JP2008521396A

JP2008521396A - 高い乾物（ｄｍ）含量を有するバイオマスの酵素加水分解

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Publication number: JP2008521396A
Application number: JP2007542141A
Authority: JP
Inventors: クラウス・フェルビ; ヤン・ラーセン; ヘニング・イェルゲンセン; ヤコブ・ヴィベ−ペダーセン
Original assignee: Elsam Engineering AS; Kobenhavns Universitet
Current assignee: Elsam Engineering AS; Kobenhavns Universitet
Priority date: 2004-11-29
Filing date: 2005-11-07
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Abstract

本発明は、比較的高い乾物含量を有する、多糖類を含有するバイオマスの液化および糖化の方法に関する。本発明は、酵素加水分解と、バイオマスが機械力、主として剪断力および引裂力に付されることを保証する重力の原理に頼るタイプの混合とを結合する。さらに、本発明は、かかる加工処理したバイオマスのさらなる利用、例えばバイオエタノール、バイオガス、食物および飼料用の特製炭水化物へのつづく発酵ならびにプラスチック製品および化学製品に加工処理する炭素供給原料のための利用に関する。

Description

本発明は、高い乾物含量を有し、好ましくは大きな平均サイズのファイバーおよび粒子を有する、多糖類を含有するバイオマスの液化および糖化の方法に関する。さらに、本発明は、かかる加工処理したバイオマス、例えば、バイオエタノール、食用および飼料用の特製炭水化物、ならびにプラスチックおよび化学製品に加工処理するための炭素供給原料につづいて発酵するための、かかる加工処理したバイオマスのさらなる利用に関する。

膨大な産業および農業プロセス、例えば自治体による操作、食物および飼料の加工処理および山林管理が、例えば、デンプン、セルロースおよびヘミセルロースの形態の、重合性の糖を含有するバイオマス、廃棄物および副産物を発生する。アグリビジネスおよび化学産業ならびに公共組織は、かかるバイオマスを高い価値の物質に変換する方法を開発することにかなりの関心をもっている。したがって、例えば、かかるバイオマスは、微生物および／または加水分解酵素を用いて、バイオエタノール、バイオガスまたは化学物質に潜在的に変換し得る。しかしながら、今日知られている方法の大部分は、その高い生産コストおよび高いエネルギー要求性、および、したがって固有の不確かな経済的採算性に起因して、大規模な商業的実施に未だ到達していない。

食物および飼料として重要であることに加えて、バイオマスからの炭水化物は、多くの産業プロセスの供給原料として使用し得る。ポリマーの形態において、よく知られた製品はセルロースが主成分である紙である。しかしながら、オリゴマーおよびモノマーに加工処理した場合、炭水化物は多くの産業プロセスの重要な供給原料である。詳細に記載するように、それは、多くの微生物プロセスに必要であるが、それに加えて、それは例えばトレハロースのような食物および飼料用の特製炭水化物に酵素的に加工処理するための、供給原料として使用し得る。また、炭水化物オリゴマーおよびモノマーは、プラスチックおよび有機化学物質に加工処理するための石油化学製品に代わり得る。さらに、炭水化物は、接触水素化における水素キャリアとして使用し得る。

したがって、加工処理した炭水化物の低コストかつ豊富な資源を産業的加工処理に利用可能とすることができれば、それは実質的な経済的潜在性を有し得ることは明らかである。

デンプンは植物において最も広がった貯蔵炭水化物であり、顆粒の形態で発生し、それは、種によってサイズおよび物理的特徴において顕著に異なる。デンプン顆粒は、一般的に同一分子内の水素結合および他の近隣分子との水素結合の形成に起因して、水および加水分解酵素の両方による浸透に対してきわめて抵抗性である。しかしながら、これらの分子間および分子内の水素結合は、懸濁液の温度が上昇するにつれて弱くなり得る。デンプンの水懸濁液を加熱した場合、水素結合が弱くなり、水が吸収され、デンプン顆粒が膨潤する。このプロセスは、形成する溶液がゼラチン質で、高粘度の粘稠度を有するため、通常ゼラチン化と呼ばれる。化学的には、デンプンはグルコースの天然ポリマーであり、それは一般的には室温の水に不溶性であるが分散可能であり、セルロースの単位に類似する繰り返し単位からなり、セルロースのβ−１,４−グリコシド結合に対して、α−１,４−およびα−１,６−グリコシド結合によって互いに連結している。その単位は、アミロースと呼ばれる直鎖成分、またはアミロペクチンと呼ばれる分岐した鎖成分のいずれかを形成する。大部分の植物の種子、穀物および塊茎は、約２０−２５％のアミロースを含有する。しかし、例えばエンドウのデンプンは６０％のアミロースを有し、ある種のトウモロコシは８０％のアミロースを有する場合もある。イネのような穀物のワキシー種は低率のアミロースである。

デンプンから離れて、植物バイオマスにおける３の主要な構成物は、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンであり、これらは、一般用語としてリグノセルロースと呼ばれている。一般用語としての多糖類を含有するバイオマスには、デンプンおよびリグノセルロース系バイオマスの両方が含まれる。

セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンは、異なる植物および植物の異なる部位において変化する量で存在し、それは緊密に相互作用して、植物の構造枠組みを形成している。

