维素材料的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g PCS中纤维素，其中总蛋白包含50-99.5%w/w的纤维素分解酶蛋白，及0.5-50%w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质，在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃和合适的pH，例如5.0或5.5历时1-7天，与用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/gPCS中纤维素)所进行的对照水解相比。在一个优选的方面，使用在总蛋白重量的2-3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白质量的2-3%的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO2002/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的1.5L(NovozymesA/S，
Figure BDA0000411841600000142
enmark)的混合物作为纤维素分解活性的来源。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，例如至少1.05倍，至少1.10倍，至少1.25倍，至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少10倍，或至少20倍。
预处理的玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”意指通过用热和稀硫酸处理、碱预处理或中性预处理的源自玉米秸秆的纤维素材料。
序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)，优选5.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的参数为缺口罚分(gap penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,见上文)，优选5.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(例如几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有活性的多肽片段。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如几个)位置包含改变，即取代、插入和/或缺失的具有酶活性的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指在邻接并紧接着占据某位置的氨基酸之后添加氨基酸。
含木聚糖材料：术语“含木聚糖材料”意指任何包含含有β-(1-4)连接的木糖残基骨架的植物细胞壁多糖的材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-吡喃木糖骨架的杂聚物，所述木糖骨架有短的糖链分支。它们包含D-葡糖醛酸或其4-O-甲基醚，L-阿拉伯糖和/或多种由D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖和D-葡萄糖构成的寡糖。木聚糖类型的多糖可分为均木聚糖(homoxylan)和杂木聚糖(heteroxylan)，后者包括葡糖醛酸木聚糖，(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖，(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖，阿拉伯木聚糖和复合杂木聚糖。参见，例如Ebringerova等,2005,Adv.Polym.Sci.186:1-67。
在本发明的方法中，可使用任何含有木聚糖的材料。在一个优选的方面，所述含木聚糖材料是木素纤维素。
木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括：(1)测定总木聚糖分解活性，和(2)测定单独的木聚糖分解活性(例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶(α-glucuronyl esterase))。最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely和Puchard,Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes,2006,Journal of theScience of Food和Agriculture86(11):1636-1647；Spanikova和Biely,2006,Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllumcommune,FEBS Letters580(19):4597-4601；Herrmann,Vrsanska,Jurickova,Hirsch,Biely和Kubicek,1997,The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is amultifunctional beta-D-xylan xylohydrolase,Biochemical Journal321:375-381。
总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量，所述木聚糖包括例如燕麦小麦(oat spelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木(larchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey,Biely,Poutanen,1992,Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity,Journal ofBiotechnology23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在37℃在0.01%
Figure BDA0000411841600000161
X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)和200mM磷酸钠缓冲液pH6中来确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH6在200mM磷酸钠pH6缓冲液中从作为底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。
就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常条件下造成的桦木木聚糖(Sigma Chemical Co.,Inc.,St.Louis,MO,USA)水解的增加来确定的：1ml反应液，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠，pH5，50℃，24小时，如Lever,1972,A newreaction for colorimetric determination of carbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法进行糖分析。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解。就本发明而言，木聚糖酶活性是使用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物，在0.01%
Figure BDA0000411841600000171
X-100和200mM磷酸钠缓冲液中、pH6、37℃确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH6在200mM磷酸钠pH6缓冲液中从作为底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。
非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在70℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和25%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在45℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
发明详述
本发明涉及增加具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的活性的方法，其包括：将二价铜阳离子添加至包含所述GH61多肽的组合物，其中所述二价铜阳离子在纤维素材料的降解或转化中以约0.0001mM至约20mM的浓度存在。
本发明亦涉及增加具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的稳定性的方法，其包括：将二价铜阳离子添加至包含所述GH61多肽的组合物，其中所述二价铜阳离子以0.0001mM至约20mM的浓度存在。
本发明亦涉及增加具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的活性和稳定性的方法，其包括：将二价铜阳离子添加至包含所述GH61多肽的组合物，其中所述二价铜阳离子以0.0001mM至约20mM的浓度存在。
本发明亦涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，其包括：用包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和二价铜阳离子的酶组合物处理所述纤维素材料，其中所述二价铜阳离子以约0.0001mM至约20mM的浓度存在。
本发明亦涉及用于产生发酵产物的方法，其包括：(a)用包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的酶组合物和二价铜阳离子糖化所述纤维素材料，其中所述二价铜阳离子以约0.0001mM至约20mM的浓度存在；(b)用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收所述发酵产物。
本发明亦涉及发酵纤维素材料的方法，其包括用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料用包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的酶组合物和二价铜阳离子糖化，其中所述二价铜阳离子以约0.0001mM至约20mM的浓度存在。
二价铜阳离子和具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的存在与不含二价铜阳离子的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽相比，增加酶组合物对纤维素材料的降解、转化或糖化。
本发明亦涉及包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和二价铜阳离子的组合物，其中所述二价铜阳离子在纤维素材料的降解或转化中以约0.0001mM至约20mM的浓度存在，且所述二价铜阳离子和GH61多肽的存在没有二价铜阳离子时的GH61多肽相比，增加酶组合物对纤维素材料的降解或转化。在一个方面，所述组合物进一步包含一种或数种(例如几种)选自下组的酶：纤维素酶，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，半纤维素酶，棒曲霉素，酯酶，漆酶，木质素分解酶，果胶酶，过氧化物酶，蛋白酶，和膨胀素。
二价铜阳离子
二价铜阳离子优选以使得GH61多肽与二价铜阳离子完全复合的浓度存在。术语“与二价铜阳离子完全复合”意指GH61多肽优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，或甚至最优选100%为含铜形式，即所述GH61多肽是优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，或甚至最优选100%活性的。GH61多肽与二价铜阳离子的复合可使用本领域公知技术，例如电子顺磁共振(EPR)来确定。
与二价铜阳离子完全复合的GH61多肽可在发酵产生多肽的过程中通过在发酵培养基中包含充份量的二价铜阳离子来获得。或者，可通过本领域中已知的标准方法对GH61多肽脱金属，例如，从金属螯合树脂洗脱，或在与金属螯合剂预温育后，进行膜过滤或凝胶过滤以去除螯合剂和被螯合的金属，并用二价铜阳离子来替代。
对于给定的经预处理的木素纤维素材料，可通过改变二价铜阳离子的浓度来确定产生最大的向葡萄糖的转化的最低铜浓度，以鉴定出产生最佳GH61活性的二价铜阳离子浓度。在一个方面，二价铜阳离子以约0.0001mM至约20mM，例如约0.0005mM至约15mM，约0.001mM至约10mM，约0.005mM至约5mM，约0.01mM至约2.5mM，约0.05mM至约1mM，或约0.1mM至约1mM的浓度添加至酶降解反应。确保GH61多肽与二价铜阳离子完全复合的二价铜阳离子的合适量可通过EPR确定。二价铜阳离子优选作为可溶性盐，例如氯酸盐、氯化物、铬酸盐、柠檬酸盐、氟化物、甲酸盐、碘化物、硝酸盐、草酸盐、高氯酸盐、硒酸盐或硫酸盐添加，或作为不溶性盐例如碳酸盐、氢氧化物、氧化物、磷酸盐、焦磷酸盐或硫化物盐添加。在一个方面，所述可溶性盐是CuSO4或Cu(NO3)2。所述二价铜阳离子亦可来源于添加的一价铜阳离子(亚铜)盐，例如，溴化物、氯化物、氰化物、氟化物、氢氧化物、碘化物或硫化物盐，或添加的零价(原子)金属铜或含铜合金，此时所述阳离子或原子在原位被转化为二价铜阳离子。
在本领域中公知纤维素生物质可包含多种二价金属阳离子。参见，例如F.B.Salisbury和C.W.Ross:Plant Physiology，Wadsworths PublishingCompany，Belmont，California(1992)。因此，所述纤维素生物质可以是二价铜阳离子的部分或全部来源。致活化的二价铜阳离子可为可溶性或不可溶性。术语“致活化的二价铜阳离子”在本文中定义为在溶液中可供利用来使得具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的活性增加的二价铜阳离子。然而，二价铜阳离子可能无法在溶液中供利用来增加具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的活性，原因是例如它们与纤维素生物质的组分(例如焦磷酸)复合。
所述纤维素生物质亦可能以抑制细胞裂解(cellulolysis)的浓度提供可溶性二价金属阳离子(在下文中称为“抑制性二价金属阳离子”)。例如，一种抑制性二价金属阳离子是以mM或更高浓度存在时的Zn++。因此，在当二价铜阳离子和抑制性二价金属阳离子的混合物存在的条件下，可能需要过量的二价铜阳离子，以克服抑制性二价金属阳离子的抑制作用。在此种情况下，为了防止抑制性二价金属阳离子不利地影响具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，本发明的方法进一步包括补充所述二价铜阳离子的浓度以确保GH61多肽与二价铜阳离子的完全复合。补充的二价铜阳离子的有效浓度可为约0.0001mM至约20mM，例如约0.0005mM至约15mM，约0.001mM至约10mM，约0.005mM至约5mM，约0.01mM至约2.5mM，约0.05mM至约1mM，或约0.1mM至约1mM的范围。
纤维素生物质中二价阳离子的浓度可使用本领域中已知的任何方法，如原子吸收，电化学电极，金属离子生物传感器，光学传感器，或通过螯合的滴定(参见。例如Methods in Enzymology，v.158(多章)，Haugland，R.P.Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，6th ed.;MolecularProbes，Inc.:Eugene，OR，1996.，Thompson等Anal.Chem.，70(22)，4717-4723，1998，Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry，Akbar Montaser(编辑)May1998)来确定。
在一个方面，本发明的方法进一步包括在酶组合物降解或糖化纤维素材料的过程中添加螯合剂。可添加所述螯合剂使得GH61多肽的活性对经预处理的木素纤维素材料而言是最优的。在一个方面，所述螯合剂选自下组：EDTA(乙二胺四乙酸)，EGTA(乙二醇-双-(2-氨基乙基)-N,N,N',N'-四乙酸(ethyleneglycol-bis-(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraacetic acid))，DDTA(3,6-二氧杂-1,8-辛二胺四乙酸(3,6-dioxaoctamethylenedinitrilotetraacetic acid))，EDDS(乙二胺-N,N'-二琥珀酸(ethylenediamine-N,N'-disuccinic acid))，BAPTA(1,2-二(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸，(1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid))，和BIPY(2,2'-联吡啶(2,2'-bipyridine))。在另一个方面，所述螯合剂是EDTA。在另一个方面，所述螯合剂是EGTA。在另一个方面，所述螯合剂是DDTA。在另一个方面，所述螯合剂是BAPTA。在另一个方面，所述螯合剂是BIPY。然而，可使用任何合适的螯合剂。螯合剂的有效浓度可为约0.0001mM至约100mM，例如约0.0002mM至约75mM，约0.0003mM至约50mM，约0.0005mM至约25mM，约0.001mM至约10mM，约0.005mM至约5mM，约0.01mM至约2.5mM，约0.05mM至约1mM，或约0.1mM至约1mM的范围。在一个优选的方面，所述螯合剂在GH61多肽与二价铜阳离子完全复合之后添加。
在一个方面，二价铜阳离子使具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的活性与没有所述二价铜阳离子时相比，增加优选至少0.1倍，例如至少0.2倍，至少0.3倍，至少0.4倍，至少0.5倍，至少1倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少10倍，至少20倍，至少30倍，至少50倍，或至少100倍。
在另一个方面，二价铜阳离子使具有纤维素分解增强活性的多肽GH61多肽的热稳定性与没有所述二价铜阳离子时相比，增加至少1.01倍，例如至少1.05倍，至少1.1倍，至少1.5倍，至少1.8倍，至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少15倍，至少20倍，至少25倍，或至少50倍。
具有纤维素分解增强活性的多肽
在本发明的方法中，可使用任何具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。
在一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽包含下述基序：
[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ](SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66)和[FW]-[TF]-K-[AIV]，
其中X为任意氨基酸，X(4,5)为在4或5个连续位置上的任意氨基酸，而X(4)是在4个连续位置上的任意氨基酸。
包含上述所示的基序的GH61多肽可进一步包含：
H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV](SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68)，
[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV](SEQ ID NO:69)，或
H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV](SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:71)和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV](SEQ ID NO:72)，
其中X为任意氨基酸，X(1,2)为在1个位置或2个连续位置上的任意氨基酸，X(3)为3个连续位置上的任意氨基酸，而X(2)为2个连续位置上的任意氨基酸。在上述基序中，采用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。
在一个优选的实施方案中，所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽进一步包含H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV](SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74)。在另一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽进一步包含[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV](SEQ ID NO:75)。在另一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽进一步包含H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV](SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:77)和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV](SEQ ID NO:78)。
在第二个方面，所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽包含下述基序：
[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ](SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:80)，
其中X为任意氨基酸，X(4,5)为在4或5个连续位置上的任意氨基酸，而X(3)为3个连续位置上的任意氨基酸。在上述基序中，采用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。
在第三个方面，所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽包含或组成为(consist of)这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2，SEQ IDNO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，或SEQ ID NO:64的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，or至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%序列同一性。
在一个优选的方面，所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸20至326，SEQ ID NO:4的氨基酸18至239，SEQ ID NO:6的氨基酸20至258，SEQ IDNO:8的氨基酸19至226，SEQ ID NO:10的氨基酸20至304，SEQ ID NO:12的氨基酸16至317，SEQ ID NO:14的氨基酸22至249，SEQ ID NO:16的氨基酸20至249，SEQ ID NO:18的氨基酸18至232，SEQ ID NO:20的氨基酸16至235，SEQ ID NO:22的氨基酸19至323，SEQ ID NO:24的氨基酸16至310，SEQ ID NO:26的氨基酸20至246，SEQ ID NO:28的氨基酸22至354，SEQ ID NO:30的氨基酸22至250，SEQ ID NO:32的氨基酸22至322，SEQ ID NO:34的氨基酸24至444，SEQ ID NO:36的氨基酸26至253，SEQ ID NO:38的氨基酸18至246，SEQ ID NO:40的氨基酸20至334，SEQ ID NO:42的氨基酸18至227，SEQ ID NO:44的氨基酸20至223，SEQID NO:46的氨基酸22至368，SEQ ID NO:48的氨基酸25至330，SEQ ID NO:50的氨基酸17至236，SEQ ID NO:52的氨基酸19至250，SEQ ID NO:54的氨基酸23至478，SEQ ID NO:56的氨基酸17至230，SEQ ID NO:58的氨基酸20至257，SEQ ID NO:60的氨基酸23至251，SEQ ID NO:62的氨基酸19至349，或SEQ ID NO:64的氨基酸24至436。
在第四个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少非常低严格条件下，例如在至少低严格条件下，在至少中等严格条件下，在至少中等-高严格条件下，在至少高严格条件下，和在至少非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:15的成熟编码序列的基因组DNA序列，或SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链(Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d edition，Cold Spring Harbor，New York)。
