CN116286753A

CN116286753A - 重组i型胶原蛋白酶及其突变体的制备方法和应用

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Publication number: CN116286753A
Application number: CN202310015795.2A
Authority: CN
Inventors: 蒋析文; 朱伟伟; 刘春奇; 吴宇鹏; 雷泳森; 陈园园
Original assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Current assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Priority date: 2023-01-06
Filing date: 2023-01-06
Publication date: 2023-06-23

Abstract

本申请公开了一种重组I型胶原蛋白酶及其突变体的制备方法和应用。本申请中提供了I型胶原蛋白酶突变体，其具有较好的耐碱性，可适用于酶解法提取鱼皮废料；本申请还提供了基于原核表达体系的重组I型胶原蛋白酶及其突变体的表达方法，该方法可溶蛋白表达量提高，并且产物活性高，适宜工业化放大生产。

Description

重组I型胶原蛋白酶及其突变体的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及重组I型胶原蛋白酶及其突变体的制备方法和应用。

背景技术

胶原蛋白酶(Collagenase)是指能在适宜的pH和温度条件下特异性的水解天然胶原蛋白或明胶，而不损伤其他蛋白质和组织的酶类。其特异水解胶原蛋白的产物胶原三肽，相比大分子的胶原蛋白则在消化吸收、营养、功能特性等方面都会得到显著的提高。胶原蛋白酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原蛋白酶，通常应根据所要分离消化的组织类型选择胶原蛋白酶类型。

胶原蛋白酶的一个重要的应用领域是用于降解鱼皮废料提取胶原多肽。我国水域面积广阔，水产品丰富，养殖业蓬勃发展的同时，也造成了各种副产品的浪费，例如鱼皮中含有丰富的胶原蛋白。以鱼皮等工业加工废弃物为原料，开发生产新型高活性的胶原多肽逐渐成为研究热点。胶原蛋白酶降解法制备胶原多肽不仅产率高，而且较为环保，因此成为最适宜推广的工艺之一。另外，胶原蛋白酶在医疗方面也具有极高的应用价值，它可以用于治疗腰椎间盘突出、杜普伊特伦症、瘢痕疙瘩等异常增生，也在细胞研究、环境保护等方面具有极高的应用价值。

然而，国内目前生产Ⅰ型胶原蛋白酶的方法多为微生物源提取，最常用的微生物源为溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)，但这些菌株大部分为致病菌，在产胶原蛋白酶时，病原菌也产生相应的毒素，去除这些毒素需要复杂的纯化步骤，虽然最终产品中毒素含量降低，但工艺过于复杂，不适宜工业放大生产。此外，本发明人在研究中还发现，一些通过常规基因工程方式制备的重组Ⅰ型胶原蛋白酶，其耐碱性不足，难以应用于鱼皮等加工废弃物的降解。

有鉴于此，本领域尚需开发一种工艺简单，适宜大规模工业化生产的低毒素耐碱的Ⅰ型胶原蛋白酶制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种I型胶原蛋白酶突变体。

本发明的另一目的在于提供一种重组I型胶原蛋白酶的制备方法。

本发明的另一目的在于提供编码重组I型胶原蛋白酶的多核苷酸序列。

本发明的另一目的在于提供与编码重组I型胶原蛋白酶的多核苷酸序列适配的载体。

本发明的另一目的在于提供含有编码重组I型胶原蛋白酶的多核苷酸序列的试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供了I型胶原蛋白酶突变体，所述I型胶原蛋白酶突变体在选自以下的一个或多个位点发生突变：

R929、F952、V978、D966、V973和D974。

在一些优选的方案中，所述I型胶原蛋白酶突变体发生突变的方式选自以下任一种或几种的组合：

R929A、F952A、V978A、D966A、V973A和D974A。

在一些优选的方案中，所述I型胶原蛋白酶突变体的氨基酸序列选自以下任一种：

(i)如SEQ ID NO.5-6所示序列的氨基酸序列；和

(ii)与如SEQ ID NO.5-6所示序列的同源性大于95％的氨基酸序列。

本发明的第二方面，提供了一种编码重组I型胶原蛋白酶突变体的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：