セルロースは、β−１,４−グリコシド結合によって互いに連結したＤ−グルコースから全体的になる、１０,０００までの重合度を有するホモ多糖類である。セルロースの直鎖構造によって、分子内および分子間の両方の水素結合の形成が可能となり、それはセルロース鎖のマイクロフィブリルへの凝集を生じる。高次のマイクロフィブリル内の領域は結晶質と呼ばれ、より低次の領域は非晶質と呼ばれる。マイクロフィブリルはフィブリルに会合し、それはついで、セルロースファイバーを形成する。マイクロフィブリル配列に沿ったセルロースの部分結晶質構造は、セルロースに高い引っ張り強度を与え、それは、セルロースを大部分の溶媒に不溶性とし、それは微生物分解、すなわち酵素的加水分解、に対するセルロースの耐性に部分的に寄与している。

ヘミセルロースは、多くのモノマー残基：Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸および４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸からなる複合的な異成分からなる多糖類である。ヘミセルロースは２００未満の重合度を有し、側鎖を有し、それはアセチル化され得る。モミ、マツおよびトウヒのような軟木においては、ガラクトグルコマンナンおよびアラビノ−４−Ｏ−メチル−グルクロノキシランが主要なヘミセルロース画分である。シラカンバ、ポプラ、ハコヤナギ属植物またはオークのような硬木においては、４−Ｏ−アセチル−４−メチル−グルクロノキシランおよびグルコマンナンがヘミセルロースの主構成成分である。イネ、コムギ、エンバクおよびスイッチグラス（switch grass）のような草本は、主としてグルクロノアラビノキシランからなるヘミセルロースを有する。

リグニンは、フェニルプロパン単位の重合によって形成される複合ネットワークであり、それはリグノセルロース中で最も豊富な非−多糖類画分を構成する。リグニン中の３のモノマーはｐ−クマリルアルコール、コニフェリルアルコールおよびシナピルアルコールであり、それらは、最も頻繁には、アリールグリセリル−β−アリールエーテル結合を介して結合している。リグニンはヘミセルロースに連結し、炭水化物を取り囲み、それによって微生物的および化学的な分解に対する保護を提供する。

上述したように、加工処理したバイオマスは、微生物および／または加水分解酵素を用いてバイオエタノールまたは化学製品に潜在的に変換し得、あるいは、加工処理したバイオマスからの炭水化物は多くの産業プロセス、例えば食物および飼料用の特製炭水化物への酵素加工処理、またはプラスチックおよび有機化学製品の製造における石油化学製品の代替物として使用し得る。また、本発明によるバイオマス中の炭水化物の加工処理は、非−炭水化物成分の分離および画分と組合せ得る。本発明による方法の特に好ましい使用は、バイオエタノール生産の方法の一体化した部分である。

多糖類を含有するバイオマスからのバイオエタノールの生産は、３の工程に分割することができる：１）前処理、２）発酵可能な炭水化物への多糖類の加水分解、および３）炭水化物の発酵。

前処理は、多糖類のつづく加水分解（例えば、酵素加水分解）が植物材料の他の保護構造（例えば、リグニン）の分解を必要とする場合に必要である。幾つかの前処理技術が知られている。穀物および穀類については、この前処理は表面をアクセス可能とするための単純乾燥ミルの形態とし得るが、リグノセルロース系バイオマスについては、そのうえに加熱および／または化学的な加工処理が必要である。例えば、精製したデンプンからなる多糖類を含有するバイオマスは、酵素加工処理の前に該前処理方法を必要としない。前処理加工処理は酸加水分解、蒸気爆発、酸化、アルカリまたはエタノールでの抽出ほかに基づき得る。前処理技術の共通の特徴は、可能性のある添加する反応物の作用と結合することにより、それらが１００℃を超える温度で生じる植物材料の軟化および開放の利点をとることである。

前処理の後、バイオエタノールまたは他のバイオ化学製品を製造するための多糖類を含有するバイオマスの利用における次の工程は、遊離したデンプン、セルロースおよびヘミセルロースの発酵可能な糖への加水分解である。酵素的に行う場合は、これには、異なる様式の作用を有する多数の異なる酵素が必要である。酵素は外部から添加することができ、あるいはバイオマスで増殖する微生物がそれを提供し得る。

炭水化物加水分解性セルラーゼによって、セルロースはグルコースに加水分解される。セルロース加水分解系の優勢な理解では、セルラーゼは３のクラスに分類される；セルロース鎖の末端からセロビオース単位を切り離すエキソ−１,４−β−Ｄ−グルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）（ＥＣ３.２.１.９１）；セルロース鎖中の内部β−１,４−グリコシド結合をランダムに加水分解するエンド−１,４−β−Ｄ−グルカナーゼ（ＥＧ）（ＥＣ３.２.１.４）；セロビオースをグルコースに加水分解し、かつ、セロオリゴ糖からグルコース単位を切り離す１,４−β−Ｄ−グルコシダーゼ（ＥＣ３.２.１.２１）。

ヘミセルロース中の異なる糖がヘミセルラーゼによって遊離する。ヘミセルロースの不均一な性質に起因して、ヘミセルロース加水分解系はセルロース加水分解系よりもより複雑である。該系には、特に、キシラン鎖中の内部結合を加水分解するエンド−１,４−β−Ｄ−キシラナーゼ（ＥＣ３.２.１.８）；非還元末端からキシロオリゴ糖を攻撃し、キシロースを遊離する１,４−β−Ｄ−キシロシダーゼ（ＥＣ３.２.１.３７）；内部結合を切断するエンド−１,４−β−Ｄ−マンナナーゼ（ＥＣ３.２.１.７８）；マンノオリゴ糖をマンノースに切断する１,４−β−Ｄ−マンノシダーゼ（ＥＣ３.２.１.２５）が含まれる。側鎖基は、多くの酵素；α−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３.２.１.２２）、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３.２.１.５５）、α−Ｄ−グルクロニダーゼ（ＥＣ３.２.１.１３９）、シンナモイルエステラーゼ（ＥＣ３.１.１.-）、アセチルキシランエステラーゼ（ＥＣ３.１.１.６）およびフェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３.１.１.７３）によって除去する。