在一个优选实施方案中，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸388至1332，SEQ ID NO:3的核苷酸98至821，SEQ ID NO:5的核苷酸126至978，SEQ ID NO:7的核苷酸55至678，SEQ ID NO:9的核苷酸58至912，SEQ ID NO:11的核苷酸46至951，SEQ ID NO:13的核苷酸64至796，SEQID NO:15的核苷酸77至766，SEQ ID NO:17的核苷酸52至921，SEQ ID NO:19的核苷酸46至851，SEQ ID NO:21的核苷酸55至1239，SEQ ID NO:23的核苷酸46至1250，SEQ ID NO:25的核苷酸58至811，SEQ ID NO:27的核苷酸64至1112，SEQ ID NO:29的核苷酸64至859，SEQ ID NO:31的核苷酸64至1018，SEQ ID NO:33的核苷酸70至1483，SEQ ID NO:35的核苷酸76至832，SEQ ID NO:37的核苷酸52至875，SEQ ID NO:39的核苷酸58至1250，SEQ ID NO:41的核苷酸52至795，SEQ ID NO:43的核苷酸58至974，SEQ ID NO:45的核苷酸64至1104，SEQ ID NO:47的核苷酸73至990，SEQ ID NO:49的核苷酸49至1218，SEQ ID NO:51的核苷酸55至930，SEQ ID NO:53的核苷酸67至1581，SEQ ID NO:55的核苷酸49至865，SEQ ID NO:57的核苷酸58至1065，SEQ ID NO:59的核苷酸67至868，SEQID NO:61的核苷酸55至1099，或SEQ ID NO:63的核苷酸70至1483。
在第五个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为下述核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列；SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列；或SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列的cDNA序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
在第六个方面，所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽是SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，or SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，或SEQ ID NO:64的成熟多肽的在一个或多个(例如几个)位置包含取代、缺失和/或插入的变体。在一个实施方案中，导入成熟多肽的氨基酸取代、确实和/或插入的数目为至多10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。氨基酸改变可为性质上较不重要的(of a minornature)，即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守的氨基酸取代或插入，；小缺失，通常为1至大约30个氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；最多大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。
保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变具体活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
或者，氨基酸改变具有致使多肽的物理化学性质改变的性质。例如，氨基酸改变可改善多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。
可以根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单个的丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的纤维素分解增强活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也可以通过对结构的物理学分析来确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，结合对推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等,1992,Science255:306-312；Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBS Lett.309:59-64。也可以根据与亲本多肽的近缘多肽的同一性分析来推断必需氨基酸的身份。
可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57;Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156;WO95/17413;或者WO95/22625所公开的那些，进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等,1991,Biochemistry30:10832-10837;美国专利号5,223,409;WO92/06204)和区域定向诱变(region-directed mutagenesis)(Derbyshire等,1986,Gene46:145;等,1988,DNA7:127)。
诱变/改组方法可与高通量、自动化的筛选方法组合，以检测宿主细胞所表达的经克隆、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology17:893-896)。可自宿主细胞回收编码活性多肽的经诱变的DNA分子，并使用本领域标准方法迅速测序。这些方法为快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性提供了条件。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽可以获得自任何属的微生物。在一个优选的方面，来自给定来源的多肽是胞外分泌的。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽可为细菌多肽。例如，所述多肽可为革兰氏阳性细菌多肽，例如具有纤维素分解增强活性的芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，如具有纤维素分解增强活性的大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽。
在一个方面，所述GH61多肽是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。
在另一个方面，所述GH61多肽是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。
在另一个方面，所述GH61多肽是不产色链霉菌(Streptomycesachromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)多肽。
所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽可为真菌多肽。例如，所述多肽可为酵母多肽，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽，或丝状真菌多肽，如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽。
在另一个方面，所述GH61多肽是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。
在另一个优选的方面，所述GH61多肽是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Penicillium thomii、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielaviaovispora)、Thielavia peruviana、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielaviaspededonium)、Thielavia subthermophila、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、绿色木霉(Trichoderma viride)或Trichophaea saccata多肽。
应理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名如何。本领域技术人员将容易地识别适合的等同物的身份。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center)(NRRL)。
此外，此类多肽可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接获得自自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)的DNA样品鉴定和获得所述亲本。用于直接从天然生境(habitat)分离微生物和DNA的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来得到编码所述多肽的多核苷酸。一旦用探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以使用本领域普通技术人员已知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽融合于具有纤维素分解增强活性的多肽或其片段的N端或C端。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们处于符合读框(in frame)，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的调控下。融合蛋白亦可使用内蛋白(intein)技术构建，其中融合物在翻译后产生(Cooper等,1993,EMBO J.12:2575-2583;Dawson等,1994,Science266:776-779)。
融合多肽还可以在两个多肽之间包含切割位点。一旦融合多肽被分泌，所述位点即被切割开，释放所述两个多肽。切割位点的实例包括，但不限于，公开于Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等,1995,Biotechnology13:498-503;和Contreras等,1991,Biotechnology9:378-381；Eaton等,1986,Biochem.25:505-512；Collins-Racie等,1995,Biotechnology13:982-987；Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World4:35-48中的位点。
在一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在二氧化合物、二环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物或从经预处理的纤维素材料(如经预处理的玉米秸秆(PCS))获得的液剂的存在下使用。
所述二氧化合物可包括任何含有两个或更多氧原子的合适化合物。在一些方面，所述二氧化合物含有如本文中所述的取代的芳基模块(moiety)。所述二氧化合物可包括一个或多个(几个)羟基和/或羟基衍生物，但亦包括缺乏羟基和羟基衍生物的取代的芳基模块。二氧化合物的非限定性实例包括邻苯二酚或儿茶酚；咖啡酸；3,4-二羟基苯甲酸；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯二酚；连苯三酚；没食子酸；甲基-3,4,5-三羟基苯甲酸；2,3,4-三羟基二苯甲酮；2,6-二甲氧基苯酚；芥子酸；3,5-二羟基苯甲酸；4-氯-1,2-苯二酚；4-硝基-1,2-苯二酚；鞣酸；没食子酸乙酯；羟乙酸甲酯；二羟基延胡索酸；2-丁炔-1,4-二醇；克酮酸；1,3-丙二醇；酒石酸；2,4-戊二醇；3-乙氧基-1,2-丙二醇；2,4,4’-三羟基二苯甲酮；顺-2-丁烯-1,4-二醇；3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮；二羟基丙酮；乙酰丙烯醛(acrolein acetal)；甲基-4-羟基苯甲酸；4-羟基苯甲酸；和甲基-3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸；或它们的盐或溶剂合物(solvate)。
所述二环化合物可包括任何如本文中所述的合适的取代稠环系统。所述化合物可包含一个或多个(例如几个)额外的环，且除非另行说明，不限于具体的环数。在一个方面，所述二环化合物是类黄酮。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的异类黄酮(isoflavonoid)。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的花色离子(flavylium ion)，如任选取代的花色素或任选取代的花色苷，或其衍生物。二环化合物的非限定性实例包括表儿茶素(epicatechin)；槲皮素(quercetin)；杨梅黄酮(myricetin)；黄杉素(taxifolin)；山奈酚(kaempferol)；桑素(morin)；金合欢素(acacetin)；柚皮素(naringenin)；异鼠李黄素(isorhamnetin)；芹菜苷配基(apigenin)；花青素(cyanidin)；花色素苷(cyanin)；kuromanin；花青素鼠李葡糖苷(keracyanin)；或它们的盐或溶剂合物。
所述杂环化合物可为任何合适的化合物，如本文中所述的任选取代的包含杂原子的芳环或非芳环。在一个方面，所述杂环是包含任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块的化合物。在另一个方面，所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的五元杂环烷基或任选取代的五元杂芳基模块。在另一个方面，任选取代的杂环烷基或任选取代的杂芳基模块是选自如下的任选取代的模块：吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基(thienyl)、二氢噻吩-吡唑基(dihydrothieno-pyrazolyl)、硫茚基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基(benzothienyl)、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基(benzooxazolyl)、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、苯并异噁唑基(benzoisazolyl)、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吗啉基、吲哚基、二氮杂环庚三烯基(diazepinyl)、氮杂环庚三烯基(azepinyl)、硫杂环庚三烯基(thiepinyl)、哌啶基和氧杂环庚三烯基(oxepinyl)。在另一个方面，所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的呋喃基。杂环化合物的非限定性实例包括(1,2-二羟乙基)-3,4-二氢呋喃-2(5H)-酮；4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮；5-羟基-2(5H)-呋喃酮；[1,2-二羟乙基]呋喃-2,3,4(5H)-三酮；α-羟基-γ-丁内酯；核糖酸γ-内酯；己醛糖酸γ-内酯(aldohexuronicaldohexuronic acidγ-lactone)；葡糖酸δ-内酯；4-羟基香豆素；二氢苯并呋喃；5-(羟甲基)糠醛；糠偶姻(furoin)；2(5H)-呋喃酮；5,6-二氢-2H-吡喃-2-酮；和5,6-二氢-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮；或它们的盐或溶剂合物。
所述含氮化合物可为任何具有一个或多个氮原子的合适化合物。在一个方面，所述含氮化合物包含胺、亚胺、羟胺或氧化亚氮(nitroxide)模块。含氮化合物的非限定性实例包括丙酮肟；紫尿酸；吡啶-2-醛肟；2-氨基苯酚；1,2-苯二胺；2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧(piperidinyloxy)；5,6,7,8-四氢生物蝶呤；6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢蝶呤；和马来酰胺酸；或它们的盐或溶剂合物。
所述醌化合物可为任何本文中所述的包含醌部分的合适的化合物。醌化合物的非限定性实例包括1,4-苯醌；1,4-萘醌；2-羟基-1,4-萘醌；2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌或辅酶Q0；2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或四甲基对苯醌；1,4-二羟基蒽醌；3-羟基-1-甲基-5,6-二氢吲哚二酮或肾上腺色素；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌；吡咯并喹啉醌(pyrroloquinoline quinone)；或它们的盐或溶剂合物。
所述含硫化合物可为任何包含一个或多个硫原子的合适的化合物。在一个方面，所述含硫化合物包含选自亚硫酰，硫醚，亚磺酰，磺酰，磺酰胺(sulfamide)，磺酰胺(sulfonamide)，磺酸和磺酸酯的模块。含硫化合物的非限定性实例包括乙硫醇；2-丙硫醇；2-丙烯-1-硫醇；2-巯基乙磺酸；苯硫醇；苯-1,2-二硫醇；半胱氨酸；甲硫氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或它们的盐或溶剂合物。
在一个方面，此种如上所述的化合物对纤维素材料的有效量，作为对纤维素的糖单元的摩尔比例为约10-6至约10，例如约10-6至约7.5，约10-6至约5，约10-6至约2.5，约10-6至约1，约10-5至约1，约10-5至约10-1，约10-4至约10-1，约10-3至约10-1，或约10-3至约10-2。在另一个方面，此种如上所述的化合物的有效量为约0.1μM至约1M，例如约0.5μM至约0.75M，约0.75μM至约0.5M，约1μM至约0.25M，约1μM至约0.1M，约5μM至约50mM，约10μM至约25mM，约50μM至约25mM，约10μM至约10mM，约5μM至约5mM，或约0.1mM至约1mM。
术语“液剂(liquor)”意指在本文中所述的条件下，通过处理浆料中的木素纤维素和/或半纤维素材料，或其单糖例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖等，所产生的溶液相，即水相、有机相或其组合，及其可溶性内含物。用于GH61多肽的纤维素分解增强的液剂可通过，任选在催化剂例如酸的存在下，任选在有机溶剂的存在下，且任选与所述材料的物理破坏相组合来藉由施加热和/或压力来处理木素纤维素材料或半纤维素材料(或原料)，然后将溶液从剩余固体分离来产生。此类条件确定在通过纤维素酶制备物水解纤维素底物过程中，通过液剂和GH61多肽的组合可获得的纤维素分解增强的程度。所述液剂可使用本领域中的标准方法如过滤、沉积或离心从经处理的材料分离。
在一个方面，所述液剂对纤维素的有效量为约10-6至约10g每g纤维素，例如约10-6至约7.5g，约10-6至约5g，约10-6至约2.5g，约10-6至约1g，约10-5至约1g，约10-5至约10-1g，约10-4至约10-1g，约10-3至约10-1g，或约10-3至约10-2g每g纤维素。
纤维素分解酶组合物
本发明亦涉及酶组合物，其包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和二价铜阳离子，其中所述二价铜阳离子在纤维素材料的降解或转化过程中以0.0001mM至约20mM，例如约0.0005mM至约15mM，约0.001mM至约10mM，约0.005mM至约5mM，约0.01mM至约2.5mM，约0.05mM至约1mM，或约0.1mM至约1mM的浓度存在，且所述二价铜阳离子和具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的存在与不含所述二价铜阳离子的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的多肽相比，增加了酶组合物对纤维素材料的降解或转化。
所述组合物可依照本领域中已知的方法制备，并可为液体或干组合物的形式。所述组合物可依照本领域中已知的方法稳定化。
所述组合物亦可为发酵液配制物或细胞组合物，如本文中所述。在一些实施方案中，所述组合物是含有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片，以及培养基的已杀灭细胞的全培养液。
术语“发酵液”用于本文中指由细胞发酵产生、不经历或仅经历最低限的回收和/或纯化的制备物。举例而言，当将微生物培养物生长至饱和，在限制碳的条件下温育以允许蛋白合成(例如由宿主细胞表达酶)，并分泌入细胞培养基时，产生发酵液。所述发酵液可含有在发酵终止时得到的发酵材料的未分级或分级的内含物。通常而言，发酵液是未分级的，并包含用过的培养基和例如通过离心去除微生物细胞(例如丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施方案中，所述发酵液含有用过的细胞培养基，胞外酶，和有活力和/或无活力的(viable and/or nonviable)微生物细胞。
在一个实施方案中，所述发酵液配制物和细胞组合物包含第一有机酸组分和第二有机酸组分，所述第一有机酸组分包含至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐，而所述第二有机酸组分包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐。在一个具体实施方案中，所述第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述两种或更多种的混合物，而所述第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基缬草酸、苯乙酸、其盐，或前述两种或更多种的混合物。
在一个方面，所述组合物含有有机酸，并任选地进一步含有被杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施方案中，从已杀灭细胞的全培养液中移除所述被杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
所述发酵液配制物或细胞组合物可进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如抑细菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾和其它本领域中已知的。
所述已杀灭细胞的全培养液或组合物可含有在发酵终止时得到的发酵材料的未分级的内含物。通常而言，所述已杀灭细胞的全培养液或组合物含有将微生物细胞(例如丝状真菌细胞)生长至饱和、在限制碳的条件下温育以允许蛋白合成之后存在的废培养基和细胞碎片。在一些实施方案中，所述已杀灭细胞的全培养液或组合物含有废细胞培养基，胞外酶，和已被杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施方案中，可使用本领域中已知的方法对已杀灭细胞的全培养液或组合物中存在的微生物细胞进行可透化和/或裂解。
如本文中所述的全培养液或细胞组合物通常为液体，但可含有不溶性组分，如被杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或不溶性酶。在一些实施方案中，可去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
本发明的全培养液配制物和细胞组合物可通过WO90/15861或WO2010/096673中描述的方法来产生。
所述酶组合物可包含任何可用于降解或转化纤维素材料的蛋白质。
在一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(例如几种)选自下组的蛋白质：纤维素酶，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，半纤维素酶，酯酶，棒曲霉素，漆酶，木质素分解酶，果胶酶，过氧化物酶，蛋白酶，和膨胀素。在另一个方面，所述纤维素酶优选为一种或多种(例如几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述半纤维素酶优选为一种或多种(例如几种)选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶，乙酰木聚糖酯酶，阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。
在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(例如几种)纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(例如几种)半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(例如几种)纤维素分解酶和一种或多种(例如几种)半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(例如几种)选自下组的酶：纤维素分解酶和半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶，β-葡糖苷酶，和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶，β-葡糖苷酶，和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，β-葡糖苷酶，和具有纤维素分解增强活性的多肽。
