RU2782586C1 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ ПРОТЕАЗЫ, ОБРАЗУЕМОЙ МИКРОМИЦЕТАМИ Aspergillus ochraceus - Google Patents
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ ПРОТЕАЗЫ, ОБРАЗУЕМОЙ МИКРОМИЦЕТАМИ Aspergillus ochraceus Download PDFInfo
- Publication number
- RU2782586C1 RU2782586C1 RU2022105169A RU2022105169A RU2782586C1 RU 2782586 C1 RU2782586 C1 RU 2782586C1 RU 2022105169 A RU2022105169 A RU 2022105169A RU 2022105169 A RU2022105169 A RU 2022105169A RU 2782586 C1 RU2782586 C1 RU 2782586C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tris
- sorbent
- buffer
- nacl
- cacl
- Prior art date
Links
- 241000122824 Aspergillus ochraceus Species 0.000 title claims abstract description 22
- 101700027333 FIBS Proteins 0.000 title claims abstract description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 28
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 32
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 29
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 21
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 16
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 15
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N Imidazole Chemical compound C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 14
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 210000003000 Inclusion Bodies Anatomy 0.000 claims description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 6
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims description 6
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 claims description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 5
- 238000007864 suspending Methods 0.000 claims description 5
- 230000001131 transforming Effects 0.000 claims description 5
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 claims description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 3
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 claims description 3
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 claims description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 23
- 102100020223 PRH1 Human genes 0.000 description 9
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 9
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 9
- 229960000856 Protein C Drugs 0.000 description 9
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 9
- 108060005018 mobB Proteins 0.000 description 9
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 9
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 7
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 102000035443 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 229960004319 Trichloroacetic Acid Drugs 0.000 description 3
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N Trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 3
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 240000008371 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 229940075615 Bacillus subtilis Drugs 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 229940079919 digestives Enzyme preparations Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl β-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091005650 Basic proteases Proteins 0.000 description 1
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004164 analytical calibration Methods 0.000 description 1
- 229940019336 antithrombotic Enzymes Drugs 0.000 description 1
- 230000000468 autoproteolytic Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 101700084791 eprA1 Proteins 0.000 description 1
- 101700026663 expR Proteins 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic Effects 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 125000003372 histidine group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic Effects 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 229940108461 rennet Drugs 0.000 description 1
- 108010058314 rennet Proteins 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ получения рекомбинантной щелочной фибринолитической протеазы, образуемой микромицетами Aspergillus ochraceus. В результате получают высокоочищенный ферментный препарат в форме порошка белого либо кремового цвета с выходом до 250 мг с 1 л экспрессионной культуры. 1 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к области получения высокоочищенных и высокоактивных ферментных препаратов, которые могут быть использованы в медицине, ветеринарии, косметологии, дерматологии, биохимии и пищевой промышленности, а также в исследовательских целях.
Микромицеты Aspergillus ochraceus являются продуцентами секретируемой щелочной протеазы, обладающей фибринолитической и активаторной по отношению к протеину С плазмы крови активностями [1-7].
Известны способы получения неочищенных препаратов секретируемой щелочной фибринолитической протеазы из культуральной жидкости микромицетов A. ochraceus при глубинном [8] и твердофазном [9] культивировании штамма-продуцента. Существенным недостатком этих способов является наличие в получаемых ферментных препаратах большого количества примесей, которые представляют собой остатки питательной среды и разнообразные продукты метаболизма самих продуцентов.
Наиболее близким является способ получения очищенного ферментного препарата, заключающийся в комбинации фракционирования культуральной жидкости продуцента сульфатом аммония и гидрофобной, ионообменной и гель-проникающей хроматографии [10]. Недостатком данного способа является относительно низкий выход целевого фермента (до 10 мг очищенной протеазы с 1 литра культуры).
Техническая задача, решаемая настоящим изобретением, состоит в увеличении выхода целевого фермента за счет его рекомбинантной экспрессии, ренатурации и хроматографической очистки на металл-хелатном сорбенте. Технический результат, полученный при реализации предлагаемого технического решения, позволяет получать до 250 мг очищенной протеазы с 1 литра культуры. Задачей настоящего изобретения является расширение спектра имеющихся способов получения щелочной фибринолитической протеазы, образуемой микромицетами A. ochraceus.
