CN100999718A - 几丁质酶基因重组的苏云金杆菌工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种外源几丁质酶基因与cry1、cry2基因融合的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)工程菌。本发明以苏云金杆菌4.0718菌株为宿主菌，经过可调控表达载体，构建带有cry1、cry2基因强启动子序列和含有domain II序列及融合了几丁质酶基因的工程菌，将重组质粒整合到染色体DNA上能稳定遗传；经发酵生产制备的高效生物杀虫剂的效价均在6000国际单位/μg以上，对鳞翅目、双翅目与鞘翅目的昆虫杀虫率都达到95％；在相同的浓度下，双价工程菌的杀虫效果要比单价的高5－8倍以上。工程菌制剂为绿色农药，无残毒，对人、畜安全，有利保护生态环境。

Description

几丁质酶基因重组的苏云金杆菌工程菌

技术领域

本发明涉及苏云金杆菌工程菌，具体涉及一种含有外源几丁质酶基因的苏云金杆菌工程菌。

背景技术

虫害是制约农作物高产、稳产、优质的主要因素。到目前为止，农作物害虫的防治仍然依赖于化学农药。化学杀虫剂在农业生产中的确起到了重要作用，但长期使用化学农药严重污染环境及耗费大量资金，其自然界中的残留造成食物链残毒，直接威胁到人类生命安全。随着时间的推移，其危害愈来愈严重，而高毒化学杀虫剂的作用方式是非特异性的，在杀灭害虫的同时，也会杀死有益昆虫及害虫天敌，从而危及到多种生物资源，破坏生态平衡。在高毒的化学农药的重复使用下，害虫已逐年产生抗性，常规使用剂量已不能有效控制昆虫。因此，世界范围内由于害虫危害而损失作物总产量的15％～35％左右，严重时导致失收。每年全球因虫害造成的经济损失高于1000亿美元。由于化学农药引起的环境污染，害虫产生抗药性等一系列问题日益引起了人们的广泛的焦虑，生物防治也越来越受到人们的重视，人们迫切要求对害虫进行生物农药防治，来保护生态环境和农产品安全。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是对鳞翅目(Lepidopteran)、双翅目(dipteran)和鞘翅目(coleopteran)等多种害虫具有毒杀作用的微生物，Bt的杀虫活性主要来自伴孢晶体，杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)由cry基因和cyt基因编码。该种晶体毒蛋白进入昆虫消化道后，经特定蛋白酶水解，释放出毒性肽，并与昆虫消化道缘膜囊泡上的受体高亲和性结合，快速而不可逆地插入细胞质膜，形成孔或病灶，引起细胞膜非极性化，破坏细胞渗透平衡，从而导致细胞裂解。同时，Bt在昆虫的血腔中迅速增殖引起昆虫的败血症。目前普遍认为，该种晶体毒蛋白先与昆虫中肠膜上的受体结合，然后插入膜并形成孔，引起害虫死亡。苏云金芽孢杆菌不杀死害虫天敌，以其高效安全、对目标害虫的特异性而倍受人们青睐，并已逐渐成为研究最深入、应用最广泛的生物杀虫剂，但是Bt基因在应用中也存在一些问题，Bt晶体蛋白抗虫谱较窄，害虫易对杀虫晶体蛋白产生耐受性，如蔬菜害虫小菜蛾在苏云金杆菌选择压力下抗性增强，因此提高Bt制剂杀虫毒力已成为科学研究者追求的目标。近年来不少研究将2个或2个以上不同类型的抗虫基因同时导入细胞，这样能在很大程度上延缓昆虫抗性的发生。如专利号01114592.7和0128665.2的发明专利公开了蛛毒蛋白基因和鹅膏肽类毒素蛋白基因与Bt毒蛋白基因融合构建的双效工程菌提高了苏云菌杆菌的杀虫能力。

几丁质(chitin)又称甲壳质、甲壳素、是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)通过β-1、4糖苷键聚合而形成的直链大分子。几丁质广泛存在于昆虫的中肠围食膜和甲壳动物的甲壳中。它也是真菌细胞壁的主要成分，参与真菌细胞的发生和维持以及分隔的形成，对真菌的生长和功能的发挥具有特殊的意义。

