BRPI0815262B1

BRPI0815262B1 - Metodo para a preparação de um produto de biomassa pre-tratada aprimorado

Info

Publication number: BRPI0815262B1
Application number: BRPI0815262-4A
Authority: BR
Inventors: Marie Hennessey Susan; Friend Julie; T. Elander Richard; P. Tucker Melvin Iii
Original assignee: E.I. Du Pont De Nemours And Company
Priority date: 2007-08-22
Filing date: 2008-08-18
Publication date: 2018-01-16
Also published as: CN104911228B; ES2487511T3; CN104911228A; BRPI0815262A2; WO2009045654A2; EP2179085A2; CA2693128C; US20090053770A1; CA2693128A1; JP5352589B2; WO2009045654A3; PL2179085T3; US8445236B2; AU2008307307B2; JP2010536376A; EP2179085B1; AU2008307307A1; CN101802299A

Description

(54) Título: MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE UM PRODUTO DE BIOMASSA PRE-TRATADA APRIMORADO (51) lnt.CI.: D21C 3/02; C12P 19/02; C13K 1/02; C12P 7/10 (30) Prioridade Unionista: 22/08/2007 US 11/843,157 (73) Titular(es): E.l. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY. ALLIANCE FOR SUSTAINABLE ENERGY LLC (72) Inventor(es): SUSAN MARIE HENNESSEY; JULIE FRIEND; RICHARD T. ELANDER; MELVIN P. TUCKER III

1/40 “MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE UM PRODUTO DE BIOMASSA PRÉTRATADA APRIMORADO”

Declaração dos Direitos Governamentais [001] A presente invenção foi realizada com o suporte do governo dos Estados Unidos da América sob Contrato de número 04-03-CA70224 e DE FC36-03GO13146 concedido pelo Departamento de Energia. O governo possui determinados direitos sobre a presente invenção.

Campo da Invenção [002] A presente invenção apresenta um método para a produção de um produto de biomassa pré-tratada aprimorado para a utilização na sacarificação para produzir um hidrolisado de alto teor de açúcar. Especificamente, o produto de biomassa pré-tratado derivado a partir da utilização do presente método possui menos inibidores da sacarificação e/ou fermentação.

Antecedentes da Invenção [003] As matérias-primas e os resíduos celulósicos e lignocelulósicos, tais como resíduos agrícolas, madeira, resíduos de silvicultura, lodo da fabricação de papel e resíduos sólidos industriais e municipais, fornecem uma matéria-prima de grande potencial de renovação para a produção de produtos de valor, tais como combustíveis e outras substâncias químicas. As matérias-primas e os resíduos celulósicos e lignocelulósicos, compostos de polímeros de carboidratos que compreendem a celulose, hemicelulose, glicanos e a lignina são, em geral, tratados por uma variedade de meios químicos, mecânicos e enzimáticos para liberar principalmente os açúcares de hexose e de pentose, que podem ser fermentados em produtos úteis.

[004] Em primeiro lugar, as matérias-primas de biomassa são tratadas de forma a tornar os polímeros de carboidratos de materiais

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2/40 celulósicos e lignocelulósicos mais facilmente acessíveis às enzimas de sacarificação, que é muitas vezes denominado pré-tratamento. A biomassa pré-tratada é, então, hidrolisada na presença das enzimas de sacarificação para a liberação dos oligossacarídeos e/ou monossacarídeos em um hidrolisado. As enzimas de sacarificação utilizadas para a produção de açúcares fermentáveis a partir da biomassa pré-tratada normalmente incluem uma ou mais glicosidases, tais como as glicosidases que hidrolisam a celulose, as glicosidases que hidrolisam a hemicelulose e as glicosidases que hidrolisam o amido, bem como as peptidases, lipases, ligninases e/ou esterases de feruloíla. As enzimas de sacarificação e os métodos para o tratamento da biomassa são revistos por Lynd, L. R., et al., (Microbiol. Mol. Biol. Rev. (2002) 66: 506 a 577).

[005] Durante o pré-tratamento da biomassa, os diferentes componentes da celulose, hemicelulose e lignina podem ser liberados, que podem incluir açúcares e/ou subprodutos, incluindo compostos como o ácido acético, ácido fórmico, ácido levulínico, furaldeídos e compostos fenólicos. Alguns dos subprodutos são inibidores na medida em que afetam as atividades das enzimas sacarificação e/ou o crescimento e o metabolismo dos microrganismos utilizados na fermentação subseqüente. Estes inibidores podem reduzir as eficiências dos processos de sacarificação e/ou fermentação. Algumas tentativas foram realizadas para remover ditos inibidores com etapas adicionais, tais como a coleta de açúcares, criando assim um pré-hidrolizado. Estas medidas são insatisfatórias, porque não são econômicas e resultam na menor produção de açúcares.

[006] Portanto, há uma necessidade por um método de prétratamento que produz a biomassa pré-tratada com retenção máxima de açúcares e presença mínima de inibidores, sem formar um fluxo de açúcar de pré-tratamento separado (pré-hidrolisado). Isto proporcionaria uma entrada de

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3/40 biomassa mais econômica e eficaz para utilização na sacarificação seguido pela fermentação para a produção de produtos úteis.

Descrição Resumida da Invenção [007] A presente invenção apresenta um método para a preparação de um produto de biomassa pré-tratada aprimorado, que compreende:

(a) fornecer uma biomassa;

(b) pré-tratar a dita biomassa através do contato da dita biomassa, em condições adequadas, com uma solução aquosa que compreende a amônia para formar uma mistura de biomassa - amônia aquosa, em que a amônia está presente em uma concentração pelo menos suficiente para manter o pH alcalino da mistura de biomassa - amônia aquosa, mas onde a dita amônia está presente em menos de cerca de 12% em peso em relação ao peso seco da biomassa, e ainda onde o peso seco da biomassa está em uma alta concentração de sólidos de pelo menos cerca de 15% em peso em relação ao peso da mistura de biomassa - amônia aquosa, de modo que um produto de sólidos de biomassa pré-tratada e um liquor de pré-tratamento de biomassa pré-tratada que compreende um ou mais compostos inibidores é formado; e (c) remover dito líquido de pré-tratamento de biomassa;

- em que o produto de sólidos de biomassa pré-tratada possui uma quantidade reduzida de compostos inibidores e redução não substancial do teor de açúcar.

[008] Em outros aspectos, o método ainda compreende a adição de mais um componente aquoso em uma ou mais das seguintes formas:

(i) antes da etapa (b);

(ii) como um componente adicional na etapa (b); ou (III) após a etapa (b) como uma etapa de lavagem.

[009] Além disso, o produto sólido da biomassa pré-tratada pode

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4/40 ser sacarificado para formar um hidrolisado de açúcares que pode então ser fermentado para produzir uma substância química alvo.

[0010] Outros aspectos da presente invenção são a biomassa, que foi pré-tratada de acordo com o presente método, e o hidrolisado produzido pela sacarificação da biomassa que foi pré-tratada com o presente método. No entanto, outros aspectos são as substâncias químicas alvo produzidas pela fermentação biocatalítica do hidrolisado produzido pela sacarificação da biomassa que foi pré-tratada com o presente método.

[0011] A biomassa se refere a qualquer material celulósico ou lignocelulósico, por exemplo, culturas bioenergéticas, resíduos agrícolas, resíduos sólidos urbanos, resíduos sólidos industriais, resíduos de jardim, madeira, resíduos florestais e suas combinações. A solução aquosa que compreende a amônia pode ser derivada do gás amônia, hidróxido de amônio, ureia, e suas combinações. A solução aquosa que compreende a amônia pode incluir pelo menos uma base adicional. Além disso, no presente método, o vácuo pode ser aplicado à biomassa antes da biomassa entrar em contato com uma solução aquosa que compreende a amônia. A amônia também pode ser removida antes da etapa (c); a amônia pode ser reciclada de volta para o reator de pré-tratamento. A amônia e a biomassa podem reagir no presente método a uma temperatura entre cerca de 4^SC e 200^sC. Um agente de amolecimento plastificante ou uma combinação do mesmo pode ser utilizado no presente método. Além disso, a energia pode ser aplicada à biomassa antes, durante ou após a etapa (a) a fim de reduzir o tamanho, aumentar a área de superfície exposta e/ou aumentar a acessibilidade à amônia aquosa ou às enzimas de sacarificação.

Descrição Detalhada da Invenção [0012] O Depositante incorpora especificamente todo o conteúdo de todas as referências citadas no presente relatório descritivo. Além disso,

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5/40 quando uma quantidade, concentração ou outro valor ou parâmetro é dado como um intervalo, intervalo preferido ou uma lista de valores superiores preferíveis e valores inferiores preferíveis, este deve ser entendido como a descrição especifica de todos os intervalos formados a partir de qualquer par de qualquer limite de intervalo ou valor superior preferido e qualquer limite de intervalo ou valor inferior preferido, independentemente se os intervalos são descritos separadamente. Quando um intervalo de valores numéricos é citado neste documento, salvo indicação em contrário, o intervalo pretende incluir seus pontos finais, e todos os números inteiros e frações dentro do intervalo. Não se pretende que o escopo da presente invenção seja limitado aos valores específicos citados na definição de um intervalo.

[0013] A presente invenção apresenta um método para o prétratamento da biomassa que reduz a quantidade de inibidores em um produto de biomassa pré-tratada. Devido à reduzida presença de inibidores, os processos de sacarificação e fermentação para a produção de produtos de valor a partir de dita biomassa são mais eficientes. O uso eficiente da biomassa renovável, incluindo os resíduos de biomassa, para produzir produtos químicos de valor pode diminuir a necessidade do petróleo.

Definições [0014] No presente relatório descritivo, uma série de termos são utilizados. As seguintes definições são fornecidas:

[0015] O termo “açúcar fermentável” ou “açúcares” se refere aos oligossacarídeos e monossacarídeos que podem ser utilizados como fontes de carbono por um microorganismo em um processo de fermentação.

[0016] O termo “lignocelulósico” se refere a uma composição que compreende tanto a lignina e a celulose. O material lignocelulósico também pode compreender a hemicelulose.

[0017] O termo “celulósico” se refere a uma composição que

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6/40 compreende a celulose.