(i)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示序列的多核苷酸；

(ii)与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和

(iii)与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。

本发明第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第二方面提供的多核苷酸。

在一些优选的方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，更优选为pET-28a(+)。

本发明第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第三方面提供的表达载体；或者

所述宿主细胞的基因组中整合有如本发明第二方面提供的多核苷酸。

在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)。

在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

本发明第五方面提供了一种制备重组I型胶原蛋白酶的方法，所述方法包括步骤：培养本发明第四方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和

分离所述目的蛋白，即得所述重组I型胶原蛋白酶；

在一些优选的方案中，所述宿主细胞通过含有本发明第二方面所述多核苷酸的质粒转化大肠杆菌获得。

在一些优选的方案中，使用SB、TB、LB、SOC培养基培养所述的宿主细胞，更优选为使用TB培养基培养所述的宿主细胞。

在一些优选的方案中，在振荡的环境中培养所述的宿主细胞。

在一些优选的方案中，在温度为16至19℃下或35至39℃下培养所述宿主细胞，更优选为在温度为16至19℃下培养所述宿主细胞。

在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。

在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，使用IPTG进行诱导，以表达出目的蛋白。

在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，培养至OD600在0.6至0.8，后使用IPTG进行诱导，以表达出目的蛋白。

在一些优选的方案中，所述分离所述目的蛋白的步骤包括：

将经破碎的目的蛋白上清液与流动相同时通过层析柱进行洗脱，收集洗脱液。

在一些优选的方案中，所述层析柱为Ni-柱亲和层析柱(Ni-NTA)。

本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如本发明第一方面提供的I型胶原蛋白酶突变体；或者

如本发明第二方面提供的的多核苷酸；或者

如本发明第三方面提供的表达载体；或者

如本发明第四方面所述的宿主细胞。

本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：

(1)本发明提供了I型胶原蛋白酶突变体，其具有较好的耐碱性，可适用于酶解法提取鱼皮废料；

(2)本发明提供了基于原核表达体系的重组I型胶原蛋白酶及其突变体的表达方法，该方法可溶蛋白表达量提高，产物中内毒素含量低，产物活性好，适宜工业化放大生产。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。

图1是根据本发明实施例中重组I型胶原蛋白酶表达产物SDS-PAGE鉴定图；

图2是根据本发明实施例中重组I型胶原蛋白酶电泳图；

图3根据本发明实施例中I型胶原蛋白酶酶活测试标准曲线图；

图4是根据本发明实施例中内毒素测定标准曲线图。

具体实施方式

现有技术中，生产的I型胶原蛋白酶内霉素含量较高，为降低毒性，需要对I型胶原蛋白酶进行纯化处理，通常纯化的步骤极其繁琐，费时费力，但I型胶原蛋白酶实际使用时通常不需要极高的纯度，因此开发一种简便的制备低毒I型胶原蛋白酶的方式十分重要。本发明的一个方面，利用重组蛋白技术，通过同义密码子偏好性优化，得到了胶原蛋白酶优化密码子序列，并研究适宜的培养条件和纯化方式，开发了产量高、活性好和低毒的I型胶原蛋白酶原核表达体系，并获得了重组I型胶原蛋白酶。

此外，由于现有的I型胶原蛋白酶常不耐受强碱环境，限制了其使用，本发明人进一步在前述表达体系的基础上，将优化的I型胶原蛋白酶密码子序列替换成编码I型胶原蛋白酶突变体的密码子序列，使表达产物的碱耐受性得以提升。

本发明中，I型胶原蛋白酶原核表达体系的构建包括以下步骤：1)由目的蛋白(I型胶原蛋白酶或其突变体)的氨基酸序列得到目的基因序列/编码目的蛋白的多核苷酸序列；2)对所得多核苷酸序列进行同义密码子偏好性优化得到多个优化密码子；3)构建包含所得优化密码子的载体；4)将含有优化密码子的载体导入宿主细胞并诱导培养，以表达出重组目的蛋白。优选地，步骤4)后还包括纯化目的蛋白的步骤。