デンプン加水分解に使用する最も重要な酵素は、アルファ−アミラーゼ（１,４−α−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ（ＥＣ３.２.１.１）である。これらは、１,４−α−Ｄ−グルコシド結合を切断し、１,６−アルファ−Ｄ−グルコシド分岐点を迂回できるが加水分解することができないエンド−作用型のヒドロラーゼである。しかしながら、ベータ−アミラーゼ（ＥＣ３.２.１.２）およびプルラナーゼ（ＥＣ３.２.１.４１）のようなエキソ−作用型のグリコアミラーゼも、デンプン加水分解に使用し得る。デンプン加水分解の結果は、主としてグルコース、マルトース、マルトトリオース、α−デキストリンおよび変化する量のオリゴ糖である。デンプンに基づく加水分解を発酵に使用する場合、タンパク質加水分解酵素を添加することが有利になり得る。かかる酵素は、微生物の凝集を防ぐことができ、微生物に利用可能なアミノ酸を発生し得る。

リグノセルロース系バイオマスの前処理および酵素加水分解の組合せにおいて、酸化酵素の使用が全体加水分解ならびに例えばつづく発酵に利用する微生物の生存に対して正の効果を有し得ることを見出した。この効果の理由は、酸化酵素によって引き起こされるリグニンおよび他のフェノール性インヒビターの酸化架橋である。典型的には、ラッカーゼ（ＥＣ１.１０.３.２）またはペルオキシダーゼ（ＥＣ１.１１.１.７）を、外部的にか、または応用微生物にラッカーゼ遺伝子を入れるかのいずれかで利用する。

バイオマスの酵素加水分解は以前に記載されている。しかしながら、リグノセルロース系バイオマスの場合においては、１インチ（２５.４ｍｍ）未満の平均サイズを有し、さらに比較的低い乾物含量、すなわち２０％（ｗ／ｗ）未満の乾物含量を有するファイバーおよび粒子からなる材料しか、かかる方法によっては首尾よく加水分解されていない。

米国特許第4409329号は、固体セルロース材料の糖への加水分解を記載しており、そこでは、３０−８０％（ｗ／ｗ）のセルロースを含有する３−２０％（ｗ／ｗ）の固形飼料の粒状スラリーをセルラーゼ酵素複合体で処理することによって、セルロースを単糖に加水分解している。固形セルロースを含有するチャージ・ストック（charge stock）は、０.０１ないし１インチ（０.０２５４−２５.４ｍｍ）径の平均粒子サイズを有していた。孔をあけたローターブレードを混合に使用した。

米国特許出願2002117167A号は、バイオマス材料中のヘミセルロースの酵素加水分解を記載しており、それには、ヘミセルロースの少なくとも一部分を可溶化し、可溶化したヘミセルロースを加水分解して少なくとも１の単糖類を生成することが含まれる。利用したバイオマスは、好ましくは原材料または前処理した材料の水性スラリーである。バイオマス材料は、ヘミセルロースを含むいずれのセルロース性材料であってもよい。該方法は、トウモロコシ、コムギ、イネ、エンバクまたはオオムギのような穀物ファイバーで特に有効であると記載されている。

米国特許出願2004005674A号は、リグノセルロースの酵素加水分解の方法を記載している。リグノセルロースの糖への分解には、リグノセルロースと少なくとも１の補助酵素および少なくとも１のセルラーゼとを接触させることが含まれる。リグノセルロース材料は潰され（材料の平均ファイバーサイズはさらに特定されていない）、低い乾物含量（１０ｍｌの酵素溶液中の０.２ｇの潰したかいば材料）を有していた。

発明の概要
本発明は、バイオマスを含有し、比較的高い、好ましくはバイオマスの少なくとも２０％（ｗ／ｗ）が２６−７０ｍｍに入るファイバーおよび粒子サイズの分布を有する、好ましくは比較的大きなファイバーおよび粒子からなる、および、好ましくは２０％を超える比較的高い乾物含量を有する、多糖類を含有するバイオマスの液化および糖化の方法に関する。さらに、当該方法は、特に、主としてデンプン、精製デンプン、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンからなる多糖類を含有するバイオマス、例えば、穀類またはコムギわらの液化および糖化に好適である。リグノセルロース系バイオマスの場合は、それを好ましくは、セルロースが酵素に利用可能となり、同時に前処理したバイオマス中に制限された含量の発酵インヒビターしか存在しないことが保証される様式で、１１０−２５０℃の温度に１−６０分間付すことによって前処理する。本発明は、炭水化物加水分解酵素および酸化酵素を含む加水分解酵素と、機械力、主として剪断力および引裂力（tear force）がバイオマスに加わることを保証する重力原理に頼るタイプの混合との組合せに基づいて酵素加水分解を結合する。混合の好ましいタイプは、例えば、ドラムミキサー、タンブルミキサーまたは同様の混合デバイスのような自由落下ミキサーである。

発明の詳細な説明
濃縮糖溶液の製造は、改善された容積生産性および下流の加工処理の低いコストに起因して、つづく発酵または他の微生物加工処理との関係で有利である。バイオエタノール製造の場合において、発酵ブロスが４％を超えるエタノールを含む場合は、蒸留のエネルギー要求性は顕著に低下する（GalbeおよびZacchi, 2002）。これは８％を超える糖濃度を必要とし、これは、大部分のタイプのリグノセルロース系バイオマスでは、２０％を超える初期乾物含量に対応する。換言すると、好ましくは２０％を超える、高い乾物含量を有する多糖類を含有するバイオマスを、エタノールの蒸留に好適なバイオエタノール含有発酵ブロスをつづいて製造することができるために、酵素加水分解に付すことが望ましい。