[0018] Por “peso seco” de biomassa entende-se o peso da biomassa que possui toda ou essencialmente toda a água retirada. O peso seco é normalmente medido de acordo com a American Society for Testing and Materials (ASTM) Norma E1756-01 (Standard Test Method for Determination of Total Solids in Biomass) ou Technical Association of the Pulp and Paper Industry, Inc. (TAPPI) Norma T-412 om-02 (Moisture in Pulp, Paper and Paperboard).

[0019] Os termos “plastificante” e “agente de amolecimento” se referem aos materiais que causam uma redução nas forças intermoleculares coesas ao longo ou entre as cadeias poliméricas. Esses materiais podem agir, por exemplo, para diminuir a cristalinidade ou interromper ligações entre as fibras de carboidratos de lignina e não-lignina (por exemplo, celulose e hemicelulose).

[0020] O termo “sacarificação” se refere à produção de açúcares fermentáveis a partir dos polissacarídeos.

[0021] Os termos “tratar” e “pré-tratar” em relação à biomassa estão relacionados da seguinte maneira. A biomassa é tratada com o reagente para formar um produto de biomassa tratada, que também pode ser referido como tratamento para formar a biomassa pré-tratada ou pré-tratamento para formar a biomassa pré-tratada. A utilização do “pré” distingue o tratamento da biomassa, que é anterior à sacarificação da biomassa.

[0022] O termo “biomassa pré-tratada” significa a biomassa que foi submetida ao pré-tratamento antes da sacarificação. Os processos de prétratamento são descritos com detalhes abaixo.

[0023] “Biomassa” se refere a qualquer material celulósico ou lignocelulósico e inclui os materiais que compreendem celulose e, opcionalmente, compreendem ainda a hemicelulose, lignina, amido,

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7/40 oligossacarídeos e/ou monossacarídeos. A biomassa também pode compreender os componentes adicionais, tais como proteína e/ou lipídio. De acordo com a presente invenção, a biomassa pode ser derivada a partir de uma única fonte, ou a biomassa pode compreender uma mistura derivada de mais de uma fonte; por exemplo, a biomassa poderia compreender uma mistura de espigas de milho e forragem ou fibra de milho ou uma mistura de grama e folhas. A biomassa inclui, mas não está limitada a culturas bioenergéticas, resíduos agrícolas, resíduos sólidos urbanos, resíduos sólidos industriais, lodo da fabricação de papel, resíduos de depósitos, resíduos de madeira e de silvicultura. Os exemplos de biomassa incluem, mas não estão limitados a, grãos de milho, espigas de milho, resíduos de plantação, tais como cascas de milho, forragem de milho, fibra de milho, gramas, trigo, palha de trigo, cevada, palha de cevada, feno, palha de arroz, grama do gênero Panicum, resíduos de papéis, bagaço da cana de açúcar, sorgo, soja, componentes obtidos a partir do processamento de grãos, árvores, galhos, raízes, folhas, aparas de madeira, serragem, arbusto e moitas, vegetais, frutas, flores e esterco de animal ruminante. Em uma realização, a biomassa que é útil para a presente invenção inclui a biomassa que possui um valor de carboidrato relativamente alto, é relativamente denso, e/ou é relativamente fácil de coletar, transportar, armazenar e/ou manipular. Em uma realização da presente invenção, a biomassa que é útil inclui as espigas de milho, as forragens de milho, as fibras de milho e o bagaço da cana de açúcar.

[0024] Para o propósito da presente invenção, uma “solução aquosa que compreende amônia” se refere ao uso do gás amônia (NH3), os compostos compreendem íons amônio (NH4+), tal como o hidróxido de amônio ou o sulfato de amônio, os compostos que liberam amônia na degradação, tais como ureia, e suas combinações, em um meio aquoso.

[0025] Um “consórcio de enzima” para sacarificação é uma

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8/40 combinação de enzimas que são capazes de agir em uma mistura de biomassa para produzir açúcares fermentáveis. Normalmente, um consórcio de enzima de sacarificação pode compreender uma ou mais glicosidases; as glicosidases podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste em glicosidases que hidrolisam a celulose, glicosidases que hidrolisam a hemicelulose e glicosidases que hidrolisam o amido. Outras enzimas no consórcio de enzima de sacarificação podem incluir as peptidases, lipases, ligninases e esterases de feruloíla.

[0026] O pré-tratamento da biomassa de concentração elevada com baixa concentração de amônia aquosa é descrito no pedido de patente de co-propriedade e pendente US 2007/0031918 A1. Os Depositantes revelaram de modo surpreendente que os inibidores da sacarificação e/ou fermentação são liberados a partir da biomassa que é pré-tratada utilizando o método do documento US 2007/0031918 A1, enquanto os açúcares pequenos são liberados. Os açúcares que são liberados são considerados insubstanciais. Por exemplo, uma perda de açúcar insubstancial é de cerca de 0,0% até cerca de 10%, ou cerca de 0,01%, 0,02%, 0,04%, 0,06%, 0,07%, ou 0,09%. Os inibidores são componentes solúveis de uma fração líquida que pode ser separada dos sólidos da biomassa pré-tratada. A retirada do líquido remove os inibidores e não reduz substancialmente a produção de açúcar, produzindo desta forma um melhor produto de biomassa pré-tratada.

Pré-tratamento com Baixo Teor de Amônia Aquosa [0027] No pré-tratamento com baixo teor de amônia aquosa utilizado no presente método, a concentração de amônia é minimamente uma concentração que é suficiente para manter alcalino o pH da mistura de biomassa - amônia aquosa e no máximo inferior a cerca de 12% em peso em relação ao peso seco da biomassa. Esta baixa concentração de amônia é suficiente para o pré-tratamento, e a baixa concentração também poderá ser

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9/40 inferior a cerca de 10% em peso em relação ao peso seco da biomassa. Uma concentração muito baixa de 6% de amônia em relação ao peso seco da biomassa, ou menos, também pode ser utilizada para o pré-tratamento. Por alcalino entende-se um pH superior a 7,0. Particularmente adequado é um pH da mistura de biomassa - amônia aquosa, que é superior a 8. Em uma realização, a amônia está presente em menos de cerca de 10% em peso em relação ao peso seco da biomassa. Particularmente adequada é a amônia inferior a cerca de 6% em peso em relação ao peso seco da biomassa.

[0028] A solução aquosa que compreende a amônia pode opcionalmente compreender pelo menos uma base adicional, tal como o hidróxido de sódio, carbonato de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de potássio, hidróxido de cálcio e carbonato de cálcio. Pelo menos uma base adicional pode ser adicionada em uma quantidade que é combinada com o amônio para formar uma quantidade de base total que é inferior a cerca de 20% em peso em relação ao peso seco da biomassa. De preferência, a segunda base total mais a amônia está em uma quantidade que é inferior a cerca de 15% em peso. A(s) base(s) adicional(is) pode(m) ser utilizada(s), por exemplo, para neutralizar os ácidos na biomassa, para fornecer íons metálicos para as enzimas de sacarificação, ou para fornecer íons metálicos para o meio de crescimento da fermentação.

[0029] No presente método, o peso seco da biomassa está em uma concentração inicial de pelo menos cerca de 15% em peso da mistura de biomassa - amônia aquosa. Normalmente, o peso seco da biomassa está em uma concentração inicial de pelo menos cerca de 15% a cerca de 80% em peso da mistura de biomassa - amônia aquosa. Em outro aspecto, o peso seco da biomassa está em uma concentração de pelo menos cerca de 15% a cerca de 60% em peso da mistura de biomassa - amônia aquosa. A porcentagem de biomassa na mistura de biomassa - amônia aquosa é mantida alta para

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10/40 minimizar a necessidade da concentração de açúcares resultantes da sacarificação da biomassa pré-tratada, para a utilização na fermentação. A alta concentração de biomassa também reduz o volume total do material de prétratamento, tornando o processo mais econômico.

[0030] A biomassa pode ser utilizada diretamente conforme obtida a partir da fonte, ou a energia pode ser aplicada à biomassa para reduzir o tamanho, aumentar a área de superfície exposta e/ou aumentar a disponibilidade de celulose, hemicelulose e/ou oligossacarídeos presentes na biomassa com amônia e com as enzimas de sacarificação utilizadas para produzir açúcares a partir da biomassa pré-tratada. A energia significa meios úteis para reduzir o tamanho, aumentando a área de superfície exposta e/ou aumentando a disponibilidade da celulose, hemicelulose e/ou oligossacarídeos presentes na biomassa com amônia e com as enzimas de sacarificação incluem, mas não estão limitados a moagem, esmagamento, trituração, corte fino, corte, refinamento em disco, ultra-som e microondas. Esta aplicação de energia pode ocorrer antes, durante ou após o pré-tratamento.

[0031] O pré-tratamento da biomassa com uma solução com baixo teor de amônia aquosa é realizado em qualquer recipiente adequado. Normalmente, o recipiente é um que pode suportar a pressão, possui um mecanismo de aquecimento e possui um mecanismo para misturar os conteúdos. Os recipientes comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, o reator Zipperclave® (Autoclave Engineers, Erie, PA), o reator Jaygo (descrito nos Métodos Gerais; Jaygo Manufacturing, Inc., Mahwah, NJ), e um reator de pistola de vapor (descrito nos Métodos Gerais; Autoclave Engineers, Erie, PA). Os reatores de escala muito maior com capacidades similares podem ser utilizados. Alternativamente, a solução de biomassa e amônia pode ser combinada em um recipiente, em seguida, transferida para outro reator. Do mesmo modo, a biomassa pode ser pré-tratada em um recipiente, então

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11/40 processada posteriormente em outro reator, tal como um reator de pistola de vapor (descrito nos Métodos Gerais; Autoclave Engineers, Erie, PA). Um aparelho particularmente apropriado que pode ser utizado é descrito no pedido de patente de co-propriedade e provisório US CL 3949, e um sistema para o pré-tratamento da amônia de baixo teor utilizando o aparelho de CL 3949 é descrito no pedido de patente de co-propriedade e provisório US CL 3950.

