Campo da Invenção
[0001] A presente invenção refere-se a um processo para liquefação e sacarificação de biomassas contendo polissacarídeos, tendo um teor elevado de matéria seca e, preferivelmente, possuindo fibras e partículas com tamanhos médio grandes. Além disso, a presente invenção refere-se à utilização adicional de tais biomassas processadas, por exemplo, para fermentação subseqüente em bioetanol, especialmente carboidratos para alimento e alimentação, bem como alimentação de carbono para processamento em plásticos e em produtos químicos.
Antecedentes da Invenção
[0002] Numerosos processos industriais e agriculturais, por exemplo, operações da municipalidade, processamento de alimentos e alimentação e florestas geram biomassas, açúcares poliméricos contendo despejo e subprodutos, por exemplo, na forma de amido, celulose e hemicelulose. As indústrias de agronegócios e químicas, bem como as organizações públicas, têm interesse considerável nos processos de desenvolvimento para converter tais biomassas em materiais de um valor mais elevado. Assim, como exemplo, tais biomassas podem potencialmente ser convertidas em bioetanol, no biogás ou nos produtos químicos usando microorganismos e/ou enzimas hidrolíticas. Entretanto, a maioria dos processos conhecidos hoje não alcançaram ainda a prática comercial em grande escala devido ao seu alto custo de produção, e alta demanda de energia e, desse modo, incerta viabilidade econômica inerente.
[0003] Além de serem importantes como alimento e alimentação, os carboidratos a partir da biomassa podem ser usados como alimentação para um número de processos industriais. Na forma de polímeros, um produto bem conhecido é papel, onde a celulose é o componente principal. Entretanto, quando processados em oligômeros e monômeros, os carboidratos são um alimentação importante para um número de processos industriais. Conforme será descrito em detalhes, eles são necessários para um número de processos microbiais, mas, em adição, eles podem ser usados como alimentação para, por exemplo, processamento enzimático em especialmente carboidratos para alimento e alimentação, por exemplo, trealose. Também, os oligômeros e monômeros de carboidrato podem substituir petroquímicos para processamento em plásticos e em produtos químicos orgânicos. Além disso, os carboidratos podem ser usados como veículos em hidrogenação catalítica.
[0004] É, portanto, evidente que, se uma fonte de baixo custo e abundante de carboidratos processados pode ser feita disponível para processamento industrial, ela pode ter um potencial econômico substancial.
[0005] O amido é o carboidrato de armazenamento mais difundido em plantas, e ocorre na forma de grânulos, que diferem marcadamente no tamanho e nas características físicas de espécie para espécie. Os grânulos de amido são geralmente muito resistentes à penetração por ambas a água e enzimas hidrolíticas devido à formação de ligações de hidrogênio dentro da mesma molécula, e com outras moléculas vizinhas. Entretanto, estas ligações inter- e intra-hidrogênio podem tornar-se fracas a medida que a temperatura da suspensão é elevada. Quando uma suspensão aquosa do amido é aquecida, as ligações de hidrogênio se enfraquecem, a água é absorvida, e os grânulos de amido entumescem. Este processo é comumente denominado gelatinização porque a solução formada tem uma consistência gelatinosa, altamente viscosa. Quimicamente, o amido é um polímero natural de glicose, que é geralmente insolúvel, mas dispersível em água à temperatura ambiente, e composto de uma unidade de repetição similar àquela da celulose, e ligada junto pelas ligações α-1,4 e a-1,6-glicosídicas, ao contrário das ligações β-1,4-glicosidicas para a celulose. As unidades formam, ou um componente de cadeia linear, denominado amilose, ou um componente de cadeia ramificada, denominado amilopectina. Muitas sementes de planta, grãos e tubérculos contêm cerca de 20-25% de amilose. Mas alguns como, por exemplo, o amido da ervilha, contém 60% de amilose, e certas espécies de milho têm 80% de amilose. As variedades cerosas de grãos, tais como o arroz, são baixas em amilose.
[0006] Diferente do amido, os três maiores constituintes na biomassa da planta são celulose, hemicelulose e lignina, que são comumente referidas pelo termo genérico lignocelulose. As biomassas contendo polissacarídeo, como um termo genérico, incluem ambos o amido e biomassas lignocelulósicas.
[0007] A celulose, a hemicelulose e a lignina estão presentes em quantidades variadas em plantas diferentes, e nas partes diferentes da planta, e elas estão associadas intimamente para formarem a parte estrutural da planta.
[0008] A celulose é um homopolissacarídeo composto inteiramente de D-glicose ligada junto por ligações β-1,4-glicosidicas, e com um grau de polimerização até 10.000. A estrutura linear da celulose possibilita a formação de ambas ligações do hidrogênio intra- e intermolecular, que resulta na agregação das cadeias de celulose em micro fibrilas. As regiões dentro das microfibrilas com ordem elevada são denominadas cristalinas, e as regiões menos ordenadas são denominadas amorfas. As microfibrilas se reúnem em fibrilas, as quais formam, então, as fibras de celulose. A estrutura parcialmente cristalina da celulose, junto com o arranjo microfibrilar, dá à celulose resistência à tensão elevada, tornando a celulose insolúvel em muitos solventes, e é, em parte, responsável pela resistência da celulose contra a degradação microbial, isto é, hidrólise enzimática.
