CN100347189C - 炭疽保护抗原的高水平组成性生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用补料分批培养在大肠杆菌中制备炭疽保护抗原蛋白的方法。该方法建立了在大肠杆菌中快速、有效、有成本效益和高水平生产炭疽保护抗原(PA)的组成型表达系统。该方法的步骤涉及用含PA基因的重组组成型表达质粒转化大肠杆菌DH 5α细胞以获得重组DH 5α细胞和通过裂解所述细胞、接着变性凝胶电泳及使用PA抗体的蛋白质印迹技术来测试PA的表达。接着发酵并收集高细胞密度的细胞。所述的细胞用6-8摩尔尿素溶解并离心分离。尿素变性的PA从上述上清液中分离、纯化并此后洗脱。

Description

炭疽保护抗原的高水平组成性生产
技术领域
本发明涉及使用补料分批培养(fed Batch culture)在大肠杆菌中高水平组成性生产炭疽保护抗原。
发明背景
炭疽是一种动物源性疾病，由革兰氏阳性的孢子形成细菌炭疽杆菌(Bacillusanthracis)引起。保护抗原PA是所有抗炭疽疫苗中的主要成分。至今，炭疽杆菌的培养上清液是纯化PA的主要来源。但是，炭疽杆菌的培养工作需要P3级的设施，这在成本上是过高的。除此以外，从炭疽杆菌中制备PA常常污染其他炭疽毒性蛋白。研究人员试图在其他微生物中，如枯草芽胞杆菌、杆状病毒和大肠杆菌中表达和提纯PA。从枯草芽胞杆菌中提纯PA的产量少，要求生长在丰富的培养基中，由于生物体分泌蛋白酶大量的PA被降解(L.W.J.Baillie等，Lett.Appl.Microbial(1994)19，225-227)。杆状病毒载体在昆虫细胞中表达PA；但是，由于产量低，不可能提纯。虽然PA已经能在大肠杆菌中表达，但超量生产蛋白的努力尚未成功(M.H.Vodkin等，Cell，(1983)34，693-697)。研究人员也通过引导该蛋白到周质间隙，但纯化的PA产量很低。所有已知的用于保护抗原表达的大肠杆菌表达系统是需要使用IPTG(一种昂贵的化学品)的诱导系统。
美国专利2,017,606描述了在合适的培养基上培养炭疽杆菌并从培养基中分离杆菌以制备炭疽抗原。
美国专利2,151,364描述了生产炭疽疫苗的方法，该方法包括制备炭疽孢子悬浮液并把该悬浮液加到含明矾的无菌悬浮溶液中。
上述美国专利的缺点是它们都使用炭疽杆菌培养或孢子。炭疽杆菌是一种传染性生物，处理时不能没有保护设施。炭疽杆菌中保护抗原的表达水平很低。这种疫苗制备物也会被炭疽杆菌中的毒性和非毒性蛋白污染，导致许多副作用和致反应性。
本发明的目的是建立使用补料分批培养在大肠杆菌中快速、有效、有成本效益和高水平生产炭疽保护抗原的组成型表达系统。
为获得上述本发明的目标，提供使用补料分批培养在大肠杆菌中制备炭疽保护抗原(PA)的方法包括：
-用含PA基因的重组组成表达质粒转化大肠杆菌DH 5α细胞以产生重组DH5α细胞表达PA蛋白，
-培养上述重组DH 5α细胞并通过裂解上述细胞、接着变性凝胶电泳及使用PA抗体的蛋白质印迹(Western Blotting)技术来测试PA的表达。
-在生物反应器中使用下列步骤发酵上述细胞：
●在32-42℃多羟基化合物、碳水化合物或有机酸作为主要补充物加入Luria Broth培养基，
●补料分批培养技术，和
●用pH-DO静态方法检测营养丧失以产生表达PA蛋白的高细胞密度培养物，
-用离心方法收集所述的细胞，以5000-10,000rpm、10-30分钟离心所述高密度细胞培养物，
-使用6-8摩尔尿素溶液溶解所述高密度细胞培养物，并在环境温度搅拌1-2小时，