获取目的基因/获取目的蛋白有关的核酸序列

本发明中目的蛋白或其元件的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

在本发明的一个实施方式中，目的蛋白是成熟Ⅰ型胶原蛋白酶(溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)的ColG基因，UniProtKB数据库编号为Q9X721，截取aa111-1118的氨基酸获得)。在本发明的另一个实施方式中，目的蛋白是前述Ⅰ型胶原蛋白酶的突变体，所述突变体在选自以下的一个或多个位点发生突变：R929、F952、V978、D966、V973和D974。更优选地，所述I型胶原蛋白酶突变体发生突变的方式选自以下任一种或几种的组合：R929A、F952A、V978A、D966A、V973A和D974A。更优选地，所述突变体氨基酸序列如SEQ IDNO:5或SEQ IDNO:6所示。

同义密码子偏好性优化

为克服在大肠杆菌中表达异源蛋白时产量降低的潜在问题，本发明涉及经同义密码子偏好性优化的多核苷酸序列。对获取的目的基因序列进行同义密码子偏好性优化，经同义密码子偏好性优化的目的基因序列可表达与目的蛋白相同的氨基酸序列。在本发明的一些实施方式中，通过对编码溶组织梭菌来源的I型胶原蛋白酶的基因序列进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化，得到如SEQ ID NO:1所示的优化密码子Ⅰ。在本发明的一些实施方式中，通过对编码溶组织梭菌来源的I型胶原蛋白酶突变体的基因序列进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化，得到如SEQ ID NO:2所示的优化密码子Ⅱ和如SEQ ID NO:3所示的优化密码子Ⅲ。

本发明还涉及与SEQ ID NO:1-3所示序列的同源性大于80％，优选大于85％，更优选大于90％，更优选大于91％，更优选大于95％的多核苷酸；和与SEQ ID NO:1-3所示序列互补的多核苷酸。

目的基因的载体

本发明中还涉及包含本发明的多核苷酸的载体。本发明中“载体”表示线性或环状DNA分子，其包含编码目的蛋白的片段，所述目的蛋白可操作地连接到提供其转录的其它片段。这样的附加片段可以包括启动子和终止子序列，并且可以任选地包括一个或多个复制起点，一个或多个可选择标记，增强子，多腺苷酸化信号，载体等。载体片段可以衍生自宿主生物体，另一生物体，质粒或病毒DNA，或可以是合成的。载体可以是合成的或方便地进行重组DNA操作的任何表达载体，载体的选择通常取决于载体要导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即载体，其作为染色体外实体存在，染色体外实体的复制与染色体复制无关，例如质粒。或者，载体可以是当引入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。在一个实施方案中，本发明的载体是表达载体。本发明的一个实施例中选择pET-28a(+)作为载体，以获取更高效的表达效率。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。示例性地，使用DNA内切酶将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，然后将经密码子优化的目的基因片段连接于载体，可选用单酶切位点的黏端连接、双酶切片段的定向克隆、不同限制酶切位点的黏端连接、平端连接、人工接头连接或同寡核苷酸末端连接实现外源DNA片段的插入。

含有目的基因的载体转化宿主细胞

本发明还涉及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞。含有经密码子优化的目的基因的载体可以通过已知的方法插入、转染或乙其他方式转化到宿主细胞中，从而获得含有本发明经密码子优化的目的基因并能够表达目的蛋白的转化体。本发明中“宿主细胞”是引入了外源多核苷酸和/或载体的细胞。宿主细胞可以是真核宿主细胞或原核宿主细胞，宿主细胞优选是细菌，并且优选是大肠杆菌，更优选是大肠杆菌ROSETTA(DE3)菌种(Escherichia coli Rosetta(DE3)strain)。

制备目的蛋白的方法

本发明还涉及制备目的蛋白的方法，可利用本发明的多核苷酸序列表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

其中，步骤(1)含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞可通过本领域技术人员熟知的常规技术进行，当宿主是大肠杆菌时，可选用热击法和电转化法等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，优选为SB、TB、LB或SOC培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。为促进目的蛋白的表达并提升可溶蛋白的表达量，本发明的一个优选的实施方式，使用TB或LB培养基培养的宿主细胞，且所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。

为进一步促进目的蛋白的可溶性表达，在本发明的一个优选的实施方式中，培养宿主细胞至OD₆₀₀在0.6-0.8之间后，采用IPTG进行诱导，并在17至19℃下或35至39℃下继续培养约8至12小时。在低温范围例如17至19℃下可溶性表达量高。