几丁质酶(chitinase，EC3.2.1.14)是广泛存在于微生物和植物体内的一类蛋白质，是植物体中与防御有关的一种次生水解酶，它能催化真菌细胞壁的重要成分几丁质的水解，从而抑制真菌的生长增殖，提高植物的抗真菌能力。随着研究的不断深入，研究者不仅已从小麦、番茄、甘薯、蚕豆、烟草、大豆、水稻、黄瓜中提取和纯化了几丁质酶，而且利用几丁质酶基因培育抗虫、抗真菌基因工程植物新品种正日益成为植物防御真菌病害的一种有效途径。Angela等(1986)用试验证明植物几丁质酶是植物体中重要的抗真菌蛋白；植物产生的几丁质酶则可以通过水解病原菌的细胞壁以抵御侵害。王海波(1994)等发现蚕豆几丁质酶还可以抑制早期若蚜的存活和生殖发育。此外，从哈兹木霉和绿粘帚霉提纯的几丁质酶对灰霉菌具有抑制作用，从粘质沙雷氏菌提纯的几丁质酶对立枯丝核菌有抑制生长作用。因此，将外源几丁质酶基因导入苏云金杆菌进一步提高苏云菌杆菌生物杀虫剂的杀虫毒力、杀虫范围与生物安全性，这是一条值得探索的途径。

发明内容

本发明旨在研制一种苏云菌杆菌工程菌，通过导入外源几丁质酶基因以提高苏云菌杆菌工程菌的杀虫范围、杀虫毒力与生物安全性。

本发明是通过以下技术方案实现上述发明目的的：工程菌株为由苏云金杆菌4.0718菌株的Cry1、Cry2基因与外源几丁质酶基因chi融合构建的双效工程菌。

所述的外源几丁质酶基因包括植物烟草几丁质酶基因tchiA21、粘质沙雷氏菌几丁质酶基因schiA12和白僵菌几丁质酶基因Bbchit1。

下面结合附图进一步详述本发明。

附图说明

图1cry1基因的启动子序列、SD序列、Orf和下游终止序列

图2cry2基因的启动子序列、SD序列、Orf和下游终止序列

图3pUAc19(pUAa19)质粒的构建流程

图4表达使用的穿梭载体载体pHT315结构示意

图5pHAc19(pHAa19)质粒的构建流程

图6pUAccB19(pUAacB19)中间质粒的构建流程

图7pHUAccB5(pHUAacB5)穿梭表达质粒的构建流程

图8pUAccS19(pUAacS19)中间质粒的构建流程

图9pHUAccS5(pHUAacS5)穿梭表达质粒的构建流程

图10pUAccT19(pUAacT19)中间质粒的构建流程

图11pHUAccT5(pHUAacT5)穿梭表达质粒的构建流程

图12将带有启动序列的融合蛋白基因整合到Bt菌DNA上稳定遗传示意图

图13杀虫工程菌发酵生产工艺流程示意图

自美国的Schnepf和Whiteley分离克隆了第一个Bt cry基因以来，已有多种cry基因用于高效广谱杀虫工程菌的构建和杀虫转基因植物的培育，部分商品化的工程菌和转基因植物已带来明显的经济效益和生态效益。

昆虫幼虫的中肠的围食膜是其抵御病毒等危害的一道天然屏障，围食膜主要由几丁质构成，而几丁质酶能分解昆虫中肠围食膜和真菌细胞壁的几丁质，因而几丁质酶能增进对害虫的毒杀效果。利用cry+chi双价基因克隆是延缓对鳞翅目等多种害虫抗性、弥补Bt毒蛋白的不足、提高杀虫毒力的一条有效途径。另外从生物安全性上来说，因为几丁质酶只是对昆虫围食膜上的几丁质有作用，对人、畜等高等动物都是没有害处的，有利于生物环保。

