UA80809C2 - Process for preparation of protective antigen protein of anthracis with e.coli - Google Patents
Process for preparation of protective antigen protein of anthracis with e.coli Download PDFInfo
- Publication number
- UA80809C2 UA80809C2 UA20040503327A UA20040503327A UA80809C2 UA 80809 C2 UA80809 C2 UA 80809C2 UA 20040503327 A UA20040503327 A UA 20040503327A UA 20040503327 A UA20040503327 A UA 20040503327A UA 80809 C2 UA80809 C2 UA 80809C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- cells
- medium
- protective antigen
- protein
- recombinant
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 4
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 claims abstract description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 69
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 30
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 18
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 16
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 15
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 13
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 10
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 10
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 8
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 7
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 6
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 6
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 claims description 6
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 5
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 claims description 5
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 5
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 claims description 5
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 4
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 4
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 4
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 claims description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 claims description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 claims 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 18
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 15
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 12
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 12
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 229960002235 anthrax antigen Drugs 0.000 description 3
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- JDIIGWSSTNUWGK-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazol-3-ium;chloride Chemical compound [Cl-].[NH2+]1C=CN=C1 JDIIGWSSTNUWGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000035472 Zoonoses Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- -1 ammonium ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960005447 anthrax vaccines Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000006860 carbon metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000003936 denaturing gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000017525 heat dissipation Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015816 nutrient absorption Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000009751 slip forming Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Description
Опис винаходу
Цей винахід стосується способу конститутивного одержання захисного антигену антракс з високим рівнем 2 виходу продукту в Е.соїї, використовуючи культуру підживлюваних клітин. Рівень техніки
Антракс -- це зоонозне захворювання, викликане грампозитивними, спороутворюючими бактеріями Васіїїшв апіпгасіз. Захисний антиген (ЗА) є головним компонентом усіх вакцин проти антраксу. На сьогодні супернатанти культури В. апіпгасіз є головним джерелом очищення ЗА. Проте, робота з культурами в. апіпгасіз потребує РЗ обладнання, яке є дорогим. Окрім цього, препарати ЗА з в. апійгасіз часто містять домішки інших білків 70 токсинів антракс. Дослідники намагалися експресувати та очищати ЗА з інших мікроорганізмів, таких як Васійив зи,ибійв5, Васціомігиз та Е.соїї. Виділення ЗА з Васіиз зибБійїз дало поганий вихід, потребувало росту в збагаченому середовищі й велика кількість ЗА руйнувалася завдяки протеазам, які секретувалися організмом
І.МУ. 9. Ваїййе еї аїЇ, Гек. Аррі. Мікробіаії (1994) 19, 225-227). Бакуловірусні вектори експресували ЗА в клітинах комах; однак, очищення не було можливим завдяки, можливо, низькому виходу. Хоча ЗА й 12 експресували в Е.соїї, спроби надекспресувати білок виявилися невдалими |М. Н. МоакКіп еї аї, СеїІ, (1983) 34, 693-697). Дослідники також очищали ЗА, спрямовуючи білок у периплазматичний простір, однак, вихід очищеного ЗА був дуже низьким. Усі відомі експресійні системи для експресії захисного антигену, використовуючи Ес.соїї, є індуцибельними системами, що потребують використання ІРТО, дорогого реагенту. (Патент США Мо2017606| описує одержання антигену антракс шляхом вирощування Васіїїи5 апійгасів на 20 придатному культуральному середовищі та виділення бактерії з культурального середовища. (Патент США Мо2151364) описує спосіб одержання вакцини антракс, який складається з одержання суспензії спор антракс та додавання до суспензії стерильного розчину, що містить галун.
Недоліками вищезгаданих патентів США є те, що вони обидва використовують Васіїїиз апійгасіз культури або спори. Васі: апійпгасіз є інфекційним організмом і з ним не можливо працювати без використання захисного с 25 обладнання. Кількість захисного антигену, що експресується в Васійй5 апійгасії, є дуже низькою. Цей вид Ге) одержання вакцини також містить домішки інших токсичних та нетоксичних білків з ВасійШе апійгасів, що призводить до появи побічних ефектів та реакційності.
Метою цього винаходу є створення конститутивної експресійної системи для швидкого, ефективного, прибуткового та високопродуктивного одержання ЗА антракс з Е.соїї, використовуючи культуру клітин. о 30 Для досягнення вищезгаданої мети цей винахід пропонує процес одержання білка захисного антигену Га») антракс з Е.соїї, використовуючи культуру клітин, що складається з: - трансформації клітин ОНба Е.соїї рекомбінантною плазмідою, що конститутивно експресується, яка містить со
ЗА ген, для одержання рекомбінантних ОНба клітин, що експресують білок ЗА, Га») - вирощування вищезгаданих рекомбінантних клітин ОНба та тестування експресії ЗА лізисом вищезгаданих 35 клітин з наступним денатуруючим гель-електрофорезом та методом Вестерн-блотинг, використовуючи антитіла со до ЗА, - ферментування вищезгаданих клітин у біореакторі, використовуючи: - поліоли, вуглеводи або органічні кислоти як первинні додатки у І игіа Вгоїйп середовищі за 32 - 422С, « - культивування культури підживлюваних клітин, та З 10 - використання рН-рО-віаї методу підвищення чутливості до відміни поживного компоненту для одержання с культури з високим вмістом клітин, що експресують білок ЗА, "з - збирання вищезгаданих клітин центрифугуванням вищезгаданої культури з високим вмістом клітин за 5000-10000об/хв протягом 10-30 хвилин, - солюбілізації вищезгаданої культури з високим вмістом клітин, використовуючи 6-8 М розчин сечовини та 75 перемішуючи за температури навколишнього середовища протягом 1-2 годин, со - виділення осаду вищезгаданої культури з високим вмістом клітин центрифугуванням за 10000-15000 об/хв («в протягом 30-60 хвилин за 32-422С та збирання супернатанту, що містить ЗА, денатурований сечовиною, со - виділення вищезгаданого ЗА, денатурованого сечовиною з вищезгаданого супернатанту та очищення його
Мі-МТА хроматографією шляхом поступового видалення сечовини, у той час як вищезгаданий ЗА зв'язаний з (ав) 50 колонкою для афінної хроматографії, та с - елюювання вищезгаданого очищеного ренатурованого ЗА та зберігання білка захисного антигену (ЗА) як заморожених аліквот за температури від -20 до -702С залежно від термінового або довготривалого використання.