Поставленная задача достигается способом получения щелочной фибринолитической протеазы, образуемой микромицетами A. ochraceus, заключающимся в том, что из мицелия продуцента A. ochraceus выделяют РНК и осуществляют синтез кДНК методом обратной транскрипции. Затем на матрице полученной кДНК амплифицируют фрагмент, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и клонируют его в экспрессионный вектор с последующей трансформацией компетентных клеток продуцирующего микроорганизма. После этого проводят экспрессию целевого фермента в нерастворимой форме и выделяют из полученной биомассы фракцию тел включения путем гомогенизации и осаждения. Полученные тела включения промывают путем суспендирования в 50 мМ Трис-HCl буфере, рН 8,0, 500 мМ NaCl, 2 М мочевина в соотношении 1 л буфера на 100 г тел включения и переосаждения. После промывания солюбилизируют осадок в 50 мМ ацетатном буфере, рН 4,0, 8 М мочевина в соотношении 2 л буфера на 100 г осадка, осаждают нерастворимую фракцию, затем доводят рН полученного солюбилизата до величины 8,5 добавлением сухого Трис. Далее проводят ренатурацию полученного солюбилизата путем его плавного десятикратного разбавления в 25 мМ Трис-HCl буфере, рН 8,5, 1 М сахароза, 1 мМ CaCl2 в течение 100 минут при температуре +4°С и инкубируют ренатурат в течение 24 ч при температуре +4°С. Полученный ренатурат наносят на металл-хелатный хроматографический сорбент, после чего промывают сорбент 20 мМ Трис-HCl буфером, рН 8,0, 200 мМ NaCl, 1 мМ CaCl2, в соотношении 5 л буфера на 1 л сорбента при линейной скорости потока 50 см/ч. Далее промывают сорбент 20 мМ Трис-HCl буфером, рН 8,0, 200 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 1 мМ CaCl2, в соотношении 10 л буфера на 1 л сорбента при линейной скорости потока 50 см/ч. Элюцию целевых ферментов проводят 20 мМ Трис-HCl буфером, рН 8,0, 200 мМ NaCl, 200 мМ имидазол, 1 мМ CaCl2. К элюату добавляют охлажденный этанол до конечной объемной концентрации 75%, затем осаждают целевой фермент, промывают осадок путем суспендирования в 75%-ном этаноле и переосаждения, после чего лиофилизируют. В результате получают высокоочищенный ферментный препарат в форме порошка белого либо кремового цвета с выходом до 250 мг с 1 л экспрессионной культуры.
Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 включает в себя пропептидный домен целевого фермента SEQ ID NO: 2, протеазный домен целевого фермента SEQ ID NO: 3 и полигистидиновую последовательность SEQ ID NO: 4.
Пропептидный домен SEQ ID NO: 2 обеспечивает правильное сворачивание протеазного домена целевого фермента SEQ ID NO: 3 в процессе экспрессии и рефолдинга, после чего автокаталически расщепляется. Специалисту в области понятно, что удаление последовательности пропептидного домена SEQ ID NO: 2 на этапе клонирования может привести к снижению выхода активного фермента.
Полигистидиновая последовательность SEQ ID NO: 4 необходима для выделения целевого фермента при помощи металл-хелатной хроматографии. В предпочтительном варианте, однако без ограничения, она содержит шесть аминокислотных остатков гистидина. Специалисту в области очевидно, что для увеличения сродства к металл-хелатному сорбенту число остатков гистидина в полигистидиновой последовательности SEQ ID NO: 4 может быть увеличено. Специалисту в области понятно, что между последовательностями протеазного домена SEQ ID NO: 3 и полигистидиновой последовательности SEQ ID NO: 4 может быть дополнительно введен линкерный участок, служащий для отщепления полигистидиновой последовательности SEQ ID NO: 4 после очистки фермента.