[0032] Antes de colocar a biomassa em contato com uma solução aquosa que compreende a amônia, um vácuo pode ser aplicado ao recipiente contendo a biomassa. Ao evacuar o ar dos poros da biomassa, pode ser obtida uma melhor penetração da amônia na biomassa. O período de tempo para a aplicação do vácuo e a quantidade de pressão negativa que é aplicada à biomassa irá depender do tipo de biomassa e pode ser determinada empiricamente, de modo a obter o pré-tratamento ótimo da biomassa (conforme medido pela produção de açúcares fermentáveis seguinte à sacarificação).

[0033] O contato da biomassa com uma solução aquosa que compreende a amônia é realizado a uma temperatura de cerca de 4^SC a cerca de 200^sC. O contato inicial da biomassa com a amônia a 4^SC, permitindo a impregnação nesta temperatura, pode aumentar a eficiência da sacarificação com relação à biomassa nativa não pré-tratada. Em outra realização, dito contato da biomassa é realizado a uma temperatura de cerca de 75^SC a cerca de 150^sC. Ainda em outra realização, dito contato da biomassa é realizado de uma temperatura superior a 90^sC a cerca de 150^sC.

[0034] O contato da biomassa com uma solução aquosa que compreende a amônia é realizado por um período de tempo até cerca de 25 horas. Períodos mais longos de pré-tratamento são possíveis, porém, um período de tempo mais curto pode ser preferível por razões práticas e econômicas. Tipicamente, em um período de tratamento de contato com

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12/40 amônia é de cerca de 8 horas ou menos.

[0035] Em uma realização, o processo de pré-tratamento pode ser realizado em uma temperatura relativamente elevada durante um período de tempo relativamente curto, por exemplo, de cerca de 100^sC a 150^sC por cerca de 5 minutos a cerca de 2 horas. Em outra realização, o processo de prétratamento pode ser realizado em uma menor temperatura durante um período de tempo relativamente longo, por exemplo, de cerca de 75^SC a cerca de 100^sC por cerca de 2 h a cerca de 8 horas. Em ainda outra reallização, o processo de pré-tratamento pode ser realizado à temperatura ambiente (cerca de 22^SC a 26^SC) por um período de tempo ainda mais longo de cerca de 24 h. Outras combinações de temperatura e tempo intermediárias a estes também podem ser utilizadas.

[0036] Para o processo de pré-tratamento, as “condições adequadas”, tais como a temperatura, tempo de contato com a amônia, concentração de amônia, concentração de uma ou mais bases adicionais, concentração de biomassa, tipo de biomassa e tamanho de partícula da biomassa estão relacionados; assim, essas variáveis podem ser ajustadas conforme necessário para obter um produto ideal.

[0037] Um plastificante, agente de amolecimento, ou a combinação dos mesmos, tais como os polióis (por exemplo, glicerol, etileno glicol), ésteres de polióis (por exemplo, glicerol monoacetato), éteres de glicol (por exemplo, dietileno glicol), acetamida, etanol e etanolamina, pode ser adicionado no processo de pré-tratamento (ou seja, etapa (a)). Um plastificante pode ser adicionado como um componente da solução aquosa de amônia, como uma solução independente, ou como um componente seco.

[0038] O pré-tratamento ou a reação de pré-tratamento pode ser realizada em qualquer recipiente adequado, como um reator em batelada ou um reator contínuo. Um técnico no assunto irá reconhecer que em maiores

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13/40 temperaturas (acima de 100^sC), um recipiente de pressão é necessário. O recipiente adequado pode ser equipado com meios, tais como rotores, para agitar a mistura de biomassa - amônia aquosa. O projeto do reator é discutido em Lin, K. H., e Van Ness, HC (em Perry, RH e Chilton, CH (eds.), Chemical Engineer's Handbook, 5^ã edição (1973) Capítulo 4, McGraw-Hiil, NY). A reação de pré-tratamento pode ser realizada como um processo em batelada, ou como um processo contínuo.

[0039] É bem conhecido pelo técnico no assunto que uma fonte de nitrogênio é necessária para o crescimento de microrganismos durante a fermentação; portanto, a utilização de amônia durante o pré-tratamento fornece uma fonte de nitrogênio e reduz ou elimina a necessidade de completar o meio de crescimento utilizado durante a fermentação com uma fonte de nitrogênio. Se o pH do produto pré-tratado exceder aquele em que as enzimas de sacarificação são ativas, ou exceder o intervalo adequado para o crescimento microbiano na fermentação, ácidos podem ser utilizados para reduzir o pH. A quantidade de ácido utilizada para atingir o pH desejado pode resultar na formação de sais em concentrações que inibem as enzimas de sacarificação ou o crescimento microbiano. A fim de reduzir a quantidade de ácido necessário para atingir o pH desejado e reduzir o custo das matérias-primas de NH3 no presente processo de pré-tratamento, o gás amônia pode ser evacuado do reator de pré-tratamento e reciclado. Normalmente, pelo menos uma parte da amônia é removida, o que reduz o pH, mas deixa um pouco de nitrogênio que fornece este nutriente para a utilização na fermentação subseqüente.

Liberação e Remoção de Inibidores [0040] Os Depositantes revelaram de modo surpreendente que os inibidores são liberados a partir de biomassa reagida com baixo teor de amônia aquosa, enquanto poucos açúcares são liberados. Os inibidores são

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14/40 compostos que são prejudiciais à sacarificação e/ou fermentação, por isso é desejável reduzir a quantidade de inibidores presentes em um produto de biomassa pré-tratada. Os inibidores foram encontrados como componentes solubilizados de uma fração líquida, que estava presente, juntamente com os sólidos seguinte à reação da biomassa e da amônia aquosa de baixo teor. Esta fração líquida contendo inibidores forma um líquido de pré-tratamento da biomassa. A remoção do líquido de pré-tratamento da biomassa a partir dos sólidos resulta na eliminação dos inibidores liberados, deixando um produto de biomassa sólida pré-tratada, que reduziu a composição inibidora sem perda substancial de açúcares.

[0041] Este fato está em contraste com outros tipos de processos de pré-tratamento (tais conforme descritos nos documentos US 5.705.369, US 2005/161.038 e US 2004/0.016.525) onde os açúcares solúveis substanciais são liberados durante o pré-tratamento. Nesses processos, o líquido é geralmente coletado como um açúcar contendo um pré-hidrolisado e utilizado na fermentação. Portanto, se os inibidores também forem liberados no líquido, não há nenhuma maneira simples de remover estes inibidores sem perder também os açúcares. Os métodos que envolvem separações de soluto seriam necessários, que são caros, tais como a cromatografia.

[0042] No presente método, o líquido em que os inibidores liberados são dissolvidos para formar o líquido de pré-tratamento da biomassa é um componente aquoso que pode ser produzido de maneiras diferentes. O componente aquoso pode ser adicionado em qualquer estágio do processo de pré-tratamento. O componente aquoso pode ser qualquer componente à base de água que é adicionado antes, durante ou depois da adição de amônia. Por exemplo, quando a biomassa é pré-tratada em uma concentração de sólidos de cerca de 15% em peso em relação ao peso da mistura de biomassa e amônia aquosa, a água pode ser adicionada à biomassa antes da adição de amônia

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15/40 aquosa ou a amônia aquosa pode ser diluída o suficiente para atingir a concentração final de biomassa de 15%. Em ambos os casos, nesta concentração é provável que uma fração líquida esteja presente na mistura de biomassa e amônia aquosa. O líquido também pode estar presente quando a biomassa for de 20% em peso ou ainda maior, dependendo do tipo de biomassa sendo pré-tratada. Se o vapor for adicionado para aumentar a temperatura da mistura de biomassa e amônia aquosa, a condensação parcial do vapor pode fornecer o componente aquoso adicionado. A quantidade de vapor adicionado e a quantidade de condensação que leva a uma fração de líquido irão depender de fatores como a temperatura inicial da biomassa, amônia aquosa, e o recipiente de reação, bem como a temperatura final de prétratamento. Um técnico no assunto irá determinar facilmente a contribuição do vapor condensado nas condições utilizadas. Alternativamente ou em adição, pode haver uma etapa de lavagem onde, por exemplo, a água é adicionada à biomassa após a reação com amônia aquosa e os inibidores liberados solubilizam nesta água adicionada.

[0043] Os inibidores solubilizados podem ser quaisquer compostos prejudiciais à sacarificação e/ou fermentação que são liberados a partir da biomassa tratada com baixo teor de amônia aquosa. Uma parcela substancial de ácido acético, que é um inibidor da fermentação, e acetamida estavam presentes no líquido de pré-tratamento da biomassa. Estes compostos foram encontrados no líquido em um nível que representa cerca de 10% da quantidade teórica de ácido acético e acetamida que potencialmente poderíam ser liberados a partir da amostra de biomassa. O ácido acético e a acetamida são potentes inibidores do crescimento de alguns tipos de células bacterianas. Por exemplo, o ácido acético é um inibidor da E. coli, que geralmente é cultivada em fermentações de produção. Outro exemplo é a Zymomonas, uma bactéria utilizada na fermentação para a produção de etanol.

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16/40 [0044] O líquido de pré-tratamento da biomassa pode ser removido para separá-lo dos sólidos de pré-tratamento pelos métodos bem conhecidos pelos técnicos no assunto, tal como a drenagem, decantação, centrifugação, aspiração e/ou filtração. Além disso, a biomassa pode ser prensada para a liberação de líquidos para a sua remoção. Ao prensar a biomassa para remover o líquido, é preferível não compactar a biomassa para permitir um melhor desempenho durante a sacarificação.

[0045] Após a remoção do líquido de pré-tratamento da biomassa, o produto de biomassa pré-tratada restante é utilizado na sacarificação, ou na sacarificação e fermentação simultânea (SSF). A fim de obter quantidades suficientes de açúcares a partir da biomassa, a biomassa pode ser pré-tratada com uma solução aquosa de amônia uma vez ou mais de uma vez. Da mesma forma, uma reação de sacarificação pode ser realizada uma ou várias vezes. Ambos os processos de sacarificação e pré-tratamento podem ser repetidos, se desejar obter rendimentos mais elevados de açúcares. Para avaliar o desempenho dos processos de pré-tratamento e sacarificação, separadamente ou em conjunto, o rendimento teórico de açúcares derivado da biomassa de partida pode ser determinado e comparado aos rendimentos medidos.