本発明の方法は、典型的には３０−５０％の酵素加水分解の程度を提供する。しかしながら、最適化した条件下では、なおより高い程度の酵素加水分解を得ることができる。液化および糖化したバイオマスは、結果的に比較的多い量のグルコース、キシロース、セロビオース、リグニン、非分解セルロースおよびヘミセルロースを含有し、さらなる加工処理、すなわち発酵加工処理（エタノール、乳酸ほか）に好適ないまだ活性な酵素を含有する。液化したバイオマスは、ガス化、水素添加、有機合成、またはバイオガスおよび飼料の生産にも好適であろう。

多糖類を含有するバイオマスがリグノセルロース系である場合、前処理により、リグノセルロース含有物の構造がより酵素に利用されやすくなることが保証され、同時に、酢酸、フルフラールおよびヒドロキシメチルフルフラールのような有害な阻害副産物を実質的に低量に留めることが保証されなければならない。このことを達成するために幾つかの戦略が存在し、そのすべては、リグノセルロース材料を１１０−２５０℃の温度に１−６０分間付すことを暗示している。例えば：
・熱水抽出
・阻害物質が形成される前に溶解した材料を取り出す多段階の希酸加水分解
・比較的低い過酷条件での希酸加水分解
・アルカリ湿潤酸化
・蒸気爆発
・つづく無毒化をともなう大部分のいずれかの前処理

本発明に係る多糖類を含有するバイオマスは、例えばデンプンの形態、ならびに精製デンプン、セルロースおよびヘミセルロースのようなポリマー性の糖を含むいずれかの材料を含有する。２０％を超える乾物含量を有するバイオマスが好ましい。

本発明に係る酵素加水分解および混合のためのバイオマスの関連したタイプには、例えば：
・デンプン、例えば穀物および精製デンプンを含有するデンプン
・かいば
・バガス
・例えばイネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、ライムギ、セイヨウアブラナ、ソルガムからのわら
・例えば、ピナス・シルベストリス（Pinus sylvestris）、ピナス・ラディアータ（Pinus radiata）のような軟木
・ヤナギ属（Salix spp.）、ユーカリノキ属（Eucalyptus spp.）のような硬木
・例えば、ビート、ジャガイモの塊茎
・例えば、イネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、ライムギ、セイヨウアブラナ、ソルガムおよびトウモロコシからの穀物
・同様の乾物含量を有する、廃棄紙、バイオガス加工処理からのファイバー画分、肥料、ギネアアブラヤシ加工処理からの残渣、自治体固形廃棄物など
のような農業的作物由来のバイオマスが含まれ得る。

多糖類を含有するバイオマスがリグノセルロース系である場合、材料は、前処理の前に、２０％（ｗ／ｗ）のバイオマスが好ましくは２６−７０ｍｍの範囲であるピースにカットし得る。前処理した材料は、混合デバイスに入れる前に好ましくは２０％を超える乾物含量を有する。バイオマスから炭水化物を開放することに加えて、前処理加工処理はバイオマスを殺菌し、バイオマスを部分的に溶解し、同時に、リグニン画分から塩化カリウムを洗い流す。

本発明に係る方法において行う混合は、少なくとも４の部分からなる目的を供する。
第１に、大部分の場合において多糖類を含有するバイオマスは不溶性または非常にわずかに溶解性であろうため、使用する酵素と多糖類を含有するバイオマス（基質）との間の緊密な接触が保証される。

第２に、混合の間に材料に行う機械的作業により、より大きなバイオマスファイバーおよび粒子を別個に破砕することが助けられ、したがって、材料の表面積を増大させる支援をするであろう。このことは、例えばセルロースおよびヘミセルロースの使用する酵素による利用性を高めるであろう。材料に対する機械的作業をさらに増加するために、材料と衝突する金属ボールまたは同様の手段をドラムに添加し得る。

第３に、材料の混合は、高いセロビオース濃度の局部的蓄積を防ぐ。当業者に知られているように、それは、例えばセルラーゼ酵素、特にセロビオヒドロラーゼを阻害し得るからである。

第４に、セルラーゼ酵素の重要な特性は、酵素性能上のセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）の影響である。ＣＢＤは、セルロース分解酵素の機能部分である。ＣＢＤは、水溶性酵素の不溶性基質表面（セルロース）への付着を可能にする。ＣＢＤによって提供される酵素およびセルロースの間の緊密な会合は、触媒速度および酵素の安定性を高める。セルロースを加水分解するためには、酵素はセルロース鎖上のＣＢＤの位置を変化させなければならない。機械的作用、すなわち、混合がＣＢＤの移動に重要であり、その結果としてセルロース鎖に沿った酵素の酵素作用に重要であると考えられる。