在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。因此本发明中，在成功培养得到目的蛋白后，还涉及对其进行分离和纯化的步骤，例如步骤(3)中，从培养基中分离和纯化蛋白质以获得高纯度的目的蛋白。虽纯化目的蛋白的方法可是本领域技术人员熟知的常规手段，包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。本发明的优选的实施方式中提供了一种简便地纯化目的蛋白的方法，步骤包括：1)使用Ni-NTA柱对破碎后的重组目的蛋白进行纯化，2)对纯化产物进行超滤浓缩；3)收集对应分子量的目的蛋白条带进行透析，得到纯化的目的蛋白。优选地，步骤3)中，在透析液中加入含有钙离子和/或锌离子的盐。纯化的样品可通过BCA法测量浓度，计算产量。

由于胶原蛋白酶常用于分离组织或生物酶解法提取胶原蛋白，因此可以理解地在实际使用胶原蛋白酶的过程中，去除内毒素使产物毒性较低即可，对酶纯度并无过高的要求，本发明的实施方式提供的纯化目的蛋白的方式与本发明开发的目的蛋白表达体系相互配合，无须使用耗时较长且费用较高的纯化方法，即可使表达产物内毒素含量达到较低的水平(低于0.1EU/mL)。

在本发明中，使用针对本文中的某些实施例提供的任何示例性或示例性措辞(例如，“”)只是为了更好地呈现本发明，而不限制以其它方式要求权利的本发明的范围。本文中的任何措辞都不应被解释为表示本发明实施中不可缺少的权利要求中未描述的要素。

如果引用文献中的术语的定义或使用与本文中描述的术语的定义不一致或不一致，则使用本文中描述的术语的定义，而不使用引用文献中的术语的定义。

本文中使用的各种术语如下所示。如果权利要求中使用的术语未在下文中定义，则应给出本领域技术人员给出的该术语的最广泛定义，以反映在申请时印刷的出版物或所发布的专利中。

如本文中所用的，术语“分离的”是指与核酸或多肽在其天然来源中存在的至少一种其它组分(例如核酸或多肽)分离的核酸或多肽。在一个实施方案中，发现核酸或多肽仅存在(如果有的话)通常存在于其溶液中的溶剂，缓冲液，离子或其它组分。术语“分离的”和“纯化的”不包括存在于其天然来源中的核酸或多肽。

如本文中所用的，术语“多核苷酸”和“多核苷酸序列”可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。

如本文中所用的，术语“密码子优化”是指根据实际做蛋白表达或生产的生物(包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物血细胞、植物细胞、昆虫细胞等)表现出的密码子利用差异，避免使用低利用率或稀有的密码子，来提高基因合成效率的方式。

如本文中所用的，术语“同源性”和“同一性”可互换使用，是指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即相同)核苷酸或氨基酸的百分比。可以通过以下方法测量两个或多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性。排列多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列，对排列的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行评分，并将其与排列的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行比较。多核苷酸可以在一个位置上不同，例如，根据包含不同的核苷酸(即，替换或变异)或核苷酸的缺失(即，在多核苷酸中插入或缺失一个或两个核苷酸)。多肽可以例如通过含有氨基酸(即，取代或变异)或氨基酸的缺失(即，插入一个或两个多肽中的氨基酸或氨基酸的缺失)在一个位置上不同。可以通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算序列同一性。例如，百分比同一性可通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数，然后乘以100来计算。

如本文中所用的，术语“序列互补”和“反向序列互补”可互换使用，指的是与原多核苷酸序列的方向相反，且与原多核苷酸序列互补的序列。例如，如果原始多核苷酸序列是ACTGAAC，则其反向互补序列是GTTCAT。

如本文中所用的，术语“表达”包括涉及宿主细胞中多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录，翻译，翻译后修饰和分泌。表达后可收获，即回收宿主细胞或表达产物。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。

实施例1

本实施例中，合成了含有编码溶组织梭菌属重组胶原蛋白酶I型的优化密码子的质粒，并将其导入大肠杆菌培养获得单克隆。

(1)构建重组胶原蛋白酶I型质粒

获取溶组织梭菌属胶原蛋白酶I型基因序列，并对其进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化，得到优化密码子Ⅰ(SEQ ID NO.1)，连接到pET-28a(+)载体，并委托苏州金维智生物科技有限公司合成。