Sacarificação [0046] A biomassa pré-tratada aprimorada preparada de acordo com o presente método é ainda hidrolisada na presença de um consórcio de enzimas de sacarificação para a liberação de oligossacarídeos e/ou monossacarídeos em um hidrolisado. As enzimas de sacarificação e os métodos para o tratamento da biomassa são revistos por Lynd, L. R., et al., (Microbiol. Mol. Biol. Rev. (2002) 66: 506 a 577).

[0047] Antes de sacarificação, a biomassa pré-tratada pode ser tratada de modo a alterar o pH, a composição ou a temperatura de tal forma que as enzimas do consórcio de enzima de sacarificação serão ativas. O pH

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17/40 pode ser alterado por meio da adição de ácidos ou bases na forma sólida ou líquida. Alternativamente, o dióxido de carbono (CO2), que pode ser recuperado a partir da fermentação, pode ser utilizado para diminuir o pH. Por exemplo, o CO2 pode ser coletado a partir de um fermentador e alimentado no headspace (espaço vazio) do produto de pré-tratamento no tanque de expansão ou borbulhado através da biomassa pré-tratada se o líquido adequado estiver presente enquanto monitora o pH, até o pH desejado ser obtido. A temperatura pode ser levada a uma temperatura que seja compatível com a atividade enzimática de sacarificação, tal conforme indicado abaixo. Quaisquer co-fatores necessários para a atividade das enzimas utilizadas na sacarificação podem ser adicionados.

[0048] O consórcio da enzima de sacarificação compreende uma ou mais enzimas selecionadas principalmente, mas não exclusivamente, a partir do grupo das “glicosidases”, que hidrolisam as ligações de éter di-, oligoe polissacarídeos e são encontradas na classificação da enzima EC 3.2.1.x (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego, Califórnia, com (1993) Suplemento 1, Suplemento 2 (1994), Suplemento 3 (1995, Suplemento 4 (1997) e Suplemento 5 [em Eur. J. Biochem. (1994) 223: 1 a 5, Eur. J. Biochem. (1995) 232: 1 a 6, Eur. J. Biochem. (1996) 237: 1 a 5, Eur. J. Biochem. (1997) 250: 1 a 6 e Eur. J. Biochem. (1999) 264: 610 a 650, respectivamente]) do grupo geral das “hidrolases” (EC 3). As glicosidases úteis no presente método podem ser classificadas pelo componente da biomassa que elas hidrolisam. As glicosidases úteis para o presente método incluem as glicosidases que hidrolisam a celulose (por exemplo, celulases, endoglicanases, exoglicanases, celobiohidrolases, β-glicosidases), glicosidases que hidrolisam a hemicelulose (por exemplo, xilanases, endoxilanases, exoxilanases, β-xilosidases, arabinoxilanases, mannases, galactases, pectinases, glicuronidases), e glicosidases que hidrolisam o amido (por

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18/40 exemplo, amilase, α-amilase, β-amilases, glicoamilases, a-glicosidases, isoamilases). Além disso, pode ser útil adicionar outras atividades no consórcio de enzima de sacarificação, tais como as peptidases (CE 3.4.xy), lipases (EC 3.1.1.x e 3.1.4.x), ligninases (CE 1.11.1.x) e esterases de feruloíla (EC 3.1.1.73) para ajudar na liberação de polissacarídeos dos outros componentes da biomassa. É bem conhecido no estado da técnica que os microorganismos que produzem as enzimas que hidrolisam os polissacarídeos frequentemente apresentam uma atividade, tais como de degradação da celulose, que é catalisada por várias enzimas, ou um grupo de enzimas com diferentes especificidades ao substrato. Portanto, uma “celulase” de um microorganismo pode compreender um grupo de enzimas, todas as quais podem contribuir para a atividade de degradação da celulose. As preparações de enzimas comerciais ou não comerciais, tais como celulases, podem compreender diversas enzimas, dependendo do esquema de purificação utilizado para obter a enzima. Assim, o consórcio de enzima de sacarificação do presente método pode compreender a atividade enzimática, tais como “celulase”, porém reconhece-se que essa atividade pode ser catalisada por mais de uma enzima.

[0049] As enzimas de sacarificação podem ser obtidas comercialmente, tal como a celulase Spezyme® CP (Genencor International, Rochester, NY) e a xilanase Multifect® (Genencor). Além disso, as enzimas de sacarificação podem ser produzidas biologicamente, incluindo o uso de microrganismos recombinantes.

[0050] Um técnico no assunto saberia como determinar a quantidade eficaz de enzimas para o uso em consórcio e ajustar as condições para a atividade ideal da enzima. Um técnico no assunto, também sabe como otimizar as classes de atividades das enzimas necessárias dentro do consórcio para obter a sacarificação ideal de um dado produto de pré-tratamento nas condições selecionadas.

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19/40 [0051] De preferência, a reação de sacarificação é realizada em ou perto da temperatura e pH ótimo para as enzimas sacarificação. A temperatura ótima utilizada com o consórcio da enzima de sacarificação nos intervalos do presente método de cerca de 15^SC a cerca de 100^sC. Em outra realização, a temperatura ideal varia de cerca de 20^sC a cerca de 80^sC. O pH ótimo pode variar de cerca de 2 até cerca de 11. Em outra realização, o pH ótimo utilizado com o consórcio de enzima de sacarificação no presente método varia de cerca de 4 a cerca de 10.

[0052] A sacarificação pode ser realizada por um período de tempo de cerca de alguns minutos a cerca de 120 h e, de preferência, de cerca de alguns minutos a cerca de 48 h. O tempo para a reação irá depender da concentração das enzimas e da atividade específica, bem como do substrato utilizado e das condições ambientais, tais como temperatura e pH. Um técnico no assunto pode facilmente determinar as condições ideais de temperatura, pH e tempo para ser utilizado com um determinado substrato e consórcio de enzima(s) de sacarificação.

[0053] A sacarificação pode ser realizada em bateladas ou como um processo contínuo. A sacarificação também pode ser realizada em uma etapa, ou em uma série de etapas. Por exemplo, diferentes enzimas necessárias para a sacarificação podem apresentar diferentes pH ou temperatura ideal. Um tratamento primário pode ser realizado com a(s) enzima(s) a uma temperatura e pH, seguido dos tratamentos secundário ou terciário (ou mais) com diferente(s) enzima(s) em diferentes temperaturas e/ou pH. Além disso, o tratamento com enzimas diferentes em etapas seqüenciais pode ser no mesmo pH e/ou temperatura, ou em diferentes pHs e temperaturas, tal como a utilização das hemicelulases estáveis e mais ativas em maiores pH e temperaturas seguida pelas celulases, que são ativas em pH e temperaturas mais baixas.

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20/40 [0054] O grau de solubilização dos açúcares a partir da biomassa depois da sacarificação pode ser monitorado através da medida da liberação dos monossacarídeos e oligossacarídeos. Os métodos para medir os monossacarídeos e oligossacarídeos são bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, a concentração dos açúcares redutores pode ser determinada utilizando o teste do ácido 1,3-dinitrossalicílico (DNS) (Miller, G. L., Anal. Chem. (1959) 31: 426 a 428). Alternativamente, os açúcares podem ser medidos por HPLC utilizando uma coluna adequada, tal conforme descrito no presente, na seção dos Métodos Gerais.

Fermentação [0055] Os açúcares fermentáveis liberados a partir da biomassa podem ser utilizados por microrganismos adequados para a produção de substâncias químicas alvo. Seguinte à sacarificação, mas antes da fermentação, a mistura de sacarificação pode ser concentrada por evaporação, por exemplo, para aumentar a concentração dos açúcares fermentáveis. Opcionalmente, o líquido no produto de sacarificação pode ser separado dos sólidos em um método em batelada ou contínuo. Opcionalmente, o líquido ou o produto total de sacarificação pode ser esterilizado antes da fermentação. Dependendo do(s) microorganismo(s) utilizado(s) durante a fermentação e do pH utilizado durante a sacarificação, o pH pode ser ajustado àquele adequado para a fermentação. Além disso, a mistura de sacarificação pode ser suplementada com nutrientes adicionais necessários para o crescimento microbiano. Os suplementos podem incluir, por exemplo, extrato de levedura, aminoácidos específicos, fosfato, fontes de nitrogênio, sais e oligoelementos. Os componentes necessários para a produção de um produto específico criado por um biocatalisador específico também podem ser incluídos, tal como um antibiótico para manter um plasmídeo ou um co-fator necessário em uma reação catalisada por enzima. Do mesmo modo, os açúcares adicionais podem

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21/40 ser incluídos para aumentar a concentração de açúcares totais. A mistura de sacarificação pode ser utilizada como um componente de um caldo de fermentação, por exemplo, compondo entre cerca de 100% e cerca de 10% do meio final.

[0056] A temperatura e/ou headspace do gás também podem ser ajustados, dependendo das condições úteis para a fermentação do(s) microorganismo(s). A fermentação pode ser aeróbia ou anaeróbia. A fermentação pode ocorrer após a sacarificação, ou pode ocorrer concomitantemente com sacarificação por sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). O SSF pode manter os níveis de açúcar produzido por baixa sacarificação, reduzindo assim a inibição do produto potencial das enzimas de sacarificação, reduzindo a disponibilidade de açúcar para a contaminação por microrganismos, e melhorando a conversão da biomassa pré-tratada em monossacarídeos e/ou oligossacarídeos.

[0057] Os produtos químicos desejados que podem ser produzidos por fermentação incluem, por exemplo, ácidos, alcoóis, alcanos, alcenos, aromáticos, aldeídos, cetonas, biopolímeros, proteínas, peptídeos, aminoácidos, vitaminas, antibióticos e produtos farmacêuticos. Os alcoóis incluem, mas não estão limitados a metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, etileno glicol, propanodiol, butanodiol, glicerol, eritritol, xilitol e sorbitol. Os ácidos incluem o ácido acético, ácido láctico, ácido propiônico, ácido 3hidroxipropiônico, ácido butírico, ácido glucônico, ácido itacônico, ácido cítrico, ácido succínico e ácido levulínico. Os aminoácidos incluem o ácido glutâmico, ácido aspártico, metionina, lisina, glicina, arginina, treonina, fenilalanina e tirosina. Os produtos químicos adicionais incluem o metano, etileno, acetona e enzimas industriais.