上述のことに加えて、バイオマスの酵素加水分解は、発酵産業で使用されているものに類似する中央に位置するインペラーシャフト上にマウントされたインペラー（例えば、ラッシュトン型タービンまたはインテミグ（Intemig）インペラー）を備えた攪拌糟リアクター中で行われていることは注意しなければならない。この器具に起因して、高粘度、非常に粘着性または非常に乾燥した材料の溶液は効率的に攪拌することができず、非常に混合が少ないまたは全く混合されないゾーンが生じる。さらに、かかる溶液の攪拌は、加工処理経済に有害な非常に大きなエネルギー入力を必要とする。多糖類を含有するバイオマスを用いた操作は、可能な上限をほぼ２０％までに以前は制限している。本発明に係る重力ベースの混合原理はこの課題を克服し、８０％まで、好ましくは２０−５０％の乾物含量を有する多糖類を含有するバイオマスに使用し得る。本発明に係る重力混合の原理は、容易にスケールアップすることができ、精製デンプンに加えて、８０％を超えるまでのセルロースを含有するすべての種類のバイオマスに適用することができる。

酵素加水分解に伝統的に使用されている従来の攪拌糟リアクターとは異なり、重力ベースの混合原理、すなわちドラムミキサー、バイオマスを持ち上げる回転軸を有するミキサーまたは自由落下原理を利用する同様の混合デバイスは、同時に、小さい電力入力および高乾物含量でさえ効率的な混合を可能にし、材料とドラムとの間の剪断力および破砕力を含む重力の力ならびに落ちる材料とドラムの底部との間の衝突から生じる力を介する機械的加工処理／分解を行い、同時に、酵素性能に対するセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）の影響に正に作用する。

例えば、比較的高い乾物含量および大きな平均ファイバーおよび粒子サイズを有する多糖類を含有するバイオマスのような非−混和性の植物材料の加工処理は、回転型のミキサーを混合に使用する固体状態発酵またはバイオリアクターから知られている（Giovanozziら, 2002）が、この原理は、専用の液化／糖化加工処理またはバイオエタノール発酵加工処理において以前に実行されていない。

本発明は比較的高い乾物含量、例えば２０−８０％、好ましくは２０−５０％の乾物含量のバイオマスの加工処理の方法を提供する。さらに、本発明に係る方法は、例えば発酵糟中の、最終産物の直接的使用を可能にする効率的な液化および糖化を保証する。

デンプン、セルロースおよびヘミセルロースまたはそれらの部分のグルコース、キシロースおよびセロビオースへの変換に作用することができる酵素を、天然形態またはかかる酵素の蓄積を生じる微生物の形態のいずれかでバイオマスに添加する。バイオマスのｐＨおよび温度は、適用する酵素の至適ｐＨおよび至適温度に参照して調節する。

酵素負荷に依存して、バイオマスは、３−２４時間以内に、いずれの残留する大きなファイバーおよび粒子を残すことなくまたは少量のみ残して、液体に液化および糖化される。加水分解および液化の間の所定の時間にグルコース代謝微生物を添加することは、阻害酵素産物がそれによって除去されるため、酵素加水分解の程度を向上し得る。

本発明に係る方法は、以下の好ましい技術的パラメータを用いて行うことができる。
・乾物含量：２０−８０％、好ましくは２５−７０％、より好ましくは２５−６０％、なおより好ましくは２５−５０％または２５−４０％、および最も好ましくは２５−３５％
・リグノセルロース系バイオマスのファイバーおよび粒子サイズの分布：０−１５０ｍｍ、好ましくは５−１２５ｍｍ、より好ましくは１０−１００ｍｍ、なおより好ましくは１５−９０ｍｍまたは２０−８０ｍｍ、および最も好ましくは２６−７０ｍｍ。ファイバーおよび粒子サイズの好ましい分布は、好ましい間隔内の範囲のリグノセルロース系バイオマスの少なくとも２０％（ｗ／ｗ）と規定する。

多糖類を含有するバイオマスがリグノセルロース系である場合、それは例えば熱水抽出によって前処理しなければならない。熱水前処理を選択する場合、以下の技術データが好ましい：
・前処理温度：１１０−２５０℃、好ましくは１２０−２４０℃、より好ましくは１３０−２３０℃、より好ましくは１４０−２２０℃、より好ましくは１５０−２１０℃、より好ましくは１６０−２００℃、なおより好ましくは１７０−２００℃または最も好ましくは１８０−２００℃。
・前処理時間：１−６０分、好ましくは２−５５分、より好ましくは３−５０分、より好ましくは４−４５分、より好ましくは５−４０分、より好ましくは５−３５分、より好ましくは５−３０分、より好ましくは５−２５分、より好ましくは５−２０分、および最も好ましくは５−１５分。
・少なくとも２０ｗ／ｗ％の前処理後の乾物含量。

重力ミキサーにおける多糖類を含有するバイオマスの酵素処理：
バイオマスを持ち上げる水平設置したスターラーシャフトを有するリアクターの形態で自由落下混合概念に基づく容器または同様の混合デバイスを用いる場合、以下の技術データが好ましい：
・回転速度：0-30 rpm、好ましくは0-20 rpm、より好ましくは0-15rpm、なおより好ましくは0-10 rpmおよび最も好ましくは0-5 rpm
・定期的に変化する回転方向を有する回転
・所定の間隔の回転

最適な回転速度は容器の容積に依存し、したがって好ましい回転速度は加工処理を比較的小さな容器中で行う場合は比較的高くし得、一方で、比較的大きな容器中で行う場合は比較的低くし得る。

