RU2004117085A - Высокие уровни конститувного продуцирования защитного антигена сибирской язвы - Google Patents

Claims (14)

1. Способ получения защитного антигенного белка сибирской язвы из Е.coli с использованием культуры с подпиткой, предусматривающий трансформацию клеток Е.coli DH5α рекомбинантной конститутивной экспрессионной плазмидой, содержащей ген РА, для получения рекомбинантных клеток Е.coli DH5α , экспрессирующих белок РА, выращивание указанных рекомбинантных клеток Е.coli DH5α и испытание экспрессии РА посредством лизиса указанных клеток с последующим электрофорезом в денатурирующем геле и методом Вестерн-блоттинга с использованием РА-антител, ферментацию указанных клеток в биореакторе с использованием полиолов, углеводов или органических кислот в качестве первичных добавок в среде-бульоне Луриа при 32-42° С, способа культивирования с подпиткой и рН-DO-статного метода для определения питательной депривации для получения культуры высокой плотности, экспрессирующей белок РА; приводящую к высокому выходу, сбор указанных клеток путем центрифугирования указанной культуры высокой плотности клеток при 5000-10000 об/мин в течение 10-30 мин, солюбилизацию указанных клеток культуры высокой плотности клеток с использованием 6-8 М раствора мочевины и перемешивание при температуре окружающей среды в течение 1-2 ч, отделение дебриса указанной культуры высокой плотности клеток центрифугированием при 10000-15000 об/мин в течение 30-60 мин при 32-42° С и сбор супернатанта, содержащего денатурированный мочевиной РА, выделение указанного денатурированного мочевиной РА из указанного супернатанта и очистку его Ni-NTA-хроматографированием с постепенным удалением мочевины, в то время как указанный РА связывается с этой аффинной колонкой, и элюцию указанного очищенного ренатурированного РА и хранение защитного антигенного белка (РА) в виде замороженных аликвот при (–20) - (-70)° С, в зависимости от немедленного или долгосрочного использования.

2. Способ по п.1, где указанная используемая рекомбинантная конститутивная экспрессионная плазмида экспрессирует белок РА в виде нерастворимых телец включения в клетках Е.coli штамма DH5α .

3. Способ по п.1, где сбор указанных клеток путем центрифугирования указанной культуры высокой плотности клеток проводят при 5000 об/мин в течение 10 мин.

4. Способ по п.1, где центрифугирование дебриса указанной культуры с высокой плотностью клеток проводят при 10000 об/мин в течение 30 мин для максимизации сбора указанных клеток.

5. Способ по п.1, где указанным полиолом, используемым во время ферментации в качестве первичной добавки в среде-бульоне Луриа при 37° С, является глицерин.

6. Способ по п.1, где указанными углеводами, используемыми в качестве первичной добавки в среде-бульоне Луриа при 37° С, являются глюкоза, галактоза, мальтоза, фруктоза и лактоза.

7. Способ по п.1, где указанной органической кислотой, используемой в качестве первичной добавки в среде-бульоне Луриа при 37° С, является яблочная кислота.

8. Способ по п.1, где с использованием полиола, углевода или органической кислоты в качестве первичной добавки в среде-бульоне Луриа максимальная плотность клеток варьирует в диапазоне между 10 и 13 единицами оптической плотности в культурах во встряхиваемых колбах.

9. Способ по п.1, где максимальная плотность клеток в случае рекомбинантных клеток достигается с использованием культур с подпиткой, содержащих MgSO₄.

10. Способ по п.1, где концентрация среды-бульона Луриа, используемая в подпитке, составляет 5-25Х.

11. Способ по п.1, где концентрация среды-бульона Луриа, используемая в подпитке, составляет 25Х для минимизации объема подпитки, добавляемого во время ферментации.

12. Способ по п.1, где указанной плазмидой является вектор серии pQE, содержащий узнаваемый Е.coli промотор фага.

13. Чистый защитный антигенный белок сибирской язвы, экспрессируемый в безопасном хозяине Е.coli, полученный по любому из предыдущих пунктов.

14. Антиген сибирской язвы, содержащий очищенный структурно, биологически и функционально активный рекомбинантный защитный антигенный (РА) белок Bacillus anthracis, экспрессируемый в виде слитого с 6Х-гистидином белка в клетках Е.coli DH5α , не содержащий полисахаридов, мертвых бактерий, культуральной среды, водорастворимых и не растворимых в воде побочных продуктов и суспендированных примесей.