В предпочтительном варианте, однако без ограничения, для получения ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, применяют методы обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, используя в качестве матрицы тотальную РНК, выделенную из микромицета A. ochraceus. Специалисту в области очевидно, что ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, может быть получена любым другим известным из уровня техники способом, например, методом химического синтеза генов.
В предпочтительном варианте, однако без ограничения, в качестве экспрессионного вектора, в который химико-ферментативным путем клонирована ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, используют коммерчески доступную плазмиду pET-23d. Специалисту в области очевидно, что в качестве экспрессионного вектора может быть использована другая коммерчески доступная плазмида.
В предпочтительном варианте, однако без ограничения, в качестве трансформируемого продуцирующего микроорганизма используют коммерчески доступный штамм Escherichia coli BL21 (DE3). Специалисту в области понятно, что в качестве продуцирующего микроорганизма может выступать другая бактерия (например, Bacillus subtilis) либо дрожжи (например, Pichia pastoris). Для проведения трансформации могут использоваться любые методы, известные из уровня техники, например, кальций-хлоридный метод, метод электропорации. При осуществлении конкретных воплощений настоящего изобретения специалист, основываясь на существующем уровне знаний, может выбрать наиболее оптимальный метод выполнения трансформации.
Для получения биомассы созданного штамма-продуцента осуществляют его культивирование, после чего доступными из уровня техники методами отделяют фракцию, содержащую целевой белок.
Специалисту понятно, что культивирование может осуществляться на орбитальном шейкере в колбах Эрленмейера, в ферментерах различного объема или любыми другими известными из уровня техники в настоящее время или созданными впоследствии способами.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, отделение культуральной жидкости от клеток осуществляют центрифугированием.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, дезинтеграцию клеток осуществляют при помощи ультразвукового дезинтегратора.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, осаждение нерастворимых фракций осуществляют центрифугированием.
В предпочтительном варианте целевой фермент экспрессируют в форме нерастворимых тел включения. Специалисту в области понятно, что экспрессия целевого фермента в растворимой форме может привести к снижению его выхода из-за автопротеолитической деградации.
В предпочтительном варианте, однако без ограничения, в качестве металл-хелатного хроматографического сорбента используют коммерчески доступную Ni-NTA-агарозу. Специалисту в области очевидно, что в качестве металл-хелатного хроматографического сорбента может быть использован другой коммерчески доступный носитель, например, Ni-IDA-агароза.
Последовательное промывание хроматографического сорбента с линейной скоростью потока 50 см/ч буферами 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 200 мМ NaCl, 1 мМ CaCl2, в соотношении 5 л буфера на 1 л сорбента, и 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 200 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 1 мМ CaCl2, в соотношении 10 л буфера на 1 л сорбента обеспечивает расщепление и отделение пропептидного домена, в результате чего целевой фермент приобретает свою активность. Специалисту в области понятно, что изменение линейной скорости потока, а также объемного соотношения используемых буферов и хроматографического сорбента, может снизить удельную активность целевого фермента.
Определения и термины
Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Пример осуществления изобретения
Приведенный далее пример предоставлен посредством объяснения изобретения и не может являться ограничением изобретения. Фактически, специалистам в данной области техники будет понятно, что в изобретение могут быть внесены различные модификации и изменения без отступления от объема или сущности изобретения. Специалисту в данной области техники следует понимать, что настоящее исполнение представляет собой описание только приведенного в качестве примера варианта осуществления и не предполагается в качестве ограничения более широких аспектов настоящего изобретения.
1. Из 100 мг мицелия микромицета A. ochraceus ВКМ-F4104D выделяют тотальную РНК, на матрице которой синтезируют первую цепь кДНК методом обратной транскрипции. Далее на матрице полученной первой цепи кДНК при помощи ПЦР проводят амплификацию нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, после чего клонируют амплификат в плазмиду pET-23d (Novagen, США) по рестриктным сайтам NcoI и XhoI. Трансформируют полученной молекулярно-генетической конструкцией экспрессионный штамм E. coli BL21 (DE3). Для выделения РНК, проведения обратной транскрипции, ПЦР-амплификации, клонирования и трансформации используют известные протоколы [11].