在另一个方面，所述酶组合物包含乙酰甘露聚糖酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含乙酰木聚糖酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含阿拉伯聚糖酶(例如α-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含阿拉伯呋喃糖苷酶(例如α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含香豆酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含阿魏酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含半乳糖苷酶(例如α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含葡糖醛酸糖苷酶(例如α-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含葡糖醛酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含甘露聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含甘露糖苷酶(例如β-甘露糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含木聚糖酶。在一个优选的方面，所述木聚糖酶是家族10木聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含木糖苷酶(例如β-木糖苷酶)。
在另一个方面，所述酶组合物包含酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含棒曲霉素。在另一个方面，所述酶组合物包含漆酶。在另一个方面，所述酶组合物包含木质素分解酶。在一个优选的方面，所述木质素分解酶是锰过氧化物酶。在另一个优选的方面，所述木质素分解酶是木质素过氧化物酶。在另一个优选的方面，所述木质素分解酶是H2O2-产生酶。在另一个方面，所述酶组合物包含果胶酶。在另一个方面，所述酶组合物包含过氧化物酶。在另一个方面，所述酶组合物包含蛋白酶。在另一个方面，所述酶组合物包含膨胀素。
在本发明的方法中，所述酶可在糖化，糖化和发酵，或发酵之前或之中添加。
酶组合物的一种或多种(例如几种)组分可为野生型蛋白，重组蛋白，或野生型蛋白和重组蛋白的组合。例如，一种或多种(例如几种)组分可以是用于重组表达所述酶组合物的一种或多种(例如几种)其他组分的宿主细胞的天然蛋白。可以将所述细胞组合物的一种或多种(例如几种)组分作为单组分产生，然后将它们组合以形成酶组合物。所述酶组合物可以是多组分和单组分蛋白制备物的组合。
用于本发明的方法中的酶可为任何适于使用的形式，例如，发酵液配制物或细胞组合物，含或不含细胞碎片的细胞裂解物，半纯化或纯化的酶制备物，或宿主细胞，作为酶的来源。所述酶组合物可为干粉或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。液体酶制备物可根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有机酸来稳定化。
具有纤维素分解酶活性或半纤维素分解酶活性的多肽，以及其它可用于降解纤维素材料的蛋白/多肽，例如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，(在下文中统称为“具有酶活性的多肽”)可来源于或获得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物或哺乳动物来源。术语“获得”在本文中还意味着所述酶可在宿主生物中采用本文中所述的方法重组产生，其中重组产生的酶对于宿主生物是天然的或外源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如具有一个或多个(例如几个)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶是突变体，和/或天然氨基酸序列的突变体和/或片段，或者是通过本领域中已知的核酸改组工艺产生的酶。天然酶的含意中涵盖的是天然变体，而外源酶的含意涵盖的是重组获得的变体，如通过定位诱变或改组。
具有酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor)、热酸菌属(Acidothermus)、Thermobifidia或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有酶活性；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有酶活性。
在一个方面，所述多肽是具有酶活性的嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌或马链球菌兽瘟亚种多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌或浅青紫链霉菌多肽。
具有酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽如假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属多肽，其具有酶活性；或更优选丝状真菌多肽如具有酶活性的枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、Botryospaeria、拟蜡菌属、Chaetomidium、金孢子菌属、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属、Coptotermes、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、Filibasidium、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、蘑菇属、Leptospaeria、梨孢菌属、Melanocarpus、多孔菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、Pseudotrichonympha、根毛霉属、裂褶菌属、柱顶孢属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、包脚菇属或炭角菌属多肽。
在一个方面，所述多肽是具有酶活性的卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母多肽。
在另一个方面，所述多肽是具有酶活性的解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、灰腐质霉、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、绳状青霉、产紫青霉、黄孢平革菌、Thielaviaachromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳、Thielaviafimeti、小孢梭孢壳、卵孢梭孢壳、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳、毛梭孢壳、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉或褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)多肽。
还可以使用具有酶活性的多肽的经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。
所述纤维素分解酶组合物的一种或多种(例如几种)组分可以是重组组分，亦即，通过克隆编码所述单独组分的DNA序列并随后用该DNA序列转化细胞并在宿主中表达(参见，例如，WO91/17243和WO91/17244)产生。所述宿主优选是异源宿主(酶对宿主是外源的)，但该宿主在一定条件下也可以是同源宿主(酶对宿主是天然的)。单组分纤维素分解蛋白还可以通过从发酵液中提纯这样的蛋白质来制备。
在一个方面，所述一种或多种(例如几种)纤维素分解酶包含商业性纤维素分解酶制备物。适用于本发明的商业的纤维素分解酶制备物的实例包括，例如，CELLICTMCtec(Novozymes A/S)、CELLICTMCTec2(Novozymes A/S)、
Figure BDA0000411841600000381
Ctec3(Novozymes A/S)、CELLUCLASTTM(Novozymes A/S)、NOVOZYMTM188(Novozymes A/S)、CELLUZYMETM(Novozymes A/S)、CEREFLOTM(Novozymes A/S)和ULTRAFLOTM(Novozymes A/S)，ACCELERASETM(Genencor Int.)、LAMINEXTM(Genencor Int.)、SPEZYMETMCP(Genencor Int.)，
Figure BDA0000411841600000382
NL(DSM)、
Figure BDA0000411841600000383
S/L100(DSM)，ROHAMENTTM7069W(
Figure BDA0000411841600000391
GmbH)，
Figure BDA0000411841600000392
LDI(DyadicInternational,Inc.)、
Figure BDA0000411841600000393
LBR(Dyadic International,Inc.)或
Figure BDA0000411841600000394
150L(Dyadic International,Inc.)。所述纤维素酶酶以固体的约0.001至约5.0wt%，例如固体的约0.025至约4.0wt%，或固体的约0.005至约2.0wt%的有效量添加。
可以用于本发明的方法的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO91/05039；WO93/15186;美国专利5,275,944；WO96/02551；美国专利5,536,655，WO00/70031，WO05/093050)；Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(WO05/093050)；和Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(WO05/093050)。
可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等,1986,Gene45:253-263，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GENBANKTM登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等,1988,Gene63:11-22)，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GENBANKTM登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等,1988,Appl.Environ.Microbiol.64:555-563；GENBANKTM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等,1994,Molecular Microbiology13:219-228；GENBANKTM登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等,1990,Nucleic Acids Research18:5884)；川地曲霉(Aspergillus kawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等,1995,Current Genetics27:435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等,1990,Gene90:9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号L29381)；灰腐质霉thermoidea变种内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号AB003107)；Melanocarpus albomyces内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V；嗜热毁丝霉CBS117.65内切葡聚糖酶；担子菌纲(basidiomycete)CBS495.95内切葡聚糖酶；担子菌纲CBS494.95内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6B内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7F内切葡聚糖酶；Cladorrhinum foecundissimum ATCC62373CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号M15665)。
可用于本发明的纤维二糖水解酶的实例包括但不仅限于，棘孢曲霉纤维二糖水解酶II(WO2011/059740)，嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)纤维二糖水解酶I，嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II，特异腐质霉纤维二糖水解酶I，嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II，(WO2009/042871)，Thielavia hyrcanie纤维二糖水解酶II(WO2010/141325)，土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A，WO2006/074435)，里氏木霉纤维二糖水解酶I，里氏木霉纤维二糖水解酶II，以及褐孢长毛盘菌纤维二糖水解酶II(WO2010/057086)。
可用于本发明的β-葡糖苷酶的实例包括但不仅限于来自棘孢曲霉(Kawaguchi等,1996,Gene173:287-288)、烟曲霉(WO2005/047499)、黑曲霉(Dan等,2000,J.Biol.Chem.275:4973-4980)、米曲霉(WO2002/095014)、巴西青霉IBT20888(WO2007/019442和WO2010/088387)、土生梭孢霉(WO2011/035029)和褐孢长毛盘菌(WO2007/019442)的β-葡糖苷酶。
所述β-葡糖苷酶可以是融合蛋白。在一个方面，所述β-葡糖苷酶是米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白(WO2008/057637)或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(2008/057637)。
其它可用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶公开于使用根据Henrissat B.,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities,Biochem.J.280:309-316和Henrissat B.和Bairoch A.,1996,Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases,Biochem.J.316:695-696的分类的许多糖基水解酶家族中。
其它可用于本发明的纤维素分解酶描述于WO98/13465、WO98/015619、WO98/015633、WO99/06574、WO99/10481、WO99/025847、WO99/031255、WO2002/101078、WO2003/027306、WO2003/052054、WO2003/052055、WO2003/052056、WO2003/052057、WO2003/052118、WO2004/016760、WO2004/043980、WO2004/048592、WO2005/001065、WO2005/028636、WO2005/093050、WO2005/093073、WO2006/074005、WO2006/117432、WO2007/071818、WO2007/071820、WO2008/008070、WO2008/008793、美国专利No.5,457,046、美国专利No.5,648,263和美国专利No.5,686,593。
在一个方面，所述一种或多种(例如几种)半纤维素分解酶包含商品化的半纤维素分解酶制备物。适用于本发明的商品化的半纤维素分解酶制备物的实例包括，例如，SHEARZYMETM(Novozymes A/S)、
Figure BDA0000411841600000419
HTec(NovozymesA/S)、
Figure BDA0000411841600000412
Htec2(Novozymes A/S)、
Figure BDA0000411841600000413
Htec3(Novozymes A/S)、
Figure BDA0000411841600000415
(Novozymes A/S)、(Novozymes A/S)、
Figure BDA0000411841600000416
HC(Novozymes A/S)、
Figure BDA00004118416000004110
木聚糖酶(Genencor)、
Figure BDA0000411841600000417
XY(Genencor)、
Figure BDA0000411841600000418
XC(Genencor)、
Figure BDA0000411841600000411
TX-200A(AB Enzymes)、HSP6000木聚糖酶(DSM)、DEPOLTM333P(Biocatalysts Limit,Wales,UK)、DEPOLTM740L(Biocatalysts Limit,Wales,UK)和DEPOLTM762P(Biocatalysts Limit,Wales,UK)。
可用于本发明方法的木聚糖酶的实例包括但不限于来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(GeneSeqP:AAR63790;WO94/21785)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(WO2006/078256)、嗜松青霉(WO2011/041405)、青霉属菌种(WO2010/126772)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)NRRL8126(WO2009/079210)和褐孢长毛盘菌GH10(WO2011/057083)的木聚糖酶。
可用于本发明方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于来自粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(SwissProt登录号Q7SOW4)、里氏木霉(Trichoderma reesei)(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)和埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)(SwissProt登录号Q8X212)的β-木糖苷酶。
可用于本发明方法的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于来自棘孢曲霉(WO2010/108918)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)(Uniprot登录号Q2GWX4)、细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)(GeneSeqP登录号AAB82124)、特异腐质霉(Humicola insolens)DSM1800(WO2009/073709)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)(WO2005/001036)、嗜热毁丝霉(Wo2010/014880)、粗糙脉孢菌(UniProt登录号q7s259)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)(Uniprot登录号Q0UHJ1)和土生梭孢霉NRRL8126(WO2009/042846)的乙酰木聚糖酯酶。
可用于本发明方法的阿魏酸酯酶的实例包括但不限于来自特异腐质霉DSM1800(WO2009/076122)、费希新萨托菌(Neosartorya fischer)(UniProt登录号A1D9T4)、粗糙脉孢菌(UniProt登录号Q9HGR3)、橘灰青霉(WO2009/127729)和土生梭孢壳(WO2010/053838和WO2010/065448)的阿魏酸酯酶。
可用于本发明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于来自黑曲霉(Aspergillus niger)(GeneSeqP登录号AAR94170)、特异腐质霉(Humicolainsolens)DSM1800(WO2006/114094和WO2009/073383)和M.giganteus(WO2006/114094)的阿拉伯呋喃糖苷酶。
可用于本发明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于来自棒曲霉(Aspergillus clavatus)(UniProt登录号alcc12)、烟曲霉(SwissProt登录号Q4WW45)、黑曲霉(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉(Aspergillus terreus)(SwissProt登录号Q0CJP9)、特异腐质霉(WO2010/014706)、橘灰青霉(WO2009/068565)、埃默森踝节菌(UniProt登录号Q8X211)和里氏木霉(Uniprot登录号Q99024)的α-葡糖醛酸糖苷酶。
用于本发明方法的具有酶活性的多肽可通过在含有合适碳源和氮源和无机盐的营养培养基上，使用本领域已知方法(参见，例如Bennett,J.W.和LaSure,L.(编),More Gene Manipulations in Fungi,Academic Press,CA,1991)发酵上述指出的微生物菌株来产生。合适的培养基可从供应商获得，或可根据已公开组合物制备(例如美国典型培养物保藏中心的目录)。适于生长和酶产生的温度范围和其他条件在本领域是已知的(参见，例如Bailey,J.E.和Ollis,D.F.,Biochemical Engineering Fundamentals,McGraw-Hill Book Company,NY,1986)。
所述发酵可以是任何其结果为酶或蛋白表达或分离的培养细胞的方法。因此，发酵可以理解为包括在合适的培养基中并在允许所述酶得以表达或分离的条件下进行的摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中的小-或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)。通过上述方法产生的所得的酶可从发酵培养基回收并通过常规方法纯化。
核酸构建体
可以用许多方式操作编码具有酶活性的多肽的分离的多核苷酸多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
调控序列可为启动子，其由用于表达编码多肽的多核苷酸的宿主细胞所识别的多核苷酸。
启动子含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等,1988,Gene69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of the National Academy ofSciences USA75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25)。另外的启动子在"Useful proteins from recombinant bacteria"于Gilbert等,1980,Scientific American,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,见上文中描述。串联启动子的实例公开于WO99/43835。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、里氏木霉翻译延伸因子，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自在曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。其它启动子描述于美国专利号6,011,147。
在酵母宿主中，有用的启动子从如下的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast8:423-488描述。
调控序列也可以是转录终止子，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。在本发明中，可使用任何在宿主细胞中有功能的终止子。
对于细菌宿主细胞优选的终止子从如下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定化区，其增加所述基因的表达。
合适的mRNA稳定化区的实例从如下的基因获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等,1995,Journal ofBacteriology177:3465-3471)。
调控序列还可以是合适的前导序列，其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990描述。