・リグノセルロース系バイオマスの酵素：
−セロビアーゼ（例えば、Novozym 188）
−セルラーゼ（例えば、Celluclast 1.5FG L）
・Filter Paper Unit（ＦＰＵ）／ｇＤＭの酵素負荷
１ＦＰＵは、当業者によく知られた特定の条件下で、Whatmann#1濾紙上で１μｍｏｌ／分のグルコシド結合を加水分解するのに必要な酵素の量に等しい。しかしながら、酵素活性は、望ましい酵素活性を生じる微生物の添加を介することを含むいずれかの考え得る形態で原則として供給し得る：０.００１−１５ＦＰＵ／ｇ乾物、好ましくは０.０１−１０ＦＰＵ／ｇ乾物、より好ましくは０.１−８ＦＰＵ／ｇ乾物、より好ましくは１−７ＦＰＵ／ｇ乾物および最も好ましくは６ＦＰＵ／ｇ乾物未満に対応する。
・デンプンを含有するバイオマスの酵素：
−デンプンの加工処理における酵素：α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ
・酵素加水分解の処理時間：０−７２時間、好ましくは１−６０時間、より好ましくは２−４８時間、およびより好ましくは４−２４時間のような、６−２４時間のような、８−２４時間のような、１０−２４時間のような、１２−２４時間のような、１８−２４時間または２２時間のような３−２４時間。
・酵素加水分解の温度。適用した酵素活性の至適温度に参照して調節：０−１０５℃、好ましくは１０−１００℃、より好ましくは１５−９０℃、より好ましくは２０−８０℃、より好ましくは２５−７０℃および最も好ましくは４０−４５℃または室温のような３０−７０℃。
・バイオマスのｐＨ。適応した酵素活性の至適ｐＨに参照して調節：５−１０のような、６−９、７−８のような３−１２、および好ましくは４−１１
・酵素処理は、バッチ、フェッド−バッチまたは連続加工処理として行い得る。

実施例１：研究室スケールの酵素加水分解
２５ｇ乾物重量（＝６７.０ｇの前処理したわら）に相当する、平均サイズがほぼ４０ｍｍ（１８０−２００℃にて５−１０分間の向流水抽出、５：１の水および乾物の流動比）を有する圧縮した前処理コムギわらをプラスチックバッグに入れた。０.７５ｍＬのNovozym 188、３.７５ｍＬのCelluclast １．５ＦＧＬおよび１１.９ｍＬの５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.０を混合し、わらの上に噴霧した。これは、３０％の最終乾物含量となった。酵素負荷は、１０Filter Paper Unit（ＦＰＵ）／ｇＤＭに相当した。

ミキサーは、材料の適当な混合を保証する長軸に沿った５の内部リブを有するドラム（１.０ｍ長および０.７８ｍ径）からなる。ドラムは、２６ｒｐｍの速度で水平軸に沿って回転した。材料の混合／加水分解は、室温にて１８−２４時間行った。これにより、いずれの残留する大きなファイバーも含まない濃厚なペーストを生じた。同一の酵素負荷を有するが混合しない対照バッグは、わらの分解の兆候を何ら示さなかった。

２４時間の酵素加水分解後の得られた材料の一部（２９ｇ乾物に相当する量）をブルーキャップボトル中で１５％乾物まで希釈し、酵母（パン酵母、De Danske Spritfabrikker）を添加した。ボトルを空気を遮断して閉め、５００ｒｐｍで攪拌しつつ３０℃にて７２時間静置した。得られた液体は、３３ｇ／Ｌのエタノール、１０ｇ／Ｌのキシロースを含んでいた。グルコースが検出されなかったことは、加水分解の間に生成したすべてのグルコースを酵母が利用し得たことを示している。０.５ｇエタノール／ｇグルコースのグルコース上のエタノール収率を仮定すると、これは元のセルロースの７０％の変換に相当する。

実施例２：試作スケールの酵素加水分解
７ｋｇＤＷ（＝２０ｋｇの前処理したわら）に相当する、平均サイズがほぼ４０ｍｍ（１８０−２００℃にて５−１０分間の向流水抽出、５：１の水および乾物の流動比によって前処理）を有する圧縮した前処理コムギわらを、約１０°傾斜した水平軸を有する従来の回転式セメントミキサーに入れた。該ミキサーは長軸に沿った２の内部リブを有し、材料の混合を保証する。開口部に蓋を載せてミキサーからの蒸発を回避した。ミキサードラムは、２９ｒｐｍのスピードで水平軸に沿って回転させた。

２００−１１５０ｍＬのCelluclast １.５ＦＧＬおよび４０−２２５ｍＬのNovozym 188をわらに添加した。これは、３０％の最終乾物含量を生じた。酵素負荷は、３−１５ＦＰＵ／ｇＤＭに相当した。炭酸ナトリウムを添加することにより、ｐＨを４.８ないし５.０に調節した。

ファンヒーターを使用することによってセメントミキサーを４０−４５°に加熱した。材料の混合／加水分解は２２時間行った。酵素負荷に依存して、これは、いずれの残留する大きなファイバーも残留することなく、より高いまたはより低い粘性の液体を生じた。前処理したわらは、ほぼ３−５時間でペーストに分解した。混合の５−２４時間後に、ペーストは粘性の液体に変化した。前処理したコムギわらのみまたは１６０℃のみで前処理するが同一の酵素負荷を用いたコムギわらを用いた対照実験は、わらの液化の兆候を何ら示さなかった。

同時の糖化および発酵を、１０−１５ＦＰＵ／ｇＤＭの酵素負荷を用いて４０−４５℃にて２４時間加水分解した後に酵母をセメントミキサーに添加することによって行った。放冷して３５℃未満まで冷却し、圧縮酵母（パン酵母、De Danske Spritfabrikker）をわらの初期乾物含量に基づいてほぼ１％（ｗ／ｗ）の濃度まで添加した。糖化および発酵は、２５℃にて４８時間続けた。