本发明利用选育的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki)高效杀虫新菌株4.0718(CCTCC NO：M200016)及无晶体突变株(XBU001)(苏云金芽孢杆菌伴孢晶体20KbDNA中cry1Ac基因的克隆、高效表达和生物活性研究生物工程学报Vol30 No.5September 2004 656-661)作为受体菌，分别从植物、微生物和真菌中提取几丁质酶基因，将植物(烟草几丁质酶基因tchiA21)、微生物(粘质沙雷氏菌的几丁质酶基因schiA12和真菌几丁质酶基因Bbchit1)与cry1、cry2基因融合以合适的载体克隆并转入苏云金杆菌实现高表达，构建出超效、广谱、安全的新型生物杀虫剂菌株，并制备工程菌生物杀虫剂。

融合工程菌生物杀虫剂的制备，包括苏云金杆菌工程菌的构建与苏云金杆菌工程菌剂的发酵生产两部分：

一、苏云金杆菌融合工程菌的构建

首先从原始出发菌株Bt4.0718中PCR扩增出cry基因，构建中间载体质粒pUAc19(pUAa19)，然后PCR扩增不同几丁质酶的ORF，利用分子生物学，在载体质粒pUAc19(pUAa19)和几丁质酶的ORF的一端构建相同的酶切位点，酶切，用T₄ DNA连接酶连接构建形成新的双价的中间工程质粒。然后将中间工程质粒与穿梭表达载体pHT315用T₄DNA连接酶连接构建形成新的双价的目的工程质粒。将双价的目的工程质粒电转不同的宿主菌无晶体突变株(XBU001)和Bt4.0718，形成新的工程菌。其具体的操作如下：

cry基因构建中间载体质粒pUAc19(pUAa19)及质粒pHAc19(pHAa19)

提取Bt4.0718菌株的总DNA，方法参考文献[Diversity of locations for Bacillus thuringiensis crystal protein genes.J Bacteriol.1983 Apr；154(1)：419-28.]，以Bt4.0718菌株的总DNA为模板，Ac-F(5′ACG CGT CGA CTT GCA GGT AAA TGG TTC TA)、Ac-R(5′ACG CGG ATC CCA AAA ACA CCC TAT TAG TG)为引物进行PCR扩增，扩增含有上游启动序列和ORF的Cry1(图1)、Cry2(图2)基因，用Sal I/Bgl II双酶切，载体pUC19同样用Sal I/Bgl II双酶切，用碱性磷酸酶去磷酸化，两者混合，用T₄ DNA连接酶在ATP存在的条件下将两者连接起来，形成质粒pUAc 19(pUAa19)(图3)，转化E.coliDH5α中扩增。挑选多个转化，提取质粒，由于cry1、cry2基因的差异性，用Pst1酶作为选择酶，能够被Pst1酶切的质粒为pUAc19(含有cry1基因)，而不能够被Pst1酶切的质粒为pUAa19(含有cry2基因)。其具体流程参照图3。

提取质粒pUAc19(pUAa19)，其5’端和3’端分别带有Bgl II、Sal I识别位点，将片断插入表达载体pHT315(图4)，形成质粒pHAc19(pHAa19)，转化E.coli.DH5α扩增。其具体流程参照图5。

提取质粒pHAc19(pHAa19)，转化Bt无晶体突变株或Bt4.0718菌株，通过红霉素抗性平板(10μg/ml)选择转化子，并通过革兰氏染色镜检观察选择能产生晶体的转化子。得到单价cry基因表达的工程菌株。

植物烟草几丁质酶基因tchiA21与cry1、cry2基因融合基因的构建

——(1)、PCR扩增含有几丁质酶基因(tchiA21)：用碱裂解法提取质粒pBG1112，其基因参照GenBank中的基因注册号：M15173和文献[含烟草几丁质酶基因的质粒pBG1121的构建及水稻转化湖南农业大学学报Vol 28 No.2 Apr 2002]，以pBG1112质粒为模板，PCR扩增含有几丁质酶基因(tchiA21)，引物为F-5′(5′GCG CAG ATC TAT GAG GCT TAG AGA ATT CA 3′)、R-5′(5′ACG CCC ATG GTC ACA TAG TAT CGA CTA AA 3′)进行PCR扩增。在基因的5’端和3’端分别带有Bgl II/Nco I位点，同时在3’端另加终止密码子TGA。