调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N端相连，并指导所述多肽进入细胞分泌途径的信号肽。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码所述多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有外源于所述编码序列的信号肽编码序列。在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时，外源信号肽编码序列可能是必需的。或者，外源信号肽编码序列可直接取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。更多的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews57:109-137描述。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子的基因获得前肽编码序列。
当信号肽和前肽序列二者均存在时，前肽序列被置于紧接着(next to)多肽的N端，并且信号肽序列被置于紧接着前肽序列的N端。
同样理想的是添加调节序列，其相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节序列包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子和里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本文中所述的多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述重组表达载体包含编码具有酶活性的多肽的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。所述表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。或者，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述多核苷酸序列的核酸构建体或所述序列来表达所述编码多肽的多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的调控序列可操作地连接以供表达。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
所述载体优选地含有一个或多个选择性标记，使得简单地选择经转化、转染、转导等的细胞成为可能。选择性标记是基因，它的产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于adeA(磷酸核糖氨基咪唑琥珀羧酰胺合酶，phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamide synthase)、adeB(磷酸核糖氨基咪唑合酶，phosphoribosyl-aminoimidazole synthase)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选用于木霉属细胞的是adeA、adeB、amdS、hph和pyrG基因。
选择性标记可为WO2010/039889中所述的双重选择性标记系统。在一个方面，所述双重选择性标记是hph-tk双重选择性标记系统。
所述载体优选含有允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制元件。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可为任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可为非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
宿主细胞
包含可操作地连接于一个或多个指导多肽产生的调控序列的多核苷酸的重组宿主细胞可有利地用于重组产生多肽。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞，使所述构建体或载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是在多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)和脲原体属(Ureaplasma)。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于，似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于，不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)细胞。
可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，感受态细胞转化(参见，例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：原生质体转化，电穿孔(参见，例如，Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：电穿孔(参见，例如，Choi等,2006,J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
宿主细胞还可为真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可为真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)。
真菌宿主细胞可为酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,Passmore,和Davenport编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。
酵母宿主细胞可为假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474以及Christensen等,1988,Bio/Technology6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods inEnzymology,Volume194,pp182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920。
产生方法
产生具有酶活性的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下培养细胞，其以其野生型形式能够产生多肽；和任选地(b)回收所述多肽。
或者，产生具有酶活性的多肽的方法包括(a)在有助于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞，和任选地(b)回收所述多肽。
所述宿主细胞使用本领域已知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法(enzyme assay)可用于确定多肽的活性。
所述多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。在一个方面，回收了包含多肽的发酵液。
多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,Janson和Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)。
在另一个方面，不回收多肽，而是使用表达所述多肽的本发明的宿主细胞作为所述多肽的来源。
加工纤维素材料的方法
本发明的方法和组合物可以用于将纤维素材料糖化成可发酵糖，并且将可发酵糖转化成很多有用的发酵产物，例如燃料、饮用乙醇和/或平台化学品(platform chemical)(例如酸、醇、酮、气体等)。从纤维素材料产生期望的发酵产物通常涉及预处理、酶水解(糖化)和发酵。
根据本发明的纤维素材料的处理可以使用本领域的常规工艺完成。此外，本发明的方法可以使用经配置以依照发明操作的任何常规生物质加工设备进行。
水解(糖化)和发酵，可以是分别或同时的，包括但不限于，分离的水解和发酵(SHF)、同步糖化和发酵(SSF)、同步糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、分离的水解和共发酵(SHCF)、混合的水解和共发酵(HHCF)，和直接微生物转化(DMC)，有时也称为合并的生物加工(consolidated bioprocessing，CBP)。SHF使用分离的处理步骤以首先将纤维素材料酶水解为可发酵糖，例如，葡萄糖，纤维二糖和戊糖单体，然后将可发酵糖发酵成为乙醇。在SSF中，纤维素材料的酶水解和糖变为乙醇的发酵在一个步骤中组合(Philippidis,G.P.,1996,Cellulose bioconversion technology,于Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多种糖的共发酵(Sheehan J.和Himmel M.,1999,Enzymes,energy and the environment:A strategic perspective on the U.S.Department ofEnergy’s research and development activities for bioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF在同步糖化和水解步骤之外，还涉及单独的水解步骤，所述步骤可以在同一个反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度，即，高温酶法糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC在一个或多个(例如几个)步骤中组合了所有三个过程(酶产生、水解和发酵)，其中使用相同的生物体产生用于将纤维素材料转化成可发酵糖并将可发酵糖转化成终产物的酶(Lynd L.R.,Weimer,P.J.,van Zyl,W.H.,和Pretorius,I.S.,2002,Microbial cellulose utilization:Fundamentals and biotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)。在本文可以理解的是，任何本领域中已知的方法，包括预处理、酶水解(糖化)、发酵，或它们的组合，可用于实施本发明的方法。
常规设备包括补料批式搅拌反应器、批式搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器和/或连续活塞流柱式反应器(Fernanda de Castilhos Corazza,Flávio Faria de Moraes,Gisella Maria Zanin and Ivo Neitzel,2003,Optimalcontrol in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis,Acta Scientiarum.Technology25:33-38;Gusakov,A.V.和Sinitsyn A.P.,1985,Kinetics of theenzymatic hydrolysis of cellulose:1.A mathematical model for a batch reactorprocess,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、研磨反应器(Ryu,S.K.和Lee J.M.,1983,Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65)，或者具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(Gusakov,A.V.,Sinitsyn,A.P.,Davydkin,I.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,O.V,1996,Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactorwith intensive stirring induced by electromagnetic field,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反应器类型包括：流化床、升流层(upflowblanket)、固定化和用于水解和/或发酵的挤出机型的反应器。
预处理。在本发明的方法的实施中，可以使用本领域已知的任何预处理过程破坏植物细胞壁的纤维素材料组分(Chandra等,2007,Substratepretreatment:The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics?Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:67-93;Galbe和Zacchi,2007,Pretreatment oflignocellulosic materials for efficient bioethanol production,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41-65;Hendriks和Zeeman,2009,Pretreatments to enhance thedigestibility of lignocellulosic biomass,Bioresource Technol.100:10-18;Mosier等,2005,Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosicbiomass,Bioresource Technol.96:673-686;Taherzadeh和Karimi,2008,Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production:A review,Int.J.of Mol.Sci.9:1621-1651;Yang和Wyman,2008,Pretreatment:the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol,Biofuels Bioproducts andBiorefining-Biofpr.2:26-40)。
纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、筛分、预浸泡、润湿、洗涤和/或调理(conditioning)。
常规的预处理包括但不限于，蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱性预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理和生物预处理。其它预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧、离子性液体和γ辐射预处理。
可以在水解和/或发酵之前预处理纤维素材料。预处理优选在水解前进行。或者，预处理可以与酶水解同时进行以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身使一些生物质转化成可发酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。
蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素和纤维素，使酶可接触纤维素和其它级分，例如，半纤维素。将纤维素材料经过或通过反应容器，其中注入蒸汽以增加温度至需要的温度和压力，并且在其中保持期望的反应时间。蒸汽预处理优选在140-250℃，例如160-200℃，或170-190℃进行，其中最优的温度范围依赖于任何化学催化剂的添加。蒸汽预处理的停留时间优选1-60分钟，例如1-30分钟，1-20分钟，3-12分钟，或4-10分钟，其中最优的停留时间依赖于温度范围和化学催化剂的添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，使纤维素材料在预处理过程中通常仅仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的物质的爆炸放料(explosivedischarge)组合，这称为蒸汽爆炸，即，快速闪变至大气压和物质的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff和Murray,1996,Bioresource Technology855:1-33;Galbe和Zacchi,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628;美国专利申请No.20020164730)。在蒸汽预处理过程中，切割半纤维素乙酰基团，并且得到的酸自催化(autocatalyzes)半纤维素部分水解成为单糖和寡糖。木质素仅以有限的程度被去除。
化学预处理：术语“化学处理”指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学处理。此种预处理可将晶体纤维素转化为无定形纤维素。合适的化学预处理工艺的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子性液体和有机溶剂预处理。
经常在蒸汽预处理之前加入催化剂如H2SO4或SO2(通常0.3至5%w/w)，其可减少时间，降低温度，增加回收率，并改进酶水解(Ballesteros等,2006,Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508;Varga等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:509-523;Sassner等.,2006,Enzyme Microb.Technol.39:756-762)。在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(通常是H2SO4)和水混合以形成浆料，由蒸汽加热至期望的温度，并在一段停留时间后闪变至大气压。可以用很多反应器设计进行稀酸预处理，例如，活塞流反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray,1996,supra;Schell等,2004,Bioresource Technol.91:179-188;Lee等,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。
还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱预处理包括，但不限于，氢氧化钠、石灰、湿氧化、氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。
用氧化钙或氢氧化钙，在85-150℃的温度进行石灰预处理，停留时间从1小时到几天(Wyman等,2005,Bioresource Technol.96:1959-1966;Mosier等,2005,Bioresource Technol.96:673-686)。WO2006/110891、WO2006/110899、WO2006/110900和WO2006/110901公开了使用氨的预处理方法。
湿法氧化是热预处理，通常在180-200℃进行5-15分钟，加入氧化剂如过氧化氢或过压氧(Schmidt和Thomsen,1998,Bioresource Technol.64:139-151;Palonen等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17;Varga等,2004,Biotechnol.Bioeng.88:567-574;Martin等,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。预处理以优选1-40%干物质，例如2-30%干物质，或5-20%干物质进行，并且由于加入碱如碳酸钠，初始pH常常会增加。
湿法氧化预处理方法的修改方法，称为湿爆炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)，能够处理高达30%的干物质。在湿爆炸中，在预处理过程中，在一定的停留时间后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而结束预处理(WO2006/032282)。
氨纤维爆炸(AFEX)涉及在温和温度如90-150℃和高压如17-20bar，用液体或气体氨将纤维素材料处理5-10分钟，其中干物质含量可以高达60%(Gollapalli等,2002,Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35;Chundawat等,2007,Biotechnol.Bioeng.96:219-231;Alizadeh等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141;Teymouri等,2005,Bioresource Technol.96:2014-2018)。在AFEX预处理过程中，纤维素和半纤维素保持相对完整。木质素-糖复合物则被切割。
有机溶剂预处理通过用含水乙醇(40-60%乙醇)在160-200℃提取30-60分钟而将纤维素材料去木质素化(Pan等,2005,Biotechnol.Bioeng.90:473-481;Pan等,2006,Biotechnol.Bioeng.94:851-861;Kurabi等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:219-230)。经常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素和木质素被去除。
合适的预处理方法的其他实例如Schell等,2003,Appl.Biochem andBiotechn.Vol.105-108:69-85,和Mosier等,2005,Bioresource Technology96:673-686,和美国公开申请2002/0164730所述。
在一个方面，化学预处理优选作为稀酸处理，并且更优选作为连续稀酸处理进行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物。弱酸(mild acid)处理在优选1-5，例如1-4，或1-2.5的pH范围进行。在一个方面，酸浓度在优选0.01至10wt%酸，例如0.05至5wt%酸或0.1至2wt%酸的范围。将酸与纤维素材料接触，并在优选140-200℃，例如165-190℃范围的温度保持1至60分钟的时间。
在另一个方面，预处理发生在含水浆料中。在优选的方面，在预处理过程中纤维素材料以优选10-80wt%，例如20-70wt%或30-60wt%，如约40wt%的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或者使用本领域任何已知的方法洗涤，例如，用水洗涤。
机械预处理或物理预处理：术语“机械预处理”或“物理预处理”指任何促进颗粒大小减少的预处理。举例而言，此种预处理可涉及各种类型的磨制(grinding)或粉碎(milling)(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。
纤维素材料可经物理(机械)和化学预处理。机械或物理预处理可与下述偶联：汽蒸/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射(例如微波辐射)，或其组合。在一个方面，高压指优选约100至约400psi，例如约150至约250psi的范围的压力。在另一个方面，高温指约100至300℃，例如约140至约200℃范围的温度。在一个优选的方面，机械或物理预处理在使用利用如上所定义的高温和高压的蒸汽枪水解器系统(例如来自Sunds Defibrator AB,Sweden的Sunds Hydrolyzer)的分批过程中进行。所述物理和化学预处理可视需要顺序进行或同时进行。
因此，在一个优选的方面，对纤维素材料进行物理(机械)或化学预处理，或者它们的任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
生物预处理：术语“生物预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木质素的微生物和/或酶(参见，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatment of biomass,于Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212;Ghosh和Singh,1993,Physicochemical andbiological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333;McMillan,J.D.,1994,Pretreating lignocellulosicbiomass:a review,于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production,Himmel,M.E.,Baker,J.O.,和Overend,R.P.,编,ACS Symposium Series566,American Chemical Society,Washington,DC,第15章;Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewable resources,于Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology,Scheper,T.,编,Springer-Verlag BerlinHeidelberg,Germany,65:207-241;Olsson和Hahn-Hagerdal,1996,Fermentation oflignocellulosic hydrolysates for ethanol production,Enz.Microb.Tech.18:312-331;和Vallander和Eriksson,1990,Production of ethanol from lignocellulosic materials:State of the art,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。