(2)重组质粒导入宿主大肠杆菌

取上述步骤(1)中制备的表达质粒1μL，在冰浴条件下，加入到30μL大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，冰浴放置30min，42℃水浴45s，立刻冰上放置2min，加入400μL不含抗生素的SOC培养基，37℃、230rpm振荡培养45min。取100μL菌液均匀涂布到含100μg/mL卡那抗性的LB平板上，37℃培养箱培养过夜。

SEQ ID NO.1

ATTGCGAACACCAACAGCGAAAAATATGATTTTGAATATCTGAACGGTCTGAGCTATACCGAACTGACCAACCTGATTAA

AAACATTAAATGGAATCAGATTAACGGCCTGTTTAACTATAGCACCGGCAGTCAGAAATTTTTTGGCGATAAAAACCGCG

TGCAAGCGATTATTAACGCGCTGCAAGAAAGCGGCCGCACCTATACCGCGAATGATATGAAGGGCATTGAAACCTTTACC

GAAGTGCTGCGCGCGGGCTTTTATCTGGGCTATTATAACGATGGCTTAAGTTATTTAAACGATCGCAACTTTCAAGATAA

ATGCATTCCGGCGATGATTGCGATTCAGAAAAACCCGAACTTTAAACTGGGCACGGCGGTGCAAGATGAAGTGATTACGA

GCCTGGGCAAACTGATTGGCAACGCGAGCGCGAACGCGGAAGTGGTGAACAACTGCGTGCCGGTGCTGAAACAGTTTCGC

GAAAACCTGAATCAGTATGCGCCGGATTATGTGAAAGGCACCGCGGTGAACGAACTGATTAAAGGCATTGAATTTGATTT

TAGCGGCGCGGCGTATGAAAAAGATGTGAAAACCATGCCGTGGTATGGCAAAATTGACCCGTTTATTAACGAACTGAAAG

CGCTGGGCCTGTATGGCAACATTACGAGCGCGACCGAATGGGCGAGCGATGTGGGCATTTATTATCTGAGCAAATTTGGC

CTGTATAGCACCAACCGCAACGATATTGTGCAGAGCCTGGAAAAAGCGGTGGATATGTATAAATATGGCAAAATCGCGTT

CGTGGCGATGGAACGCATTACCTGGGATTATGATGGCATTGGCAGCAACGGCAAAAAAGTTGATCACGATAAATTTCTGG

ATGATGCGGAAAAACATTATCTGCCGAAAACCTATACCTTTGATAACGGCACCTTTATTATTCGCGCGGGCGATAAAGTG

AGCGAAGAAAAAATTAAACGCCTGTATTGGGCGAGCCGCGAAGTGAAAAGTCAGTTTCATCGCGTGGTGGGCAACGATAA

AGCGCTGGAAGTGGGCAACGCGGATGATGTGCTGACCATGAAAATTTTTAACAGCCCGGAAGAATATAAATTTAACACCA

ACATTAACGGCGTGAGCACCGATAACGGCGGCCTGTATATTGAACCGCGCGGCACCTTTTATACCTATGAACGCACCCCG

CAGCAGAGCATTTTTAGCCTGGAAGAACTGTTTCGCCATGAATATACCCATTATCTGCAAGCGCGCTATCTGGTGGATGG

CCTGTGGGGCCAAGGCCCGTTTTATGAAAAAAACCGCCTGACCTGGTTTGATGAAGGCACGGCGGAATTTTTTGCGGGCA

GCACCCGCACGAGCGGCGTGCTGCCGCGCAAAAGCATTCTGGGCTATCTGGCGAAAGATAAAGTGGATCATCGCTACAGC

CTGAAAAAAACCCTGAACAGCGGCTATGATGATAGCGATTGGATGTTTTATAACTATGGCTTTGCGGTGGCGCATTATCT