——(2)、以Bt4.0718菌株的总DNA为模板，F-5′(5′ACG CCC ATG GTC TCATGC AAA CTC A 3′)，R-5′(5′ACG CGG ATC CCA AAA ACA CCC TAT TAG T 3′)，PCR扩增含有cry基因下游终止子。在基因的5’端和3’端分别带有Nco I/Xaml I位点，同时在3’端另加终止密码子TGA

——(3)、融合几丁质酶基因和下游终止子：将(1)(2)中的片段同时纯化，用Nco I酶切，两者混合，用T₄ DNA连接酶在ATP存在的条件下将两者连接起来，然后以这个连接产物为模板扩增融合几丁质酶基因和下游终止子。

——(4)、质粒pUAccB19(pUAacB19)和质粒pHUAccB5(pHUAacB5)的构建：将中间载体质粒pUAc19(pUAa19)和(3)中的片段同时用BglII/Xaml I双酶切，纯化回收，两者混合，用T₄ DNA连接酶在ATP存在的条件下将两者连接起来形成质粒pUAccB19(pUAacB19)(图6)，转化E.coli DH5α中扩增，Amp抗性筛选阳性转化子。

穿梭表达载体质粒pHUAccB5(pHUAacB5)的构建：将质粒pUAccB19(pUAacB19)和穿梭表达载体pHT315[图6]同时用Sal I/Xaml I酶切，回收其目的片段，两者混合，用T₄DNA连接酶在ATP存在的条件下将两者连接起来形成质粒pHUAccB5(pHUAacB5)，具体体流程见图7，转化E.coli DH5α，Amp抗性筛选阳性转化子。

——(5)、融合基因表达载体电转化无晶体突变株XBU001：电转化感受态的制备和电转化参照文献[胡宏源，夏立秋，史红娟，等。苏云金芽孢杆菌伴孢晶体20kb DNA中cry1Ac基因的克隆、高效表达和生物活性研究。生物工程学报，2004，20(5)：656-661]，电转化条件：1.8KV、200Ω、25μF。通过红霉素抗性平板初步筛选转化子，采用菌落PCR进一步鉴定和SDS-PAGE检测.

粘质沙雷氏菌的几丁质酶基因schiA12与cry1、cry2基因融合的构建

——(1)、PCR扩增含有几丁质酶基因(schiA12)：PCR扩增含有几丁质酶基因(schiA12)，其基因参照GenBank中的基因注册号：Z36294和文献[含粘质沙雷氏菌几丁质酶schiA12基因的植物转化质粒BG1112构建和水稻遗传转化农业生物技术学报2003 11 2 121-126]。以BG1112质粒为模板，以F-5′(5′GCG CAG ATC TAT GCG CAA ATT TAA TAA ACC 3′) R-5′(5′ATA TCA ATT GTC ATT GAA CGC CGG CG 3′)为引物，在基因的5’端和3’端分别带有BglII/Mun I位点，同时在3’端另加终止密码子TGA。

——(2)、PCR扩增含有cry1、cry2基因下游终止子：以Bt4.0718菌株的总DNA为模板，F-5′(5′ACG CCA ATT GTC TCA TGC AAA CTC A 3′)，R-5′(5′ACG CGGGAT CCA AAA ACA CCC TAT TAG T 3′)，PCR扩增含有cry基因下游终止子。在基因的5’端和3’端分别带有Mun I/BamH I位点，同时在3’端另加终止密码子TGA。

——(3)、融合几丁质酶基因和下游终止子：将(1)(2)中的片段同时纯化，用Mun I酶切，两者混合，用T₄ DNA连接酶在ATP存在的条件下将两者连接起来，然后以这个连接产物为模板扩增融合几丁质酶基因和下游终止子。

——(4)、质粒pUAccS19(pUAacS19)和质粒pHUAccS5(pHUAacS5)的构建：将中间载体质粒pUAc19(pUAa19)和(3)中的片段同时用Bgl II/BamH I双酶切，纯化回收，两者混合，用T₄ DNA连接酶在ATP存在的条件下将两者连接起来形成质粒pUAccS 19(pUAacS19)，具体流程见图8、转化E.coli DH5α中扩增，Amp抗性筛选阳性转化子。