-在32-42℃以10,000-15,000rpm离心分离所述高密度细胞培养物碎片30-60分钟，并收集含尿素变性PA的上清液，
-从所述上清液中分离所述的尿素变性PA，用Ni-NTA色谱法提纯所述的PA并通过逐步除去尿素而所述的PA结合在亲和柱上，
-洗脱所述提纯的复性PA，并在-20到-70℃作为冷冻等分部分储存保护抗原(PA)蛋白，温度取决于即时使用还是长期使用。
所述用于表达PA蛋白的重组组成型表达质粒在大肠杆菌菌株DH 5α细胞中为不溶解包含体。
以5000rpm对所述的高细胞密度培养物离心10分钟收集所述细胞。
以10,000rpm对所述的高细胞密度培养物碎片离心30分钟最大限度地收集所述细胞。
在发酵期间用作主要补充物加入Luria Broth培养基的所述的多羟基化合物是甘油。
用作主要补充物加入Luria Broth培养基的所述的碳水化合物是葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、果糖或乳糖。
用作主要补充物加入Luria Broth培养基的所述的有机酸是苹果酸。
通过使用多羟基化合物、碳水化合物或有机酸作为Luria Broth培养基的主要补充物，在摇瓶培养中最大细胞密度的范围是10-14光密度单位。
通过使用含有MgSO4的补料分批培养获得重组细胞的最大细胞密度。
用于培养的Luria Broth培养基的浓度是5-25X。
用于培养的Luria Broth培养基的浓度是25x以便在发酵时加入的补料体积最小化。
所述质粒是含大肠杆菌可识别的噬菌体启动子的pQE系列载体。
炭疽抗原包括纯化的结构上、生物学上和功能上有活性的炭疽杆菌的重组保护抗原(PA)蛋白，这些抗原在不含多糖、死细菌、培养基、水溶性和不溶于水的副产品和悬浮的杂质的大肠杆菌DH 5α细胞中表达为6X组氨酸融合蛋白。
附图的简要描述
本发明参考下列方案和附图进行描述。
图1显示在摇瓶培养中最大光密度是通过使用葡萄糖作为附加的碳源获得的，最小光密度是通过使用麦芽糖获得的。
图2显示分批培养和使用MgSO4和不使用MgSO4的补料分批培养中获得的光密度。
图3显示产生的重组PA在生物学上和功能上与炭疽杆菌来源的天然PA一样有活性。
发明的详细描述
包含在pQE系列载体中克隆的PA基因的重组组成性表达质粒用于转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞。所述包含重组质粒的细胞在具有100μg/ml氨苄青霉素的Luria Broth培养基中37℃250rpm生长过夜。以5,000rpm离心20分钟收集细胞。PA的表达和定位用SDS-PAGE确定。超过90％的重组蛋白在包含体中发现。发现蛋白表达量的增长与生长的培养物中细胞密度的增长成正比。
葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、苹果酸和甘油作为七种不同的碳源在摇瓶中制备每个都是5X浓度的改良的100ml LB的复合培养基。只有没有任何附加碳源的LB(培养基)作为对照。等摩尔量的碳原子用作碳源，浓度控制在与0.5％葡萄糖相等。还加入10mM MgSO4，100mM磷酸钾和痕量元素。所有的烧瓶在同时接种，使用包含所述重组质粒的过夜生长的DH 5α细胞接种物。样品每小时无菌收集并测定OD600。收集培养物等分部分，它们的重组蛋白含量用SDS-PAGE分析。以葡萄糖作为主要碳源可获得最高的OD600(在600毫微米的光密度)，使用LB和麦芽糖的例子中可见到最低的OD600(图1)。使用苹果酸、麦芽糖和甘油作为主要碳源可获得最大蛋白浓度。使用Lb和乳糖的例子中可见到最低蛋白浓度。