[0009] A hemicelulose é um polissacarídeo heterogêneo complexo composto de um número de resíduos de monômero: D-glicose, D- galactose, D-manose, D-xilose, L-arabinose, ácido D-glucurônico e ácido 4-O-metil-D-glucurônico. A hemicelulose tem um grau de polimerização abaixo de 200, tem cadeias laterais, e pode ser acetilada. Em madeira macia como abeto, pinho e os abetos vermelhos, galactoglucomanan e arabino-4-O-metil-glucuronoxilano são as frações maiores da hemicelulose. Na madeira dura como vidoeiro, tulipeiro, álamo tremedor ou o carvalho, 4-O-acetil-4-metil-glucuronoxilano e glucomanan são os constituintes principais da hemicelulose. As gramíneas como arroz, trigo, aveia e a gramínea da borla tem hemicelulose composta de principalmente glucuronoarabinoxilano.
[00010] A lignina é uma rede complexa formada pela polimerização de unidades de propano fenila, e constitui a fração não-polissacarídica mais abundante em lignocelulose. Os três monômeros na lignina são álcool p-coumaril, álcool coniferílico e álcool sinapílico, e eles são mais freqüentemente unidos através das ligações arilgliceril-β-aril éter. A lignina é ligada à hemicelulose e embute os carboidratos, oferecendo, desse modo, proteção contra à degradação microbial e química.
[00011] Conforme citado acima, as biomassas processadas podem potencialmente ser convertidas em bioetanol, ou em produtos químicos usando microorganismos e/ou enzimas hidrolíticas, ou os carboidratos a partir das biomassas processadas podem ser usados como alimentação para um número de processos industriais, por exemplo, processamento enzimático em carboidratos especialmente para alimento e alimentação, ou como substituintes para petroquímicos na produção de plásticos e produtos químicos orgânicos. Em adição, o processamento de carboidratos em biomassa, de acordo com a presente invenção, pode ser combinado com separação e fracionamento dos componentes não-carboidratos. Um uso particularmente preferido de um processo, de acordo com a presente invenção, é uma parte integrada de um processo para produção de bioetanol.
[00012] A produção do bioetanol a partir de biomassas contendo polissacarídeo pode ser dividida em três etapas: 1) pré-tratamento, 2) hidrólise dos polissacarídeos em carboidratos fermentáveis 3) e fermentação dos carboidratos.
[00013] O pré-tratamento é requerido se hidrólise subseqüente (por exemplo, hidrólise enzimática) dos polissacarídeos requerer a quebra de uma estrutura de proteção diferente (por exemplo, lignina) dos materiais de planta. Diversas técnicas de pré-tratamento são conhecidas. Para cereais e grãos, este pré-tratamento pode ser na forma de moagem seca simples de maneira a tornar as superfícies acessíveis, mas para biomassas lignocelulósicas, processos térmicos e/ou químicos são necessários também. Uma biomassa contendo polissacarídeo consistindo, por exemplo, em amido refinado, não requer referidos métodos de pré-tratamento antes do processamento enzimático. Os processos de pré-tratamento podem ser baseados na hidrólise acídica, na explosão de vapor, oxidação, na extração com álcali ou etanol, etc. Uma característica comum das técnicas de pré- tratamento é que combinadas com a ação de reagentes possivelmente adicionados, elas levam a vantagem do amaciamento e do desprendimento dos materiais de planta que ocorrem nas temperaturas acima de 100°C.
[00014] Seguindo o pré-tratamento, a próxima etapa na utilização de biomassas contendo polissacarídeo para produção de bioetanol, ou outros bioquímicos, é hidrólise do amido, celulose e hemicelulose liberados em açúcares fermentáveis. Se feito enzimaticamente, isto requer um grande número de enzimas diferentes com modos diferentes de ação. As enzimas podem ser adicionadas externamente, ou o crescimento de microorganismos na biomassa pode fornecê-las.
[00015] A celulose é hidrolisada na glicose pelas celulases carboidrolíticas. A compreensão prevalecente do sistema celulolítico divide as celulases em três classes; exo-1,4-β-D-glucanases ou celobioidrolases (CBH) (EC 3.2.1.91), que divide as unidades de celobiose a partir das extremidades das cadeias de celulose; endo-1,4- β-D-glucanases (EG) (EC 3.2.1.4), que hidrolisa ligações internas β-1,4- glicosídicas aleatoriamente na cadeia de celulose; 1,4-β-D-glucosidase (EC 3.2.1.21), que hidrolisa a celobiose à glicose e também divide as unidades de glicose a partir dos celooligossacarídeos.
[00016] Os açúcares diferentes na hemicelulose são liberados pelas hemicelulases. O sistema hemicelulítico é mais complexo do que o sistema celulolítico devido à natureza heteróloga da hemicelulose. O sistema envolve, dentre outros, endo-1,4-β-D-xilanases (EC 3.2.1.8), que hidrolisa ligações internas na cadeia xilano; 1,4-β-D-xilosidases (EC 3.2.1.37), que atacam os xilooligossacarídeos a partir da extremidade de não-redução e libera a xilose; endo-1,4-β-D-mananases (EC 3.2.1.78), que dividem as ligações internas; 1,4-β-D-manosidases (EC 3.2.1.25), que dividem manooligossacarídeos à manose. Os grupos laterais são removidos por um número de enzimas; α-D-galactosidases (EC 3.2.1.22), α-L-arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55), α-D- glucuronidases (EC 3.2.1.139), cinamoil esterases (EC 3.1.1.-), acetil xilano esterases (EC 3.1.1.6) e feruloil esterases (EC 3.1.1.73).