2. Свежетрансформированные клетки культивируют при температуре +37°С в биореакторе в 20 литрах питательной среды LB (состав среды в г/л: триптон - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 10), содержащей 100 мкг/мл ампициллина, до достижения оптической плотности культуры при длине волны 600 нм, равной 0,6 оптических единиц.
3. Добавляют индуктор белкового синтеза IPTG (изопропил-β-D-тиогалактопиранозид) до конечной концентрации 0,5 мМ и инкубируют в течение 4 ч при температуре +37°С для проведения экспрессии целевого фермента в нерастворимой форме.
4. Осаждают биомассу продуцирующих клеток путем центрифугирования в течение 15 мин при ускорении 4000 g, после чего гомогенизируют полученный осадок в 20 мМ Трис-HCl буфере, рН 8,0, 200 мМ NaCl и повторно центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 10000 g для получения осадка тел включения. В результате из бактериальной культуры объемом 20 л получают осадок тел включения с массой около 150 г.
5. Полученный осадок тел включения промывают суспендированием в 1,5 л 50 мМ Трис-HCl буфера, рН 8,0, 500 мМ NaCl, 2 М мочевина, после чего центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 10000 g, супернатант отбрасывают.
6. Осадок тел включения после промывания солюбилизируют в 3 л 50 мМ ацетатном буфере, рН 4,0, 8 М мочевина, по мере солюбилизации доводят значение рН раствора до величины 4,0 добавлением соляной кислоты, после чего центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 10000 g, осадок отбрасывают. Доводят значение рН полученного супернатанта до величины 8,5 добавлением сухого Трис.
7. Для получения ренатурата при температуре +4°С и перемешивании добавляют полученный на предыдущей стадии солюбилизат со скоростью 30 мл/мин (общее время добавления - 100 мин) к 27 л 25 мМ Трис-HCl буфера, рН 8,5, 1 М сахароза, 1 мМ CaCl2. Инкубируют полученный ренатурат в течение 24 ч при температуре +4°С.
8. После инкубации наносят полученный на предыдущей стадии ренатурат на 1 л хроматографического сорбента WorkBeads 40 Ni-IDA (BioWorks, Швеция).
9. Промывают сорбент 5 л 20 мМ Трис-HCl буфера рН 8,0, 200 мМ NaCl, 1 мМ CaCl2 при линейной скорости потока 50 см/ч.
10. Промывают сорбент 10 л 20 мМ Трис-HCl буфера, рН 8,0, 200 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 1 мМ CaCl2 при линейной скорости потока 50 см/ч.
11. Проводят элюцию целевого фермента 20 мМ Трис-HCl буфером, рН 8,0, 200 мМ NaCl, 200 мМ имидазол, 1 мМ CaCl2, затем добавляют к элюату охлажденный этанол до конечной объемной концентрации 75%, центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 10000 g, супернатант отбрасывают.
12. Полученный на предыдущей стадии осадок промывают суспендированием в 1 л 75%-ного этанола, центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 10000 g, супернатант отбрасывают. Полученный осадок лиофилизируют. В результате получают ферментный препарат массой до 5 г с удельной активностью по отношению к казеину до 5000 Ед./мг.
Определение протеолитической активности ферментного препарата:
Для измерения протеолитической активности полученного ферментного препарата используют метод Ансона-Хагихары [12, 13], заключающийся в определении количества тирозина в неосаждаемых трихлоруксусной кислотой (ТХУ) продуктах протеолиза после десятиминутного гидролиза 1%-ного раствора казеина в 100 мМ Трис-HCl буфере рН 8,2 при температуре +37°С. К 200 мкл раствора навески анализируемого ферментного препарата добавляют 400 мкл раствора казеина, инкубируют в течение 10 мин при температуре +37°С, после чего останавливают реакцию добавлением 600 мкл 10%-ного раствора ТХУ. Для формирования осадка пробирки после проведения реакции выдерживают в течение 30 мин при температуре +4°С, после чего центрифугируют в течение 10 мин при ускорении 10000 g и определяют оптическое поглощение супернатанта при 275 нм. За единицу активности (Ед.) принимают количество фермента, которое за 1 мин в условиях определения высвобождает 1 нмоль тирозина, для расчетов строят калибровочную кривую.