穿梭表达载体质粒pHUAccS5(pHUAacS5)的构建：将质粒pUAccS19(pUAacS19)和穿梭载体pHT315同时用Sal I/BamH I酶切，回收其目的片段，两者混合，用T₄ DNA连接酶在ATP存在的条件下将两者连接起来形成质粒pHUAccS5(pHUAacS5)，具体流程见图9，转化E.coli DH5α，Amp抗性筛选阳性转化子。

——(5)、融合基因表达载体电转化无晶体突变株XBU001步骤同前述的植物几丁质酶基因与Bt基因融合基因的构建。

白僵菌的几丁质酶基因Bbchit1与cry1、cry2基因融合的构建

选用白僵菌的几丁质酶基因Bbchit1酶切位点与粘质沙雷氏菌的几丁质酶基因schiA12的相同，用BglII/Mun I双酶切，其基因参照GenBank中的基因注册号：AY147011。以白僵菌为模板，PCR扩增的引物是上游F-5′：GCG CAG ATC TAA TGT TAG GTCTTT TCG G下游R-5′：GCG CGT TAA CTT ATG CCA TGC CTT T，构建白僵菌的几丁质酶基因Bbchit1与cry1、cry2基因融合中间质粒，其表达载体构建参照图10和图11。融合基因表达载体电转化无晶体突变株XBU001，通过红霉素抗性平板初步筛选转化子，采用菌落PCR进一步鉴定和SDS-PAGE检测。

将带有启动序列的融合蛋白基因整合到Bt菌DNA上稳定遗传

1、质粒pHT5401的构建。

将野生型转座子Tn5401两端通过核酸外切酶处理去除转座酶识别的边界，用酶切的方法删除转座酶，然后插入pHT315中，产生质粒pHT5401，转入E.coli DH5α中扩增。

2、质粒pHUAccB5-1(pHUAacB5-1)、pHUAccS5-1(pHUAacS5-1)pHUAccT5-1(pHUAacT5-1)的构建

通过Triton X-100温和法提取质粒pHUAccB5(pHUAacB5)、pHUAccS5(pHUAacS5)和pHUAccT5(pHUAacT5)，将重组片段分离，纯化后插入质粒pHT5401中删除了转座酶的位点上，并用酶切去除质粒pHT5401中的Bt复制子，产生质粒pHUAccB5-1(pHUAacB5-1)、pHUAccS5-1(pHUAacS5-1)和pHUAccT5-1(pHUAacT5-1).

3、质粒pHUAccB5-1(pHUAacB5-1)、pHUAccS5-1(pHUAacS5-1)和pHUAccT5-1(pHUAacT5-1)整合到菌株4.0718的染色体上

野生型转座子转入Bt4.0718菌株的染色体上，将质粒pHUAccB5-1(pHUAacB5-1)、pHUAccS5-1(pHUAacS5-1)和pHUAccT5-1(pHUAacT5-1)电转化菌株4.0718，改造后的Tn5401及全长融合基因会整合到已存在于染色体上的野生型转座子Tn5401中，并失去转移能力，用红霉素平板选择转化子。流程见图12。

通过southern杂交、ELISA确定克隆基因存在于染色体上并能表达。

二、苏云菌杆菌工程菌剂的生产

发酵生产

双效杀虫工程剂发酵工艺流程示意图(图11)，主要包括菌种活化、一级种子罐发酵培养、二级种子罐发酵培养和生产用发酵罐培养。

1、菌种活化

将保藏的高效广谱杀虫工程菌划线接种于固体种子培养基斜面上，接种前将装有培养基的扁瓶在121℃条件下灭菌30分钟，接种后在28～35℃条件下培养30～48h，配成孢子液，以5％的接种量用于种子罐接种。

2、种子罐发酵

先将一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将孢子液接入培养液中，通入无菌空气培养，可得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在121℃下灭菌30min，装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将一级种子罐发酵液按5％～8％接种量接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，可得二级种子罐发酵菌液。