得られた材料を２５００ｒｐｍにて１５分間遠心した。その上清を０.４５μｍフィルターを通して濾過し、ＨＰＬＣ上で糖について分析した。１５ＦＰＵ／ｇＤＭの酵素負荷では、上清は加水分解の２４時間後に７０ｇ／Ｌのグルコース、３０ｇ／Ｌのキシロースを含んでいた。これは、わらに元々存在していたセルロースおよびヘミセルロースの５０％の加水分解に相当する。１０ＦＰＵ／ｇＤＭの酵素負荷を用いた同時の糖化および発酵は、４２ｇ／Ｌのエタノールおよび３０ｇ／Ｌのキシロースを生じた。

実施例３：液化、加水分解および発酵
加水分解リアクターは、２０％ＤＭを超える液化および加水分解の固形物濃度で実験を行うために設計した（図１）。リアクターは、各々２０ｃｍ幅および６０ｃｍ径の５の別々のチャンバーに分割された水平に設置されたドラムからなる。各チャンバー中に３のパドルとマウントされた水平回転シャフトを、混合／振盪に使用した。１.１ｋＷモーターを運転に使用し、回転速度は２.５ないし１６.５ｒｐｍの範囲内で調節可能であった。回転の向きは、時計回りおよび反時計回りの間で毎分２回シフトするようにプログラムした。外部の水を満たした加熱ジャケットは、８０℃までの温度の制御を可能にした。

チャンバーに、ほぼ４０ｍｍの平均サイズを有する圧縮した前処理コムギわら（５：１の水および乾物の流動比で１８０−２００℃にて５−１０分間の向流水抽出によって前処理した）および水を満たして、２０ないし４０％の初期ＤＭ含量を得た。５：１の比でCelluclast １.５ＦＧＬおよびNovozym 188を添加して、ｇＤＭ当たり７ＦＰＵの酵素負荷を得た。液化および加水分解は、５０℃およびｐＨ４.８ないし５.０で行った。混合速度は６.６ｒｐｍとした。同時の糖化および発酵（ＳＳＦ）実験は、液化および加水分解の８時間後に温度を３２℃まで下げ、その後にｋｇ初期ＤＭ当たり１５ｇの圧縮パン酵母（De Danske Spritfabrikker）を添加することによって行った。

液化および加水分解は、４０％ＤＭまでの初期ＤＭで可能であった（図２および３）。初期４０％ＤＭでは、９６時間後に８０ｇｋｇ^−１のグルコース濃度を達成することは可能であった。また、ＳＳＦと同様に加工処理を操作することも可能であり（図３）、それによってグルコース蓄積によって生じるセルラーゼの生成物阻害を減少することが可能であった。普通のパン酵母を用いて４０％までの初期ＤＭ含量で加水分解物を発酵することが可能であった。完全に嫌気性でない条件下では、エタノール収率は、２０、２５、３０、３５および４０％ＤＭで理論的に得ることができるものの各々８０、７９、７６、７３および６８％であった。

実施例４：全作物の液化、糖化および発酵
リグノセルロース系およびデンプンを含有するバイオマスは、重力混合とセルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびアミラーゼの混合物を用いて同時に加工処理し得る。リグノセルロース系バイオマスは、例えば、かいば、例えばイネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、ライムギ、セイヨウアブラナおよびソルガムからのわら、塊茎、例えばビート、ジャガイモ、例えばイネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、ライムギ、セイヨウアブラナ、ソルガムからの穀物からなる農業的作物、例えば、ピナス・シルベストリス、ピナス・ラディアータのような軟木、例えば、ヤナギ属（Salix spp.）、ユーカリノキ属（Eucalyptus spp.）のような硬木からなる木本、自治体の固形廃棄物、廃棄紙、同様のバイオガスから由来し得る。

実施例３に記載した加水分解リアクターを実験に使用した。コムギわら（主にリグノセルロース源）を、５：１の水および乾物流動比で、１８０−２００℃にて５−１０分間の無流水抽出を用いて前処理した。コムギ穀物（主にデンプン源）をKongskildeローラーミルを用いて乾燥ミルした。ほぼ４０ｍｍの平均サイズを有するコムギ穀物および前処理したわらを乾燥ベースで１：１の比で混合した。水を添加することによって、ＤＭを３０ないし４０％に調節した。５：１の比のCelluclast 1.5 FG LおよびNovozym 188を添加して、わらｇＤＭ当たり７ＦＰＵの酵素負荷を得た。デンプンの加水分解は、ｋｇコムギ穀物当たり３.５ｇの負荷で冷マッシュ酵素NS50033（Novozymes A/S, Bagsveard, Denmark）を用いて行った。液化および加水分解は、５０℃およびｐＨ４.８ないし５.０で行った。８時間後に温度を３４℃まで下げ、初期ＤＭのｋｇ当たり１５ｇの圧縮パン酵母（De Danske Spritfabrikker）を添加した。平行して、３０％ＤＭのみのわらを用いた実験を行った。

わらと穀物との混合は、わらのみを適用する場合と比較して液化および加水分解工程における迅速なグルコースの初期蓄積を生じた（図４）。液化およびＳＳＦの９６時間後に、唯一の基質としてコムギわらのみを用いて、エタノール濃度は４１ｇｋｇ^−１であった。わらおよび穀物を用いる実験においては、エタノール濃度は６８ｇｋｇ^−１に達した。