[00017] As enzimas mais importantes para o uso na hidrólise do amido são alfa-amilases (glucanohidrolases 1,4-α-D-glucan, (EC 3.2.1.1). Estas são hidrolases endo-ativas que dividem as ligações 1,4- α-D-glicosidicas e podem derivar, mas não podem hidrolisar os pontos de ramificação 1,6-alfa-D-glicosídicas. Entretanto, também as glicoamilases exo-ativas, tais como beta-amilase (EC 3.2.1.2) e pululanase (EC 3.2.1.41) podem ser usadas para hidrólise do amido. O resultado da hidrólise do amido é primeiramente glicose, maltose, maltotriose, α-dextrina e quantidades variáveis de oligossacarídeos. Quando o hidrolisado baseado em amido é usado para a fermentação, pode ser vantajoso adicionar enzimas proteolíticas. Tais enzimas podem impedir floculação do microorganismo, e podem gerar aminoácidos disponíveis ao microorganismo.
[00018] Em combinação com o pré-tratamento e a hidrólise enzimática de biomassas lignocelulósicas, verificou-se que o uso de enzimas oxidativas pode ter um efeito positivo na hidrólise total, bem como na viabilidade dos microorganismos empregados para, por exemplo, fermentação subseqüente. A razão para este efeito é a reticulação oxidativa das ligninas e outros inibidores fenólicos conforme causada pelas enzimas oxidativas. Tipicamente a lacase (EC 1.10.3.2) ou a peroxidase (EC 1.11.1.7) são empregadas tanto externamente ou pela incorporação de um gene da lacase no microorganismo aplicado.
[00019] A hidrólise enzimática da biomassa foi anteriormente descrita. Entretanto, no caso das biomassas lignocelulósicas, somente materiais consistindo em fibras e partículas com um tamanho médio abaixo de 25,4 milímetros (1 polegada) e, além disso, tendo um teor de matéria seca relativamente baixo, isto é, abaixo de 20% (p/p), têm sido hidrolizados com sucesso por tal método.
[00020] O documento US 4.409.329 descreve a hidrólise de material de celulose sólida para açúcar, onde a celulose é hidrolisada para açúcares simples pelo tratamento de uma polpa granular de 3-20% (p/p) de alimentação sólida contendo 30-80% (p/p) de celulose, com um complexo de enzima celulase. O estoque de carga contendo celulose sólida tem um tamanho de partícula médio de 0,0254-25,4mm (0,01 a 1 polegada) de diâmetro. Lâminas de rotor perfuradas foram usadas para mistura.
[00021] O documento US 2002.117167A descreve a hidrólise enzimática de hemicelulose no material de biomassa, compreendendo solubilizar pelo menos uma porção de hemicelulose e hidrolizar a hemicelulose solubilizada para produzir pelo menos um monossacarídeo. A biomassa utilizada é preferivelmente uma polpa aquosa de material bruto ou pré-tratado. O material de biomassa pode ser qualquer material celulósico que inclua hemicelulose. O processo é descrito como sendo especialmente eficaz com fibras de grão tais como milho, trigo, arroz, aveia ou cevada.
[00022] O documento US 2004005674A descreve um processo para hidrólise enzimática de lignocelulose. A degradação da lignocelulose para açúcares compreende contatar a lignocelulose com pelo menos uma enzima auxiliar e pelo menos uma celulase. O material lignocelulósico foi triturado (o tamanho médio da fibra do material não foi adicionalmente especificado), e tem um teor baixo de matéria seca (0.2 g de material de forragem triturado em 10 ml da solução de enzima). Sumário da Invenção
[00023] A presente invenção se refere a um processo para liquefação e sacarificação de biomassas contendo polissacarídeo, tendo um teor relativamente alto de matéria seca, preferivelmente acima de 20%, e preferivelmente consistindo em fibras e partículas relativamente grandes preferivelmente com uma distribuição de tamanhos de fibra e de partícula em que pelo menos 20% (p/p) da biomassa varia dentro de 26-70 milímetros. Além disso, o processo é particularmente adequado para a liquefação e sacarificação de biomassas contendo polissacarídeo consistindo principalmente em amido, amido refinado, celulose, hemicelulose e lignina, por exemplo, grãos ou palha de trigo. No caso das biomassas lignocelulósicas, estas são preferivelmente pré- tratadas pela sujeição à temperaturas entre 110-250°C por 1-60 min, em uma maneira que fixa a acessibilidade da celulose às enzimas e, ao mesmo tempo, fixa um teor limitado de inibidores de fermentação na biomassa pré-tratada. A presente invenção combina a hidrólise enzimática baseada na combinação de enzimas hidrolíticas incluindo uma enzima carboidrolítica e uma enzima oxidativa com um tipo de mistura baseada no princípio da gravidade assegurando a aplicação de forças mecânicas, principalmente forças de cisalhamento e de rasgamento, para as biomassas. Os tipos preferidos de mistura são, por exemplo, misturadores de queda livre, tais como misturadores de tambor, misturadores de inclinação ou dispositivos misturadores similares.