[0058] A fermentação de açúcares nos produtos químicos desejados pode ser realizada por um ou mais biocatalisadores adequados em fermentações

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22/40 únicas ou de várias etapas. Os biocatalisadores podem ser microorganismos selecionados a partir de bactérias, fungos filamentosos e leveduras. Os biocatalisadores podem ser microorganismos do tipo selvagem ou microorganismos recombinantes, e incluem Escherichia, Zymomonas, Saccharomyces, Candida, Pichia, Streptomyces, Bacillus, Lactobacillus e Clostridium. Em outra realização, os biocatalisadores podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em Escherichia coli, Zymomonas mobilis, Bacillus stearothermophilus, Saccharomyces cerevisiae, Clostridia thermocellum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum e Pichia stipitis recombinante.

[0059] Muitos biocatalisadores utilizados na fermentação para a produção de produtos químicos desejados têm sido descritos e outros podem ser descobertos, produzido através de mutação, ou manipulados através de meios recombinantes. Qualquer biocatalisador que utilize os açúcares fermentáveis, produzidos a partir da sacarificação da biomassa pré-tratada utilizando o presente método, pode ser utilizado para produzir o(s) produto(s) químico(s) desejado(s) que é conhecido por produzir por fermentação.

[0060] Os biocatalisadores particularmente interessantes são aqueles que produzem biocombustíveis, incluindo o etanol e o butanol. Por exemplo, a fermentação dos hidratos de carbono em acetona, butanol e etanol (fermentação ABE) por Clostridia solventogênica é bem conhecida (Jones e Woods (1986) Microbiol. Rev. 50: 484 a 524). Um processo de fermentação para a produção de altos níveis de butanol, que também produz acetona e etanol, utilizando uma cepa mutante de Clostridium acetobutylicum é descrito no documento US 5.192.673. A utilização de uma cepa mutante de Clostridium beijerinckii para produzir altos níveis de butanol, que também produz acetona e etanol, é descrita no documento US 6.358.717. Os pedidos de patente de copropriedade e provisórios WO 2007/041269 e WO 2007/050671, descrevem a produção do 1-butanol e do isobutanol, respectivamente, em hospedeiros

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23/40 microbianos geneticamente modificados. Os pedidos de patente de copropriedade e provisórios US 11/741892 e US 11/741916 descrevem a produção do 2-butanol em hospedeiros microbianos geneticamente modificados. O isobutanol, o 1-butanol e o 2-butanol podem ser produzidos a partir da fermentação do hidrolisado produzido utilizando o presente método por um hospedeiro microbiano seguindo os métodos descritos.

[0061] As cepas geneticamente modificadas de E. coli também foram utilizadas como biocatalisadores para a produção de etanol (Underwood et al., (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68: 6.263 a 6.272). Uma cepa geneticamente modificada de Zymomonas mobilis, que possui uma melhor produção de etanol é descrita no documento US 2003/0162271 A1. Uma cepa produtora de etanol modificada adicional de Zymomonas mobilis e a sua utilização para a produção de etanol são descritas nos pedidos de patente de co-propriedade e provisórios US 60/847813 e US 60/847856, respectivamente. O etanol pode ser produzido a partir da fermentação do hidrolisado produzido utilizando o presente método por Zymomonas mobilis seguindo os métodos descritos. A sacarificação da biomassa pré-tratada, que teve o líquido de prétratamento com inibidores removido, em açúcares fermentáveis seguido pela fermentação dos açúcares a uma substância química alvo, é exemplificada no Exemplo 4 no presente para a produção de etanol a partir das espigas de milho pré-tratadas com Z. mobilis como biocatalisador para a fermentação dos açúcares em etanol.

[0062] O ácido lático foi produzido nas fermentações por cepas recombinantes de E. coli (Zhou etal., (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69: 399 a 407), cepas naturais de Bacillus (documento US 2005/0250192) e Rhizopus oryzae (Tay e Yang (2002) Biotechnol. Bioeng. 80: 1 a 12). As cepas recombinantes de E. coli têm sido utilizadas como biocatalisadores na fermentação para produzir o 1,3 propanodiol (documentos US 6.013.494, US

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6.514.733), e o ácido adípico (Niu et al., (2002) Biotechnol. Prog. 18: 201 a 211). O ácido acético foi produzido por fermentação utilizando Clostridia recombinante (Cheryan et al., (1997) Adv. Appl. Microbiol. 43: 1 a 33), e cepas de leveduras recém-identificadas (Freer (2002) World J. Microbiol. Biotechnol. 18: 271 a 275). A produção do ácido succínico por E. coli recombinante e outras bactérias está descrita no documento US 6.159.738, e por E. coli mutante recombinante em Lin etal., (2005) Metab. Eng. 7: 116 a 127). O ácido pirúvico foi produzido pela levedura de Torulopsis glabrata mutante (Li et al., (2001) Appl. Microbiol. Technol. 55: 680 a 685) e pela E. co//mutante (Yokota et al., (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58: 2.164 a 2.167). As linhagens recombínantes de E. coli têm sido utilizadas como biocatalisadores para a produção de ácido para-hidroxicinâmicos (documento US 2003/0170834) e ácido quínico (documento US 2006/0003429).

[0063] Um mutante de Propionibacterium acidipropionici tem sido utilizado na fermentação para a produção do ácido propiônico (Suwannakham e Yang (2005) Biotechnol. Bioeng. 91: 325 a 337), e o ácido butírico foi produzido pela Clostridium tyrobutyricum (Wu e Yang (2003) Biotechnol. Bioeng. 82: 93 a 102). O propionato e o propanol foram produzidos pela fermentação da treonina pela cepa de Clostridium sp. 17cr1 (Janssen (2004) Arch. Microbiol., 182: 482 a 486). A Aureobasidium pullulans do tipo levedura foi utilizada para produzir o ácido glucônico (Anantassiadis et al., (2005) Biotechnol. Bioeng. 91: 494 a 501), por um mutante do Aspergillus niger (Singh et al., (2001) Indian J. Exp. Biol., 39: 1.136 a 43). O 5-ceto-D-glucônico foi produzido por um mutante de Gluconobacteroxydans (Elfari etal., (2005) Appl. Microbiol. Biotech. 66: 668 a 674), o ácido itacônico foi produzido por mutantes de Aspergillus terreus (Reddy and Singh (2002) Bioresour. Technol. 85: 69 a 71), o ácido cítrico foi produzido por uma cepa mutante de Aspergillus niger (Ikram-UI-Haq et al., (2005) Bioresour. Technol. 96: 645 a 648), e o xilitol foi

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25/40 produzido pela Candida guilliermondii FTI 20037 (Mussatto e Roberto (2003) J. Appl. Microbiol., 95: 331 a 337). Os biopoliésteres contendo 4-hidroxivalerato, que também contém quantidades significativas de ácido 3-hidroxibutírico, ácido 3-hidroxivalérico, foram produzidos por recombinantes de Pseudomonas putida e Ralstonia eutropha (Gorenflo et al., (2001) Biomacromolecules 2: 45 a 57). O L-2,3-butanodiol foi produzido pela E. coli recombinante (Ui et al. (2004) Lett. Appl. Microbiol. 39: 533 a 537).

[0064] A produção de aminoácidos por fermentação foi realizada utilizando cepas auxotróficas e cepas resistentes análogas de aminoácidos de Corynebacterium, Brevibacterium e Serratia. Por exemplo, a produção de histidina utilizando uma cepa resistente a um análogo de histidina é descrita na publicação JP 56.008.596 e utilizando uma cepa recombinante é descrita no documento EP 136.359. A produção de triptofano que utiliza uma cepa resistente a um análogo de triptofano é descrita nas publicações JP 47.004.505 e JP 51.019.037. A produção de isoleucina utilizando uma cepa resistente a um análogo de isoleucina é descrita nas publicações JP 47.038.995, JP 51.006.237, JP 54.032.070. A produção de fenilalanina utilizando uma cepa resistente a um análogo de fenilalanina é descrita na publicação JP 56.010.035. A produção de tirosina utilizando uma cepa que requer fenilalanina para o crescimento, resistentes à tirosina (Agr. Chem. Soc. Japão 50 (1) R79R87 (1976), ou uma cepa recombinante (documentos EP 263.515, EP 332.234), e a produção de arginina utilizando uma cepa resistente a um análogo de L-arginina (Agr. Bioi. Chem. (1972) 36: 1675 a 1684, publicação JP 54.037.235 e publicação JP 57.150.381) foram descritos. A fenilalanina também foi produzida por fermentação em cepas de Escherichia coli ATCC 31882, 31883 e 31884. A produção de ácido glutâmico em uma bactéria corineforme recombinante é descrita no documento US 6.962.805. A produção de treonina por uma cepa mutante de E. coli é descrita em Okamoto e Ikeda

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26/40 (2000) J. Biosci Bioeng. 89: 87 a 79. A metionina foi produzida por uma cepa mutante de Corynebacterium lilium (Kumar et al., (2005) Bioresour. Technol. 96: 287 a 294).

[0065] Os peptídeos, enzimas e outras proteínas úteis também têm sido produzidas por biocatalisadores (por exemplo, documentos US 6.861.237, US 6.777.207, US 6.228.630).

[0066] O método da presente invenção também pode ser utilizado na produção do 1,3-propanodiol a partir da biomassa. As cepas recombinantes de E. coli têm sido utilizadas como biocatalisadores na fermentação para produzir o 1,3 propanodiol (US 6.013.494, US 6.514.733). A biomassa prétratada com o presente sistema pode ser sacarificada; seguinte à sacarificação, a E. coli é utilizada para produzir o 1,3-propanodiol, conforme descrito no Exemplo 10 do pedido de patente de co-propriedade e provisório US 11/403087.