3、生产发酵罐培养

先将发酵罐灭菌，装入培养基后再灭菌，保压降温至25℃～30℃，按5％～8％的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养，通过无菌空气。

4、浓缩

发酵罐中发酵结束后，将菌液通过超滤进行浓缩、补加增效添加剂、随后装瓶。

5、灭菌及培养条件

上述灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在121℃，压力0.3-0.5kg/cm2条件下灭菌30min，发酵罐接种后，在28～35℃条件下培养36～48小时，通气量1～2Vols/vol/min，氧气含量30～40％。种子罐培养液配方：牛肉膏0.3～0.8％，蛋白胨0.7～1.2％，葡萄糖0.1～0.6％，NaCl 0.1～0.6％，MgSO₄·7H₂O 0.01～0.06％，K₂HPO₄ 0.01％～0.06％，MnSO₄ 0.02％～0.08％，pH值消毒前7.0～7.8，消毒后pH6.8～7.8。

发酵罐培养液配方：黄豆粉2～8％，玉米淀粉0.3～1.5％，NaOH 0.2～0.8％，在121℃水解20min后，过滤去除杂质，按体积补加葡萄糖1.3～2.0％，KH₂PO₄ 0.08～0.22％，K₂HPO₄ 0.10～2.2％，CaCO₃ 0.1～2.20％，FeSO₄·7H₂O 0.001～0.005％，搅拌均匀，pH值消毒前8.5～11.0，消毒后6.5～9.5。

6、发酵液要求

发酵液含活芽胞数每毫升达80亿以上，菌体量不足5％时放罐，pH值7.0-8.0，无杂菌污染。

杀虫功能验证

1、.ELISA检测毒素基因的表达产物

将已纯化的目标几丁质酶免疫兔子，获得抗体后与辣根过氧化物酶连接，形成酶联抗体；将培养的细菌用超声波处理后，将总蛋白电泳后转膜、用抗体杂交，洗脱、显色，确定是否有毒素表达。

2、.验证表达的正确性

通过HPIC纯化融合蛋白，C端测序可确定表达是否正确。

3、室内杀虫试验确定工程菌株的杀虫效价。

本发明的工程菌生物杀虫剂，是一种产生Bt毒蛋白和经基因克隆后产生几丁质酶蛋白的苏云金杆菌制剂，该制剂的苏云金杆菌工程菌的芽孢含量在80亿/ml以上，制剂的效价在6000国际单位/μg以上，制剂对鳞翅目、双翅目和鞘翅目害虫幼虫杀虫率达95％以上。在相同的浓度下，双价工程菌的杀虫效果要比单价的高5-8倍以上.工程菌为绿色农药，无残毒，对人、畜安全，有利保护生态环境。

本发明与现有的生物农药相比具有以下优点：

(1)、杀虫效果好：由于工程菌株分别带有多种杀虫毒素Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Ac、Cry2Aa与几丁质酶，除了自身的杀虫能力外还具有显著的正协同作用，能对害虫产生胃毒及触杀双重效果，因此杀虫效价更高，效价能达到6000国际单位/μg以上。

(2)、杀虫谱广：工程菌自身带有多种杀虫毒素，同时由于几丁质酶基因与改造后的ICPs domain II区域以融合蛋白形式表达，使其可识别的范围增大，同时能对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多类害虫有效，因此在使用上防治面很广，成本相对较低。

(3)、安全性更高：由于工程菌所携带的昆虫毒素均为天然毒蛋白，容易为自然界中的微生物所降解和易受阳光紫外线破坏、不形成残留；同时，各种昆虫毒素对人、畜均无害。因此，在生态环境保护、出口创汇及促进人类健康等方面有极大的优势。

Claims (2)

1、一种苏云金杆菌工程菌，其特征在于该工程菌为由苏云金杆菌4.0718菌株的Cry1、Cry2基因与外源几丁质酶基因chi融合构建的双效工程菌。

2、按照权利要求1所述的苏云金杆菌工程菌，其特征在于所述的外源几丁质酶基因包括植物烟草几丁质酶基因tchiA21、粘质沙雷氏菌几丁质酶基因schiA12和白僵菌几丁质酶基因Bbchit1。

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