Descrição da Invenção
[00024] A produção de soluções de açúcares concentrados é benéfica em relação à fermentação subseqüente, ou outros processos microbiais, devido à produtividade volumétrica aperfeiçoada e custo reduzido de processamento de corrente descendente. No caso da produção de bioetanol, o requerimento de energia para destilação é significantemente reduzido se o caldo de fermentação contém acima de 4% de etanol (Galbe and Zacchi, 2002). Isto requer uma concentração de açúcar acima de 8%, que, com a maioria dos tipos de biomassas lignocelulósicas, corresponde a um teor de matéria seca inicial acima de 20%. É, em outras palavras, desejável submeter as biomassas contendo polissacarídeos com teores de máteria seca altos, preferivelmente acima de 20%, à hidrólise enzimática de maneira a ser capaz de subseqüentemente produzir caldos de fermentação contendo bioetanol adequados para destilação de etanol.
[00025] Os processos da presente invenção proporcionam um grau de hidrólise enzimática de tipicamente 30-50%. Entretanto, sob condições otimizadas mesmo um grau mais alto de hidrólise enzimática pode ser obtido. A biomassa liquefeita e sacarificada conterá, consequentemente, quantidades relativamente grandes de glicose, xilose, celobiose, lignina, celulose não-degradada e hemicelulose, e ainda enzimas ativas adequadas para processamento adicional, isto é, processos de fermentação (etanol, ácido láctico, etc.). A biomassa liquefeita também será adequada para gasificação, hidrogenação, síntese orgânica, ou produção de biogás e alimentação.
[00026] Se as biomassas contendo polissacarídeo são lignocelulósicas, o pré-tratamento deve assegurar que a estrutura do teor lignocelulósico seja tornada mais acessível às enzimas, e, ao mesmo tempo, as concentrações de subprodutos inibitórios nocivos, tais como ácido acético, furfural e hidroximetil furfural, permanecem substancialmente baixas. Existem várias estratégias para alcançar isto, as quais todas implicam em submeter o material lignocelulósico à temperaturas entre 110-250°C por 160 min, por exemplo: • Extração de água quente • Hidrólise de ácido diluído em múltiplos estágios, que remove material dissolvido antes das substâncias inibitórias serem formadas • Hidrólise de ácido diluído em condições de severidade relativamente baixas • Oxidação úmida alcalina • Explosão de vapor • Quase qualquer pré-tratamento com detoxificação subseqüente
[00027] As biomassas contendo polissacarídeo, de acordo com a presente invenção, incluem qualquer material contendo açúcares poliméricos, por exemplo, na forma de amido, bem como amido refinado, celulose e hemicelulose. Biomassas tendo um teor de matéria seca acima de 20% são preferidas.
[00028] Relevantes tipos de biomassas para hidrólise enzimática e mistura, de acordo com a presente invenção, podem incluir biomassas derivadas de safras agriculturais como, por exemplo: • Amido, por exemplo, grãos contendo amido e amido refinado • Forragem de milho • Bagaço • Palha, por exemplo, de arroz, trigo, centeio, cevada, aveia, centeio, nabo silvestre, sorgo • Madeira macia, por exemplo, Pinus sylvestris, Pinus radiate • Madeira dura, por exemplo, Salix spp. Eucalyptus spp. • Tubérculos, por exemplo, beterraba, batata • Cereais a partir de, por exemplo, arroz, trigo, centeio, cevada, aveia, centeio, nabo silvestre, sorgo e milho • Papel de despejo, frações de fibras a partir do processamento do biogás, adubo, resíduos a partir de processamento de palma de óleo, despejo sólido municipal, ou similares, com um teor de matéria seca similar.
[00029] Se as biomassas contendo polissacarídeos são lignocelu- lósicas, o material pode ser cortado em peças onde 20% (p/p) da biomassa preferivelmente varia dentro de 26-70 mm, antes do pré- tratamento. O material pré-tratado tem preferivelmente um teor de matéria seca acima de 20% antes de entrar no dispositivo de mistura. Além da liberação dos carboidratos a partir da biomassa, o processo de pré-tratamento esteriliza e dissolve parcialmente a biomassa e, ao mesmo tempo, retira o cloreto de potássio a partir da fração de lignina.
[00030] A mistura realizada em um processo de acordo com a presente invenção serve pelo menos a quatro propósitos.
[00031] Primeiramente, ela assegura contato próximo entre as enzimas usadas e a biomassa contendo polissacarídeo (substrato), conforme esta será, em muitos casos, insolúvel ou somente muito ligeiramente solúvel.
[00032] Em segundo lugar, o trabalho mecânico realizado no material durante a mistura ajuda no rasgamento das fibras e partículas de biomassa maiores, e, portanto, auxiliarão no aumento da área superficial do material. Isto aumentará a acessibilidade, por exemplo, da celulose e da hemicelulose às enzimas usadas. Para aumentar adicionalmente o trabalho mecânico no material, esferas de aço ou meios similares, que colidirão com o material, devem ser adicionados ao tambor.
[00033] Em terceiro lugar, a mistura do material impede o acúmulo local de alta concentração de celobiose que - conforme é bem sabido para um versado na técnica - pode inibir, por exemplo, as enzimas celulase, especialmente as celobioidrolases.