[0067] Os produtos químicos desejados produzidos na fermentação pelos biocatalisadores podem ser recuperados utilizando vários métodos conhecidos no estado da técnica. Os produtos podem ser separados dos outros componentes da fermentação por centrifugação, filtração, microfiltração e nanofiltração. Os produtos podem ser extraídos por troca iônica, extração com solvente ou eletrodiálise. Os agentes de floculação podem ser utilizados para auxiliar na separação de produtos. Como um exemplo específico, o 1 -butanol bioproduzido pode ser isolado do meio de fermentação utilizando os métodos conhecidos no estado da técnica para as fermentações ABE (vide, por exemplo, Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 639 a 648 (1998), Groot et al., Process. Biochem. 27: 61 a 75 (1992), e as referências citadas no mesmo). Por exemplo, os sólidos podem ser removidos do meio de fermentação por centrifugação, filtração, decantação ou similares. Em seguida, o 1-butanol pode ser isolado do meio de fermentação através de métodos

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27/40 como a destilação, a destilação azeotrópica, extração líquido - líquido, adsorção, retirada de gás, a evaporação da membrana ou a pervaporação. A purificação do 1,3-propanodiol a partir do meio de fermentação pode ser obtida, por exemplo, submetendo a mistura de reação à extração com um solvente orgânico, à destilação e à cromatografia em coluna (documento US 5.356.812). Um solvente orgânico particularmente bom para este processo é o ciclohexano (documento US 5.008.473). Os aminoácidos podem ser coletados a partir do meio de fermentação pelos métodos tais como a adsorção de resina por troca iônica e/ou a cristalização.

Exemplos

Métodos Gerais e Materiais [0068] São utilizadas as seguintes abreviações:

“HPLC” é Cromatografia Líquida de Alta Performance, “C” é centígrado, “kPa” é quiloPascal, “m” é metro, “mm” é milímetro, “kW” é quilowatt, “pm” é micrometro, “pL” é microlitro, “mL” é milímetro, “L” é litro, “min” é minuto, “mM” é milimolar, “cm” é centímetro, “g” é grama, “kg” é quilograma, “p” é peso, “h” é hora, “temp” ou “T” é temperatura, “teori” é teórico, “trat. pr.” é tratado previamente, “DWB” é o peso seco da biomassa, “ASME” é a American Society of Mechanicals Engineers, “s.s.” é aço inoxidável.

[0069] O ácido sulfúrico, hidróxido de amônio, ácido acético, acetamida, extrato de levedura, glicose, xilose, sorbitol, MgSO4.7H2O, ácido fosfórico e ácido cítrico foram obtidos pela Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Reator Jaygo [0070] O reator Jaygo é um reator do tipo pás horizontais de 130 litros (cerca de 51 cm de diâmetro x 91 cm de comprimento), (Jaygo Manufacturing, Inc., Mahwah, NJ) fabricado da liga Hastelloy® C-22. O reator é equipado com uma camisa de vapor capaz de aquecer a cerca de 177^SC (kPa 862). A injeção direta de vapor também é utilizada para trazer rapidamente a

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28/40 biomassa até a temperatura de pré-tratamento. A pressão do vapor é ajustada e controlada para manter a temperatura de pré-tratamento desejada. Várias portas permitem a injeção de solventes e outros líquidos quentes.

Reator de Tambor Grande com Pistão [0071] Um reator de tambor grande com pistão (código ASME carimbado) foi construído e consistia em um tambor de aço inoxidável de 5,1 cm x 68,6 cm equipado com um pistão, orientado horizontalmente. O pistão foi selado no tambor, com quatro anéis O e foi pressurizado com nitrogênio na parte posterior do pistão durante o curso de descarga. O tambor de 68,6 cm foi equipado com oito portas de uso múltiplo, cada 4 ao longo das superfícies superiores e inferiores, permitindo a aplicação de vácuo, injeção de amônia aquosa, injeção de vapor e inserção de termopares para a medição da temperatura no interior do tambor. O tambor do reator foi equipado com uma camisa de vapor para um aquecimento regular do tambor. O tambor do reator estava diretamente ligado a um tanque de expansão de aço inoxidável de 15,2 cm x 61 cm, orientado verticalmente. O tambor foi isolado do tanque de expansão por um bocal cônico e um arranjo da válvula de cisalhamento do assento final. O diâmetro do molde de cisalhamento da válvula final era de 3,5 cm. A contrapressão sobre o bocal cônico e o assento era regulável, com a maioria dos testes realizados utilizando cerca de 138 kPa (pressão manométrica) de contrapressão em um cilindro de ar de 10,2 cm de diâmetro ligado ao cone da válvula de cisalhamento final. O cone da válvula de cisalhamento final poderia recuar até 1,6 cm para permitir a descarga de partículas no tanque de expansão. Um cotovelo na saída da válvula de cisalhamento final direcionou os sólidos pré-tratados para baixo no fundo do tanque de expansão, onde os sólidos foram facilmente removidos ao abrir um flange de extremidade convexa no fundo do tanque. Um flange convexo superior no tanque de expansão está incluído em uma saída especial adaptada

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29/40 com ranhuras perpendiculares ao eixo do tanque de expansão, o que fez com que os vapores liberados viajassem em torno de um caminho curvo até uma saída adaptada, ajudando a evitar o transporte das partículas de biomassa arrastadas e das gotículas de água em um condensador de ventilação. Três aquecedores de banda elétrica (fixados em 60^sC) e isolamento foram adicionados ao longo do tanque de expansão para permitir que os sólidos tratados a quente se expandam em um recipiente aquecido, simulando melhor um processo em escala comercial.

Reator de Sacarificação de Alimentação em Batelada [0072] Este reator é descrito com mais detalhes no pedido de patente de co-propriedade e provisório US CL3873.

[0073]0 reator de sacarificação de alimentação em batelada é um fermentador de 15 L (B. Braun Biotech International, Allentown, PA) controlado por uma unidade de controle de dados BioStat ED e módulo de controle associado contendo uma bomba de circulação, bombas de ácido e base, válvulas solenoides, trocadores de calor para o controle de temperatura, fornecimento de vapor, água de processo, válvulas de controle de abastecimento de ar e filtração, válvulas de controle da pressão de retorno e filtros de descarga. O fermentador foi equipado com dois rotores de Ligntnin A-310 de alta eficiência com três lâminas de 11,4 cm de diâmetro. O rotor inferior estava localizado a 7,6 cm do fundo do reator (que não poderia estar localizado mais perto devido à presença de um arranjo de selo grande perto do fundo do eixo para a penetração do eixo direcionado para baixo) e o impulsor superior estava localizado a 22,9 cm a partir do fundo do reator. O vaso do fermentador possui um diâmetro de 19,0 cm e uma altura máxima de 55,9 cm. Quatro defletores removíveis foram instalados, cada qual possui uma largura de 1,6 cm e um comprimento de 48,3 centímetros e prolongados a partir do fundo do vaso

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30/40 para dentro de cerca de 7,6 cm do topo. Prumada nas portas superiores e inferiores do sistema de fermentação estava uma alça ao redor da bomba que consistia de uma bomba de lóbulo APV (modelo M1/028/06), 1 ¹/> polegada (3,81 cm) de mangueiras flexíveis e um indicador de fluxo de Teflon. A bomba ao redor da alça foi isolada do vaso de fermentação com 1 ¹/2 polegada (3,81 cm) de válvulas de esfera de bola de porta total Valmicro e SVF com corpos CF8M, 316 s.s. e assentos de PTFE. Além disso, uma válvula de cisalhamento de porta V (Triac Controls) estava localizada a jusante da bomba de lobo, antes da válvula de esfera isolar a bomba da porta superior do fermentador. Durante os ciclos de recirculação, esta válvula foi fechada gradativamente até 60° para fornecer maior cisalhamento dos sólidos pré-tratados recirculantes.

Métodos Analíticos

Quantificação da Glicose e Xilose em Sólidos [0074] A quantidade de glicose e xilose em cada amostra inicial de biomassa foi determinada utilizando métodos bem conhecidos no estado da técnica, tais como a norma ASTM E1758-01 “Standard method for the determination of carbohydrates by HPLC’.

Medida do Teor de Açúcar, Acetamida, Ácido Lático e Ácido Acético [0075] Os açúcares solúveis (glicose, celobiose, xilose, galactose, arabinose e manose), ácido acético e de etanol em bebidas de sacarificação ou caldo de fermentação foram medidos por HPLC (Agilent modelo 1100, Agilent Technologies, Paio Alto, CA), utilizando colunas Bio-Rad HPX-87P e Bio-Rad HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) com colunas de proteção adequadas. O pH da amostra foi medido e ajustado para 5-6 com ácido sulfúrico, se necessário. A amostra foi então passada por um filtro de seringa de 0,2 pm diretamente em um frasco de HPLC. As condições de execução do HPLC foram as seguintes:

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31/40

ΗΡΧ-87Ρ (para carboidratos):

Volume de Injeção: 10-50 pL, dependente da concentração e dos limites de detecção.

Fase móvel: água para HPLC, 0,2 pm filtrados e degaseificados Taxa de Fluxo: 0,6 mL/min

Temperatura da coluna: 80 - 85^SC, temperatura da coluna de proteção <60^sC

Temperatura do detector: o mais próximo possível da temperatura da coluna principal

Detector: índice de refração

Tempo de execução: coleta de dados de 35 minutos mais 15 minutos após a execução (com ajuste possível para os compostos de eluição posterior)

Biorad Aminex HPX-87H (para carboidratos, ácido acético e etanol)

Volume de injeção: 5 a 10 pL, dependente da concentração e dos limites de detecção

Fase móvel: 0,01 N de ácido sulfúrico, 0,2 pm filtrados e degaseificados

Taxa de fluxo: 0,6 mL/min Temperatura da coluna: 55^SC

Temperatura do detector: o mais próximo possível da temperatura da coluna

Detector: índice de refração

Tempo de execução: coleta de dados de 25 a 75 minutos [0076] Após a execução, as concentrações na amostra foram determinadas a partir das curvas padrão para cada um dos compostos.