Вищезгадана використовувана рекомбінантна конститутивна експресійна плазміда експресує білок ЗА як нерозчинні включення в ОНба клітинах штаму Е.соїї.
Збирання вищезгаданих клітин центрифугуванням вищезгаданої культури з високим вмістом клітин (Ф) виконується за 5000об/хв протягом 10 хвилин.
Ге Центрифугування осаду вищезгаданої культури з високим вмістом клітин виконується за 10000об/хв протягом
ЗО хвилин для збільшення збирання вищезгаданих клітин. во Вищезгаданим поліолом, використовуваним як первинний додаток у І Шгіа Вгоїй середовищі під час ферментації, є гліцерин.
Вищезгаданими вуглеводами, використовуваними як первинний додаток у І игіа Вгоїп середовищі, є глюкоза, галактоза, мальтоза, фруктоза та лактоза.
Вищезгаданою органічною кислотою, використовуваною як первинний додаток у І ціа Вгоїй середовищі, є яблучна кислота. б5 Використовуючи поліол, вуглевод або органічну кислоту як первинні додатки у І шгіа Вгоїй середовищі,
максимальна кількість клітин сягає між 10-14 одиницями оптичної густини для культур, які вирощують у колбах.
Максимальна кількість рекомбінантних клітин досягається, використовуючи культуру клітин, що містить
Мао».
Концентрація І игіа Вгоїй середовища, що використовується для споживання, становить 5-25Х.
Концентрація І игіа Вгоїй середовища, що використовується для споживання, становить 25Х для того, щоб мінімізувати об'єм поживного середовища, доданого під час ферментації.
Вищезгаданою плазмідою є роОЕ вектор, що містить промотор фага, який впізнається Е.соїї.
Антиген оантракс складається з очищеного структурно, біологічно та функціонально активного 70 рекомбінантного захисного антигену (ЗА) білка Васіїйиз5 апінгасіз, експресованого як 6Х гістидиновий складений білок в Е.сої ОНба клітинах, що не містить полісахаридів, мертвих бактерій, культурального середовища, водорозчинних та нерозчинних побічних продуктів та суспендованих включень.
Короткий опис графічних матеріалів
Винахід буде описано з посиланням на наступний протокол та супровідні графічні матеріали.
На Фігурі 1 показано, що максимальну оптичну густину в культурі для вирощування в колбі одержують, використовуючи глюкозу як додаткове джерело вуглецю, а мінімальну оптичну густину одержують, використовуючи мальтозу.
На Фігурі 2 показано оптичну густину, одержану в культурі клітин та культурі підживлюваних клітин з використанням та без використання Мао5О,.
На Фігурі З показано, що одержаний рекомбінантний ЗА є біологічно та функціонально активним і природним
ЗА з ВасіПиз апінгасів.
Рекомбінантну плазміду з властивою конститутивною експресією, що містить ЗА ген, клоновану у вектор серн рРОЕ, використовували для трансформації компетентних клітин штаму ОНба Е.соїї. Вищезгадані клітини, що містять рекомбінантну плазміду, вирощували протягом ночі за 37 «С та 250об/хв в І шгіа ргоїй з 100 мкг/мл сч ампіциліну. Клітини збирали центрифугуванням за 5000об/хв протягом 20 хвилин. Експресію та локалізацію ЗА підтверджували за допомогою ЗО5-РАСЕ. Більш ніж 9095 рекомбінантного білка виявляли у включеннях. о
Кількість експресованого білка підвищувалась у прямій пропорції з підвищенням кількості клітин вирощуваної культури.
Складне середовище модифікованого 100 мл ІВ 5х концентрацій кожне одержували з глюкози, фруктози, ду
Зо галактози, лактози, мальтози, яблучної кислоти та гліцерину як семи різних джерел вуглецю в колбах. Лише І В без будь-якого додаткового джерела вуглецю використовували як контроль. о
Рівнозначну кількість атомів вуглецю використовували як джерело вуглецю, а концентрацію підтримували Ге) рівнозначну 0,595 глюкози. Також додавали 10 мМ МазоО»4, 100 мМ фосфату калію та слідові елементи. Усі колби засівали водночас посівним матеріалом ОНба клітин, які вирощували протягом ночі, що містив вищезгадану -
Зз5 рекомбінантну плазміду. Зразки збирали асептично щогодини та вимірювали ООеоо- Аліквоти культур збирали о та їх вміст рекомбінантного білка аналізували за допомогою 5О5-РАСЕ. Найвища ООсоро (оптична густина за 600 нанометрів) може бути досягнута там, де глюкозу використовували як головне джерело вуглецю та найнижчу
Оеоо спостерігали у випадку ЇВ та мальтози (Фігура 1). Максимальну концентрацію білка одержували, використовуючи яблучну кислоту, мальтозу та гліцерин як головне джерело вуглецю. Найнижчу концентрацію « білка спостерігали у випадку І В та лактози. шщ с А БІ Віовіаї В (В Вгашп Віоїесп Іпіегпайопа!) ферментер, обладнаний зондами для рН, температури, й розчинного кисню та протипінним зондом, використовували для ферментації. Ферментер було підключено до «» персонального комп'ютера. Програмне забезпечення МЕСобл/Лміп 2.0 використовували для обробки даних та керування ферментера в режимах як культури клітин, так і підживлюваної культури клітин.