Литература
1. Осмоловский А.А., Крейер В.Г., Кураков А.В., Баранова Н.А., Егоров Н.С. Микромицеты Aspergillus ochraceus - продуценты внеклеточных протеиназ - активаторов протеина С плазмы крови // Прикладная биохимия и микробиология. 2012. 48, 5, 537-542.
2. Осмоловский А.А., Звонарева Е.С., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С. Воздействие внеклеточных протеаз микромицетов рода Aspergillus на белки системы гемостаза // Биоорганическая химия. 2014. 40, 6, 688-694.
3. Осмоловский А.А., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Кураков А.В., Егоров Н.С. Свойства внеклеточной протеиназы - активатора протеина С плазмы крови, образуемой микромицетом Aspergillus ochraceus // Прикладная биохимия и микробиология. 2015. 51, 1, 86-92.
4. Пат. РФ 2460772. Штамм Aspergillus ochraceus - продуцент протеиназы-активатора протеина С плазмы крови / Осмоловский А.А., Кураков А.В., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С. № 2011108671/10, заявл. 09.03.2011, опубл. 10.09.2012, Бюл. № 25.
5. Пат. РФ 2461614. Штамм Aspergillus ochraceus - продуцент протеиназы-активатора протеина С плазмы крови / Осмоловский А.А., Кураков А.В., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С. № 2011108668/10, заявл. 09.03.2011, опубл. 20.09.2012, Бюл. № 26.
6. Пат. РФ 2461615. Штамм Aspergillus ochraceus - продуцент протеиназы-активатора протеина С плазмы крови / Кураков А.В., Осмоловский А.А., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С. № 2011108669/10, заявл. 09.03.2011, опубл. 20.09.2012, Бюл. № 26.
7. Пат. РФ 2461616. Штамм Aspergillus ochraceus - продуцент протеиназы-активатора протеина С плазмы крови / Кураков А.В., Осмоловский А.А., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С. № 2011108669/10, заявл. 09.03.2011, опубл. 20.09.2012, Бюл. № 26.
8. Пат. РФ 2468081. Способ получения протеиназы-активатора протеина С плазмы крови / Осмоловский А.А., Кураков А.В., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С. № 2011108672/10, заявл. 09.03.2011, опубл. 27.11.2012, Бюл. № 33.
9. Пат. РФ 2535872. Способ твердофазного культивирования Aspergillus ochraceus для получения протеиназы-активатора протеина С плазмы крови / Осмоловский А.А., Кураков А.В., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С. № 2013113997/10, заявл. 29.03.2013, опубл. 20.12.2014, Бюл. № 35.
10. Комаревцев С.К., Попова Е.А., Крейер В.Г., Мирошников К.А., Осмоловский А.А. Очистка протеазы-активатора протеина С плазмы крови человека, продуцируемой микромицетом Aspergillus ochraceus ВКМ-F4104D // Прикладная биохимия и микробиология. 2020. 56, 1, 39-44.
11. Sambrook J., Russell D.W. Molecular cloning. A laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. XXV, 2209 p.
12. Anson M.L. Crystalline carboxypolypeptidase // Science. 1935. 81, 2106, 467-468.
13. Hagihara B., Matsubara H., Nakai M., Okunuki K. Crystalline bacterial proteinase. I. Preparation of crystalline proteinase of Bacillus subtilis // J. Biochem. 1958. 45, 185-194.