糖化。在水解(也称作糖化)步骤中，将例如经预处理的纤维素材料水解以将纤维素和半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解使用本发明的酶组合物以酶法进行，所述酶组合物包含有效量的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和二价铜阳离子。组合物的酶组分也可以同时或顺序加入。
酶水解优选在容易由本领域技术人员确定的条件下，在合适的含水环境中进行。在一个方面，水解在适于酶的活性，即对于酶最佳的条件下进行。水解可以以补料分批或连续的过程进行，其中将纤维素材料逐渐补入，例如，含酶的水解溶液中。
糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可持续长达200小时，但是通常进行优选约12至约120小时，例如约16至约72小时，或约24至约48小时。温度在优选约25℃至约70℃，例如约30℃至约65℃，约40℃至约60℃，或约50℃至55℃的范围。pH在优选约3至约8，例如约3.5至约7，约4至约6，或约5.0至约5.5的范围。干固体含量在优选约5至约50wt%，例如约10至约40wt%，或约20至约30wt%的范围。
酶和具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的最适量取决于几个因素，其包括但不限于，组分纤维素分解和/或半纤维素分解酶的混合物、纤维素材料、纤维素材料的浓度、纤维素材料的预处理、温度、时间、pH和包括发酵生物体(例如，同步糖化和发酵的酵母)。
在一个优选的方面，纤维素分解酶或半纤维素分解酶对于纤维素材料的有效量是约0.5至约50mg，优选约0.5至约40mg，更优选约0.5至约25mg，更优选约0.75至约20mg，更优选约0.75至约15mg，甚至更优选约0.5至约10mg，和最优选约2.5至约10mg每g纤维素材料。
在另一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽对于纤维素材料的有效量是约0.01至约50.0mg，优选约0.01至约40mg，更优选约0.01至约30mg，更优选约0.01至约20mg，更优选约0.01至约10mg，更优选约0.01至约5mg，更优选约0.025至约1.5mg，更优选约0.05至约1.25mg，更优选约0.075至约1.25mg，更优选约0.1至约1.25mg，甚至更优选约0.15至约1.25mg，和最优选约0.25至约1.0mg每g纤维素材料。
在另一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽对于纤维素分解酶的有效量是约0.005至约1.0g，优选约0.01至约1.0g，更优选约0.15至约0.75g，更优选约0.15至约0.5g，更优选约0.1至约0.5g，甚至更优选约0.1至约0.25g，和最优选约0.05至约0.2g每g纤维素分解酶。
发酵。可通过一种或多种(例如几种)能将糖直接或间接发酵成所需发酵产物的发酵微生物发酵自经水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费品醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如，发酵乳产品)、皮革业和烟草业的发酵方法。发酵条件依赖于期望的发酵产物和发酵生物体，并且能由本领域的技术人员容易地确定。
在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖，通过发酵生物体(如酵母)发酵成为产物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和发酵可以是单独或同时的。
在实施本发明的发酵步骤中可以使用任何合适的经水解的纤维素材料。通常根据所需发酵产品(即，要从发酵获得的物质)和使用的方法来选择所述材料，如本领域中所公知的。
术语“发酵培养基”在本文中可理解为指加入发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及同步的糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。
“发酵微生物”指适用于理想的发酵方法产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是己糖和/或戊糖发酵生物体，或它们的组合。己糖和戊糖发酵生物体均在本领域公知。合适的发酵微生物能将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖和/或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所需的发酵产品。可产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例如Lin等,2006,Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。
能发酵己糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括假丝酵母属、克鲁维酵母属和酵母属，例如Candida sonorensis、马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母的菌株。
以其天然状态能发酵戊糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如一些酵母。优选的木糖发酵酵母包括假丝酵母属，优选休哈塔假丝酵母(Candida sheatae)或Candida sonorensis；和毕赤酵母属，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS5773的菌株。优选的戊糖发酵酵母包括管囊酵母属(Pachysolen)，优选嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)的菌株。不能够发酵戊糖如木糖和阿拉伯糖的生物通过本领域已知方法可经遗传修饰而发酵戊糖。
能有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、Clostridium phytofermentans、地芽孢杆菌属菌种、解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)(Philippidis,1996,见上文)。
其它发酵生物包括芽孢杆菌属，如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，如Candidasonorensis、C.methanosorbosa、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、C.naedodendra、C.blankii、C.entomophilia、芸薹假丝酵母(C.brassicae)、假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、产朊假丝酵母(Candida utilis)和休哈塔假丝酵母(C.scehatae)；梭菌属，如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌和C.phytofermentans；大肠杆菌，特别是经遗传修饰促进乙醇产生的大肠杆菌菌株；地芽孢杆菌属菌种；汉逊酵母属，如异常汉逊酵母(Hansenula anomala)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，如产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)；克鲁维酵母属，如马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、K.thermotolerans和脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)，如解糖热厌氧杆菌，和发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌的菌株。
在一个优选的方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在一个更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)。在另一个更优选的方面，酵母是假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida sonorensis。在另一个更优选的方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida blankii。在另一个更优选的方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candidaentomophiliia。在另一个更优选的方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是休哈塔假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选的方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一个优选的方面，酵母是克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Kluyveromyces thermotolerans。在另一个优选的方面，酵母是管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母。在另一个优选的方面，酵母是毕赤酵母。在另一个更优选的方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，酵母是酵母属菌种。在另一个优选的方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。
在一个优选的方面，细菌是芽孢杆菌属。在一个更优选的方面，细菌是凝结芽孢杆菌。在另一个更优选的方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选的方面，细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一个更优选的方面，细菌是Clostridiumphytofermentans在另一个更优选的方面，细菌是热纤维梭菌。在另一个更优选的方面，细菌是地芽孢杆菌属菌种。在另一个更优选的方面，细菌是热厌氧杆菌属。在另一个更优选的方面，细菌是解糖热厌氧杆菌。在另一个更优选的方面，细菌是发酵单胞菌属。在另一个更优选的方面，细菌是运动发酵单胞菌。
商业上可得到的适合乙醇产生的酵母包括，例如BIOFERMTMAFT和XR(NABC-North American Bioproducts Corporation,GA,USA)，ETHANOLREDTM酵母(Red Star/Lesaffre,USA)、FALITM(Fleischmann’s Yeast,Burns PhilpFood Inc.,USA)，FERMIOLTM(DSM Specialties)，GERT STRANDTM(GertStrand AB,Sweden)以及SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(Ethanol Technology,WI,USA)。
在一个优选的方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，提供发酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
通过将异源基因克隆入多种发酵微生物已经构建了能将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho,1993,Cloning and improving the expression ofPichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147;Ho等,1998,Genetically engineered Saccharomyces yeastcapable of effectively cofermenting glucose and xylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859;Kotter和Ciriacy,1993,Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783;Walfridsson等,1995,Xylose-metabolizingSaccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1and TAL1genes encodingthe pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190;Kuyper等,2004,Minimal metabolic engineering ofSaccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation:a proof ofprinciple,FEMS Yeast Research4:655-664;Beall等,1991,Parametric studies ofethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli,Biotech.Bioeng.38:296-303;Ingram等,1998,Metabolic engineering of bacteria forethanol production,Biotechnol.Bioeng.58:204-214;Zhang等,1995,Metabolicengineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis,Science267:240-243;Deanda等,1996,Development of an arabinose-fermentingZymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470;WO2003/062430,xylose isomerase)。
在一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是Candida sonorensi。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是马克斯克鲁维酵母。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。
本领域中公知的是，上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。
通常向降解的纤维素材料或水解物加入发酵微生物，并进行约8至约96小时，例如约24至约60小时发酵。温度通常为约26℃至约60℃，例如约32℃或50℃，并且在约pH3至约pH8，例如约pH4-5、6或7。
在一个方面，对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物，并进行约12至约96小时，如通常为24-60小时发酵。在另一个方面，温度优选为约20℃至约60℃，例如约25℃至约50℃，并且约32℃至约50℃，约32℃至约50℃，并且pH通常为约pH3至约pH7，例如约pH4至约pH7。然而，一些发酵生物体例如细菌，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以约105-1012，优选约107-1010，特别是约2x108活细胞计数每ml发酵液的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可见于例如“The Alcohol Textbook”(K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall编,Nottingham University Press,UnitedKingdom1999)，其通过提述并入本文。
发酵刺激剂可以与本文所述的任何方法组合使用，以进一步改进发酵工艺，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。优选的用于生长的发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore等,Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by avitamin feeding strategy during fed-batch process,Springer-Verlag(2002)，其通过提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。
发酵产物：发酵产物可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨醇和木糖醇)；烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；环烷烃(例如环戊烷、环己烷、环庚烷、和环辛烷)；烯烃(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))；异戊二烯；酮(例如，丙酮)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；和聚酮化合物。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。
在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”包括包含一个或多个羟基基团的物质。在更优选的方面，所述醇是正丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是异丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甲醇。在另一个更优选的方面，所述醇是阿拉伯糖醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丁二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丙三醇(glycerin)。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油(glycerol)。在另一个更优选的方面，所述醇是1,3-丙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是山梨醇。在另一个更优选的方面，所述醇是木糖醇。参见，例如，Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanolproduction from renewable resources,于Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.编,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241;Silveira,M.M.,和Jonas,R.,2002,The biotechnologicalproduction of sorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408;Nigam,P.和Singh,D.,1995,Processes for fermentative production of xylitol–a sugar substitute,Process Biochemistry30(2):117-124;Ezeji,T.C.,Qureshi,N.和Blaschek,H.P.,2003,Production of acetone,butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101and in situ recovery by gas stripping,World Journal of Microbiology andBiotechnology19(6):595-603。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是烷烃。所述烷烃是未支化或支化的烷烃。在另一个更优选的方面，所述烷烃是戊烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是己烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是庚烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是辛烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是壬烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是癸烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十一烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十二烷。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是环烷烃。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环戊烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环己烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环庚烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环辛烷。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是烯烃。所述烯烃可为未支化或支化的烯烃。在另一个更优选的方面，所述烯烃是戊烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是己烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是庚烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是辛烯。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是氨基酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard A.和Margaritis A.,2004,Empiricalmodeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production and othermicrobial biopolymers,Biotechnology and Bioengineering87(4):501-515。
在另一个优选的方面，所述物质是气体。在另一个更优选的方面，所述气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见，例如，Kataoka,N.,A.Miya,和K.Kiriyama,1997,Studies on hydrogen production bycontinuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria,WaterScience and Technology36(6-7):41-47；和Gunaseelan V.N.,于Biomass andBioenergy,Vol.13(1-2),pp.83-114,1997,Anaerobic digestion of biomass formethane production:A review。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是异戊二烯。
在另一个优选的方面，所述发酵产物似乎酮。应理解的是，术语“酮”涵盖了含有一个或多个酮模块的酮。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如Qureshi和Blaschek,2003,见上文。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是有机酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen,R.和Lee,Y.Y.,1997,Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acidproduction from cellulosic biomass,Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435-448。
在另一个优选的方面，所述物质是聚酮化合物。
回收可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基回收发酵产物，所述方法包括，但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料分离并纯化醇。可以获得纯度高达约96vol.%的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇(即，可饮用的中性含酒精饮料)，或工业乙醇。
通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
实施例
实施例1：GH61多肽的制备
桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽和土生梭孢壳GH61E多肽分别根据WO2005/074656和WO2005/074647制备。