Середовище, яке використовували для ферментації, було складним середовищем, що складалося з І Шгіа
Ге | Во з МаЗзО4х7НоО (10ММ), фосфату калію (5г/л) та гліцерину (195) за рН 7,4. Для культури клітин Мо950 4 додавали до середовища перед автоклавуванням. Гліцерин також додавали до середовища перед о автоклавуванням. 25Х поживне середовище одержували з 2595 гліцерину (вага/об'єм) та 25Х ІВ та о автоклавували окремо. Розчин фосфату калію також автоклавували окремо, охолоджували до кімнатної 5р температури і додавали асептично відразу перед початком. рН зонд калібрували зі стандартними буферами рн о 7,0 та 9,2 перед автоклавуванням. Після автоклавування середовища, ферментер автоматично підводили до рн
Ге) 7,А додаванням ТМ Масним Неї і встановлювали температуру 37202. БО (розчинний кисень) зонд калібрували, встановлюючи електронно значення нуля розчинного кисню у діапазоні від нуля 4-15 наноампер (нАмпер) і 10090 ро значення надавали тиску кисню в 2 м/т накачуваного повітря за швидкості перемішування 250 об/хв. Ферментер включали у фазі культури клітин з робочим об'ємом гл. Клітини, що містять рекомбінантну плазміду, вирощували протягом ночі в ЇВ під селективним тиском 100 мкг/мл ампіциліну за 372, 250 об/хе. 195 нічної о культури використовували для посіву у ферментер. БО значення встановлювали на 4095 і перемішувач іме) переключали на каскадний режим. У цьому режимі після посівання, як тільки БО починає падати нижче 40905, швидкість перемішувана підвищується автоматично для підтримання значення на рівні 4095. Зразки збирали в бо інтервалах 1 години. Аліквоти культури розводили до оптичної густини (ОЮОвоо) приблизно нижче 0,5 одиниць. Як тільки вирощувана культура досягала середини лог-фази, починали подавати 25Х середовище, використовуючи перистальтичний насос (РНагтасіа). Швидкість подачі спостерігали та вручну контролювали для підтримання рн значення між 7,2 та 7,4. Додавання кисню ставало необхідним після досягання ОЮ 70. Кисень подавали до культури, використовуючи СбСавзтіх функцію ферментера. Культуру вирощували до ООбо0 120 одиниць, після 65 чого клітини збирали. Протипінну речовину спочатку додавали до середовища перед автоклавуванням, а пізніше її додавали як і коли потрібно.
Для оптимізації складу середовища та інших умов для наступної д ферментації, серії культивування клітин виконували на модифікованому І В з гліцерином з додаванням або без додавання М950, в середовище для зростання. Культивування клітин без
МазоО, в модифікованому І В (з гліцерином як джерелом вуглецю) дозволяло одержати максимально ОО 14, тоді як культивування з МаЗО 5 в модифікованому ІВ дозволяло одержувати значення ОО оо більше за 18. Був зроблений висновок, що Мо95О, є необхідним для росту клітин за більшої щільності. Включення МаоЗО у в середовище для зростання є необхідним для досягнення більшого виходу біомаси під час ферментації. (Фігура 2). 70 бмл культури з високим вмістом клітин центрифугували за 100009 протягом півгодини в попередньо зважених пробірках. Після висушування супернатанту пробірку з центрифугованими клітинами зважували на вагах для визначення сирої ваги клітин. Для визначення сухої ваги клітин ту саму пробірку лишали протягом ночі в інкубаторі за 702 і зважували наступного дня.
Для перевірки стабільності плазміди РМУУ1 у ферментері зразки культури асептично збирали щогодини під 7/5 час ферментації. Зразки розводили так, щоб ООеосо кожного зразка становило 5,0, і центрифугували за 100009 протягом 1 хвилини. Супернатант висушували повністю й осад суспендували в 100мкл буфері для лізису, що містить буфер -- 100ММ фосфату калію, рН 8,0 з 8 М сечовиною. Ці зразки піддавали 505-РАСЕ для перевірки на експресію білка з рекомбінантної плазміди. Також одержували препарати колоній та мініпрепарати плазмідної
ДНК, щоб безпосередньо перевіряти присутність рекомбінантної плазміди всередині експресованих клітин. Не спостерігали жодного утворення клітин без плазміди.
Білок очищали, використовуючи метал-хелат хроматографію за спорідненістю за денатуруючих умов.