--->
Перечень последовательностей
SEQ ID NO: 1. Аминокислотная последовательность
гибридного предшественника рекомбинантной щелочной
фибринолитической протеазы, образуемой микромицетами A. ochraceus
MPVENTRRASEKIAGKYIVTFKNGIDTAKIEQHTTWATNIHKRNLARRDGSDDSDLPVGIEKKFKIKDFAAYFGS
FDDSTIEEIRKSADVAHIEEDQVWHLDALTTQTGATWGLGSISHKGESSTSYVYDSSAGEGTYGYVVDTGINVDH
SEFGGRASLAYNAVGGQHVDSVGHGTHVAGTIGGKTYGVSKKANLLSVKVFQGESSSTSIILDGYNWAANDIVSK
SRTGKAAINLSLGGGYSYAFNQAVENAFDEGVLTVVAAGNENSDAGNTSPASAPNALTVTASTNRNARASFSNYG
SVVDVFAPGQDIKSAWIGGSSATNTISGTSMATPHIVGLAIYLQALEGLTSPAAVTKRIKELATSGVVTDVKGSP
NLLAYNGAAHHHHHH
SEQ ID NO: 2. Аминокислотная последовательность пропептидного
домена щелочной фибринолитической протеазы, образуемой
микромицетами A. ochraceus
PVENTRRASEKIAGKYIVTFKNGIDTAKIEQHTTWATNIHKRNLARRDGSDDSDLPVGIEKKFKIKDFAAYFGSF
DDSTIEEIRKSADVAHIEEDQVWHLD
SEQ ID NO: 3. Аминокислотная последовательность протеазного
домена щелочной фибринолитической протеазы, образуемой
микромицетами A. ochraceus
ALTTQTGATWGLGSISHKGESSTSYVYDSSAGEGTYGYVVDTGINVDHSEFGGRASLAYNAVGGQHVDSVGHGTH
VAGTIGGKTYGVSKKANLLSVKVFQGESSSTSIILDGYNWAANDIVSKSRTGKAAINLSLGGGYSYAFNQAVENA
FDEGVLTVVAAGNENSDAGNTSPASAPNALTVTASTNRNARASFSNYGSVVDVFAPGQDIKSAWIGGSSATNTIS
GTSMATPHIVGLAIYLQALEGLTSPAAVTKRIKELATSGVVTDVKGSPNLLAYNGAA
SEQ ID NO: 4. Полигистидиновая последовательность
HHHHHH
SEQ ID NO: 5. Нуклеотидная последовательность гибридного
предшественника рекомбинантной щелочной фибринолитической протеазы,
образуемой микромицетом A. ochraceus ВКМ-F4104D
ATGCCCGTCGAGAACACCCGCCGGGCTTCCGAGAAGATCGCTGGAAAGTACATTGTCACTTTCAAGAACGGCATC
GACACCGCCAAGATCGAGCAGCACACCACCTGGGCTACCAACATCCACAAGCGCAACCTTGCCCGCCGTGATGGT
TCCGACGATTCTGACCTCCCCGTCGGTATCGAGAAGAAATTCAAGATCAAGGACTTCGCCGCCTACTTCGGTTCC
TTCGATGACTCCACCATCGAGGAGATCCGCAAGAGCGCCGATGTTGCTCACATCGAGGAGGACCAGGTCTGGCAC
CTCGATGCTCTGACCACCCAGACCGGTGCTACCTGGGGCCTGGGTTCCATCTCGCACAAGGGTGAATCCAGCACC
AGCTACGTCTACGACTCCAGCGCCGGCGAGGGCACCTACGGCTACGTCGTTGACACCGGTATCAACGTCGACCAC
AGCGAGTTCGGCGGCCGTGCGAGCCTCGCCTACAACGCTGTTGGCGGCCAGCACGTTGACAGCGTCGGCCACGGA
ACTCACGTTGCCGGCACCATTGGTGGCAAGACCTACGGTGTCTCCAAGAAGGCCAACCTCCTCTCCGTCAAGGTC
TTCCAGGGCGAATCTTCTTCTACCTCCATCATTCTTGACGGATACAACTGGGCCGCCAACGACATCGTGAGCAAG
TCCCGTACCGGAAAGGCCGCCATCAACCTGTCTCTCGGTGGTGGATACTCCTATGCCTTCAACCAGGCTGTCGAG
AACGCCTTCGATGAGGGTGTCCTGACCGTCGTCGCCGCCGGTAACGAGAACTCCGATGCTGGCAACACCAGCCCT
GCCTCTGCCCCCAACGCCTTGACCGTCGCTGCCAGCACCAACCGCAACGCCCGTGCCTCTTTCTCCAACTACGGC
TCCGTCGTTGATGTCTTCGCTCCCGGTCAGGACATCAAGTCTGCCTGGATCGGCGGCAGCTCTGCCACCAACACC
ATCTCCGGTACCTCCATGGCTACTCCCCACATCGTTGGTCTGGCCATCTACCTGCAGGCTCTTGAGGGTCTCACC
AGCCCCGCCGCCGTCACCAAGCGCATCAAGGAGCTCGCCACCTCCGGCGTTGTCACCGATGTCAAGGGCAGCCCC
AACCTCCTTGCCTACAACGGCGCTGCTCACCACCACCACCACCAC
<---
Claims (1)