GTATGAAAAGGATATGCCGACCTTTATTAAAATGAACAAAGCGATTCTGAACACCGATGTGAAAAGCTATGATGAAATTA

TTAAAAAACTGAGCGACGATGCGAACAAAAACACCGAATACCAAAACCATATTCAAGAACTGGCGGATAAATATCAAGGC

GCGGGCATTCCGCTGGTGAGCGATGATTATCTGAAAGATCATGGCTATAAAAAAGCGAGTGAAGTGTATAGCGAAATTAG

CAAAGCGGCGAGCCTGACCAACACGAGCGTGACCGCGGAAAAAAGTCAGTATTTTAACACCTTTACCCTGCGCGGCACGT

ACACCGGCGAAACGAGCAAAGGCGAATTTAAAGATTGGGATGAAATGAGCAAAAAACTGGATGGCACCCTGGAAAGCCTG

GCGAAAAACAGCTGGAGCGGCTATAAAACCCTGACCGCGTATTTTACCAACTATCGCGTGACGAGCGATAACAAAGTGCA

GTATGATGTGGTGTTTCATGGCGTGCTGACCGATAACGCGGATATTAGCAACAACAAAGCGCCGATTGCGAAAGTGACCG

GCCCGAGCACCGGCGCGGTGGGCCGCAACATTGAATTTAGCGGCAAAGATAGCAAAGATGAAGACGGTAAAATTGTGAGC

TATGATTGGGATTTTGGCGATGGCGCGACGAGCCGCGGCAAAAACAGCGTGCATGCGTACAAAAAAGCGGGCACCTATAA

CGTGACCCTGAAAGTGACCGATGATAAAGGCGCGACCGCGACCGAAAGCTTTACCATTGAAATTAAAAACGAAGATACCA

CGACCCCGATTACCAAAGAAATGGAACCGAACGATGATATTAAAGAAGCGAACGGCCCGATTGTGGAAGGCGTGACCGTG

AAAGGCGATCTGAACGGCAGTGATGATGCCGATACCTTTTATTTTGATGTGAAAGAAGATGGCGATGTGACCATTGAACT

GCCGTACAGCGGCAGCAGCAACTTTACCTGGCTGGTGTATAAAGAAGGCGATGATCAGAATCATATTGCGAGCGGCATTG

ATAAAAACAACAGCAAAGTGGGCACCTTTAAAAGCACCAAAGGCCGCCATTATGTGTTTATTTATAAACATGATAGCGCG

AGCAACATTAGCTATAGCCTGAACATTAAAGGCCTGGGCAACGAAAAACTGAAAGAAAAAGAAAACAACGATAGCAGCGA

TAAAGCGACCGTGATTCCGAACTTTAACACCACCATGCAAGGCAGCCTGCTGGGCGATGATAGCCGCGATTATTATAGCT

TTGAAGTGAAAGAAGAAGGCGAAGTGAACATTGAACTGGATAAAAAAGATGAATTTGGCGTGACCTGGACCCTGCATCCG

GAAAGCAACATTAACGATCGCATTACCTATGGCCAAGTGGATGGCAACAAGGTGAGCAATAAGGTGAAACTGCGCCCGGG

CAAATATTATCTGCTGGTGTACAAATATAGCGGCAGCGGCAACTATGAACTGCGCGTGAACAAA

实施例2

本实施例中，对溶组织梭菌属I型胶原蛋白酶进行随机突变，得到若干组溶组织梭菌属重组I型胶原蛋白酶突变体，示例性地如I型胶原蛋白酶突变体A和I型胶原蛋白酶突变体B，通过分析得到编码各突变体的基因序列，并对其进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化，得到若干优化密码子，示例性地如I型胶原蛋白酶突变体A对应的优化密码子Ⅱ(SEQ IDNO.2)、I型胶原蛋白酶突变体B对应的优化密码子Ⅲ(SEQ ID NO.3)，并分别连接到pET-28a(+)载体，并委托苏州金维智生物科技有限公司合成重组质粒。