Коротко, осад зі 100мл культури ресуспендували в 7О00мл денатуруючого буфера, що містить 100ММ фосфатно-натрієвий буфер, ЗООММ хлорид натрію та 8М сечовину (рН 8,0). Ресуспендований осад інкубували за 372 протягом 2 годин на коловому вструшувачеві. Лізат центрифугували двічі протягом 60 хвилин кожний за с
Кімнатної температури і супернатант перемішували з 5095 Мі-МТА суспензією. Суспензію наносили на колонку й залишали для врівноваження. Проточний потік повторно пропускали через колонку. МІ-МТА основу промивали і)
БО0Омл денатуруючого буфера, що містить 8М сечовину, з наступною ренатурацією білка в колонці, використовуючи 8М-ОМ градієнт сечовини. Білок елюювали 250мММ хлоридом імідазолу в буфері для елюювання, 100мММ фосфатом натрію рН 8,0 з 250мММ імідазолом та ЗО0мМ хлоридом натрію. ТОмкл кожної фракції Ф) аналізували на 1295 5ЮО5-РАСЕ. Фракції, що містять білок, збирали, змішували та діапізували проти 10ММ буфера НЕРЕЗ, що містить 5ОММ Масі і зберігали замороженими за -702С в аліквотах. о
Специфічний білок визначали кількома методами. Денситометрію виконували, використовуючи систему о
Віокай і програмне забезпечення Оцапійу Опе. Ступінь очищення ЗА визначали на різних стадіях, підраховуючи кількість білка, потрібного для загибелі 5095 2774А.1 макрофаг-подібних клітин (ЕС 5о) разом з І Е (1 мкг/мл) о протягом З годин за 37 «С. Очищений білок визначали за методом Бредфорда, а також визначенням 00 (оо) препарату за 280нм. ЗА приходився на більш ніж 3095 загального білка клітини і був присутній у клітині у формі включення. 5-8г/л ЗА утворювався всередині клітин.
Біологічну активність рЗА (рекомбінантний ЗА) також визначали аналізом на цитотоксичність на .)774А.1 « макрофаг-подібній лінії клітин. Усі експерименти виконували тричі. Коротко, різні концентрації рЗА білка разом з І Е (мкг/мл) додавали до клітин. Природний ЗА з В. апінгасів разом з І Е використовували як позитивний - с контроль. Після З годин життєздатність клітин визначали, використовуючи МТТ барвник, а осад, що утворився, ч розчиняли в буфері, що містить 0,595 (вага/об'єм) додецил сульфату натрію, 25ММ НСЇ в 9095 ізопропіловому є» спирті. Поглинання зчитували за 540 нм, використовуючи мікрогіланшетний зчитувач (ВіоКад), і визначали відсоток життєздатності. Було виявлено, що рЗА разом з І Е були повністю здатні лізувати клітини макрофагів і його біологічна активність була подібною до ЗА, одержаного з В. апіпгасіз. ЕСьо рзЗА та нЗА (нативний захисний (ее) антиген) становила «бОнг/мл кожного (Фігура 3). Ступінь очищення білка визначали на кожній стадії очищення о вищезгаданим аналізом на цитотоксичність. (Таблиця 1) со я. 7 очна й 25 1,8 0,0241 1965 о а ЕСбо визначається як концентрація ЗА (мкг/мл) разом з І Е (1мкг/мл), потрібна для загибелі 5095 У774А.1 клітин. Після З годин інкубації життєздатність визначали за допомогою барвника МІГ. Результати представляють їмо) середнє трьох експериментів. в Ступінь очищення визначали діленням ЕС 50 для лізату клітин на ЕС5о для фракцій, одержаних з різних 60 колонок.
Обговорення
Надекспресія будь-якого рекомбінантного білка залежить від оптимальної конфігурації різних елементів системи експресії. Кілька факторів значно впливають на експресію рекомбінантного білка, силу промотора, стабільність плазм іди, кількість копій плазмід, термінатори транскрипції, ефективність транскрипції та 65 трансляції, що врешті решт підсилює стабільність МРНК, термінаторів трансляції, чітку регуляцію транскрипції генів, доступність рибосом, посттрансляційні модифікації,- стабільність та розчинність самого рекомбінантного білка, а також клітину-хазяїна та умови культивування. Процеси, в яких досягається високий рівень експресії чужорідного білка, використовують сильні промотори, такі як Т5, 77, РІ, РК, Рігс, Ріас, для створення ефективних експресійних систем. Більшість із таких систем містять індуцибельні промотори й індукції передує фаза низького утворення або відсутності утворення продукту. Після індукції специфічна швидкість одержання підвищується до максимальної за короткий термін і білок безперервно утворюється протягом 4-5 годин. Після індукції відбуваються деякі зміни, такі як зміни в метаболізмі вуглецю, що призводять до накопичення ацетату, підвищення дихальної активності, зменшення синтезу власних білків та появи білків теплового шоку та
ЗОБ-реакцій. Усі з цих реакцій ведуть до деградації рекомбінантних продуктів. Утворення включень 7/0 перешкоджає руйнуванню рекомбінантного білка клітинними протеазами, які можуть призвести до значної деградації білка, тобто до низького виходу виділеного білка. ЗО5-РАСЕ та Вестерн-блот аналізи у різних проміжках часу підтверджують той факт, що експресія ЗА з рекомбінантної плазміди РММУУї є незалежною від розглянутих факторів та пропорційною ОО культури. Без жодної значної деградації більшість білка була присутня всередині клітин у формі включень.