[00034] Em quarto lugar, uma característica importante das enzimas celulase é a influência dos domínios de ligação da celulose (CBD) na performance da enzima. O CBD é parte funcional das enzimas de degradação da celulose. O CBD possibilita a adesão da enzima solúvel em água em uma superfície insolúvel de substrato (celulose). A associação próxima entre a enzima e a celulose proporcionada pelo CBD aumenta a taxa catalítica e a estabilidade da enzima. Para hidrolisar a celulose, a enzima deve mudar a posição do CBD na cadeia de celulose. Acredita-se que a ação mecânica, isto é, mistura, é importante para o movimento dos CBD e, conseqüentemente, para a ação enzimática das enzimas ao longo da cadeia de celulose.
[00035] Em adição ao acima, deve ser notado que a hidrólise enzimática da biomassa tem tradicionalmente sido conduzida em reatores de tanque agitados equipados com os impulsores (por exemplo, turbina de Rushton ou impulsor de Intemig) montados em um eixo mecânico do impulsor centralmente colocado similar ao que é usado na indústria de fermentação. Devido a este equipamento, soluções de viscosidade elevada, muito viscosas, ou de material muito seco, não podem ser agitadas eficientemente, mas resultarão em zonas com muito pouco ou nenhuma mistura. Além disso, as agitações de tais soluções requerem entradas de energia muito grandes, o que é prejudicial à economia do processo. A operação com biomassas contendo polissacarídeo tem restringido previamente o limite possível superior a aproximadamente 20%. O princípio de mistura baseado na gravidade, de acordo com a presente invenção, supera este problema, e pode ser usado para biomassas contendo polissacarídeo com um teor de matéria seca até 80%, preferivelmente 20-50%. O princípio da mistura por gravidade, de acordo com a presente invenção, pode facilmente ser escalado e aplicado para todos os tipos de biomassas, além do amido refinado, contendo até mais do que 80% de celulose.
[00036] Ao contrário dos reatores de tanque agitados convencionais tradicionalmente usados para a hidrólise enzimática, um princípio de mistura baseado em gravidade, isto é, um misturador de tambor, um misturador com um eixo giratório que eleva a biomassa ou dispositivo de mistura similar utilizando um princípio de queda livre, ao mesmo tempo, possibilitam uma mistura eficiente mesmo com entradas de energia pequenas e teores elevados de matéria seca e, além disso, realizam um processamento mecânico/de degradação através de forças de gravidade incluindo forças de cisalhamento e de rasgamento entre o material e o tambor, bem como as forças resultantes do impacto entre o material em queda e o fundo do tambor e, ao mesmo tempo, afetam positivamente a influência dos domínios de ligação de celulose (CBD) na performance da enzima.
[00037] Embora o processamento de materiais de planta não- miscíveis, tais como, por exemplo, biomassa contendo polissacarídeo com teor de matéria seca relativamente elevado e tamanho de fibra e de partícula médio grande, é conhecido a partir da fermentação de estado sólido ou biorreatores, onde misturadores de tipo de inclinação são usados para mistura (Giovanozzi et al. 2002), este princípio não tendo sido previamente implementado em um processo dedicado de liquefação/sacarificação ou em um processo de fermentação do bioetanol.
[00038] A presente invenção proporciona um processo para processamento de biomassas em teores relativamente elevados de matéria seca, por exemplo, teores de matéria seca entre 20-80%, preferivelmente entre 20-50%. Além disso, o processo, de acordo com a presente invenção, assegura liquefação e sacarificação eficientes, possibilitando o uso direto do produto final em, por exemplo, fermentadores.
[00039] As enzimas capazes de efetuar uma conversão de amido, celulose e hemicelulose, ou partes destes em glicose, xilose e celobiose, são adicionadas à biomassa tanto na forma nativa como na forma dos organismos microbiais que ocorrem no acúmulo de tais enzimas. O pH e a temperatura da biomassa são ajustados com referência ao pH-ótimo e à temperatura ótima das enzimas aplicadas.
[00040] Dependendo do carregamento de enzima, a biomassa será liquefeita e sacarificada a um líquido sem qualquer ou somente com poucas fibras e partículas grandes remanescentes dentro de 3-24 horas. Adicionar um microorganismo de metabolização de glicose em qualquer tempo dado durante a hidrólise e a liquefação pode aumentar o grau de hidrólise enzimática, enquanto os produtos inibitórios da enzima são, desse modo, removidos.
Descrição Detalhada da Invenção
[00041] Um processo, de acordo com a presente invenção, pode ser realizado usando os seguintes parâmetros técnicos preferidos. • Teor de matéria seca: 20-80%, preferivelmente 25-70%, mais preferivelmente 25-60%, ainda mais preferivelmente 25-50% ou 25-40% e mais preferivelmente 25-35% • Distribuição de tamanhos da fibra e de partícula da biomassa lignocelulósica: 0-150 milímetros, preferivelmente, 5-125 milímetros, mais preferivelmente, 10-100 milímetros, ainda mais preferivelmente 15-90 milímetros ou 20-80 milímetros, e mais preferivelmente 26-70 milímetros. A distribuição preferida de tamanhos da fibra e de partícula é definida como pelo menos 20% (p/p) da biomassa lignocelulósica variando dentro do intervalo preferido.
