JP5352589B2 - 改善されたバイオマス前処理 - Google Patents
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Description
本発明は、エネルギー省によって授与された契約番号04−03−CA−70224およびDE−FC36−03GO13146の下で、米国政府後援でなされたものであった。政府は本発明における特定の権利を有する。
a)バイオマスを提供するステップと、
b)前記バイオマスを適切な条件下でアンモニアを含有する水溶液と接触させ、バイオマス−水性アンモニア混合物を形成することによって前記バイオマスを前処理するステップであって、ここでアンモニアはバイオマス−水性アンモニア混合物のアルカリ性pHを維持するのに少なくとも十分な濃度で存在するが、ここで前記アンモニアはバイオマスの乾燥重量に対して約12重量パーセント未満で存在し、またさらにここでバイオマスの乾燥重量はバイオマス−水性アンモニア混合物の重量に対して少なくとも約15重量パーセントの高固形物濃度であり、それにより前処理バイオマス固形生産物および1つもしくはそれ以上の阻害因子化合物を含有するバイオマス前処理液が形成されるステップと、
c)前記バイオマス前処理液を除去するステップと、
を含み、ここで前処理バイオマス固形生産物は低減された量の阻害因子化合物および糖含有物のごくわずかな低下を有する、方法を提供する。
i)ステップ(b)の前
ii)ステップ(b)における追加的成分として、または
iii)ステップ(b)の後の洗浄ステップとして
の中の1つもしくはそれ以上において追加的水性成分を添加するステップをさらに含む。
本開示では、多数の用語が使用される。以下の定義が提供される。
用語「発酵性糖」または「糖類」は、発酵工程における微生物による炭素源として使用可能なオリゴ糖および単糖を示す。
本方法で用いられる低水性アンモニア前処理においては、アンモニアの濃度は、最低限、バイオマス−水性アンモニア混合物のpHをアルカリ性に維持するのに十分な濃度であり、かつバイオマスの乾燥重量に対して最大で約12重量パーセント未満である。この低いアンモニアの濃度は前処理にとって十分であり、かつ低い濃度はまたバイオマスの乾燥重量に対して約10重量パーセント未満でありうる。バイオマスの乾燥重量に対して6パーセントまたはそれ未満の非常に低い濃度のアンモニアはまた、前処理において使用されうる。アルカリ性は、7.0を超えるpHを意味する。バイオマス−水性アンモニア混合物の8を超えるpHが特に適切である。一実施形態では、アンモニアはバイオマスの乾燥重量に対して約10重量パーセント未満で存在する。バイオマスの乾燥重量に対して約6重量パーセント未満のアンモニアが特に適切である。
出願人は、驚くべきことに、阻害因子が低水性アンモニアと反応されるバイオマスから放出される一方、糖類がほとんど放出されないことを見出している。阻害因子は糖化および/または発酵に対して有害な化合物であることから、前処理バイオマス生産物中に存在する阻害因子の量を低減することは望ましい。阻害因子は、バイオマスと低水性アンモニアの反応後に固形物と共に存在する液体画分の可溶化成分として見出された。阻害因子を含有するこの液体画分はバイオマス前処理液を形成する。固形物からバイオマス前処理液を除去する結果、放出された阻害因子が除去され、糖類の実質的低下を伴わずに阻害因子組成物を低減している固形物の前処理バイオマス生産物が残存する。
次いで、本方法に従って調製される改善された前処理バイオマスは糖化酵素共同体の存在下でさらに加水分解され、加水分解物におけるオリゴ糖および/または単糖が放出される。糖化酵素およびバイオマス処理のための方法については、Lynd,L.R.ら(Microbiol.Mol.Biol.Rev.(2002年)66:506−577頁)中でレビューされている。