按照与实施例1中相同的方法导入将得到的重组质粒导入大肠杆菌进行培养，获得单克隆。

SEQ ID NO.2

ATCGCAAACACTAACTCCGAAAAATACGACTTCGAATACCTGAACGGCCTGTCCTATACTGAACTGACTAACCTGATTAA

AAACATCAAATGGAATCAAATCAATGGTCTGTTTAACTATTCTACCGGTTCCCAGAAATTCTTCGGTGATAAGAACCGTG

TCCAGGCCATCATTAACGCACTGCAGGAATCTGGTCGTACCTATACTGCTAACGACATGAAAGGTATCGAGACCTTTACC

GAAGTGCTGCGTGCCGGTTTCTATCTGGGTTATTATAACGACGGTCTGTCCTATCTGAACGATCGTAACTTCCAAGATAA

ATGCATTCCGGCGATGATCGCAATCCAAAAAAACCCAAACTTTAAACTGGGCACCGCGGTTCAGGACGAGGTTATCACGA

GCCTGGGTAAGCTGATCGGCAACGCATCTGCCAACGCGGAAGTTGTGAACAACTGCGTGCCGGTACTGAAACAGTTCCGC

GAAAACCTGAATCAGTACGCTCCGGATTATGTGAAAGGTACCGCAGTTAACGAGCTGATCAAAGGCATTGAATTCGACTT

CTCTGGCGCTGCGTATGAGAAAGACGTCAAAACCATGCCGTGGTATGGTAAGATCGACCCTTTCATTAACGAACTGAAAG

CTCTGGGTCTGTACGGTAACATCACCTCCGCCACTGAATGGGCGAGCGATGTGGGTATCTACTACCTGTCTAAATTCGGC

CTGTACTCCACTAATCGTAACGACATCGTGCAGAGCCTGGAAAAGGCGGTGGATATGTACAAATACGGTAAGATTGCCTT

CGTTGCTATGGAACGTATTACCTGGGACTACGACGGTATTGGTAGCAACGGTAAGAAGGTGGACCATGACAAATTCCTGG

ATGATGCAGAGAAGCATTATCTGCCGAAAACTTACACCTTTGACAACGGTACTTTTATTATCCGTGCCGGCGACAAAGTT

TCTGAAGAAAAAATCAAACGTCTGTATTGGGCTTCCCGTGAAGTTAAGAGCCAGTTCCACCGTGTTGTAGGCAACGACAA

AGCGCTGGAAGTGGGCAACGCTGATGATGTTCTGACTATGAAAATCTTCAACTCCCCGGAAGAATACAAATTCAACACCA

ACATCAACGGTGTTTCTACTGATAACGGTGGTCTGTATATCGAACCGCGTGGCACCTTCTACACTTACGAGCGTACTCCG

CAGCAGTCCATCTTCTCTCTGGAAGAACTGTTCCGTCACGAATATACCCACTACCTGCAAGCTCGCTATCTGGTTGACGG

TCTGTGGGGCCAGGGTCCATTCTACGAAAAAAACCGCCTGACCTGGTTCGATGAGGGCACCGCTGAATTCTTTGCAGGTT

CTACCCGTACCTCCGGTGTGCTGCCGCGTAAAAGCATCCTGGGCTACCTGGCCAAAGACAAGGTAGATCACCGTTACTCC

CTGAAAAAAACCCTGAACAGCGGTTATGACGATAGCGACTGGATGTTCTATAACTACGGTTTCGCTGTTGCACACTATCT

GTATGAAAAAGACATGCCGACTTTTATTAAGATGAACAAAGCCATCCTGAACACCGATGTTAAAAGCTATGACGAAATTA

TTAAAAAACTGAGCGATGACGCGAATAAAAACACCGAATATCAGAACCATATCCAAGAACTGGCGGATAAATACCAGGGT

GCGGGCATCCCGCTGGTTTCCGATGATTATCTGAAAGATCACGGTTACAAAAAAGCCAGCGAAGTGTACTCTGAAATCAG

CAAAGCCGCAAGCCTGACCAACACTTCTGTAACCGCCGAAAAGAGCCAGTATTTCAACACCTTCACTCTGCGTGGTACTT

ACACTGGCGAGACCAGCAAAGGCGAGTTCAAAGACTGGGATGAAATGTCCAAAAAGCTGGACGGTACCCTGGAATCCCTG

GCGAAAAACTCTTGGAGCGGCTACAAAACGCTGACCGCATACTTCACCAACTACCGTGTTACCTCCGATAATAAAGTTCA

GTATGACGTGGTTTTCCACGGCGTGCTGACCGACAACGCTGACATTTCCAATAACAAAGCTCCAATCGCCAAGGTAACGG