実施例５：デンプンまたはデンプンを含有する材料の低温液化
本発明に係る方法は、精製デンプンまたはデンプンを含有する材料（例えば、ビート、ジャガイモ、例えばイネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、ライムギ、ソルガムからの穀物）の低温加工処理にも適用し得る。実施例４に従って、穀物の高温前処理はデンプンの液化および加水分解に必要でない。他方、乾燥ミルは、一般的にデンプン含有穀物の前処理に使用される。２０−６０％の乾物含量を有する乾燥ミル穀物を重力ミキサーに負荷する。冷マッシュ酵素NS50033（Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark）またはアルファ−アミラーゼおよびグルコアミラーゼを同時に添加する。その場合、デンプンの完全な液化および糖化が１−ポット加工処理で可能である。酵素加水分解加工処理の間の温度およびｐＨ範囲は酵素によって決まり、各々、２５−６０℃、好ましくは４０−５５℃およびｐＨ３−１２、好ましくは３−８の範囲であろう。
加工処理はＳＳＦと組合せ得る。

引用文献
Galbe, M., Zacchi, G. (2002). A review of the production of ethanol from softwood. Appl. Microbiol. Biotechnol. 59:618-628.
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http://www.unitus.it/dipartimenti/dabac/progetti/ssbioreactors/solidstatebioreactor.htm
Gregg, D., Saddler, J.N. (1995). Bioconversion of lignocellulosic residues to ethanol: Process flow-sheet development. Biomass Bioenerg. 9:287-302.
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Biochem. Biotechnol. 98-100:463-472.
米国特許第4409329号
米国特許出願2002117167A
米国特許出願2004005674A

図１は５−チャンバー加水分解リアクターの縦長図（左側）および側面図（右側）である。図２は７ＦＰＵ（ｇＤＭ）^−１の酵素負荷を用いた２０％（黒円）、２５％（黒逆三角）、３０％（黒四角）、３５％（黒菱形）および４０％（黒三角）の乾物含量の前処理コムギわらの液化および加水分解の間のグルコースの濃度を示す。図３は７ＦＰＵ（ｇＤＭ）^−１の酵素負荷を用いた２０％（円）、２５％（逆三角）、３０％（四角）、３５％（菱形）および４０％（三角）の乾物含量の前処理コムギわらの液化、加水分解および発酵の間のグルコース（白抜き記号）およびエタノール（黒塗り記号）の濃度を示す。図４は前処理したコムギわらおよび前処理したコムギわらおよびコムギ穀物の混合物の液化および発酵の間のグルコース、キシロースおよびエタノールの濃度を示す。酵母は液化および加水分解の８時間後に添加した。

Claims

２０％を超える乾物含量を有する多糖類を含有するバイオマスの液化および糖化の方法であって、該バイオマスを：
ａ）酵素加水分解、および
ｂ）バイオマスの機械的加工処理および／または分解を提供する重力ベースのタイプの混合による混合
に付すことを特徴とする該方法。
該多糖類を含有するバイオマスが、例えばかいば、バガス、例えばイネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、ライムギ、セイヨウアブラナおよびソルガムからのわら、例えばビート、ジャガイモなどの塊茎、例えばイネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、ライムギ、セイヨウアブラナ、ソルガムからの穀物からなる農業作物、例えばピナス・シルベストリス（Pinus sylvestris）、ピナス・ラディアータ（Pinus radiata）のような軟木、例えばヤナギ属（Salix spp.）、ユーカリノキ属（Eucalyptus spp.）のような硬木からなる木材、または自治体の固形廃棄物、廃棄紙、バイオガスの加工処理からのファイバー画分、肥料および同様のバイオガス由来のリグノセルロース系バイオマスである請求項１記載の方法。
多糖類を含有するバイオマスが、デンプン、例えばデンプンを含有する穀物または精製デンプンである請求項１記載の方法。
多糖類を含有するバイオマスが、デンプン、例えばデンプンを含有する穀物または精製デンプン、および、例えばかいば、例えばイネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、ライムギ、セイヨウアブラナおよびソルガムからのわら、例えばビート、ジャガイモなどの塊茎、例えばイネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、ライムギ、ソルガムからの穀物よりなる農業作物、例えばピナス・シルベストリス（Pinus sylvestris）、ピナス・ラディアータ（Pinus radiata）のような軟木、例えばヤナギ属（Salix spp.）、ユーカリノキ属（Eucaryptus spp.）のような硬木からなる木材、自治体の固形廃棄物、廃棄紙および同様のバイオマス由来のリグノセルロース系バイオマスの混合物である請求項１記載の方法。
多糖類を含有するバイオマスの乾物含量が２５−８０％である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
リグノセルロース系バイオマスの少なくとも２０％（ｗ／ｗ）が２６ｍｍを超えるファイバーサイズを有する請求項１、２または４のいずれか１項に記載の方法。
リグノセルロース系バイオマスが１１０−２５０℃の加熱前処理に付されている請求項１、２または４のいずれか１項に記載の方法。
酵素加水分解を、炭水化物加水分解酵素を含む加水分解酵素および酸化酵素の組合せで行う請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
デンプンを含有する穀物の酵素加水分解を、加水分解酵素およびタンパク質加水分解酵素の組合せで行う請求項１、３または４のいずれか１項に記載の方法。
酵素加水分解を０−１０５℃で行う請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
多糖類を含有するバイオマスの混合を、ドラムミキサー、タンブルミキサーまたは同様の混合デバイスのような自由落下ミキサーにたよる請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
酵素加水分解の処理の時間が０−７２時間である請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
バッチ、フェッド−バッチ、連続または同様の方法として行う請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
エタノール生産の方法における、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の方法によって生成した材料の使用。
乳酸生産の方法における、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の方法によって生成した材料の使用。
バイオガス生産の方法における、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の方法によって生成した材料の使用。
飼料生産の方法における、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の方法によって生成した材料の使用。