将每个GH61多肽样品(约0.5mM，在10mM乙酸钠缓冲液中)使用固体螯合树脂根据Carrer等,2006,Anal.Bioanal.Chem.385:1409-1413的方法彻底脱金属，生成干净的脱辅基GH61多肽，在溶液中不含其它金属种类。将250μl体积的每种经脱金属的多肽分别用10μl的10mM硝酸铜(II)的水溶液处理。添加充分的金属溶液以构成1:1的金属:蛋白化学计量比，其中总金属-蛋白浓度为大约0.5mM。
在进一步的实验中，将经铜处理的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽添加至10mM抗坏血酸和0.1%PACS溶液中。
实施例2：电子顺磁共振(EPR)
作为在140K的10-20%甘油溶液中的冷冻玻璃态，使用Bruker EMX分光光度计(Bruker AXS GmbH,Karlsruhe,Germany)在9.28GHz获得了连续波EPR谱。
作为对照，记录了10mM乙酸钠缓冲液中的1.0mM硝酸铜(II)的EPR谱，其呈现铜(II)种类在轴向延伸的配位环境中的标准的各向异性分裂样式。作为进一步的对照，脱金属的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽和土生梭孢壳GH61E多肽的EPR谱(图2)在未显示可辨识的高于背景的信号，表明在脱辅基蛋白中不存在顺磁性种类。
经铜处理的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽和土生梭孢壳GH61E多肽的EPR谱分别示于图3A和3B。该谱是铜(II)种类的典型谱，在平行于铜(I=3/2)的维度上具有明显的超精细偶合。两张谱几乎完全相同，但两者均与简单的铜(II)水溶液的谱显著不同(图1)。这些谱表明在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽和土生梭孢壳GH61E多肽中均生成了铜-蛋白复合物，且对于每个多肽结合位点非常类似。此外，每张谱产生了明显的单个铜(II)(即在单个的、界限清楚的位点结合于蛋白的铜)的典型各向异性信号。
Cu-桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽和Cu-土生梭孢壳GH61E多肽一旦用10mM抗坏血酸和1%PASC处理则均显示铜-EPR信号的丧失(图4A和4B)。发现了一个小的残余信号，其可归于基于有机物的基团，表明铜从铜(II)还原为铜(I)。
实施例3：评价正铜离子对具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的作用的方法
根据下文所述的方法评价正铜(铜(II))离子对GH61多肽的纤维素分解增强活性的作用。
使用微晶纤维素(
Figure BDA0000411841600000681
PH101;Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)作为纤维素材料的来源。
使用里氏木霉纤维素酶组合物(补充有米曲霉β-葡糖苷酶的
Figure BDA0000411841600000682
可从Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark获得)作为纤维素酶制备物。所述纤维素酶制备物在本文中在实施例中命名为“里氏木霉纤维素酶组合物”。
Figure BDA0000411841600000683
的水解使用2.0ml深孔板(Axygen Scientific,Union City,CA,USA)在1.0ml的总反应体积中进行。每次水解用14mg (14mg纤维素)每ml50mM乙酸钠pH5.0缓冲液，4mg蛋白每克纤维素的里氏木霉纤维素酶组合物，含或不含0.4mg每g纤维素的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，以及含或不含硫酸铜，和在指定浓度的脱氢抗坏血酸。然后将平板使用ALPS-300TM或ALPS-3000TM平板热密封器(Abgene,Epsom,UnitedKingdom)密封，充分混合，并在Isotemp Plus温育箱(Thermo Fisher ScientificInc.,Waltham,MA,USA)在50℃温育3-7日。所有实验至少重复进行两次。
在水解之后，将样品使用0.45μm
Figure BDA0000411841600000685
96孔过滤板(Millipore,Bedford,MA,USA)过滤，并如下所述分析滤过物的糖含量。当不立即使用时，将经过滤的等分试样在-20℃冷冻。样品在0.005M H2SO4中稀释至合适浓度，如下测量糖浓度：使用
Figure BDA0000411841600000686
HPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)，用0.05%(w/w)苯甲酸-0.005M H2SO4在65℃以0.6ml每分钟的流速洗脱，并通过将来自折射率检测(
Figure BDA0000411841600000687
Figure BDA0000411841600000688
1100HPLC,Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)(通过纯糖样品校正)的葡萄糖和纤维二糖的信号积分来进行定量。使用所得的葡萄糖和纤维二糖当量对于每个反应计算纤维素转化的百分比。对测得的糖浓度根据合适的稀释因子进行调整。数据使用MICROSOFTEXCELTM软件处理(Microsoft,Richland,WA,USA)。
百分比转化基于溶解的糖苷单元对不溶性纤维素的起始质量的质量比来计算。对于可溶性糖仅测量葡萄糖和纤维二糖，因为比纤维二糖更长的纤维糊精以可忽略的浓度存在(由于酶水解)。总纤维素转化的程度使用下述公式计算：
Figure BDA0000411841600000691
   (公式1)
对于葡萄糖和纤维二糖的1.111和1.053因子分别考虑了当纤维素中的糖苷单元(平均分子量为162道尔顿)转化为葡萄糖(分子量为180道尔顿)或纤维二糖糖苷单元(平均分子量为171道尔顿)时的质量增加。
被评价的化合物是从Sigma-Aldrich Co.(St.Louis,MO,USA)获得的脱氢抗坏血酸和硫酸铜。
实施例4：具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽的制备
具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽根据WO2005/074656使用米曲霉JaL250作为宿主来重组制备。
将重组产生的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽首先通过使用10kDa膜(
Figure BDA0000411841600000692
GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)的超滤从60ml浓缩至7ml，交换缓冲液为20mM Tris-HCl加上150mM NaCl pH8.0，然后使用用20mM Tris-HCl加150mM NaCl pH8.0平衡的320ml
Figure BDA0000411841600000693
75柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)以1ml每分钟的流速纯化。收集5ml的级分，并基于SDS-PAGE将级分汇集。
蛋白浓度使用BCATM蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc.,Rockford,IL,USA)确定，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白标样。
实施例5：具有纤维素分解活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A对里氏木霉纤维素酶组合物水解微晶纤维素的作用
在没有硫酸铜和脱氢抗坏血酸存在的条件下，使用与实施例3中所述的相同实验条件和步骤确定桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(实施例4)对里氏木霉纤维素酶组合物(实施例3)水解
Figure BDA0000411841600000694
的作用。
桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的存在并未增强里氏木霉纤维素酶组合物对
Figure BDA0000411841600000695
的水解。在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽不存在下，在1、3和7日，
Figure BDA0000411841600000696
的百分比转化分别为15.2±0.1%，29.4±0.4%，和43.7±0.1%，相对而言，在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽存在下，在1、3和7日，
Figure BDA0000411841600000697
的百分比转化分别为14.5±0.4%，29.7±0.3%，和42.6±0.9%。
实施例6：在里氏木霉纤维素酶组合物水解微晶纤维素过程中，正铜离子对桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的作用
硫酸铜对桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽在里氏木霉纤维素酶组合物(实施例3)水解
Figure BDA0000411841600000704
过程中的纤维素分解增强活性的作用使用实施例3中所述的实验条件和步骤来确定，但有下述补充。硫酸铜的浓度为0、1、10或100μM，而脱氢抗坏血酸的浓度为0或5mM。
通过确定在正铜离子存在下纤维素材料的百分比转化相对于在正铜离子不存在下纤维素材料的百分比转化的比例，来定量正铜离子在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽不存在下对里氏木霉纤维素酶组合物水解纤维素材料的作用：
Figure BDA0000411841600000701
   (公式2)
正铜离子刺激水解则得出>1的比例；抑制水解则得出<1的比例；而对水解无作用则得出=1的比例(图5和7，白色条)。
通过确定在正铜离子存在下纤维素材料的百分比转化相对于在杂环化合物(即脱氢抗坏血酸)不存在下纤维素材料的百分比转化的比例，来定量正铜离子在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽存在下对里氏木霉纤维素酶组合物水解纤维素材料的作用：
Figure BDA0000411841600000702
   (公式3)
在GH61多肽的存在下，正铜离子刺激水解则产生>1的比例；抑制水解则产生<1的比例；而对水解无作用则产生=1的比例(图5和7，灰色条)。
通过确定在GH61多肽存在下的纤维素材料的转化百分比相对于在GH61多肽不存在下的纤维素材料的转化百分比的比例，来定量桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽在正铜离子存在下对里氏木霉纤维素酶组合物水解纤维素材料的作用：
Figure BDA0000411841600000703
   (公式4)
GH61多肽增强水解则产生>1的比例；抑制水解则产生<1的比例；而对水解无作用则产生=1的比例(图5和7，黑色条)。
图5显示在脱氢抗坏血酸存在下进行1、3和7日时，(1)在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽不存在下正铜离子对里氏木霉纤维素酶组合物水解
Figure BDA0000411841600000711
的作用(正铜离子作用(无GH61)，白色条)，(2)在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽存在下正铜离子对里氏木霉纤维素酶组合物水解
Figure BDA0000411841600000712
的作用(正铜离子作用(+GH61)，灰色条)，和(3)在正铜离子的存在下，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽在脱氢抗坏血酸存在1、3、7日的条件下对里氏木霉纤维素酶组合物水解
Figure BDA0000411841600000713
的作用(GH61作用，黑色条)。
里氏木霉纤维素酶组合物对
Figure BDA0000411841600000714
的水解对于低浓度的正铜离子的存在是惰性的，但受高浓度的正铜离子的存在所抑制，如由低于1的正铜离子作用(-GH61)(如公式2所定义)所显示(图5，白色条)。桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的存在减弱了正铜离子抑制(图5，灰色条)，表现为接近1的正铜离子作用(+GH61)(如公式3所定义)。此外桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的作用大于1(GH61作用，公式4)，表明当正铜离子存在时，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽增强水解(图5，黑色条)。图6显示正铜离子对桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的增强的活化取决于正铜离子浓度。桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽在正铜离子和脱氢抗坏血酸不存在下并不增强微晶纤维素的水解(实施例3)。
图7显示在脱氢抗坏血酸不存在下进行1、3和7日时，(1)在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽不存在下正铜离子对里氏木霉纤维素酶组合物水解
Figure BDA0000411841600000715
的作用(正铜离子作用(无GH61)，白色条)，(2)在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽存在下正铜离子对里氏木霉纤维素酶组合物水解的作用(正铜离子作用(+GH61)，灰色条)，和(3)在正铜离子的存在下桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解
Figure BDA0000411841600000717
的作用(GH61作用，黑色条)。
里氏木霉纤维素酶组合物对
Figure BDA0000411841600000718
的水解被低浓度的正铜离子的存在略微增强，但受高浓度的正铜离子的存在所抑制，表现为正铜离子作用(-GH61)低于1(如公式2所定义)(图7，白色条)。桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的存在部分地减弱了正铜离子抑制(图7，灰色条)，表现为正铜离子作用(+GH61)比正铜离子作用（-GH61)更接近1(如公式3所定义)。此外，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的作用大于1(GH61作用，公式4)，表明当正铜离子存在时，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽增强水解(图7，黑色条)。图8显示正铜离子对桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的增强的活化取决于正铜离子浓度。桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽在正铜离子和脱氢抗坏血酸不存在下并不增强微晶纤维素的水解(实施例3)。
总的结果表明，在正铜离子的存在下，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的纤维素分解增强活性在里氏木霉纤维素酶组合物对的水解过程中是明显的。然而，在正铜离子不存在下，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽对于里氏木霉纤维素酶组合物水解
Figure BDA0000411841600000722
不具有可检测出的作用。
实施例7：经预处理的玉米秸秆水解测定
玉米秸秆在美国能源部可再生能源实验室(U.S.Department of EnergyNational Renewable Energy Laboratory(NREL))使用1.4wt%硫酸在165℃和107psi处理8分钟。在经预处理的玉米秸秆中的水不溶性固体含有56.5%纤维素，4.6%半纤维素和28.4%木质素。纤维素和半纤维素通过两阶段硫酸水解，接着通过使用NREL标准分析程序(Standard Analytical Procedure)#002的高效液相色谱分析糖来测定。木质素在用硫酸使用NREL标准分析程序#003水解纤维素和半纤维素级分之后通过重量分析法来确定。
经磨制、未洗涤的PCS(干重量32.35%)通过在Cosmos ICMG40湿式多用途研磨机(EssEmm Corporation,Tamil Nadu,India)中磨制全浆料PCS来制备。
PCS的水解使用2.2ml深孔板(Axygen，Union City，CA，USA)在1.0ml的总反应体积中进行。水解使用50mg可溶性PCS固体/ml的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液来进行，缓冲液含有1mM硫酸锰和标示的蛋白加载量的酶组合物(表示为mg蛋白每克纤维素)。制备酶组合物，然后以50至200μl的体积同时添加至所有孔，使每个反应的终体积为1ml。然后使用ALPS-300TM平板热密封器(Abgene,Epsom,United Kingdom)来密封平板，充分混合，并在特定温度温育72小时。所有报道的实验进行一式三次。
在水解之后，将样品使用0.45μm96孔过滤板(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤，并如下所述分析滤过物的糖含量。当不立即使用时，将经过滤的等分试样冷冻在-20℃。样品在0.005M H2SO4中稀释，使用4.6x250mm
Figure BDA0000411841600000724
HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)来测量其糖浓度，方式是在65℃以0.6ml每分钟的流速用0.05%w/w苯甲酸-0.005M H2SO4洗脱，并通过对来自折射率检测(
Figure BDA0000411841600000725
Figure BDA0000411841600000726
1100HPLC，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)的葡萄糖、纤维二糖和木糖信号(通过纯糖样品校正)积分来进行定量。使用所得的葡萄糖和纤维二糖当量计算每个反应的纤维素转化的百分比。
葡萄糖、纤维二糖和木糖分别测量。根据合适的稀释因子来调整测量的糖浓度。在未经洗涤的PCS的情况下，通过将测得的糖浓度针对零时点的未洗涤的PCS中相应的背景糖浓度进行调整来确定酶产生的糖的净浓度。所有的HPLC数据加工使用MICROSOFT EXCELTM软件(Microsoft,Richland,WA,USA)进行。
纤维素转化为葡萄糖的程度使用下述方程来计算：
%转化=(葡萄糖浓度/限制消化中的葡萄糖浓度)x100
为了计算%转化，基于纤维素酶对照(100mg里氏木霉纤维素酶每克纤维素)来设定100%转化点，并将所有值除以该值后乘以100。对一式三份的数据点取平均值，并计算标准偏差。
实施例8：高温酶组合物的制备
烟曲霉菌株NN055679GH7A纤维二糖水解酶的制备。烟曲霉GH7A纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO:81[DNA序列]和SEQ ID NO:82[推导的氨基酸序列])在米曲霉中如WO2011/057140中所述重组制备。烟曲霉GH7A纤维二糖水解酶I根据WO2011/057140纯化。
烟曲霉菌株NN055679GH6A纤维二糖水解酶II的制备。烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO:83[DNA序列]和SEQ ID NO:84[推导的氨基酸序列])在米曲霉中如WO2011/057140中所述重组制备。将烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶II的经过滤的培养液使用400ml SEPHADEXTMG-25柱(GEHealthcare,United Kingdom)根据生产商的指示交换缓冲液为20mM Tris pH8.0。将级分汇集，并调整至1.2M硫酸铵-20mM Tris pH8.0。将经平衡的蛋白加载至在含1.2M硫酸铵的20mM Tris pH8.0中平衡的PHENYLSEPHAROSETM6Fast Flow柱(高取代)(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)上，并用不含硫酸铵的20mM Tris pH8.0洗脱结合的蛋白。将级分汇集。
桔橙嗜热子囊菌CGMCC0670GH5A内切葡聚糖酶II的制备。桔橙嗜热子囊菌GH5A内切葡聚糖酶II(SEQ ID NO:85[DNA序列]和SEQ ID NO:86[推导的氨基酸序列])在米曲霉中如WO2011/057140中所述重组制备。桔橙嗜热子囊菌GH5A内切葡聚糖酶II根据WO2011/057140纯化。
烟曲霉菌株NN055679GH10木聚糖酶的制备。烟曲霉GH10木聚糖酶(xyn3)(SEQ ID NO:87[DNA序列]和SEQ ID NO:88[推导的氨基酸序列])根据WO2006/078256使用米曲霉BECh2(WO2000/39322)作为宿主来重组制备。将烟曲霉NN055679GH10木聚糖酶(xyn3)的经过滤的培养液使用
Figure BDA0000411841600000741
26/10脱盐柱根据生产商的指示脱盐并交换缓冲液为50mM乙酸钠pH5.0。
烟曲霉菌株NN055679GH3Aβ-葡糖苷酶的制备。烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶(SEQ ID NO:89[DNA序列]和SEQ ID NO:90[推导的氨基酸序列])根据WO2005/047499使用米曲霉作为宿主来重组制备。将经过滤的培养液用20%乙酸钠调整至pH8.0，这使得溶液浑浊。为了去除浑浊，将溶液离心(20000x g，20分钟)，并将上清液通过0.2μm过滤单元(Nalgene,Rochester,NY,USA)来过滤。将滤过物用去离子水稀释以达到与50mM Tris/HCl,pH8.0相同的电导率。将经调整的酶溶液施于在50mM Tris-HCl,pH8.0中平衡的Q
Figure BDA0000411841600000742
Fast Flow柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)上，并用0至500mM氯化钠的线性梯度洗脱。将级分汇集，并用1%(w/v)活性炭处理去除β-葡糖苷酶汇集物的颜色。将悬液通过0.2μm过滤单元(Nalgene,Rochester,NY,USA)过滤来去除炭。将滤过物用20%乙酸调整至pH5.0，并用去离子水稀释10倍。将经调整的滤过物施于在10mM琥珀酸，pH5.0中平衡的SP
Figure BDA0000411841600000743
Fast Flow柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)并用0至500mM氯化钠的线性梯度洗脱。
埃默森踝节菌CBS393.64β-木糖苷酶的制备。所述埃默森踝节菌β-木糖苷酶(SEQ ID NO:91[DNA序列]和SEQ ID NO:92[推导的氨基酸序列])根据Rasmussen等,2006,Biotechnology and Bioengineering94:869-876使用米曲霉JaL355作为宿主(WO2003/070956)重组制备。埃默森踝节菌β-木糖苷酶根据Rasmussen等，见上文纯化。
使用Microplate BCATM蛋白质测定试剂盒测定每个上述的单组分的蛋白浓度，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白标样。由如上所述制备的每种单组分构成高温酶组合物，如下所示：43.5%烟曲霉GH7A纤维二糖水解酶I，29.4%烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶II，11.8%桔橙嗜热子囊菌GH5A内切葡聚糖酶II，5.9%烟曲霉GH10木聚糖酶(xyn3)，5.9%烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶和3.5%埃默森踝节菌β-木糖苷酶。所述高温酶组合物在本文中命名为“高温酶组合物”。
实施例9：桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽在氯化钙或硫酸铜的存在下的热稳定性
在50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中、1mM氯化钙或50μM硫酸铜存在下，对1g/l的具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的热稳定性在4℃，50℃，55℃，60℃和65℃进行比较。对于上述每种条件，通过根据实施例7的PCS测定来确定残余活性，其中将0.5mg蛋白每g纤维素的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽在50℃添加至3.0mg蛋白每g纤维素的高温酶组合物（实施例8）。用5%经磨制、未经洗涤的PCS进行的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应进行一式三次，并包括在水解开始时进行的单次混合。
如图9A和9B中所示的结果说明，与硫酸铜温育的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽当在所有温度温育时均保持了几乎所有的残余活性，而与氯化钙温育的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽在60℃和65℃具有显著的残余活性的丧失，其中当在65℃温育时仅具有20%残余活性。这些结果显示，添加硫酸铜与添加氯化钙相比显著增加了桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的热稳定性。