Як тільки створена сильна експресійна система, одержання рекомбінантного білка в Е.сой може бути значно підвищене, використовуючи культури з високим вмістом клітин, застосовуючи різні способи. Концентрації клітин більше, ніж 50 г/л сухої ваги може бути загально прийнято досягнуто для прибуткового одержання рекомбінантних білків. Однак, культури з високим вмістом клітин також мають кілька недоліків, такі як інгібування субстратом, обмежена здатність переносити кисень, утворення інгібіторів росту й обмежене 2о розсіювання тепла, що призводить до зменшення перемішуваної ефективності ферментера. Головною проблемою одержання рекомбінантних білків у культурі з високим вмістом клітин (НСОС) є накопичення ацетату, ліпофільного агента, що є шкідливим для росту клітин. Накопичення ацетату в середовищі для зростання зменшує вихід рекомбінантного білка. Було розроблено кілька стратегій для зменшення утворення ацетату в культурі клітин, наприклад, контролювання специфічної швидкості росту обмеженням необхідних поживних сч ов речовин у середовищі, таких як джерело вуглецю або азоту, змінюючи умови росту та штами Е.соїї. Оскільки первинною метою досліджень у ферментації є прибуткове одержання рекомбінантних продуктів, важливою є і) розробка методу культивації, який дозволяє збільшувати вихід бажаного продукту. Склад середовища для росту є критичним для збільшення продукту утворення, а також зменшення ацетату. Ацетат одержували в Е.сої за умов обмеженої доступності кисню або за присутності надлишку глюкози за аеробних умов, коли потіквуглецюв (зу зо центральному метаболічному шляхові перевищує метаболічну потребу в ньому та здатність утворювати енергію всередині клітини. о
На основі кінетики росту та виходу рекомбінантного білка гліцерин був обраний як головне джерело вуглецю (ду для НСОС з 7 інших джерел вуглецю, а саме: глюкози, фруктози, лактози, галактози, мальтози, яблучної кислоти та гліцерину. Ацетат не утворюється, коли гліцерин використовують як джерело вуглецю, висока кількість клітин о
Зз5 Може бути досягнута відносно легко, використовуючи гліцерин. Менша швидкість транспорту гліцерину в клітину, со порівняно з глюкозою, очевидно призводить до зменшення потоку вуглецю через гліколіз, значно зменшуючи утворення ацетату, і клітини ростуть більш повільно на гліцерині. Гліцерин також має протипінний ефект, що призводить до меншого піноутворення під час процесу ферментації.
Спосіб подачі поживного середовища є також критичним для успішного ведення НСОС, оскільки він впливає « 70 як на кількість клітин, так ії на продуктивність. Постійне або періодичне підживлення виконується за умов з с нестатку поживних речовин. Хоча й інші види живлення успішно використовувались у НСОС в Ес.соїї, нещодавно були розроблені й більш складні способи з системами зворотного контролю. Швидкість живлення поєднується з ;» іншими фізичними параметрами, такими як БО (розчинний кисень), рН, утворювана теплота та швидкість утворення СО» (СЕК). БО-віаї метод живлення оснований на факті, що БО в культурі підвищується різко, коли субстрат закінчується. Клітини не здатні рости швидко, оскільки кількість поживних речовин зменшується й
Го! клітини використовують менше кисню. Таким чином, в методі бО-віаі концентрація субстрату підтримується в бажаних межах автоматичним додаванням поживних речовин, коли БО сягає вищезгаданого встановленого о значення. Іншою альтернативою є те, що рН-5іаі метод оснований на факті, що рН середовища змінюється, коли о головне джерело вуглецю зменшується. Коли джерело вуглецю закінчується, рН починає рости здебільшого як 5р результат підвищення концентрацій іонів амонію екскретованих / секретованих клітинами. о Аналіз системи подачі поживного середовища починається з характеристики зондування та методу
Ге) визначення. Метою є визначення насичення в диханні, перевіряючи БО та реакцію рН на зміни у швидкості подачі. Як тільки живлення починається й Е.соїї входить у лог-фазу, поживні речовини поглинаються більше або менше в експоненційній манері. Однак, швидкість подачі живлення має контролюватися так, щоб вона не перевищувала потреби в живленні або швидкості поглинання поживних речовин. Це здійснюється. шляхом підтримки рН та БО біля їх встановлених значень. Зменшення рН та БО є-ознакою передозування субстрату.
Ф) Підвищення значень рН та БО вказують, що джерело вуглецю або один із субстратів закінчується і, таким чином, ка потрібне підживлення. Якщо підвищення подачі/швидкості живлення недостатнє для утворення будь-якої значної відповіді, тобто зменшення БО або збільшення швидкості перемішування, це є явною ознакою того, що якийсь во інший фактор, такий як Мо95О 5, КНоРО,, або слідові елементи почали закінчуватись і мають бути доданими періодично в таких випадках. Додавання супроводжується швидкою зміною у вищезгаданих показниках. Е.сої здатна використовувати ацетат як джерело вуглецю, коли глюкоза або будь-яке інше головне джерело вуглецю відсутнє. Поглинання ацетату характеризується розходженням зі встановленими значеннями для зменшення значень рН і з'являється циклічний тип поглинання кисню, доки встановлене значення рН поступово не 65 Відновлюється в культурі. У цей момент відновлюється постачання живлення. ро-віаї метод швидше реагує на закінчення поживних речовин, ніж рН-віаї метод. Коли складні субстрати використовують разом із вуглеводневими субстратами, зміна в БО не є настільки очевидною, доки клітини продовжують використовувати складні субстрати. Спосіб живлення, який використовували в цих експериментах, складався з комбінації рН-віаї плюс БО-в8іаї методів.