バイオマスから放出された発酵性糖の適切な微生物による使用により、標的化学物質を生産してもよい。糖化後であるが発酵に先立ち、糖化混合物を例えば蒸発により濃縮することで、発酵性糖の濃度が増加しうる。場合により、糖化生産物中の液体は、バッチ式または連続的な方法で固体から分離されうる。場合により、液体または糖化生産物全体は、発酵に先立ち殺菌されうる。pHについては、発酵の間に用いられる微生物および糖化の間に用いられるpHに依存し、発酵に適するpHに調節されうる。さらに、糖化混合物に微生物の成長にとって必要な追加の栄養を補充することが可能である。補充物は、例えば、酵母抽出物、特定のアミノ酸、リン酸塩、窒素源、塩、および微量元素を含みうる。抗生物質など、特定の生体触媒によって作製される特定の生産物の生産にとって必要な成分もまた含まれることで、酵素触媒反応において必要とされるプラスミドまたは共同因子の維持が可能である。さらに追加の糖類が含まれることで、全糖濃度が増加しうる。糖化混合物は発酵培養液の成分として用いられ、例えば最終培地の約100%〜約10%を構成しうる。
以下の略語が使用される。すなわち、「HPLC」は高性能液体クロマトグラフィー、「C」は摂氏、「kPa」はキロパスカル、「m」はメートル、「mm」はミリメートル、「kW」はキロワット、「μm」はマイクロメートル、「μL」はマイクロリットル、「mL」はミリリットル、「L」はリットル、「min」は分、「mM」はミリモル、「cm」はセンチメートル、「g」はグラム、「kg」はキログラム、「wt」は重量、「hr」は時間、「temp」もしくは「T」は温度、「theoret」は理論、「pretreat」は前処理、「DWB」はバイオマス乾燥重量、「ASME」はAmerican Society of Mechanical Engineers(米国機械学会)、「s.s.」はステンレス鋼である。
Jaygo反応器は、Hastelloy(登録商標)C−22合金製の130リットル(直径約51cm×長さ91cm)の水平のパドル型反応器(Jaygo Manufacturing,Inc.(Mahwah,NJ))である。反応器は約177℃(862kPa)に加熱可能な蒸気ジャケットを装備する。バイオマスを最高で前処理温度まで速やかに誘導するため、直接蒸気注入も用いる。蒸気圧を調節および制御し、所望の前処理温度を維持する。極めて多くのポートにより、他の溶媒および温液の注入が可能になる。
ピストンを装備した5.1cm×68.6cmのステンレス鋼バレルで水平方向に構成される(ASMEコードがスタンプされた)大型バレルピストン反応器を組み立てた。ピストンを4つのOリングでバレルに密封し、吐出行程中、ピストンの裏側を窒素で加圧した。68.6cmのバレルに8つの複数の使用ポート(4つはそれぞれ頂部および底部表面沿い)を装備し、真空の適用、水性アンモニアの注入、蒸気の注入およびバレル内部の温度を測定するための熱電対の挿入を可能にした。反応器バレルに、バレルのさらなる加熱のための蒸気ジャケットを装備した。反応器バレルを、15.2cm×61cmのステンレス鋼フラッシュタンクに垂直方向に直接装着した。バレルを、円錐状ノズルおよびシート端部剪断弁装置により、フラッシュタンクから隔てた。端部の弁を剪断するダイの直径は3.5cmであった。円錐状ノズルおよびシートに対する背圧は調整可能であり、大部分の試験を、端部剪断弁のコーン部に接続された10.2cm直径のエアシリンダへの約138kPa(ゲージ圧)の背圧を用いて実施した。端部剪断弁のコーン部は最大で1.6cm後方移動でき、粒子のフラッシュタンクへの排出を可能にした。固形物がタンクの底部におけるドーム状端部フランジのボルトを緩めることによって容易に除去される場合、端部剪断弁の出口にあるエルボーが前処理固形物をフラッシュタンクの底部へと下方誘導した。フラッシュタンクに対して上部にあるドーム状フランジにフラッシュタンクの軸に対して直角に機械加工されたスロットに適合する特別な出口を組み込んだことで、放出された蒸気のコーナ軌跡周辺から出口フィッチングへの移動が引き起こされ、それは同伴されるバイオマス粒子および水滴のベントコンデンサへのキャリーオーバーの防止に役立った。3つの電気バンドヒーター(60℃に設定)および絶縁部をフラッシュタンクに沿って追加し、熱で前処理された固形物の加熱容器へのフラッシュを可能にし、商業用工程のシミュレーションが改善された。
この反応器は、共同所有される同時係属中の米国特許出願第CL3873号明細書により詳細に記載されている。