实施例10：里氏木霉GH61E，烟曲霉GH61B，青霉属菌种（emersonii）GH61A，甲壳嗜热子囊菌GH61A，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的制备
土生梭孢壳GH61E多肽（(SEQ ID NO:7[DNA序列]和SEQ ID NO:8[推导的氨基酸序列])根据WO2005/074647制备。为了纯化土生梭孢壳GH61E多肽，将调整至1.5M硫酸铵的发酵培养基加载于快速蛋白质液相色谱(FastProtein Liquid Chromatography(FPLC))装置和用20mM Tris-HCl和1M硫酸铵pH9预平衡的苯基
Figure BDA0000411841600000751
HP柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)，用20mM Tris-HCl pH9洗脱，并收集10ml的级分。将选定的级分加载于用20mM Tris-HCl pH9预平衡的Sephadex G-25超精细柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)并用相同的缓冲液洗脱以脱盐/缓冲液交换。将收集的样品加载到用20mM Tris-HCl pH9预平衡的Source30Q柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)，用20mM Tris-HCl pH9和1M NaCl洗脱，并按照5ml的级分收集纯化的GH61多肽。
烟曲霉GH61B多肽(SEQ ID NO:29[DNA序列]和SEQ ID NO:30[推导的氨基酸序列])根据WO2010/138754制备。为了纯化烟曲霉GH61B多肽，将经脱盐和浓缩的发酵培养基加载于FPLC和用20mM Tris-HCl pH8预平衡的
Figure BDA0000411841600000761
柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)，用20mM Tris-HCl pH8和1M NaCl洗脱，并收集6ml的级分。将选定的级分汇集，并使用分子量截留值5kD 
Figure BDA0000411841600000762
过滤器(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)浓缩，然后加载于用20mM MES-NaOH pH6预平衡的Superdex75High Load26/60柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)，并用相同的缓冲液洗脱。将纯化的GH61多肽按照6ml的级分收集。将纯化的级分使用
Figure BDA0000411841600000763
过滤器浓缩。
青霉属菌种（emersonii）GH61A多肽(SEQ ID NO:35[DNA序列]和SEQID NO:36[推导的氨基酸序列])根据WO2011/041397制备。为了纯化P.emersonii GH61A多肽，将发酵培养基加载于FPLC和用20mM Tris.HCl pH8.0预平衡的Sephadex G-25柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)，并用相同缓冲液洗脱以脱盐。将经缓冲液交换的样品加载于用20mM Tris.HCl,pH7.5预平衡的Q 
Figure BDA0000411841600000764
Big Beads柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)，用20mM Tris-HCl pH7.5和1M NaCl洗脱，并按照10ml的级分收集。汇集选定的级分，调整为1.5M硫酸铵，并加载于用20mM Tris.HCl,pH7.5和1.5M硫酸铵预平衡的Phenyl 
Figure BDA0000411841600000765
HP柱，用20mM Tris.HCl,pH7.5洗脱，并收集12ml的级分。汇集选定的积分，并使用
Figure BDA0000411841600000766
过滤器浓缩，加载于用20mM MES pH6.0和125mM NaCl预平衡的Superdex7526/60柱，用相同的缓冲液洗脱，并收集3ml的级分。汇集纯化的GH61多肽级分，并使用
Figure BDA0000411841600000767
过滤去浓缩。
甲壳嗜热子囊菌GH61A多肽(SEQ ID NO:59[DNA序列]和SEQ ID NO:60[推导的氨基酸序列])根据WO2011/041504制备。为了纯化T.crustaceusGH61A多肽，将发酵培养基使用具有Omega10kDA MWCO膜(Pall Filtron,Port Washington,NY,USA)的Ultrareservoir5L进行缓冲液交换和浓缩。将经处理的样品加载于FPLC和用20mM Tris-HCl,pH8预平衡的Q
Figure BDA0000411841600000768
Big Beads柱，用20mM Tris-HCl pH8和1M NaCl洗脱，并收集12ml的级分。汇集选定的级分，调整至1.5M硫酸铵，并加载于用20mMTris.HCl pH7.5和1.5M硫酸铵预平衡的苯基HP柱。用20mMTris-HCl,pH7.5洗脱蛋白，并收集12ml的级分。汇集选定的级分，并使用Vivacell100过滤器(Vivaproducts,Littleton,MA,USA)浓缩。将经浓缩、汇集的级分加载于用含125mM NaCl的20mM MES pH6.0预平衡的Superdex7526/60柱，用相同的缓冲液洗脱，并收集3ml的级分。汇集纯化的GH61多肽级分，使用过滤器浓缩，并交换缓冲液为20mM MES pH6.0。
桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(SEQ ID NO:13[DNA序列]和SEQ ID NO:14[推导的氨基酸序列])根据WO2005/074656制备。为了纯化桔橙嗜热子囊菌GH61A，将发酵缓冲液交换缓冲液为20mM Tris-HCl pH8，并使用Vivacell100过滤器(Vivaproducts,Littleton,MA,USA)浓缩。将经处理的样品加载至FPLC和用20mM Tris-HCl,pH8预平衡的Q Fast Flow柱，用20mM Tris-HCl pH8和1M NaCl洗脱，并按照10ml级分收集。汇集选定的级分，调整为1.5M硫酸铵，并加载于用20mM Tris.HCl,pH7.5和1.5M硫酸铵的苯基
Figure BDA0000411841600000773
HP柱上，用20mM Tris.HCl pH7.5的梯度洗脱，并收集10ml的级分。将选定的级分利用具有Omega10K膜(Port Washington,NY,USA)的Pall Minimate TFF系统洗涤并加以浓缩后，加载于用20mM MESpH6.0和125mM NaCl预平衡的Superdex7526/60柱，用相同的缓冲液洗脱，并收集3ml的级分。汇集纯化的GH61多肽级分，并使用具有Omega10K膜的Pall Minimate TFF系统浓缩。
实施例11：评价正铜离子对GH61多肽的热稳定性的作用的方法
差示扫描量热法（DSC）测量使用DSC装置(MicroCal,Northampton,MA,USA)来进行。反馈模式为被动式，并在每次扫描之后进行一次细胞洗涤。
代表性测定溶液包含50μl的0.1M乙酸钠pH5，0.1M Tris-HCl pH7，或0.1M Tris-HCl pH9，25μl的GH61多肽储液，和425μl的Milli-Q水(Millipore,Billerica,MA,USA)。对于铜（II）添加，使用20-75μl的1mM硫酸铜替换相同体积的去离子水。对于二乙二胺三氨基五乙酸（DTPA）螯合剂添加，使用25μl的1mM DTPA替换相同体积的去离子水。
最后将GH61多肽添加至反应混合物至0.3-1.5mg/ml的终浓度，将400μl的反应混合物与不含GH61蛋白的参照一起转移至96孔板。然后将所述平板置于10℃的恒温的自动取样器区室中最长48小时。为了确保储藏时间不影响结果，对同一样品在1小时和48小时之后进行测试扫描。
除非另行指示，使用1.5℃每分钟的扫描速率。确定在获得的热分析图中从折叠状态到去折叠状态的转换的峰最大值处的温度作为热去折叠温度Tm。使用Origin软件包(MicroCal,GE Healthcare,UK)进行基线扣除和图示。
实施例12：正铜离子添加对土生梭孢壳GH61E多肽的热稳定性的作用
使用实施例11中所述的相同的实验条件和步骤，通过由DSC确定的折叠-去折叠转换来测量在添加或不添加外源铜（II）离子的条件下土生梭孢壳GH61E多肽的热稳定性。
对于土生梭孢壳GH61E多肽观察到明显的热去折叠温度Tm。当将1mMDTPA螯合剂添加至1.3g/l的土生梭孢壳GH61E多肽时，未发现Tm的变化。当添加2mM Ca（II）时（相对于DTPA的摩尔比为2：1），未发现Tm的变化。当添加2mM Cu（II）时（相对于DTPA的摩尔比为2：1），观察到Tm约16℃的增加，表明增强的热稳定性（图10）。
在另一个实验中，在pH5，7和9，100μM Cu(II)的存在分别增加了Tm约18，18和13℃，表明增强的热稳定性（图11）。
在另一个实验中，将Cu(II)从40到150μM逐步递增地（递增5μM）添加至约65μM土生梭孢壳GH61E多肽的溶液。观察到Cu浓度依赖性的Tm的上升，这表明增强的热稳定性，还表明蛋白对Cu的结合为大约1：1。
实施例13：正铜离子添加对烟曲霉GH61B多肽的热稳定性的作用
使用实施例11中所述的相同的实验条件和步骤，通过由DSC确定的折叠-去折叠转换来测量在有或没有外源铜（II）离子的条件下烟曲霉GH61B多肽的热稳定性。
烟曲霉GH61B多肽观察到明显的热去折叠温度Tm。当将100μM Cu(II)添加至0.5g/l烟曲霉GH61B多肽和1mM DTPA螯合剂的混合物时，在pH5、7和9分别观察到约13、12和10℃的Tm增加，表明增强的热稳定性（图12）。
实施例14：正铜离子添加对青霉属菌种（emersonii）GH61A多肽的热稳定性的作用
使用实施例11中所述的相同的实验条件和步骤，通过由DSC确定的折叠-去折叠转换来测量有或没有外源铜（II）离子的条件下，P.emersonii GH61A多肽的热稳定性。
P.emersonii GH61A多肽观察到明显的热去折叠温度Tm。当将100μMCu(II)添加至0.8g/l P.emersonii GH61A多肽和1mM DTPA螯合剂的混合物时，在pH5、7和9分别观察到约8、11和9℃的Tm增加，表明增强的热稳定性（图13）。
实施例15：正铜离子添加对甲壳嗜热子囊菌GH61A多肽的热稳定性的作用
使用实施例11中所述的相同的实验条件和步骤通过由DSC确定的折叠-去折叠转换来测量在添加或不添加外源铜（II）离子下，甲壳嗜热子囊菌GH61A多肽的热稳定性。
对于甲壳嗜热子囊菌GH61A多肽观察到明显的热去折叠温度Tm。当将100μM Cu(II)添加至0.5g/l甲壳嗜热子囊菌GH61A多肽和1mM DTPA螯合剂的混合物时，在pH5、7和9分别观察到约11、11和9℃的Tm增加，表明增强的热稳定性（图14）。
实施例16：正铜离子添加对桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的热稳定性的作用
使用实施例11中所述的相同的实验条件和步骤通过由DSC确定的折叠-去折叠转换来测量在添加或不添加外源铜（II）离子下桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的热稳定性。
对于桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽观察到明显的热去折叠温度Tm。当将100μM Cu(II)添加至0.8g/l桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽和1mM DTPA螯合剂的混合物时，在pH5、7和9分别观察到约7、9和7℃的Tm增加，表明增强的热稳定性（图15）。
实施例17：CuSO4对桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽和连苯三酚的存在下亚甲基蓝的转化的作用
活性测定在96孔板中使用来自Spectra Max M2(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)的酶标仪来进行。将酶标仪的温度设为37摄氏度。反应混合物组成为20μl的500mM MOPS/NaOH pH7.0缓冲液，20μl的1mM亚甲基蓝(溶解于MilliQ水)，20μl的40mM连苯三酚(在MilliQ水中)，合适体积(1.6，4，8，16，40，80μl)的2500μM的CuSO4储液至相应的浓度(0至1000μM)，25μl的810μg/ml的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，并最终添加MilliQ水至200μl的终体积。通过添加连苯三酚来起始反应，并在400nm监视。对于对照，包括了所有组分，除了GH61多肽。在15分钟反应之后，进行了在400nm的吸光度读数，并通过扣除对照的吸光度来矫正。
图16中所示的结果表明桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽和连苯三酚的存在在大约200μM CuSO4最适地转化亚甲基蓝。
本发明通过下述编号段落进一步描述：
[1]一种增加具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的活性的方法，其包括：将二价铜阳离子添加至包含所述GH61多肽的组合物，其中在纤维素材料的降解或转化过程中所述二价铜阳离子以0.0001mM至约20mM，例如约0.0005mM至约15mM，约0.001mM至约10mM，约0.005mM至约5mM，约0.01mM至约2.5mM，约0.05mM至约1mM，或约0.1mM至约1mM的浓度存在。
[2]一种增加具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的稳定性的方法，其包括：将二价铜阳离子添加至包含所述GH61多肽的组合物，其中所述二价铜阳离子以0.0001mM至约20mM，例如约0.0005mM至约15mM，约0.001mM至约10mM，约0.005mM至约5mM，约0.01mM至约2.5mM，约0.05mM至约1mM，或约0.1mM至约1mM的浓度存在。
[3]一种增加具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的活性和稳定性的方法，其包括：将二价铜阳离子添加至包含所述GH61多肽的组合物，其中所述二价铜阳离子以0.0001mM至约20mM，例如约0.0005mM至约15mM，约0.001mM至约10mM，约0.005mM至约5mM，约0.01mM至约2.5mM，约0.05mM至约1mM，或约0.1mM至约1mM的浓度存在。
[4]段1-3中任一项的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽选自下组：(a)具有纤维素分解增强活性的多肽，其包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ](SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66)和[FW]-[TF]-K-[AIV]，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是4或5个连续位置上的任何氨基酸，且X(4)是4个连续位置上的任何氨基酸；和(b)具有纤维素分解增强活性的多肽，其包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ](SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:80)，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是4或5个连续位置上的任何氨基酸，且X(3)是3个连续位置上的任何氨基酸；其中该具有纤维素分解增强活性且包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ](SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66)和[FW]-[TF]-K-[AIV]的多肽任选地进一步包含：H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV](SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68)，[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV](SEQ ID NO:69)，或H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV](SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:71)和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV](SEQ ID NO:72)，其中X是任何氨基酸，X(1,2)是在一个位置或两个连续位置上的任何氨基酸，X(3)是3个连续位置上的任何氨基酸，且X(2)是在两个连续位置上的任何氨基酸。
[5]段1-3任一项的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽选自下组：(a)多肽，其包含或组成为这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，或SEQ ID NO:64的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，或至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件，例如至少中等严格条件，至少中等-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件与以下杂交(i)SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)多肽，其由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为如下所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列，或SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列的cDNA序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(d)SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQID NO:28，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQID NO:56，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，或SEQ ID NO:64的成熟多肽包含一个或多个位置的取代、缺失和/或插入的变体；和(e)具有纤维素分解增强活性的多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，或SEQ ID NO:64的成熟多肽；或其具有纤维素分解增强活性的片段。
[6]段1-5任一项的方法，其中所述组合物进一步包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、和膨胀素。
[7]段6的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，和β-葡糖苷酶。
[8]段6的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶，乙酰木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，木糖苷酶，和葡糖醛酸糖苷酶。
[9]段1-8任一项的方法，进一步包括补充二价铜阳离子的浓度以维持二价铜阳离子的有效浓度在约0.0001mM至约20mM，例如约0.0005mM至约15mM，约0.001mM至约10mM，约0.005mM至约5mM，约0.01mM至约2.5mM，约0.05mM至约1mM，或约0.1mM至约1mM。
[10]一种用于降解或转化纤维素材料的方法，其包括：用包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和二价铜阳离子的酶组合物处理所述纤维素材料，其中所述二价铜阳离子以约0.0001mM至约20mM，例如约0.0005mM至约15mM，约0.001mM至约10mM，约0.005mM至约5mM，约0.01mM至约2.5mM，约0.05mM至约1mM，或约0.1mM至约1mM的浓度存在。
[11]段10的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽选自下组：(a)具有纤维素分解增强活性的多肽，其包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ](SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66)和[FW]-[TF]-K-[AIV]，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是4或5个连续位置上的任何氨基酸，且X(4)是4个连续位置上的任何氨基酸；和(b)具有纤维素分解增强活性的多肽，其包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ](SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:80)，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是4或5个连续位置上的任何氨基酸，且X(3)是3个连续位置上的任何氨基酸；其中该具有纤维素分解增强活性且包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ](SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66)和[FW]-[TF]-K-[AIV]的多肽任选地进一步包含：H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV](SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68)，[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV](SEQ ID NO:69)，或H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV](SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:71)和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV](SEQ ID NO:72)，其中X是任何氨基酸，X(1,2)是在一个位置或两个连续位置上的任何氨基酸，X(3)是3个连续位置上的任何氨基酸，且X(2)是在两个连续位置上的任何氨基酸。
[12]段10的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽选自下组：(a)多肽，其包含或组成为这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，或SEQ ID NO:64的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，或至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如至少中等严格条件，至少中等-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)多肽，其由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列，或SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ IDNO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列的cDNA序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(d)SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，或SEQ ID NO:64的成熟多肽的包含一个或多个位置的取代、缺失和/或插入的变体；和(e)具有纤维素分解增强活性的多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ IDNO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，或SEQ ID NO:64的成熟多肽；或其具有纤维素分解增强活性的片段。
[13]段10-12任一项的方法，其中所述纤维素材料是经预处理的。
[14]段10-13的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、和膨胀素。
[15]段14的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，和β-葡糖苷酶。
[16]段14的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶，乙酰木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，木糖苷酶，和葡糖醛酸糖苷酶。
[17]段10-16任一项的方法，进一步包括回收经降解的纤维素材料。
[18]段17的方法，其中所述经降解的纤维素材料是糖。
[19]段18的方法，其中所述糖选自下组：葡萄糖，木糖，甘露糖，半乳糖，和阿拉伯糖。