- Способ получения щелочной фибринолитической протеазы, образуемой микромицетами Aspergillus ochraceus, заключающийся в том, что из мицелия продуцента A. ochraceus выделяют РНК и осуществляют синтез кДНК методом обратной транскрипции, после чего на матрице полученной кДНК амплифицируют фрагмент, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и клонируют его в экспрессионный вектор с последующей трансформацией компетентных клеток продуцирующего микроорганизма, затем проводят экспрессию целевого фермента в нерастворимой форме и выделяют из полученной биомассы фракцию тел включения путем гомогенизации и осаждения, полученные тела включения промывают путем суспендирования в 50 мМ Трис-HCl буфере, рН 8,0, 500 мМ NaCl, 2 М мочевина в соотношении 1 л буфера на 100 г тел включения и осаждения, затем солюбилизируют осадок в 50 мМ ацетатном буфере, рН 4,0, 8 М мочевина в соотношении 2 л буфера на 100 г осадка, осаждают нерастворимую фракцию, после чего доводят рН полученного солюбилизата до величины 8,5 добавлением сухого Трис, далее проводят ренатурацию полученного солюбилизата путем его плавного десятикратного разбавления в 25 мМ Трис-HCl буфере, рН 8,5, 1 М сахароза, 1 мМ CaCl2 в течение 100 минут при температуре +4°С и инкубируют ренатурат в течение 24 ч при температуре +4°С, после чего полученный ренатурат наносят на металл-хелатный хроматографический сорбент, затем промывают сорбент 20 мМ Трис-HCl буфером, рН 8,0, 200 мМ NaCl, 1 мМ CaCl2 в соотношении 5 л буфера на 1 л сорбента при линейной скорости потока 50 см/ч, далее промывают сорбент 20 мМ Трис-HCl буфером рН 8,0, 200 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 1 мМ CaCl2 в соотношении 10 л буфера на 1 л сорбента при линейной скорости потока 50 см/ч, после чего проводят элюцию целевого фермента 20 мМ Трис-HCl буфером рН 8,0, 200 мМ NaCl, 200 мМ имидазол, 1 мМ CaCl2, затем добавляют к полученному элюату охлажденный этанол до конечной объемной концентрации 75%, затем осаждают целевой фермент, промывают осадок путем суспендирования в 75%-ном этаноле и переосаждения, после чего лиофилизируют.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2782586C1 true RU2782586C1 (ru) | 2022-10-31 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2461616C2 (ru) * | 2011-03-09 | 2012-09-20 | Александр Васильевич Кураков | Штамм aspergillus ochraceus - продуцент протеиназы - активатора протеина с плазмы крови человека |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2461616C2 (ru) * | 2011-03-09 | 2012-09-20 | Александр Васильевич Кураков | Штамм aspergillus ochraceus - продуцент протеиназы - активатора протеина с плазмы крови человека |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ОСМОЛОВСКИЙ А.А. и др., Секреция протеиназ с фибринолитической активностью микромицетами рода Aspergillus, Вестник Московского университета. Серия 16. Биология, 2018, т. 73, N 1, стр.47-51. YONG PENG et al., Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo, Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, Vol. 69, N 2, pp.126-132. КОМАРЕВЦЕВ С.