固形物中のグルコースおよびキシロースの定量
各初期バイオマス試料中のグルコースおよびキシロースの量を、当該技術分野で周知の方法、例えばASTME1758−01「Standard method for the determination of carbohydrates by HPLC」を使用して測定した。
糖化液中または発酵培養液中の可溶性糖(グルコース、セロビオース、キシロース、ガラクトース、アラビノースおよびマンノース)、酢酸およびエタノールを、適切な保護カラムを有するBio−Rad HPX−87PおよびBio−Rad HPX−87Hカラム(Bio−Rad Laboratories(Hercules,CA))を使用し、HPLC(Agilent Model 1100、Agilent Technologies(Palo Alto,CA))によって測定した。試料のpHを測定し、必要に応じ硫酸を用いて5〜6に調節した。次いで、試料を直接に0.2μmのシリンジフィルターを通してHPLCバイアルに通過させた。HPLCの稼動条件は以下の通りであった。
HPX−87P(炭水化物用):
注入容量:10〜50μL、濃度および検出器の限界に依存
移動相:HPLCグレードの水、0.2μmに濾過および脱気
流速:0.6mL/分
カラム温度:80〜85℃、ガードカラム温度<60℃
検出器温度:可能な限り主カラム温度に近い
検出器:屈折率
実行時間:35分間のデータ収集に加え、実行後の15分間(後の溶出化合物のために可能な調節を行う)
Biorad Aminex HPX−87H(炭水化物、酢酸およびエタノール用)
注入容量:濃度および検出器限界に依存して5〜10μL
移動相:0.2μmで濾過され、脱気された0.01N硫酸
流速:0.6mL/分
カラム温度:55℃
検出器温度:可能な限りカラム温度に近づける
検出器:屈折率
実行時間:25〜75分間のデータ収集
実行後、試料中の濃度を各化合物における標準曲線から判定した。
低温前処理後における糖類の弱い可溶化
全粒または粉砕トウモロコシ穂軸(約13kg、乾燥重量基準)をJaygo反応器に負荷した。穂軸を、プレートC−2975を装備するディスクリファイナーに通過させることによって粉砕した(一般的方法)。生産された粉砕穂軸を1.27cmのスクリーンに通過させた。保持された任意の切片を、再びディスクリファイナーに0.5cmのより小さい間隙で通過させた。反応器に真空を適用し、希釈水酸化アンモニウム溶液を注入することで、表3に示すように所望の最終アンモニア濃度(2%もしくは6% NH3重量/乾燥バイオマス重量)および乾燥バイオマスの濃度(30%もしくは40% 乾燥バイオマス重量/全バイオマス−水性アンモニア混合物重量)が得られた。全粒穂軸の場合、初期アンモニア濃度は6%(重量/乾燥バイオマス重量)でありかつ乾燥バイオマス濃度は40%であった。粉砕穂軸の場合、初期アンモニア濃度は2%(重量/乾燥バイオマス重量)でありかつ乾燥バイオマス濃度は30%であった。真空を解放し、全粒トウモロコシ穂軸試料に対して93℃および粉砕トウモロコシ穂軸試料に対して85℃の温度まで浸漬しながら、蒸気をジャケットに適用して穂軸を加熱した。加熱速度を高める目的で、短時間の増加した撹拌器速度(最大96rpm)を適用した。浸漬した穂軸の温度を、32rpmで常に混合しながら、全粒穂軸においては8時間または粉砕穂軸においては4時間保持し、次いで連続混合しながら一晩冷却しておいた。反応器からの前処理バイオマスの除去前、反応器を90℃、真空下に置き、アンモニアを前処理バイオマスから揮散させた。
高温前処理後における糖類の弱い可溶化