配备pH、温度、溶解氧和消沫剂探头的5L Biostat B(B Braun BiotechInternational)发酵罐用于发酵。发酵罐与个人电脑相连。MFCS/win 2.0软件被用来获取数据并以批量和补料分批模式运行发酵罐。
用于发酵的培养基是由含MgSO4.7H2O(10mM)磷酸钾(5g/L)和甘油(1％)，pH 7.4的Luria Broth培养基组成的复合培养基。对于补料分批培养，在高压灭菌前加入MgSO4。甘油也在高压灭菌前加入。用25％甘油(w/v)和25X LB制备25x补料并分别高压灭菌。磷酸钾也被单独高压灭菌，在达到室温后，在开始运行前无菌地加入。在高压灭菌前pH探头用pH7.0和9.2的标准缓冲液校准。在高压灭菌后，发酵罐培养基通过加入1N NaOH/1M HCL自动调节到pH7.4，温度被设定在37℃。DO(溶解氧)探头的校准是通过设定溶解氧的电子零值在零到+15毫微安培(nAmp)的范围，100％DO值设定在搅拌速度为250rpm，泵抽空气的氧张力为2vvm。发酵罐在批量相开始，工作体积为2L。含有重组质粒的细胞在选择性压力的100μg/ml氨苄青霉素下的LB中，37℃、250rpm生长过夜。用1％过夜生长的培养物接种发酵罐。DO值设定在40％，搅拌器被调到级联模式。在此模式中，在接种后，DO值开始降至40％以下，搅拌器速度自动增加以保持DO值在40％。每隔1小时收集样品。培养物等分分部被稀释到光密度(OD600)大约0.5单位以下。当生长的培养物达到log中期，使用蠕动泵(Pharmacia)加入25x补料开始加料。加料速度被监控和手动控制以保持pH值在7.2和7.4之间。在OD达到70后需要补充氧气。使用发酵罐的Gasmix功能对培养物提供氧气。在培养物生长到OD600 120单位后收集细胞。消沫剂一开始在高压灭菌前加入培养基中，以后在需要时加入。
为了优化培养基成分和连续运行发酵的其他条件，在有甘油的改良LB的培养基中加入或不加入MgSO4来进行一系列的批量培养。在没有MgSO4的改良LB(以甘油为碳源)中批量运行获得最大OD～14，而在有MgSO4的改良LB中批量运行可获得超过18的OD600值。可以推断MgSO4对高密度细胞生长是必需的。在生长培养基中加入MgSO4对发酵中获得较高生物量产量是必需的(图2)。
5ml高密度细胞培养物用预先称量的试管以10,000g离心半小时。在抽取上清液后，具有离心细胞的试管在天平上称量以确定湿细胞重量。为确定干细胞重量，相同的试管在70℃培养箱中过夜，第二天称重。
为了检查发酵罐中质粒pMW1的稳定性，在发酵过程中每小时无菌收集培养物样品。该样品被稀释到每个样品的OD600～5.0，以10,000g离心一分钟。上清液被完全抽取后，沉积物悬浮于含有100mM磷酸钾缓冲液，8M尿素，pH8.0的100μl裂解缓冲液。这些样品进行SDS-PAGE以检查重组质粒的蛋白表达。质粒DNA的集落制备和小量制备也被用于直接检查表达细胞内的重组质粒的存在。没有发现明显的无质粒细胞的产生。
蛋白在变性条件下用金属螯合亲和色谱法进行纯化。简言之，100ml培养物的沉淀再悬浮于含有100mM磷酸钠缓冲液，300mM氯化钠和8M尿素(pH8.0)的100ml变性缓冲液。再悬浮的沉淀在旋转摇床上，37℃培育2小时。该裂解物在室温下离心两次，每次60分钟，上清液与50％Ni-NTA浆混合。该浆被灌到柱上并使之沉淀。流过物再加到柱上。Ni-NTA基质用含8M尿素的500ml变性缓冲液洗涤，接着用8M-0M尿素梯度在柱上使蛋白复性。该蛋白用洗脱缓冲液中有250mM咪唑氯化物，有250mM咪唑的pH 8.0的100mM磷酸钠和300mM氯化钠洗提。每部分10μl在SDS-PAGE上分析。含蛋白的部分被收集，集中并用含50mM NaCl的10mM HEPES缓冲液透析和等分地冷冻储藏在-70℃。