Спостерігання за обома параметрами одночасно дає кращий контроль над умовами росту вирощуваної культури. Використання цього способу подачі субстрату дало авторам змогу досягти ОО 120, яке є більшим, ніж шестикратне підвищення ОО, досягнуте у ферментерах, і більше, ніж 23-кратне з культур, які вирощують у колбах.
Це є першим повідомленням про оптимізацію умов для підкхивлюваної НСОС для досягнення високого 7/0 виходу ЗА в Б.соїї. Ця робота є спробою одержати велику кількість нереакційного ЗА, який міг би слугувати як перспективний кандидат на вакцину. Спосіб одержання ЗА, повідомлений у цьому винаході, використовує новий субстрат, який має переваги, та простий і легкий контроль за подачею живлення, який також може бути успішно застосований до інших експресійних систем рекомбінантного білка для досягнення високого виходу продукту.
Claims (11)
1. Спосіб одержання захисного антигенного білка (захисного антигену) сибірки з Е.соїї з використанням культивування з підживленням, що передбачає: а) трансформацію клітин ОН5е Е.соїї рекомбінантною конструктивною експресуючою плазмідою, що включає ген захисного антигену, для одержання рекомбінантних клітин ОН5 ес , що експресують білок захисного антигену, Б) вирощування рекомбінантних клітин СН5се і контроль за експресією захисного антигену шляхом лізису вказаних рекомбінантних клітин з наступним електрофорезом в денатуруючому гелі та методом Вестерн-блотингу з використанням антитіл до захисного антигену, Ге! с) ферментування рекомбінантних клітин у біореакторі з використанням: (5) ї) первинних добавок у середовищі І игіа Вгоїй при 372С, де первинну добавку вибирають з групи, яка включає поліоли, вуглеводи та органічні кислоти, ії) де зазначене середовище І игіа Вгойй за (ї) також містить МаЗО»,, ії) способу культивування з підживленням, та (о) їм) безперервного моніторингу концентрації розчиненого кисню і рН середовища, за зменшенням кількості о добавок у середовищі, додавання замісних добавок до середовища для підтримання концентрації розчиненого кисню і рН на рівнях, що забезпечують досягнення культури високої щільності клітин, яка експресує білок с захисного антигену, забезпечуючи високий вихід від 5 до 8 г/л захисного антигену всередині клітини, о а) збирання ферментованих клітин центрифугуванням культури високої щільності клітин при 5000-10000 об./хв. протягом 10-30 хвилин, (ее) е) солюбілізацію культури високої щільності клітин із застосуванням 6-8 М розчину сечовини та перемішування при температурі навколишнього середовища протягом 1-2 годин, 7) відділення дебрису культури високої щільності клітин центрифугуванням при 10000-15000 об./хв. протягом « 30-60 хвилин при 372С та збирання супернатанту, що містить денатурований сечовиною захисний антиген, 9) виділення денатурованого сечовиною захисного антигену з супернатанту та очищення його за допомогою о) с Мі-МТА хроматографії шляхом поступового видалення сечовини, у той час як захисний антиген зв'язується з "» афінною колонкою, у такий спосіб формуючи очищений ренатурований захисний антиген, та " елюювання очищеного ренатурованого захисного антигену та необов'язково зберігання білка захисного антигену у вигляді заморожених аліквот при температурі від -20 до -7096.
2. Спосіб за п. 1, у якому використана рекомбінантна конструктивна експресуюча плазміда експресує білок со захисного антигену у вигляді нерозчинних тілець включення в клітинах ОН5е Е. соїї. ав! З.
Спосіб за п. 1, у якому збирання клітин шляхом центрифугування культури з високою щільністю клітин виконують при 5000 об./хв. протягом 10 хвилин. со
4. Спосіб за п. 1, у якому центрифугування дебрису культури з високою щільністю клітин виконують при ав | 20 10000 об./хв. протягом 30 хвилин для максимізації збирання клітин.
5. Спосіб за п. 1, у якому поліол, який застосовують під час ферментації, являє собою гліцерин. со
6. Спосіб за п. 1, у якому вуглевод вибирають з групи, що включає глюкозу, галактозу, мальтозу, фруктозу та лактозу.
7. Спосіб за п. 1, у якому органічна кислота являє собою яблучну кислоту.
8. Спосіб за п. 1, у якому при застосуванні поліолу, вуглеводу або органічної кислоти як первинної ГФ) добавки у середовищі І игіа Вгоїй максимальна щільність клітин варіюється в діапазоні від 10 до 14 одиниць оптичної густини в культурах у колбах для струшування.
о
9. Спосіб за п. 1, у якому середовище І шгіа Вгоїй вводять у біореактор у від 5 до 25 разів розведеній концентрації від початкової концентрації середовища І игіа Вгоїй. 60
10. Спосіб за п. 1, у якому середовище І Шіа Вгоїй вводять у біореактор у розведеній в 25 разів концентрації від початкової концентрації середовища І игіа Вгоїй.