[00042] Se a biomassa contendo polissacarídeo for lignocelulósica, ela tem que ser pré-tratada, por exemplo, por uma extração de água quente. Se um pré-tratamento hidrotérmico for escolhido, os seguintes dados técnicos são preferidos: • Temperatura de pré-tratamento: 110-250°C, preferivelmente 120-240°C, mais preferivelmente 130-230°C, mais preferivelmente 140-220°C, mais preferivelmente 150-210°C, mais preferivelmente 160-200°C, ainda mais preferivelmente 170-200°C, ou mais preferivelmente 180-200°C • Tempo de pré-tratamento: 1-60 minutos, preferivelmente 2-55 minutos, mais preferivelmente 3-50 minutos, mais preferivelmente 4-45 minutos, mais preferivelmente 5-40 minutos, mais preferivelmente 5-35 minutos, mais preferivelmente 5-30 minutos, mais preferivelmente 5-25 minutos, mais preferivelmente 5-20 minutos, e mais preferivelmente 5-15 minutos • Teor de matéria seca após pré-tratamento de pelo menos 20 p/p%.
[00043] O tratamento enzimático de biomassas contendo polissaca- rídeo em um misturador da gravidade:
[00044] se um vaso baseado no conceito de mistura de queda livre na forma de um reator com um eixo mecânico do agitador colocado horizontal que eleva a biomassa, ou dispositivo de mistura similar, é usado, os seguintes dados técnicos são preferidos: • Velocidade rotacional: 0-30 rpm, preferivelmente 0-20 rpm, mais preferivelmente 0-15 rpm, ainda mais preferivelmente 0-10 rpm, e o mais preferivelmente 0-5 rpm • Rotação com direção de rotação periodicamente alternada • Rotação em intervalos predefinidos.
[00045] A velocidade rotacional ótima dependerá do volume do vaso, a velocidade rotacional preferida podendo, desse modo, ser relativamente elevada quando o processo é efetuado em um vaso relativamente pequeno, enquanto pode ser relativamente baixa quando o processo é efetuado em um vaso relativamente grande.
[00046] • Enzimas para biomassa lignocelulósica: • Celobiase (por exemplo, Novozym 188) • Celulase (por exemplo, Celluclast 1.5 FG L) • Carregamento de enzima nas Unidades de Papel Filtro (FPU)/g DM. 1 FPU se iguala a quantidade de enzima necessária para hidrolisar 1 μmol/min de ligações glicosídicas em papel de filtro Whatmann n° 1, sob condições especificadas bem conhecidas para um versado na técnica. Entretanto, a atividade enzimática poderia, em princípio, ser fornecida em qualquer forma concebível incluindo através da adição dos microorganismos que ocorrem à atividade enzimática desejada: correspondendo a 0.001-15 FPU/g de matéria seca, preferivelmente 0.01-10 FPU/g de matéria seca, mais preferivelmente 0.1-8 FPU/g de matéria seca, mais preferivelmente 1-7 FPU/g de matéria seca, e mais preferivelmente menos que 6 FPU/g
[00047] • Enzimas para biomassa contendo amido: • enzimas no processamento do amido: alfa-amilases e glucoamylases • Tempo de tratamento para hidrólise enzimática: 0-72 horas, preferivelmente 1-60 horas, mais preferivelmente 2-48 horas, e mais preferivelmente 3-24 horas, tal como 4-24 horas, tal como 6-24 horas, tal como 8-24 horas, tal como 10-24, tal como 12-24 horas, tal como 1824 horas ou 22 horas • Temperatura para hidrólise enzimática. Ajustada com referência às temperaturas ótimas das atividades enzimáticas aplicadas: 0-105°C, preferivelmente 10-100°C, mais preferivelmente 1590°C, mais preferivelmente 20-80°C, mais preferivelmente 25-70°C, e mais preferivelmente 30-70°C, tal como 40-45°C ou, temperatura ambiente • pH da biomassa. Ajustado com referência ao pH ótimo das atividades enzimáticas aplicadas: 3-12, tal como 5-10, tal como 6-9, tal como 7-8, e, preferivelmente, 4-11 • O tratamento enzimático pode ser conduzido como um processo de massa, processo de massa alimentada, ou um processo contínuo.
Exemplo 1: Hidrólise enzimática em escala de laboratório
[00048] Palha de trigo pré-tratada prensada com um tamanho médio de aproximadamente 40 milímetros (extração de água em contracorrente a 180-200°C por 5-10 min., razão de água e fluxo de matéria seca de 5:1) correspondendo a 25 g de peso seco (= 67,0 g de palha pré-tratada), foi colocada em um saco plástico. 0,75 mL de Novozym 188, 3,75 mL de Celluclast 1.5 FG L e 11,9 mL de tampão de citrato de sódio a 50 mM, pH 5.0, foram misturados e pulverizados na palha. Isto resultou em um teor de matéria seca final de 30%. O carregamento de enzima correspondeu a 10 Unidades de Papel Filtro (FPU)/g DM.
[00049] O misturador consistiu em um tambor (1,0 m de comprimento e 0,78 no diâmetro) com os 5 nervuras internas ao longo do eixo comprido para assegurar mistura apropriada do material. O tambor gira ao longo do eixo horizontal com uma velocidade de 26 rpm. A mistura/hidrólise do material foi realizada por 18-24 horas à temperatura ambiente. Isto resultou em uma pasta espessa sem quaisquer fibras grandes remanescentes. Um saco do controle com o mesmo carregamento de enzima, mas nenhuma mistura, não mostrou sinal da degradação da palha.