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32/40

Exemplo 1

Pequena Solubilização dos Açúcares Após o Pré-Tratamento em Baixa

Temperatura [0077] As espigas de milho inteiras ou fraturadas (cerca de 13 kg, base em peso seco) foram carregados no reator Jaygo. As espigas foram fraturadas ao passar pelo refinador de disco (Métodos Gerais) equipado com placas C-2975. As espigas fraturadas resultantes foram passadas através de uma tela de 1,27 centímetros. Todos os pedaços retidos foram novamente passados através do refinador de disco com uma lacuna de 0,5 cm menor. Um vácuo foi aplicado ao reator e uma solução diluída de hidróxido de amônio foi injetada para fornecer a concentração de amônia final desejada (2% ou 6% em peso NH3/ peso seco da biomassa) e a concentração de biomassa seca (30% ou 40% em peso seco de biomassa/ em peso total da mistura de biomassa - amônia aquosa). No caso das espigas inteiras, a concentração de amônia inicial era de 6% (em peso/ em peso da biomassa seca) e a concentração da biomassa seca era de 40%. No caso das espigas fraturadas, a concentração de amônia inicial era de 2% (em peso/ em peso da biomassa seca) e a concentração da biomassa seca era de 30%. O vácuo foi aliviado e 0 vapor de água foi aplicado à camisa para aquecer as espigas mesmo tempo da imersão a uma temperatura de 93^SC para a amostra espiga inteira e 85^SC para as amostras de milho fraturadas. Curtos períodos de maiores velocidades do agitador (até 96 rpm) foram aplicados em um esforço para aumentar a velocidade de aquecimento. As espigas imersas foram mantidas na temperatura por 8 horas para as espigas inteiras e 4 h para as espigas fraturadas com mistura constante a 32 rpm, então deixadas resfriar durante a noite com mistura contínua. Antes da remoção da biomassa pré-tratada do reator, 0 reator foi colocado sob vácuo, a 90^sC para retirar a amônia da biomassa pré-tratada.

[0078] A composição das fases sólida e líquida da mistura prétratada da espiga inteira foi analisada conforme descrito nos Métodos Gerais e

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33/40 os resultados são apresentados na Tabela 1. As quantidades são apresentadas como % das quantidades teóricas na biomassa inicial, com ácido acético e acetamida juntos correspondendo ao acetil na biomassa. A glicose e a xilose permaneceram em grande parte nos sólidos (na celulose e hemicelulose, respectivamente), com apenas pequenas quantidades de oligômeros solúveis medidos no líquido. Toda a matéria-prima do acetil foi encontrada na fase líquida como ácido acético ou acetamida.

Tabela 1

Separação dos Diferentes Componentes de Matérias-primas na Fase

Sólida ou Líquida após o Pré-tratamento em Baixa Temperatura das

Espigas Inteiras

Componente	Fase sólida: % teórica do valor da matéria-prima	Fase líquida: % teórica do valor da matéria-prima
Açúcares monoméricos	Açúcares oligcoméricos	Ácido acético	Acetamida
Glicose	99	0	1	-	-
Xilose	83	0	7Ί	-	-
Acetil	0	-	-	56	44

* Os totais podem não ser 100 devido ao nível de sensibilidade do teste.

[0079] A composição das fases sólida e líquida da mistura de biomassa pré-tratada da espiga fraturada foi analisada conforme descrito nos Métodos Gerais e os resultados são apresentados na Tabela 2. As quantidades são apresentadas como % das quantidades teóricas na biomassa inicial, com ácido acético e acetamida junto correspondente ao acetil na biomassa. Como acontece com a biomassa pré-tratada da espiga inteira, a glicose e a xilose permaneceram em grande parte nos sólidos (na celulose e hemicelulose, respectivamente), com apenas pequenas

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34/40 quantidades de oligômeros solúveis medidos no líquido. Da mesma forma, toda a matéria-prima do acetil foi encontrada na fase líquida como ácido acético ou acetamida.

Tabela 2

Separação dos Diferentes Componentes de Matérias-primas na Fase

Sólida ou Líquida após o Pré-tratamento em Baixa Temperatura das

Espigas Fraturadas

Componente	Fase sólida: % teórica do valor da matéria-prima	Fase líquida: % teórica do valor da matéria-prima
Açúcares monoméricos	Açúcares oligcoméricos	Ácido acético	Acetamida
Glicose	97	2	2*	-	-
Xilose	92	-	1*	-	-
Acetil	0	-	-	81	9*

* Os totais podem não ser 100 devido ao nível de sensibilidade do teste.

Exemplo 2

Pequena Solubilização dos Açúcares Após o Pré-Tratamento em Alta

Temperatura [0080]As espigas de milho fraturadas (13 kg, base em peso seco), preparadas conforme descrito no Exemplo 1, foram carregadas no reator Jaygo. Depois de aplicar um vácuo no reator, a solução de hidróxido de amônio de força adequada para fornecer amônia a 2% (em peso/ em peso da biomassa seca) e 30% em peso seco da concentração de biomassa foi bombeada para o reator com 32 rpm de mistura à temperatura ambiente. Os conteúdos do reator foram, então, aquecidos a 95^SC utilizando a camisa de vapor de baixa pressão. Uma vez que o reator atingiu 95^SC, foi utilizada a injeção direta de vapor para aquecer o

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35/40 conteúdo do reator a 145^SC. Quando o reator atingiu 145^SC, o conteúdo do reator foi mantido a essa temperatura durante 20 minutos, utilizando a camisa de vapor e algumas injeções diretas de vapor. Após 20 minutos, um vácuo foi aplicado sobre a abertura para o reator e o motor da desfribadora foi ligado por 5 minutos. Após 1 hora, a água de refrigeração para a camisa foi ligada. O conteúdo do reator Jaygo foram resfriados entre 33^SC e 37^SC; então o CO2 foi utilizado para pressurizar 0 reator a 138 kPa. A atmosfera de CO2 pressurizada foi mantida por 30 min. A temperatura final dos conteúdos do reator estava entre 27^SC a 31^SC. O pH da biomassa imersa/ pré-tratada era de cerca de 7,5.

[0081 ]A composição das fases sólida e líquida da mistura prétratada foi analisada conforme descrito nos Métodos Gerais e os resultados são apresentados na Tabela 1. As quantidades são apresentadas como % das quantidades teóricas na biomassa inicial, com ácido acético e acetamida juntos correspondendo ao acetil na biomassa. Assim como acontece na biomassa pré-tratada em baixa temperatura no Exemplo 1, a glicose e a xilose permaneceram em grande parte nos sólidos (na celulose e hemicelulose, respectivamente), com apenas pequenas quantidades de oligômeros solúveis medidos no líquido. Do mesmo modo, toda a matériaprima do acetil foi encontrada na fase líquida como ácido acético ou acetamida.

Tabela 3

Separação dos Diferentes Componentes de Matérias-primas na Fase

Sólida ou Líquida após o Pré-tratamento em Alta Temperatura das Espigas

Fraturadas

Componente

Fase sólida:

Fase líquida: % teórica do valor da matéria-prima

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36/40

	% teórica do valor da matéria-prima	Açúcares monoméricos	Açúcares oligcoméricos	Ácido acético	Acetamida
Glicose	100	0	2*	-	-
Xilose	93	0	2*	-	-
Acetil	0	-	-	90	9*

* Os totais podem não ser 100 devido ao nível de sensibilidade do teste.

Exemplo 3

Líquidos de Pré-tratamento Contendo Inibidores da Fermentação [0082] Uma série de pré-tratamentos foi realizada no reator de tambor grande com pistão (descrito nos Métodos Geral) conforme segue. O vapor foi adicionado à camisa do tambor para pré-aquecer o barril do reator de tambor grande com pistão (descrito nos Métodos Gerais) a cerca de 130^sC. O receptor de expansão foi pré-aquecido a cerca de 60^sC com aquecedores em banda. As espigas de milho inteiras foram processadas com um triturador (motor de 2,2 kW), com um espaçador do mordente de cerca de 0,95 cm, seguido por um desagrupador (ate/i/mpe/) (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc., Livingston, NJ), seguido por triagem com uma tela Sweco equipada com uma tela de 1,9 centímetros padrão US para fraturar a espiga inteira em pedaços menores. Estas espigas fraturadas (175 g, base em peso seco) foram colocadas no reator de tambor grande ao colocar manualmente as espigas no final do reator com o pistão removido. O pistão foi recolocado para plugar a extremidade. Um vácuo foi aplicado ao recipiente do reator e ao receptor de expansão para baixar a pressão a < 10 kPa, e a solução diluída de hidróxido de amônio foi injetada no reator para fornecer uma concentração de amônia de 6 g/100 g em peso seco de biomassa e um peso seco da concentração de biomassa de 45 g/ 100 g de mistura total de biomassa e amônia aquosa. Uma vez que a amônia foi carregada, o vapor foi injetado no reator para trazer a temperatura a 145° C. A mistura foi mantida nesta temperatura por 10

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37/40 minutos pela monitoração da temperatura e a adição de vapor, se necessário, e depois descarregada no tanque de expansão pré-aquecido pela ativação do pistão. O vácuo foi retirado do tanque de expansão até que o receptor de expansão atingir cerca de 59^SC. Para a série A, 12 de tais pré-tratamentos foram realizados e para a série B, 13 de tais pré-tratamentos foram realizados. Os sólidos foram coletados através da remoção do fundo do tanque de expansão. Qualquer excesso de líquido foi drenado dos sólidos, e todo o líquido coletado de cada série de pré-tratamento foi reunido. Este líquido foi analisado quanto ao teor de açúcar, ácido acético e acetamida, conforme descrito nos Métodos Gerais. O líquido continha muito pouco açúcar, enquanto que continha mais ácido acético e acetamida, conforme mostrado nas Tabelas 4 e 5.