特定的蛋白可以用许多方法测定。使用BioRad凝胶文件管理系统和QuantityOne软件进行光密度测量。通过计算在联合LF(1μg/ml)，37℃，3小时杀灭50％J774A.1巨噬细胞样细胞(EC50)所需要的蛋白的量来确定不同阶段的PA的纯化倍数。通过Bradford方法和测定制备物在280nm的OD来测量纯化的蛋白。PA占细胞总蛋白30％以上，在细胞中以包含体的形式存在。在细胞内产生5-8g/L的PA。
rPA(重组PA)的生物活性也用对J774A.1巨噬细胞样细胞系的细胞毒性分析来确定。所有的实验都重复三次。简言之，不同浓度的rPA蛋白连同LF(1μg/ml)一起加到细胞中。从炭疽杆菌天然的PA连同LF一起作为阳性对照。3小时后，用MTT染料来确定细胞存活力，所得的沉淀物溶解在含0.5％(w/v)的十二烷基硫酸钠、在90％异丙醇中25mM HCl的缓冲液中。用微型板读数器(microplate reader)(BioRad)在540nm读出吸收情况，确定存活力百分比。发现rPA连同LF一起能完全裂解巨噬细胞，其生物活性与炭疽杆菌制备的PA相似。发现rPA与nPA的EC50各在～50ng/ml(图3)。蛋白的纯化倍数通过上述细胞毒性分析在纯化的每个阶段确定(表1)。
                                     表1
                           来源于大肠杆菌的PA的纯化
  部分     体积(ml)   蛋白(mg/ml)     活性(EC50)a   纯化(倍数)b
  细胞裂解液亲和纯化     1025   2911.8     57.30.0241   11965
aEC50定义为杀灭50％J774A.1细胞所需的与LF(1μg/ml)一起的PA(μg/ml)浓度。在3小时培育后，存活力由MTT染料确定。结果代表三个实验的平均值。
b纯化倍数由细胞裂解液的EC50除以由不同柱上获得的部分的EC50确定。
讨论
任何重组蛋白的超表达取决于表达系统的各种成分的最佳构型。许多因素强烈地影响重组蛋白表达如启动子强度、质粒稳定性、质粒拷贝数、转录终止子、最终增强mRNA稳定性的转录和翻译效率、翻译终止子、基因转录的紧密调节、核糖体的有效性、翻译后修饰、重组蛋白本身的稳定性和溶解性，及宿主细胞和培养条件。针对异源蛋白表达的高水平的步骤使用强启动子如T5，T7，PL，PR，Ptrc，Ptac，以建立一个有效的表达系统。这些系统中的大多数携带可诱导启动子和在诱导前有一个低或无产物形成的阶段。在诱导时，特定的产率在短时间内达到最大，蛋白连续产生达4-5小时。已报道在诱导后有许多变化如碳代谢发生变化导致醋酸盐堆积，呼吸作用增加，持家蛋白(house keeping proteins)的合成下降，和出现热休克样反应和SOS反应。所有这些反应导致重组产物的降解。包含体的形成使重组蛋白避免细胞蛋白酶的冲击，否则这种冲击会导致蛋白的广泛降解，导致低产物回收。在不同时间点上的SDS-PAGE和蛋白质印迹(Western Blotting)分析，证实了重组质粒pMW1的PA表达不是泄漏的和该表达与培养物的OD成比例的事实。没有明显的降解，细胞内的大多数蛋白是包含体形式。