実施例1に記載のように調製した粉砕トウモロコシ穂軸(13kg、乾燥基準)をJaygo反応器に負荷した。反応器に対して真空を引いた後、2%アンモニア(wt/wt乾燥バイオマス)および30%バイオマスの乾燥重量濃度を与えるのに適切な強度の水酸化アンモニウム溶液を反応器にポンピングすると共に、室温、32rpmで混合した。次いで、反応器の内容物を、低圧のジャケット蒸気を使用して95℃に加熱した。一旦反応器が95℃に達すると、直接蒸気注入を用いて反応器の内容物を145℃に加熱した。反応器が145℃に達すると、反応器の内容物を、ジャケット蒸気および部分的な直接蒸気注入を用いてその温度で20分間保持した。20分後、反応器に至る通気口上で真空を引き、シュレッダーモーターを5分間作動させた。1時間後、ジャケットに対して冷却水を作動させた。Jaygo反応器の内容物を33℃〜37℃の間に冷却し、次いで反応器をCO2を用いて138kPaまで加圧した。加圧されたCO2雰囲気を30分間維持した。反応器の内容物の最終温度は27℃〜31℃の間であった。浸漬/前処理されたバイオマスのpHは約7.5であった。
前処理液が発酵阻害因子を含有する
一連の前処理を、以下のように(一般的方法に記載の)大型バレルピストン反応器内で実施した。蒸気をバレルのジャケットに添加し、(一般的方法に記載の)大型バレルピストン反応器のバレルを約130℃に予熱した。フラッシュレシーバーをバンドヒーターで約60℃に予熱した。全粒トウモロコシ穂軸を、約0.95cmのジョー間隔を有するジョークラッシャー(2.2kWモーター)、その後にデランパー(delumper)(1.5kWモーター、Franklin Miller Inc.(Livingston,NJ))で加工した後、1.9cmの米国標準スクリーンを装備したSweco製スクリーンでスクリーニングし、全粒穂軸をより小さい断片に粉砕した。これらの粉砕穂軸(175g、乾燥重量基準)を、穂軸をピストンを取り出した反応器の端部に手作業で入れることにより、大型バレルピストン反応器に負荷した。ピストンを元に戻し、端部に差し込んだ。真空を反応容器およびフラッシュレシーバーに適用し、10kPa未満に降圧し、希釈水酸化アンモニウム溶液を反応器に注入し、6g/100gバイオマス乾燥重量のアンモニア濃度および45g/100g全バイオマス−水性アンモニア混合物のバイオマス乾燥重量濃度を得た。一旦アンモニアを負荷すると、蒸気を反応器に注入し、温度を145℃にした。混合物を、温度を監視し、必要に応じて蒸気を添加することにより、この温度で10分間保持し、次いでピストンを駆動することによって予熱したフラッシュタンクに排出した。フラッシュレシーバーが約59℃に達するまでフラッシュタンクに対して真空を引いた。シリーズAにおいては12のかかる前処理を実施し、シリーズBにおいては13のかかる前処理を実施した。固形物を、フラッシュタンクの底部を取り出すことによって採取した。任意の過剰な液体を固形物から排出し、各前処理のシリーズから回収したすべての液体を共にプールした。この液体を、一般的方法に記載のように、糖含有物、酢酸およびアセトアミドについて分析した。表4および5に示されるように、液体は糖類が非常に少ない一方、より多量の酢酸およびアセトアミドを含有した。
除去される液体中に阻害因子を伴う前処理バイオマスからの糖化加水分解物を使用するエタノールの生産
蒸気をバレルのジャケットに添加し、(一般的方法に記載の)大型バレルピストン反応器のバレルを約130℃に予熱した。フラッシュレシーバーをバンドヒーターで約60℃に予熱した。粉砕穂軸を以下のように調製した。全粒トウモロコシ穂軸を、約0.95cmのジョー間隔を有するジョークラッシャー(2.2kWモーター)、その後にデランパー(delumper)(1.5kWモーター、Franklin Miller Inc.(Livingston,NJ))で処理し、その後に1.9cmの米国標準スクリーンを装備するSwecoスクリーンでスクリーニングし、全粒穂軸をより小さい切片に粉砕した。これらの加工済み穂軸(175g、乾燥重量基準)を、穂軸をピストンを取り出した反応器の端部に手作業で入れることにより、大型バレルピストン反応器に装入した。ピストンを元に戻し、端部に差し込んだ。真空を反応容器およびフラッシュレシーバーに適用し、10kPa未満に降圧し、希釈水酸化アンモニウム溶液を反応器に注入し、6g/100gバイオマス乾燥重量のアンモニア濃度および45g/100g全バイオマス−水性アンモニア混合物のバイオマス乾燥重量濃度を得た。一旦、アンモニアを装入すると、蒸気を反応器に注入し、温度を145℃にした。混合物を、温度を監視し、必要に応じて蒸気を添加することにより、この温度で10もしくは20分間保持し、次いでピストンを駆動することによって予熱したフラッシュタンクに排出した。フラッシュレシーバーが約59℃に達するまでフラッシュタンクに対して真空を引いた。遊離液体を、フラッシュレシーバーからの回収時、前処理固形物から分離し、糖化のために再び添加しなかった。合計17のかかる前処理を実施した。4つの前処理から得られる前処理穂軸を糖化のためにプールし、フェドバッチ糖化のための初期加水分解物を提供した。残りの13のランから得られる前処理穂軸をフェドバッチ糖化での使用のためにプールした。