[00050] Parte do material resultante após a hidrólise enzimática por 24 horas (uma quantidade correspondendo à 29 g de matéria seca) foi diluída a 15% de matéria seca em uma garrafa de tampa azul, e levedura (levedura Baker's, De Danske Spritfabrikker) foi adicionada. A garrafa foi fechada por um fechamento de ar e colocada por 72 horas a 30°C com agitação a 500 rpm. O líquido resultante continha 33 g/L de etanol, 10 g/L de xilose. Nenhuma glicose foi detectada, indicando que a levedura foi capaz de utilizar toda a glicose produzida durante a hidrólise. Assumindo-se que um rendimento de etanol em glicose de 0,5g etanol por g de glicose, isto corresponde a conversão de 70% da celulose original.
Exemplo 2: Hidrólise enzimática em escala piloto
[00051] Palha de trigo pré-tratada prensada com um tamanho médio de aproximadamente 40 milímetros (pré-tratada por extração de água em contracorrente a 180-200°C por 5-10 min. com uma razão de água e fluxo de matéria seca de 5:1) correspondendo a 7 kg DW (= 20 kg de palha pré-tratada), foi colocada em um misturador de cimento giratório convencional, com um eixo horizontal inclinado aproximadamente 10 graus. O misturador tinha 2 nervuras internas ao longo do eixo comprido para assegurar a mistura do material. Uma tampa foi montada na abertura para evitar evaporação a partir do misturador. O tambor do misturador gira ao longo do eixo horizontal com uma velocidade de 29 rpm.
[00052] 200-1150 mL de Celluclast 1,5 FG L e 40-225 mL de Novozym 188 foram adicionados à palha. Isto resultou em um teor final da matéria seca de 30%. O carregamento de enzima correspondeu a 3- 15 FPU/g DM. O pH foi ajustado para 4,8 a 5,0 pela adição de carbonato de sódio.
[00053] O misturador de cimento foi aquecido a 40-45°C pelo uso de um aquecedor de ventoinha. A mistura/hidrólise do material foi realizada por 22 horas. Dependendo do carregamento de enzima, isto resultou em um líquido mais ou menos viscoso sem quaisquer fibras grandes remanescentes. A palha pré-tratada foi degradada em uma pasta em aproximadamente 3-5 horas. Após 5-24 horas de mistura, a pasta foi transformada em um líquido viscoso. Experimentos de controle com palha de trigo pré-tratada somente, ou palha de trigo pré-tratada em somente 160°C, mas usando o mesmo carregamento de enzima, não mostrou sinal de liquefação da palha.
[00054] Sacarificação e fermentação simultâneas foram realizadas pela adição de levedura ao misturador de cimento após 24 horas de hidrólise a 40-45°C usando um carregamento de enzima de 10-15 FPU/g DM. A temperatura foi permitida resfriar para abaixo de 35°C, e levedura comprimida (levedura Baker, De Danske Spritfabrikker) foi adicionada a uma concentração de aproximadamente 1% (p/p) baseado na matéria seca inicial da palha. A sacarificação e fermentação foram continuadas por 48 horas em 25°C.
[00055] O material resultante foi centrifugado por 15 minutos a 2500 rpm. O sobrenadante foi filtrado através de um filtro de 0,45 μm, e analisado para açúcares no HPLC. Em uma carga de enzima de 15 FPU/g DM, o sobrenadante continha 70 g/L de glicose, 30 g/L de xilose após 24 horas de hidrólise. Isto correspondeu a hidrólise de 50% da celulose e da hemicelulose originalmente presentes na palha. A sacarificação e fermentação simultâneas usando um carregamento de enzima de 10 FPU/g DM resultaram em 42 g/L do etanol, e em 30 g/l de xilose.
Exemplo 3: Liquefação, hidrólise e fermentação
[00056] O reator de hidrólise foi projetado de maneira a realizar experiências com concentrações sólidas de liquefação e hidrólise acima de 20 % do DM (figura 1). O reator consistiu em um tambor horizontalmente colocado dividido em 5 câmaras separadas, cada uma com 20 cm de largura e 60 cm de diâmetro. Um eixo mecânico giratório horizontal montado com três pás em cada câmara foi usado para mistura/agitação. Um motor de 1,1 kW foi usado como acionamento e a velocidade rotacional foi ajustável dentro da faixa de 2,5 e 16,5 rpm. A direção de rotação foi programada para se alterar duas vezes um minuto entre a direção horária e anti-horária. Uma jaqueta de aquecimento preenchida com água no lado externo possibilitou o controle da temperatura até 80°C.
[00057] As câmaras foram preenchidas com a palha de trigo pré- tratada prensada com um tamanho médio de aproximadamente 40 milímetros (pré-tratada pela extração de água em contracorrente a 180200°C por 5-10 min. com uma razão de água e fluxo de matéria seca de 5:1) e água para dar um teor de DM inicial de 20 a 40 % de Celluclast 1,5 FG L e Novozym 188 em uma razão de 5:1 foram adicionados para dar um carregamento de enzima de 7 FPU por g DM. A liquefação e hidrólise foram realizadas em 50°C e pH 4,8 a 5,0. A velocidade de mistura foi 6,6 rpm. As experiências simultâneas de sacarificação e de fermentação (SSF) foram realizadas pelo abaixamento da temperatura a 32°C após 8 h de liquefação e de hidrólise, e seguindo a adição de 15 g da levedura de Baker comprimida (De Danske Spritfabrikker) por kg do DM inicial.