一旦建立了强表达系统，采用不同技术的高细胞密度培养能明显增加大肠杆菌中重组蛋白的产生。能常规获得超过50g/l干重的细胞浓度以提供有成本效益的重组蛋白生产。但高细胞密度培养也有一些缺点如底物抑制、氧转运能力有限、生长抑制副产物的形成和有限热消散导致发酵罐混合效力的下降。高细胞密度培养(HCDC)中重组蛋白生产的一个主要问题是醋酸盐的堆积，它是对细胞生长有害的亲脂剂。据报道在生长培养基中醋酸盐的堆积降低了重组蛋白的生产。在补料分批培养中已开发了许多策略来减少醋酸盐形成，如通过限制培养基的必需营养物如碳或氮源来控制特定的生长速度，改变生长条件和大肠杆菌菌株。由于发酵研究的主要目标是有成本效益生产重组产品，开发使所需产品的产量最大化的培养方法是重要的。生长培养基的成分对增加产品形成和减少醋酸盐是关键的。醋酸盐是大肠杆菌在氧有限的情况下或有氧情况下葡萄糖过多存在时，当碳流动在中心代谢通道超过其生物合成的需要和细胞内能量产生的能力时产生的。
以生长动力学和重组蛋白产量为基础，从7种碳源中选出甘油作为HCDC的主要碳源，7种碳源即葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、苹果酸和甘油。使用甘油作为碳源时不产生醋酸盐，使用甘油相对容易获得高细胞密度。与葡萄糖相比，甘油转运入细胞的速度较低，显然导致经过糖酵解的碳流动减少；大大减少了醋酸盐形成，细胞在甘油中生长较慢。甘油也有消沫作用，在发酵运行过程中导致起泡沫少。
利用营养补料的方法对HCDC的成功也很关键，因为它影响细胞密度和细胞生产率。在营养有限的条件下进行恒定或间歇补料。虽然其他补料方法已经成功应用于大肠杆菌的HCDCs，近来已经开发了有反馈控制方案的更复杂的补料方法。补料速度结合其他物理参数如DO(溶解氧)、pH、微生物热和CO2放出速度(CER)。补料的DO静态(DO-stat)方法是基于当底物耗尽时培养物中DO急剧增加的事实。当营养水平下降和较少可被细胞利用的氧时，细胞不能迅速生长。因此，在DO静态方法中，DO上升超过预设值时通过自动加入营养物来保持底物浓度在所需的范围内。另一种选择，pH静态(pH-stat)方法是基于当主要碳源有限时培养基pH变化的事实。当碳源耗尽时，pH开始升高主要是由于细胞排出/分泌铵离子的浓度增高的结果。
对补料系统的分析起自对探测和检测方法的鉴定。通过检查DO和pH对补料速度波动的反应来检测呼吸作用中的饱和度。一旦开始补料，大肠杆菌进入对数期，补料的消耗或多或少是指数方式。但是，必须控制补料速度使之不超过营养需求或补料消耗速度。这是通过维持pH和DO靠近它们的设定值来完成的。pH和DO的下降是底物过量的征兆。pH和DO值的上升表明碳源或某一底物有限，所以需要补料。如果补料波动/速度的增加不能产生任何明显的反应，即DO的下降或搅拌器速度的增加，一种理想的征兆是，一些其他因素如MgSO4，KH2 PO4或痕量元素变得有限，这种情况下必须间歇加入。加入后上述变量会有迅速变化。当没有葡萄糖或任何其他主要碳源时，大肠杆菌能使用醋酸盐作为碳源。醋酸盐消耗的特征是预设值偏差到较低pH值和氧消耗开始出现循环模式，直至培养中逐渐恢复预设的pH值。此时补料重新开始。
DO静态方法对营养损耗的反应比pH静态方法更快。当复合底物与碳水化合物底物一起使用时，DO的变化不比连续使用复合底物的细胞明显。本实验中使用的补料方法是结合了pH静态方法和DO静态方法。同时监测两种参数更好地控制生长培养的生长条件。使用这种底物补料的方法，我们能获得120的OD，该值比批量培养获得的OD高6倍，比摇瓶培养高23倍。