Tabela 4

Açúcar Removido nos Líquidos de Pré-tratamento

Série de pré- tratamento	Monômero de glicose: % teórica	Glicose total: % teórica	Monômero de xilose: % teórica	Xilose total: % teórica
A	0,02%	0,15%	0	0,12%
B	0	0,13%	0	0,11%

Tabela 5

Ácido Acético e Acetamida Removidos nos Líquidos de Pré-tratamento

Séries de pré- tratamento	Ácido acético: % teórica	% de acetamida teórica
A	6,2%	1,8%
B	10,2%	2,7%

Exemplo 4

Produção de Etanol Utilizando o Hidrolisado de Sacarificação a partir da

Biomassa Pré-tratda com Inibidores no Líquido Removido [0083] O vapor foi adicionado à camisa do tambor para préaquecer o tambor do reator de tambor grande com pistão (descrito nos Métodos Gerais) a cerca de 130^sC. O receptor de expansão foi pré-aquecido a

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38/40 cerca de 60^sC com aquecedores de banda. As espigas fraturadas foram preparadas conforme segue. As espigas de milho inteiras foram processadas com um triturador (motor de 2,2 kW), com um espaçador do mordente de cerca de 0,95 cm, seguido por um desagrupador (cte/umper) (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc., Livingston, NJ), seguido por triagem com uma tela Sweco equipada com uma tela de 1,9 centímetros padrão US para fraturar a espiga inteira em pedaços menores. Estas espigas processadas (175 g, base em peso seco) foram carregadas no reator de tambor grande, ao colocar manualmente as espigas no final do reator com o pistão removido. O pistão foi recolocado para fechar a extremidade. Um vácuo foi aplicado ao recipiente do reator e ao receptor de expansão para baixar a pressão a < 10 kPa, e a solução diluída de hidróxido de amônio foi injetada no reator para fornecer uma concentração de amônia de 6 g/ 100 g em peso seco de biomassa e um peso seco da concentração de biomassa de 45 g/ 100 g de mistura total de biomassa e amônia aquosa. Uma vez que a amônia foi carregada, o vapor foi injetado no reator para trazer a temperatura a 145° C. A mistura foi mantida nesta temperatura por 10 minutos pela monitoração da temperatura e a adição de vapor, se necessário, e depois descarregada no tanque de expansão préaquecido pela ativação do pistão. O vácuo foi retirado do tanque de expansão até o receptor de expansão atingir cerca de 59^SC. Após a coleta a partir do receptor de expansão, o líquido livre foi separado dos sólidos pré-tratados e não foi adicionado de volta para a sacarificação. Um total de 17 de tais prétratamentos foi realizado. As espigas pré-tratadas a partir de 4 pré-tratamentos foram agrupadas para a sacarificação para fornecer o hidrolisado inicial para a sacarificação em batelada. As espigas pré-tratadas dos 13 testes restantes foram agrupadas para a utilização na sacarificação de alimentação em batelada.

[0084] Para iniciar a sacarificação de alimentação em batelada, o

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39/40 reator de sacarificação de alimentação em batelada descrito nos Métodos Gerais foi primeiro carregado com o hidrolisado para preencher o volume do reator até o fundo do primeiro rotor. Este hidrolisado foi preparado por sacarificação das espigas pré-tratadas em frascos de agitação de 2,8 L. Estes frascos de agitação foram carregados com 465 g de sólidos pré-tratados, 1.000 mL de água Dl, e enzimas a 28,4 mg de celulose Spezyme® CP/g e 4,2 mg de proteína ativa/ g de celulose do consórcio de enzima de hemicelulase (Diversa, San Diego, CA) compreendendo β-glicosidase, xilanase, β-xilosidase e arabinofuranosidase. Antes da adição da enzima, o pH foi ajustado para 5 com H3PO4 a 8,5%. Os frascos de agitação foram mantidos a 50^sC e 150 rpm em um agitador rotativo por 48 horas, no momento em que 0 hidrolisado foi carregado no reator de alimentação em batelada.

[0085] Uma vez que 0 hidrolisado inicial foi carregado, a primeira alíquota da mistura de biomassa - amônia pré-tratada (cerca de 700 g) foi adicionada ao reator. O pH foi mantido em um valor nominal de 5,5 pela adição de H3PO4 a 8,5%. Uma vez que 0 pH reajustado para 0 ponto de ajuste, 28,4 mg de Spezyme® CP/ g de celulose e 4,2 mg de proteína ativa/ g de celulose do consórcio de enzima de hemicelulase (Diversa) compreendendo βglicosidase, xilanase, β-xilosidase e arabinofuranosidase foram adicionados. Alíquotas adicionais da mistura de biomassa - amônia pré-tratada, celulase Spezyme® CP e consórcio de enzima de hemicelulase foram adicionados a t = 4, 8, 12, 22, 26, 30 e 34 horas. A bomba ao redor do laço foi, em geral, iniciada cerca de 1 hora após a adição das enzimas e foi executada por cerca de 1 h até 22 h da adição dos sólidos. Após 26 h e 30 h das adições, a bomba foi iniciada cerca de 50 minutos após a adição de enzimas e executada por 30 minutos. Após 34 h da adição, a bomba foi iniciada em cerca de 3 horas após a adição de enzima e executada por 30 minutos. A bomba também foi executada por 30 minutos em t = 29, 33, 47 e 49 horas. O tempo de sacarificação total foi

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40/40 de 120 horas. Neste momento, o hidrolisado continha cerca de 60 g/L de monômero de glicose, 25 g/L de monômero de xilose e 10 g/L de ácido acético.

[0086] Este hidrolisado foi utilizado para a fermentação da Zymomonas mobilis cepas ZW800 ou ZW658 (ATCC # PTA-7858). ZW658 é uma cepa de Zymomonas mobilis que foi modificada para a fermentação de xilose em etanol e é descrita no pedido de patente de co-propriedade e provisório US 60/847813. O ZW658 foi construído através da integração de dois operons, PgapxylAB e Pgaptaltkt, contendo quatro genes que utilizam xilose codificando a xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transcetolase, no genoma de ZW1 (ATCC # 31821) através de eventos de transposição seqüencial, e seguido pela adaptação em meio seletivo contendo xilose. ZW800 é a cepa ZW658 com o gene que codifica a glicose-frutose oxidorredutase inativada, que é também descrita no pedido de patente de copropriedade e provisório US 60/847813.

[0087] As fermentações foram realizadas em fermentadores de 1 L esterilizados (sistema Biostat® B-DCU, Sartorius BBI System Inc., Bethlehem, Pensilvânia, USA.), com volume de trabalho inicial de 500 mL. O inóculo foi adicionado ao fermentador em um nível de 10% (v/v) tal que ο Οϋβοο era de cerca de 1 no caldo após a adição. O hidrolisado estava presente em 80% ou 40% (v/v), com o balanço em água. A glicose e xilose adicionais foram adicionadas para trazer as concentrações finais no caldo a 92 g/L e 82 g/L, respectivamente. O caldo de carne também foi suplementado com 10 mM de sorbitol e 1 g/L de MgSO4.7H2O. A fermentação foi realizada por 72 horas a 33^SC, pH 5,8, com agitação de 150 rpm. Os títulos de etanol final para a cepa ZW800 foram de 8 g/L em 40% do hidrolisado e 7 g/L em 80% do hidrolisado. Para ZW658, os títulos de etanol final eram de 8 g/L em 40% do hidrolisado e 6,5 g/L em 80% do hidrolisado.

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Claims

Reivindicações

1. MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE UM PRODUTO DE BIOMASSA PRÉ-TRATADA APRIMORADO, caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) fornecer uma biomassa;

(b) pré-tratar a dita biomassa através do contato da dita biomassa com uma solução aquosa que compreende amônia derivada de um ou mais dentre (i) gás amônia (NH3), (ii) compostos que compreendem íons amônio (NH₄ ⁺) ou (iii) compostos que liberam amônia na degradação para formar uma mistura de biomassa-amônia aquosa, em que a amônia está presente em uma concentração suficiente para manter o pH da mistura de biomassa-amônia aquosa em um pH superior a 7, mas onde a dita amônia está presente a menos de 12% em peso em relação ao peso seco da biomassa, e ainda onde o peso seco da biomassa está em uma alta concentração de sólidos de pelo menos 15% em peso em relação ao peso da mistura de biomassa-amônia aquosa, de modo que um produto de sólidos de biomassa pré-tratada e um líquido de prétratamento de biomassa que compreende um ou mais compostos inibidores que compreendem ácido acético, acetamida ou suas combinações, é formado;

e (c) remover dito líquido de pré-tratamento de biomassa a partir da mistura de biomassa-amônia aquosa para fornecer o produto de sólidos de biomassa pré-tratada com uma quantidade reduzida do ácido acético ou acetamida e uma redução no teor de açúcar de menos de 10% em relação ao teor na mistura de biomassa-amônia aquosa.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a adição de um componente aquoso adicional em uma ou mais das seguintes formas:

(i) antes da etapa (b);

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2/3 (ii) como um componente adicional na etapa (b); ou (III) após a etapa (b) como uma etapa de lavagem.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o componente aquoso é o vapor e é adicionado como um componente adicional na etapa (b), em que o vapor condensa parcialmente durante o pré-tratamento para formar parte do líquido de pré-tratamento da biomassa.
4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de sacarificação do produto de sólidos de biomassa pré-tratada para formar açúcares fermentáveis.
5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a fermentação dos açúcares, conforme descritos na reivindicação 4, para produzir uma substância química alvo selecionada a partir de pelo menos um dentre metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, etilenoglicol, propanodiol, butanodiol, glicerol, eritritol, xilitol, sorbitol, ácido acético, ácido láctico, ácido propiônico, ácido 3hidroxipropiônico, ácido butírico, ácido glucônico, ácido itacônico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido levulínico, ácido glutâmico, ácido aspártico, metionina, lisina, glicina, arginina, treonina, fenilalanina, tirosina, metano, etileno, acetona ou enzimas industriais.
6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH da mistura de biomassa-amônia aquosa é superior a 8.
7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que vácuo é aplicado à biomassa antes de colocar a biomassa em contato com uma solução aquosa que compreende amônia.
8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito peso seco da biomassa está em uma alta concentração de sólidos de 15% a 80% em relação ao peso da mistura de biomassa-amônia

Petição 870170073924, de 29/09/2017, pág. 14/15

3/3 aquosa.
9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita amônia está presente a menos de 10% em peso em relação ao peso seco da biomassa.
10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a biomassa é selecionada a partir de pelo menos um dentre switchgrass, resíduos de papéis, lodo da fabricação de papel, grãos de milho, espigas de milho, cascas de milho, forragem de milho, fibra de milho, gramas, trigo, palha de trigo, feno, cevada, palha de cevada, palha de arroz, bagaço da cana de açúcar, sorgo, soja, componentes obtidos a partir do processamento de grãos, árvores, galhos, raízes, folhas, aparas de madeira, serragem, arbusto ou moitas, vegetais, frutas, flores ou esterco animal.
11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amônia é derivada do grupo que consiste em gás amônia, hidróxido de amônio, ureia e suas combinações.
12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada em uma temperatura de 4°C a 200°C.
13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada em uma temperatura de 75°C a 150°C.
14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada em uma temperatura superior a 90°C a 150°C.
15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada por um período de tempo de até 25 horas.
16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que (b) é realizado por um período de tempo de até 8 horas.

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