[00058] A liquefação e a hidrólise foram possíveis com teor de DM inicial de até 40 % do DM (figura 2 e 3). Com 40% de DM inicial foi possível alcançar concentrações de glicose de 80 g kg-1 após 96 h. Foi também possível operar o processo como SSF (figura 3), desse modo, reduzindo a inibição do produto das celulases causada pelo acúmulo de glicose. Foi possível fermentar os hidrolisatos com até teor de DM inicial de 40% usando levedura de Baker normal. Sob condições não completamente anaeróbicas, o rendimento do etanol foi 80, 79, 76, 73 e 68 % do qual foi teoricamente obtenível em 20, 25, 30, 35 e 40 % de DM, respectivamente.
Exemplo 4: Liquefação, sacarificação e fermentação da safra total
[00059] Biomassa contendo lignocelulósico e amido pode ser processada simultaneamente usando mistura de gravidade e uma mistura de celulases, hemicelulases e amilases. As biomassas lignocelulósicas podem ser derivados de safras agriculturais consistindo em, por exemplo, de forragem de milho, palha, por exemplo, de arroz, trigo, centeio, aveia, cevada, centeio, nabo silvestre e sorgo, tubérculos, por exemplo, beterraba, batata, cereais de, por exemplo, arroz, trigo, centeio, aveia, cevada, nabo silvestre, sorgo, madeira consistindo em madeira suave, por exemplo, Pinus sylvestris, Pinus radiate, madeira dura, por exemplo, Salix spp., Eucalyptus spp., despejos sólidos municipais, papel de despejo e biomassas similares.
[00060] O reator de hidrólise descrito no exemplo 3 foi usado para as experiências. Palha do trigo (primeiramente uma fonte de lignocelulose) foi pré-tratada usando extração de água em contracorrente a 180-200°C por 5-10 min. com uma razão de água e fluxo de matéria seca de 5:1. O grão de trigo (principalmente uma fonte de amido) foi moído a seco usando um moinho de cilindro Kongskilde. O grão de trigo e palha pré-tratada com um tamanho médio de aproximadamente 40 mm foram misturados em uma razão de 1:1 em uma base seca. O DM foi ajustado para entre 30 e 40 % pela adição de água. Celluclast 1,5 FG L e Novozym 188 em uma razão de 5:1 foram adicionados para dar um carregamento de enzima de 7 FPU por g DM da palha. A hidrólise do amido foi efetuada usando a enzima de mistura fria NS50033 (Novozymes A/S, Bagsv^rd, Dinamarca) em um carregamento de 3,5 g por kg de grão de trigo. A liquefação e a hidrólise foram realizadas em 50°C e pH 4,8 a 5,0. Após 8 h, a temperatura foi abaixada para 34°C, e 15 g de levedura Baker comprimida (De Danske Spritfabrikker) foram adicionados por kg de DM inicial. Uma experiência com palha somente em 30 % de DM foi realizada em paralelo.
[00061] A mistura da palha com grão resultou em uma acumulação inicial rápida de glicose na etapa de liquefação e hidrólise comparada a aplicação de palha somente (figura 4). Após 96 h de liquefação e de SSF, a concentração do etanol foi 41 g kg-1 usando somente a palha do trigo como o único substrato (figura 4). Na experiência com palha e grão, a concentração do etanol alcançou 68 g kg-1.
Exemplo 5: Liquefação a baixa temperatura de amido ou materiais contendo amido
[00062] Um processo de acordo com a presente invenção pode também ser aplicado para processamento à temperatura baixa de amido refinado ou de materiais contendo amido (por exemplo, beterraba, batata, cereais a partir, por exemplo, do arroz, trigo, centeio, aveia, cevada, centeio, e sorgo). De acordo com o exemplo 4, o pré-tratamento térmico do grão não é necessário para a liquefação e a hidrólise do amido. Moagem à seco é, por outro lado, geralmente usada para pré- tratamento de grãos contendo amido. Os grãos moídos à seco com um teor de matéria seca de 20-60% são carregados em um misturador de gravidade. A enzima misturada à frio NS50033 (Novozymes A/S, Bagsv^rd, Dinamarca), ou a alfa-amilase e as glucoamilases são adicionados simultaneamente. Uma liquefação e uma sacarificação completas do amido são então possíveis em um processo de um pote. As faixas de temperatura e pH durante o processo de hidrólise enzimática são definidas pelas enzimas, e estarão na faixa de 25-60°C, preferivelmente 40-55°C, e pH 3-12, preferivelmente pH 3-8, respectivamente.
[00063] O processo pode ser combinado com o SSF. Literatura Citada Galbe, M., Zacchi, G. (2002). A review of the production of ethanol from softwood. Appl. Microbiol. Biotechnol. 59:618-628. Giovannozzi-Sermanni, G., D'Annibale, A., Perani, C., Porri, A., Falesiedi, G. (2002). Solid-state bioreactors for the sustainability. http://www.unitus.it/dipartimenti/dabac/progetti/ssbioreactors /solidstatebioreactor.htm Gregg, D., Saddler, J.N. (1995). Bioconversion of lignocellulosic residues to ethanol: Process flow-sheet development. Biomass Bioenerg. 9:287-302. Mais, U., Esteghalalian, A.R., Saddler, J.N. (2002). Influence of mixing regime on enzymatic saccharification of steam-exploded softwood chips. Appl. Biochem. Biotechnol. 98-100:463-472. US4409329 US2002117167A US2004005674A