这是首次报道补料分批HCDC的最优化条件以获得大肠杆菌中PA的高产量。本工作试图获得大量的能作为未来候选疫苗的非致反应性的PA。本文报道的生产PA的方法使用新颖和有利的底物和简单容易的控制补料方法，这些也可以成功应用到其他重组蛋白表达系统以获得高产量的产物。

Claims (12)

1.一种使用补料分批培养在大肠杆菌中制备炭疽保护抗原的方法，其包括如下步骤：
(a)用含保护抗原基因的重组组成型表达质粒转化大肠杆菌DH 5α细胞以产生表达保护抗原蛋白的重组DH 5α细胞，
(b)培养所述重组DH 5α细胞并通过裂解所述细胞、变性凝胶电泳及使用保护抗原抗体的蛋白质印迹技术来测试保护抗原的表达，
(c)在生物反应器中使用下列步骤发酵所述细胞：
(i)多羟基化合物、碳水化合物或有机酸作为主要补充物在32-42℃加入Luria Broth培养基，
(ii)补料分批培养技术，和
(iii)用pH-DO静态方法检测营养丧失以产生表达保护抗原蛋白的高细胞密度培养物，
(d)以5000-10,000rpm对上述高密度细胞培养物离心10-30分钟收集所述细胞，
(e)使用6-8摩尔尿素溶液溶解所述高密度细胞培养物，并在环境温度搅拌1-2小时，
(f)在32-42℃以10,000-15,000rpm离心分离所述高密度细胞培养物碎片，30-60分钟，并收集含尿素变性保护抗原的上清液，
(g)从所述上清液中分离所述的尿素变性保护抗原，用Ni-NTA色谱法提纯所述的保护抗原并通过逐步除去尿素而所述的保护抗原结合在亲和柱上，
(h)洗脱所述提纯的复性的保护抗原，并在-20到-70℃冷冻等分部分储存保护抗原蛋白。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述用于表达保护抗原蛋白的重组组成型表达质粒在大肠杆菌菌株DH 5α细胞中为不溶解的包含体。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于以5000rpm对所述的高密度细胞培养物进行离心10分钟收集所述细胞。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于以10,000rpm对所述的高密度细胞培养物碎片进行离心30分钟，以最大限度地收集所述细胞。
5.权利要求1所述的方法，其特征在于在发酵中用作主要补充物在37℃加入Luria Broth培养基的所述的多羟基化合物是甘油。
6.权利要求1所述的方法，其特征在于用作主要补充物在37℃加入LuriaBroth培养基的所述的碳水化合物是葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、果糖或乳糖。
7.权利要求1所述的方法，其特征在于用作主要补充物在37℃加入LuriaBroth培养基的所述的有机酸是苹果酸。
8.权利要求1所述的方法，其特征在于通过使用多羟基化合物、碳水化合物或有机酸作为Luria Broth培养基的主要补充物，在摇瓶培养中最大细胞密度的范围是10-13光密度单位。
9.权利要求1所述的方法，其特征在于通过使用含有MgSO4的补料分批培养获得重组细胞的最大细胞密度。
10.权利要求1所述的方法，其特征在于用于补料的Luria Broth培养基的浓度是5-25X。
11.权利要求1所述的方法，其特征在于用于补料的Luria Broth培养基的浓度是25x以便使发酵时加入的补料体积减少到最小。
12.权利要求1所述的方法，其特征在于所述质粒是含大肠杆菌可识别的噬菌体启动子的pQE系列载体。
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