К. и др. Очистка протеазы-активатора протеина с плазмы крови человека, продуцируемой микромицетом Aspergillus ochraceus ВКМ F-4104D, Прикладная биохимия и микробиология, 2020, т. 56, N. 1, стр.39-44. OSMOLOVSKIY A.A. et al., Fibrinolytic and collagenolytic activity of extracellular proteinases of the strains of micromycetes Aspergillus ochraceus L-1 and Aspergillus ustus 1, Moscow University Biological Sciences Bulletin, 2016, Vol. 71, N 1, pp.62-66. SHIRASAKA N. et al., Purification and characterization of a fibrinolytic protease from Aspergillus oryzae KSK-3, Mycoscience, 2012, Vol. 5 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Savopoulos et al. | Expression, purification, and functional analysis of the human serine protease HtrA2 | |
| Pozidis et al. | Protein secretion biotechnology using Streptomyces lividans: Large‐scale production of functional trimeric tumor necrosis factor α | |
| Odunuga et al. | High-level expression of pseudolysin, the extracellular elastase of Pseudomonas aeruginosa, in Escherichia coli and its purification | |
| Yuan et al. | The role of thioredoxin and disulfide isomerase in the expression of the snake venom thrombin-like enzyme calobin in Escherichia coli BL21 (DE3) | |
| RU2782586C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ ПРОТЕАЗЫ, ОБРАЗУЕМОЙ МИКРОМИЦЕТАМИ Aspergillus ochraceus | |
| RU2603054C2 (ru) | Способ получения белков семейства цистеиновых протеаз пшеницы (triticum aestivum) и препарат белка тритикаин-альфа, полученный этим способом | |
| JP5283154B2 (ja) | トリプシン様酵素 | |
| JP3915983B2 (ja) | プロテアーゼ、このプロテアーゼをコードするｄｎａ、プロテアーゼの製造方法 | |
| Uesugi et al. | Two bacterial collagenolytic serine proteases have different topological specificities | |
| JP3024989B2 (ja) | β―リティック プロテアーゼ遺伝子及びその遺伝子産物の製造法 | |
| RU2664468C2 (ru) | Способ получения протеиназ с фибринолитической и фибриногенолитической активностями | |
| EP2363469B1 (en) | Process for preparing inclusion body-forming protein | |
| Kudryakova et al. | Structural and functional properties of antimicrobial protein L5 of Lysоbacter sp. XL1 | |
| Balaban et al. | Purification and characterization of serine proteinase 2 from Bacillus intermedius 3-19 | |
| Jiang et al. | Soluble expression, purification, and characterization of Gloydius shedaoensis venom gloshedobin in Escherichia coli by using fusion partners | |
| JP6993637B2 (ja) | フコース含有糖鎖を特異的に切断するエンドグリコシダーゼ | |
| Danial et al. | Production and characterization of collagenase from Bacillus sp. 6-2 isolated from fish liquid waste | |
| US7662606B1 (en) | β-agarase isolated from Thalassomonas agarivorans, preparation process and uses thereof | |
| JP4631436B2 (ja) | メタロエンドペプチダーゼ | |
| CN112852788A (zh) | 一种碱性底物选择性提高的枯草蛋白酶e突变体及其应用 | |
| RU2787186C1 (ru) | Рекомбинантный белок нуклеазы бактерий Serratia marcescens для гидролиза нуклеиновых кислот | |
| CN114807203B (zh) | 一种嗜盐古菌胞外蛋白酶截短体的制备方法及其应用 | |
| CN114181993B (zh) | 产生基于类泛素或泛素蛋白的生化工具的方法 | |
| KR102100958B1 (ko) | 가야도모나스 주비니에게 g7 유래 알파-네오아가로올리고당 가수분해효소의 이용 | |
| CA2428642C (en) | Methods for large scale production of recombinant dna-derived tpa or k2s molecules |