11. Спосіб за п. 1, у якому плазміда являє собою вектор серії РОЕ, що містить промотор фага, який упізнається Е.соїї. б5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IN1127DE2001 IN190590B (uk) | 2001-11-05 | 2001-11-05 | |
| PCT/IN2001/000215 WO2003040179A1 (en) | 2001-11-05 | 2001-12-07 | High level constitutive production of anthrax protective antigen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA80809C2 true UA80809C2 (en) | 2007-11-12 |
Family
ID=11097131
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA20040503327A UA80809C2 (en) | 2001-11-05 | 2001-07-12 | Process for preparation of protective antigen protein of anthracis with e.coli |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7329513B2 (uk) |
| EP (1) | EP1442052B1 (uk) |
| JP (1) | JP2005510215A (uk) |
| CN (1) | CN100347189C (uk) |
| AT (1) | ATE484517T1 (uk) |
| BR (1) | BRPI0117173A2 (uk) |
| CA (1) | CA2465679A1 (uk) |
| DE (1) | DE60143276D1 (uk) |
| HK (1) | HK1072610A1 (uk) |
| IL (1) | IL161725A0 (uk) |
| IN (1) | IN190590B (uk) |
| MX (1) | MXPA04004281A (uk) |
| RU (1) | RU2288272C2 (uk) |
| UA (1) | UA80809C2 (uk) |
| WO (1) | WO2003040179A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA200403396B (uk) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA80809C2 (en) * | 2001-11-05 | 2007-11-12 | Process for preparation of protective antigen protein of anthracis with e.coli | |
| ES2427641T3 (es) | 2003-05-22 | 2013-10-31 | Ibio, Inc. | Molécula vehículo recombinante para la expresión, el suministro y la purificación de polipéptidos diana |
| AU2003271835A1 (en) * | 2003-06-06 | 2005-01-04 | Avecia Limited | Process for the separation of proteins |
| WO2005081749A2 (en) * | 2004-01-23 | 2005-09-09 | Avanir Pharmaceuticals, Inc. | Neutralizing human antibodies to anthraxtoxin |
| US20060246079A1 (en) * | 2003-11-14 | 2006-11-02 | Morrow Phillip R | Neutralizing human antibodies to anthrax toxin |
| US7355027B2 (en) | 2004-06-16 | 2008-04-08 | Dynport Vaccine Company Llc | Bacillus anthracis protective antigen |
| US8101735B2 (en) | 2004-06-16 | 2012-01-24 | Health Protection Agency | Preparation of protective antigen |
| CN100336908C (zh) * | 2004-09-10 | 2007-09-12 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种制备重组炭疽保护性抗原的方法及其专用表达质粒 |
| WO2007117264A2 (en) | 2005-08-03 | 2007-10-18 | Fraunhofer Usa, Inc. | Compositions and methods for production of immunoglobulins |
| US8277816B2 (en) * | 2006-02-13 | 2012-10-02 | Fraunhofer Usa, Inc. | Bacillus anthracis antigens, vaccine compositions, and related methods |
| JP2009526526A (ja) | 2006-02-13 | 2009-07-23 | フラウンホーファー ユーエスエー， インコーポレイテッド | インフルエンザ抗原、ワクチン組成物、および関連する方法 |
| GB0607462D0 (en) * | 2006-04-13 | 2006-05-24 | Avecia Ltd | Assay |
| EP2021021A2 (en) * | 2006-05-12 | 2009-02-11 | Oklahoma Medical Research Foundation | Anthrax compositions and methods of use and production |
| US8420607B2 (en) * | 2006-06-30 | 2013-04-16 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Anthrax carbohydrates, synthesis and uses thereof |
| WO2008115198A2 (en) | 2006-06-30 | 2008-09-25 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Anthrax carbohydrates,synthesis and uses thereof |
| EP2178558B1 (en) | 2007-07-11 | 2014-04-30 | iBio, Inc. | Yersinia pestis antigens, vaccine compositions, and related methods |
| WO2009126355A2 (en) * | 2008-01-28 | 2009-10-15 | Baxter International, Inc. | Methods of increasing recombinant production of bacillus anthracis protective antigen |
| WO2010037046A1 (en) | 2008-09-28 | 2010-04-01 | Fraunhofer Usa, Inc. | Humanized neuraminidase antibody and methods of use thereof |
| AU2009299615B2 (en) | 2008-10-02 | 2015-07-16 | Pharmathene Inc. | Anthrax vaccine formulation and uses thereof |
| US20100183675A1 (en) * | 2009-01-22 | 2010-07-22 | Allan Watkinson | Stable vaccine compositions and methods of use |
| WO2011041391A1 (en) | 2009-09-29 | 2011-04-07 | Fraunhofer Usa, Inc. | Influenza hemagglutinin antibodies, compositions, and related methods |
| US20120301951A1 (en) * | 2010-11-18 | 2012-11-29 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Prevention of contamination of nutrient feed reservoirs & feed lines in bioreactor systems |
| RU2633504C1 (ru) * | 2016-12-27 | 2017-10-12 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Штамм E.coli - продуцент полноразмерного протективного антигена Bacillus anthracis в форме вирусоподобных частиц |
| RU2633508C1 (ru) * | 2016-12-27 | 2017-10-12 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Штамм E. coli - продуцент изолированного домена 1 протективного антигена Bacillus anthracis в форме вирусоподобных частиц |
| CN115125224B (zh) * | 2022-08-11 | 2023-07-18 | 福州大学 | 一种可规模化生产具有活性的dna聚合酶的方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5800821A (en) * | 1995-03-10 | 1998-09-01 | New England Medical Center Hospitals, Inc. | Bacterial spores as a heat stable vaccine delivery system |