Claims (16)
- 改善された前処理バイオマス生産物を調製するための方法であって、
a)バイオマスを備えるステップと、
b)該バイオマスを適切な条件下でアンモニアを含有する水溶液と接触させ、バイオマス−水性アンモニア混合物を形成することによって前記バイオマスを前処理するステップであって、ここでアンモニアはバイオマス−水性アンモニア混合物のアルカリ性pHを維持するのに少なくとも十分な濃度で存在するが、ここで該アンモニアはバイオマスの乾燥質量に対して12質量パーセント未満で存在し、またさらにここでバイオマスの乾燥質量はバイオマス−水性アンモニア混合物の質量に対して少なくとも15質量パーセントの高固体濃度であり、それにより前処理バイオマス固体生産物ならびに酢酸およびアセトアミドからなる群より選択される1つもしくはそれ以上のインヒビター化合物を含むバイオマス前処理液が形成されるステップと、
c)該バイオマス前処理液を除去するステップと、
を含み、ここで前処理バイオマス固体生産物は低減された量のインヒビター化合物しか有せず、かつ糖含有物が10%を超えて低下しない、方法。 - 次の様式、すなわち
i)ステップ(b)の前
ii)ステップ(b)における追加的成分として、または
iii)ステップ(b)の後の洗浄ステップとして
の中の1つもしくはそれ以上において追加的水性成分を添加するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 追加的水性成分が蒸気、水、および緩衝液からなる群から選択される請求項2に記載の方法。
- 水性成分が蒸気であり、かつステップ(b)における追加的成分として添加され、ここで蒸気は前処理の間に部分凝縮し、バイオマス前処理液の一部を形成する請求項3に記載の方法。
- 前処理バイオマス固体生産物を糖化し、発酵性糖を形成するステップをさらに含む請求項1に記載の方法。
- 請求項5に記載の糖類を発酵し、標的化学物質を生産させるステップをさらに含む請求項5に記載の方法。
- バイオマス−水性アンモニア混合物のpHが8より大きい請求項1に記載の方法。
- バイオマスとアンモニアを含有する水溶液とを接触させる前に真空がバイオマスに適用される請求項1に記載の方法。
- バイオマスの乾燥質量が、バイオマス−水性アンモニア混合物の質量に対して少なくとも15%〜80%の高固体濃度である請求項1に記載の方法。
- アンモニアがバイオマスの乾燥質量に対して10質量パーセント未満で存在する請求項1に記載の方法。
- バイオマスが、スイッチグラス、紙くず、製紙汚泥、トウモロコシ粒、トウモロコシ穂軸、トウモロコシの皮、コーンストーバー、トウモロコシ繊維、草、小麦、麦かん、乾草、大麦、大麦わら、稲わら、サトウキビバガス、モロコシ、大豆、穀物の加工から得られる成分、木、枝、根、葉、ウッドチップ、おがくず、低木およびブッシュ、野菜、果物、花、ならびに動物糞尿からなる群から選択される請求項1に記載の方法。
- バイオマスが、トウモロコシ穂軸、コーンストーバー、トウモロコシ繊維、トウモロコシの皮、サトウキビバガス、おがくず、スイッチグラス、麦かん、乾草、稲わら、および草からなる群から選択される請求項11に記載の方法。
- バイオマスが複数の供給原料から得られる請求項1に記載の方法。
- (b)が4℃〜200℃の温度で行なわれる請求項1に記載の方法。
- (b)が75℃〜150℃の温度で行なわれる請求項11に記載の方法。
- (b)が90℃より高く〜150℃の温度で行なわれる請求項12に記載の方法。
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