[20]段10-19任一项的方法，进一步包括补充二价铜阳离子的浓度以维持所述二价铜阳离子的浓度在约0.0001mM至约20mM，例如约0.0005mM至约15mM，约0.001mM至约10mM，约0.005mM至约5mM，约0.01mM至约2.5mM，约0.05mM至约1mM，或约0.1mM至约1mM。
[21]一种用于产生发酵产物的方法，其包括：(a)用包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和二价铜阳离子的酶组合物糖化纤维素材料，其中所述二价铜阳离子以约0.0001mM至约20mM，例如约0.0005mM至约15mM，约0.001mM至约10mM，约0.005mM至约5mM，约0.01mM至约2.5mM，约0.05mM至约1mM，或约0.1mM至约1mM的浓度存在；(b)用一种或多种（例如几种）发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。
[22]段21的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽选自下组：(a)具有纤维素分解增强活性的多肽，其包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ](SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66)和[FW]-[TF]-K-[AIV]，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是4或5个连续位置上的任何氨基酸，且X(4)是4个连续位置上的任何氨基酸；和(b)具有纤维素分解增强活性的多肽，其包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ](SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:80)，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是4或5个连续位置上的任何氨基酸，且X(3)是3个连续位置上的任何氨基酸；其中该具有纤维素分解增强活性且包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ](SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66)和[FW]-[TF]-K-[AIV]的多肽任选地进一步包含：H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV](SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68)，[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV](SEQ ID NO:69)，或H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV](SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:71)和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV](SEQ ID NO:72)，其中X是任何氨基酸，X(1,2)是在一个位置或两个连续位置上的任何氨基酸，X(3)是3个连续位置上的任何氨基酸，且X(2)是在两个连续位置上的任何氨基酸。
[23]段21的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽选自下组：(a)多肽，其包含或组成为这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，或SEQ ID NO:64的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，或至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如至少中等严格条件，至少中等-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)多肽，其由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列，或SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ IDNO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列的cDNA序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(d)SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，或SEQ ID NO:64的成熟多肽的包含一个或多个位置的取代、缺失和/或插入的变体；和(e)具有纤维素分解增强活性的多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ IDNO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，或SEQ ID NO:64的成熟多肽；或其具有纤维素分解增强活性的片段。
[24]段21-23任一项的方法，其中所述纤维素材料是经预处理的。
[25]段21-24的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、和膨胀素。
[26]段25的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，和β-葡糖苷酶。
[27]段25的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶，乙酰木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，木糖苷酶，和葡糖醛酸糖苷酶。
[28]段21-27任一项的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸、烷烃、环烷烃、烯烃、异戊二烯、聚酮化合物、或气体。
[29]段21-28任一项的方法，进一步包括补充二价铜阳离子的浓度以维持所述二价铜阳离子的浓度在约0.0001mM至约20mM，例如约0.0005mM至约15mM，约0.001mM至约10mM，约0.005mM至约5mM，约0.01mM至约2.5mM，约0.05mM至约1mM，或约0.1mM至约1mM。
[30]一种用于发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种（例如几种）发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料用包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和二价铜阳离子的酶组合物糖化，其中所述二价铜阳离子以约0.0001mM至约20mM，例如约0.0005mM至约15mM，约0.001mM至约10mM，约0.005mM至约5mM，约0.01mM至约2.5mM，约0.05mM至约1mM，或约0.1mM至约1mM的浓度存在。
[31]段30的方法，其中所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。
[32]段31的方法，进一步包括从发酵回收发酵产物。
[33]段30-32任一项的方法，其中所述纤维素材料在糖化之前经预处理。
[34]段30-33任一项的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、和膨胀素。
[35]段34的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，和β-葡糖苷酶。
[36]段34的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶，乙酰木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，木糖苷酶，和葡糖醛酸糖苷酶。
[37]段31-36任一项的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸、烷烃、环烷烃、烯烃、异戊二烯、聚酮化合物、或气体。
[38]段30-37任一项的方法，还包括补充二价铜阳离子的浓度以维持所述二价铜阳离子的浓度在约0.0001mM至约20mM，例如约0.0005mM至约15mM，约0.001mM至约10mM，约0.005mM至约5mM，约0.01mM至约2.5mM，约0.05mM至约1mM，或约0.1mM至约1mM。
[39]段10-38任一项的方法，还包括在纤维素材料的降解或糖化过程中添加螯合剂。
[40]段39的方法，其中所述螯合剂选自下组：EDTA(乙二胺四乙酸)，EGTA(乙二醇-双-(2-氨基乙基)-N,N,N',N'-四乙酸，ethyleneglycol-bis-(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraacetic acid)，DDTA(3,6-二氧杂-1,8-辛二胺四乙酸，3,6-dioxaoctamethylenedinitrilotetraacetic acid)，EDDS(乙二胺-N,N'-二琥珀酸，ethylenediamine-N,N'-disuccinic acid)，BAPTA(1,2-二(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸，1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid)，和BIPY(2,2'-联吡啶，2,2'-bipyridine)。
[41]一种组合物，其包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和二价铜阳离子，其中所述二价铜阳离子在纤维素材料的降解或糖化过程中以约0.0001mM至约20mM，例如约0.0005mM至约15mM，约0.001mM至约10mM，约0.005mM至约5mM，约0.01mM至约2.5mM，约0.05mM至约1mM，或约0.1mM至约1mM的浓度存在，且所述二价铜阳离子和GH61多肽的存在与没有所述二价铜阳离子的GH61多肽相比增加酶组合物对所述纤维素材料的降解或转化。
[42]段41的组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽选自下组：(a)具有纤维素分解增强活性的多肽，其包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ](SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66)和[FW]-[TF]-K-[AIV]，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是4或5个连续位置上的任何氨基酸，且X(4)是4个连续位置上的任何氨基酸；和(b)具有纤维素分解增强活性的多肽，其包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ](SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:80)，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是4或5个连续位置上的任何氨基酸，且X(3)是3个连续位置上的任何氨基酸；其中该具有纤维素分解增强活性且包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ](SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66)和[FW]-[TF]-K-[AIV]的多肽任选地进一步包含：H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV](SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68)，[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV](SEQ ID NO:69)，或H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV](SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:71)和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV](SEQ ID NO:72)，其中X是任何氨基酸，X(1,2)是在一个位置或两个连续位置上的任何氨基酸，X(3)是3个连续位置上的任何氨基酸，和X(2)是在两个连续位置上的任何氨基酸。
[43]段41的组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽选自下组：(a)多肽，其包含或组成为这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，或SEQ ID NO:64的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，或至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如至少中等严格条件，至少中等-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ IDNO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ IDNO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列，或SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列的cDNA序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(d)SEQID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，或SEQ ID NO:64的成熟多肽的包含一个或多个位置的取代、缺失和/或插入的变体；和(e)具有纤维素分解增强活性的多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ IDNO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，或SEQ ID NO:64的成熟多肽；或其具有纤维素分解增强活性的片段。
[44]段41-43任一项的组合物，其中所述组合物进一步包含一种或多种（例如几种）选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、和膨胀素。
[45]段44的组合物，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，和β-葡糖苷酶。
[46]段44的组合物，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶，乙酰木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，木糖苷酶，和葡糖醛酸糖苷酶。
[47]一种全培养液配制物或细胞培养组合物，其包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和二价铜阳离子，其中所述二价铜阳离子在纤维素材料的降解或糖化过程中以约0.0001mM至约20mM，例如约0.0005mM至约15mM，约0.001mM至约10mM，约0.005mM至约5mM，约0.01mM至约2.5mM，约0.05mM至约1mM，或约0.1mM至约1mM的浓度存在，且所述二价铜阳离子和GH61多肽的存在与没有所述二价铜阳离子的GH61多肽相比增加酶组合物对所述纤维素材料的降解或转化。
[48]段47的全培养液配制物或细胞培养组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽选自下组：(a)具有纤维素分解增强活性的多肽，其包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ](SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66)和[FW]-[TF]-K-[AIV]，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是4或5个连续位置上的任何氨基酸，且X(4)是4个连续位置上的任何氨基酸；和(b)具有纤维素分解增强活性的多肽，其包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ](SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:80)，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是4或5个连续位置上的任何氨基酸，且X(3)是3个连续位置上的任何氨基酸；其中该具有纤维素分解增强活性且包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ](SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66)和[FW]-[TF]-K-[AIV]的多肽任选地进一步包含：H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV](SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68)，[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV](SEQ ID NO:69)，或H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV](SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:71)和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV](SEQ ID NO:72)，其中X是任何氨基酸，X(1,2)是在一个位置或两个连续位置上的任何氨基酸，X(3)是3个连续位置上的任何氨基酸，和X(2)是在两个连续位置上的任何氨基酸。
[49]段47的全培养液配制物或细胞培养组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽选自下组：(a)多肽，其包含或组成为这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，或SEQ ID NO:64的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，或至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如至少中等严格条件，至少中等-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)多肽，其由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列，或SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，或SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列的cDNA序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(d)SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:52，SEQID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，或SEQ ID NO:64的成熟多肽的包含一个或多个位置的取代、缺失和/或插入的变体；和(e)具有纤维素分解增强活性的多肽的变体，其包含或组成为SEQID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，或SEQ ID NO:64的成熟多肽；或其具有纤维素分解增强活性的片段。
[50]段47-49任一项的全培养液配制物或细胞培养组合物，其中所述组合物进一步包含一种或多种（例如几种）选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、和膨胀素。
[51]段50的组合物，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，和β-葡糖苷酶。
[52]段50的组合物，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶，乙酰木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，木糖苷酶，和葡糖醛酸糖苷酶。
本文中描述和要求保护的发明范围并不受本文中公开的具体方面所限制，因为这些方面旨在说明本发明的几个方面。任何等同的方面旨在涵盖于本发明的范围。事实上，对于本领域技术人员而言，根据前述描述，除了本文中显示和描述的那些之外，本发明的多种修饰会是明显的。此类修饰旨在落在所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包含定义的本公开为准。
本文中引用了多个参考文献，其公开通过全文提述并入本文。
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Claims (17)

1.一种增加具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的活性的方法，其包括：将二价铜阳离子添加至包含GH61多肽的组合物，其中所述二价铜阳离子在纤维素材料的降解或转化过程中以0.0001mM至约20mM的浓度存在。
2.一种增加具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的稳定性的方法，其包括：将二价铜阳离子添加至包含GH61多肽的组合物，其中所述二价铜阳离子以0.0001mM至约20mM的浓度存在。
3.一种增加具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的活性和稳定性的方法，其包括：将二价铜阳离子添加至包含GH61多肽的组合物，其中所述二价铜阳离子以0.0001mM至约20mM的浓度存在。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述组合物还包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、和膨胀素。
5.权利要求1-4任一项的方法，还包括补充二价铜阳离子的浓度以维持二价铜阳离子的有效浓度在约0.0001mM至约20mM。
6.一种用于降解或转化纤维素材料的方法，其包括：用包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和二价铜阳离子的酶组合物处理所述纤维素材料，其中所述二价铜阳离子以约0.0001mM至约20mM的浓度存在。
7.权利要求的方法6，还包括回收经降解的纤维素材料。
8.一种用于产生发酵产物的方法，其包括：(a)用包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和二价铜阳离子的酶组合物糖化纤维素材料，其中所述二价铜阳离子以约0.0001mM至约20mM的浓度存在；(b)用一种或多种（例如几种）发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。
9.一种用于发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种（例如几种）发酵微生物发酵纤维素材料，其中用包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和二价铜阳离子的酶组合物糖化所述纤维素材料，其中所述二价铜阳离子以的约0.0001mM至约20mM浓度存在。
10.权利要求9的方法，其中所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。
11.权利要求10的方法，进一步包括从发酵回收发酵产物。
12.权利要求6-11任一项的方法，还包括补充二价铜阳离子的浓度以维持所述二价铜阳离子的浓度在约0.0001mM至约20mM。
13.权利要求6-12任一项的方法，还包括在纤维素材料的降解或糖化过程中添加螯合剂。
14.权利要求13的方法，其中所述螯合剂选自下组：EDTA(乙二胺四乙酸)，EGTA(乙二醇-双-(2-氨基乙基)-N,N,N',N'-四乙酸，DDTA(3,6-二氧杂-1,8-辛二胺四乙酸)，EDDS(乙二胺-N,N'-二琥珀酸)，BAPTA(1,2-二(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸)，和BIPY(2,2'-联吡啶)。
15.权利要求6-14任一项的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、和膨胀素。
16.一种组合物，其包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和二价铜阳离子，其中所述二价铜阳离子在纤维素材料的降解或糖化过程中以约0.0001mM至约20mM的浓度存在，且所述二价铜阳离子和GH61多肽的存在与不含所述二价铜阳离子的GH61多肽相比增加酶组合物对所述纤维素材料的降解或转化。
17.一种全培养液配制物或细胞培养组合物，其包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和二价铜阳离子，其中所述二价铜阳离子在纤维素材料的降解或糖化过程中以约0.0001mM至约20mM的浓度存在，并且与没有所述二价铜阳离子的GH61多肽相比，所述二价铜阳离子和GH61多肽的存在增加酶组合物对所述纤维素材料的降解或转化。
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