| WO1999051733A2 (en) * | 1998-04-07 | 1999-10-14 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Enterotoxin-deficient bacillus |
| US20020086032A1 (en) * | 1999-02-02 | 2002-07-04 | Mahan Michael J. | Producing antibodies with attenuated bacteria with altered DNA adenine methylase activity |
| US7193126B2 (en) * | 2001-10-01 | 2007-03-20 | The Regents Of The University Of California | Method for generating overexpression of alleles in genes of unknown function |
| UA80809C2 (en) * | 2001-11-05 | 2007-11-12 | Process for preparation of protective antigen protein of anthracis with e.coli | |
| US7763451B2 (en) * | 2001-11-09 | 2010-07-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods for preparing Bacillus anthracis protective antigen for use in vaccines |
-
2001
- 2001-07-12 UA UA20040503327A patent/UA80809C2/uk unknown
- 2001-11-05 IN IN1127DE2001 patent/IN190590B/en unknown
- 2001-12-07 JP JP2003542224A patent/JP2005510215A/ja active Pending
- 2001-12-07 EP EP01274653A patent/EP1442052B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-07 IL IL16172501A patent/IL161725A0/xx unknown
- 2001-12-07 BR BRPI0117173A patent/BRPI0117173A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-12-07 DE DE60143276T patent/DE60143276D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-07 CA CA002465679A patent/CA2465679A1/en not_active Abandoned
- 2001-12-07 CN CNB018239226A patent/CN100347189C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-12-07 WO PCT/IN2001/000215 patent/WO2003040179A1/en active Application Filing
- 2001-12-07 US US10/494,680 patent/US7329513B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-12-07 MX MXPA04004281A patent/MXPA04004281A/es not_active Application Discontinuation
- 2001-12-07 RU RU2004117085/13A patent/RU2288272C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-12-07 AT AT01274653T patent/ATE484517T1/de not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-05-05 ZA ZA200403396A patent/ZA200403396B/en unknown
-
2005
- 2005-06-23 HK HK05105241A patent/HK1072610A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MXPA04004281A (es) | 2005-03-31 |
| RU2004117085A (ru) | 2005-03-27 |
| US7329513B2 (en) | 2008-02-12 |
| IN190590B (uk) | 2003-08-09 |
| US20050054038A1 (en) | 2005-03-10 |
| EP1442052B1 (en) | 2010-10-13 |
| JP2005510215A (ja) | 2005-04-21 |
| CN1582298A (zh) | 2005-02-16 |
| ATE484517T1 (de) | 2010-10-15 |
| BRPI0117173A2 (pt) | 2018-04-17 |
| EP1442052A1 (en) | 2004-08-04 |
| HK1072610A1 (en) | 2005-09-02 |
| RU2288272C2 (ru) | 2006-11-27 |
| WO2003040179A1 (en) | 2003-05-15 |
| DE60143276D1 (de) | 2010-11-25 |
| CN100347189C (zh) | 2007-11-07 |
| ZA200403396B (en) | 2005-08-05 |
| IL161725A0 (en) | 2005-11-20 |
| CA2465679A1 (en) | 2003-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA80809C2 (en) | Process for preparation of protective antigen protein of anthracis with e.coli | |
| Park et al. | Enhanced β‐galactosidase production by high cell‐density culture of recombinant Bacillus subtilis with glucose concentration control | |
| Zou et al. | Oxygen uptake rate optimization with nitrogen regulation for erythromycin production and scale-up from 50 L to 372 m3 scale | |
| Tsuchiya et al. | Effect of homogeneous and inhomogeneous high magnetic fields on the growth of Escherichia coli | |
| ES2728169T3 (es) | Procedimiento de cultivo de células de E. coli para alta densidad | |
| CN110317803A (zh) | 麦角硫因的纳米生物学制备方法 | |
| Brown et al. | Continuous production of human leukocyte interferon with Escherichia coli and continuous cell lysis in a two stage chemostat | |
| Szweda et al. | Efficient production of Staphylococcus simulans lysostaphin in a benchtop bioreactor by recombinant Escherichia coli | |
| CN107916283A (zh) | 一种烟酰胺的生产工艺 | |
| CN109536427A (zh) | 一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌 | |
| Strandberg et al. | Large-scale fermentation and purification of a recombinant protein from Escherichia coli | |
| CN102321643B (zh) | 一条编码adi的优化dna分子及表达adi的工程菌 | |
| CN104561200A (zh) | 一种有效改善重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法 | |
| CN105349561A (zh) | 一种利用血红蛋白提高发酵细胞密度的方法 | |
| Listner et al. | A simple method for the production of plasmid DNA in bioreactors | |
| Xia et al. | Optimization of process parameters for naringinase production by Aspergillus tubingensis UA13 and pilot scale-up study | |
| CN105779354A (zh) | 一种大肠杆菌培养基 | |
| Kratje et al. | Evaluation of production of recombinant human interleukin‐2 in fluidized bed bioreactor | |
| CN102776260A (zh) | 一种高效表达重组人凝血八因子的方法 | |
| CN104694523A (zh) | 一种精氨酸脱亚胺酶的胞外表达方法及其应用 | |
| Huang et al. | Enhanced human lysozyme production by Kluyveromyces lactis | |
| CN102533841B (zh) | 一种提高Bt杀虫蛋白在汉逊酵母中表达量的方法 | |
| CN106520821B (zh) | 适用于链霉菌的T7RNA聚合酶表达盒PhT7及其表达载体和应用 | |
| Feng et al. | Effect of temperature on synthesis of clavulanic acid and impurity substance G during fermentation by Streptomyces clavuligerus | |
| CN109593701A (zh) | 一种耐酸重组乳酸菌及其构建方法 |