GTCCATCTACCGGCGCAGTTGGCCGTAACATCGAATTCTCTGGTAAAGACTCTAAAGACGAAGATGGTAAAATTGTCTCT

TACGACTGGGATTTCGGTGACGGTGCCACTTCTCGTGGTAAAAACAGCGTTCACGCTTACAAAAAAGCGGGTACCTACAA

TGTGACTCTGAAAGTTACCGACGACAAAGGCGCAACCGCCACTGAGTCCTTCACCATTGAAATCAAAAACGAAGATACTA

CCACGCCAATCACTAAAGAAATGGAACCGAACGATGACATCAAAGAGGCGAATGGCCCTATCGTAGAAGGTGTCACTGTG

AAGGGTGATCTGAACGGTTCCGACGATGCGGACACCTTCTACTTCGATGTAAAAGAAGATGGCGACGTAACCATCGAACT

GCCGTACTCTGGTTCTTCTAACTTTACCTGGCTGGTTTATAAAGAAGGTGACGACCAGAACCACATCGCGTCTGGCATCG

ACAAAAACAACTCCAAGGTTGGCACTTTCAAAAGCACTAAAGGCCGTCACTACGTGTTCATTTACAAACACGATTCTGCG

TCCAACATCTCCTACTCTCTGAACATCAAAGGCCTGGGTAACGAAAAACTGAAGGAAAAAGAAAACAACGATTCTTCCGA

TAAAGCAACCGTTATTCCGAACTTTAATACTACCATGCAGGGTAGCCTGCTGGGTGATGATTCTGCTGACTATTACTCTT

TCGAAGTGAAAGAAGAGGGTGAAGTAAACATCGAACTGGATAAAAAAGACGAAGCTGGCGTAACTTGGACCCTGCACCCG

GAATCCAATATTAATGATCGTATTACGTACGGCCAAGTAGACGGCAACAAAGCGTCCAACAAGGTTAAACTGCGTCCGGG

CAAATACTATCTGCTGGTTTACAAATATAGCGGTTCTGGTAACTACGAACTGCGTGTTAACAAGSEQID NO.3

ATCGCGAATACGAATTCTGAGAAATACGATTTTGAGTACCTGAACGGCCTGAGCTATACCGAACTGACCAACCTGATCAA

AAACATCAAGTGGAATCAGATTAACGGTCTGTTCAACTACTCTACTGGCAGCCAGAAATTCTTCGGTGACAAGAACCGTG

TTCAGGCGATCATTAACGCGCTGCAGGAATCCGGCCGTACGTACACTGCTAACGACATGAAAGGCATCGAAACTTTCACT

GAGGTGCTGCGCGCTGGTTTTTACCTGGGTTATTACAACGATGGCCTGAGCTATCTGAACGACCGTAACTTCCAGGATAA

ATGCATCCCGGCGATGATCGCGATTCAGAAAAACCCAAACTTCAAACTGGGCACTGCCGTACAGGACGAGGTTATCACCT

CCCTGGGTAAACTGATTGGCAACGCTTCCGCAAACGCGGAAGTGGTTAACAACTGTGTTCCGGTGCTGAAGCAGTTCCGC

GAAAACCTGAACCAGTACGCCCCGGACTACGTTAAAGGCACCGCCGTTAACGAACTGATCAAAGGTATCGAGTTCGACTT

TAGCGGTGCTGCGTACGAAAAAGACGTCAAAACCATGCCTTGGTATGGTAAAATCGACCCGTTCATTAACGAACTGAAAG

CACTGGGTCTGTACGGTAACATTACCTCTGCGACCGAGTGGGCAAGCGATGTAGGTATTTACTACCTGTCTAAATTCGGC

CTGTATAGCACCAACCGTAACGACATTGTTCAGTCCCTGGAAAAAGCAGTTGATATGTACAAATATGGTAAGATCGCATT

CGTTGCGATGGAACGTATCACGTGGGACTACGACGGCATCGGTTCTAACGGTAAAAAAGTAGACCACGACAAGTTTCTGG

ACGACGCTGAAAAGCATTACCTGCCGAAAACCTATACTTTTGACAACGGTACCTTCATTATCCGTGCTGGTGATAAAGTA

TCCGAGGAGAAGATCAAACGTCTGTATTGGGCGTCCCGTGAAGTTAAATCCCAGTTCCACCGTGTTGTGGGTAACGACAA

AGCTCTGGAAGTGGGCAACGCTGACGATGTTCTGACCATGAAAATCTTCAACTCCCCGGAAGAATACAAATTTAACACTA

ACATTAACGGCGTGTCCACTGACAATGGTGGCCTGTATATCGAACCGCGCGGTACGTTTTACACCTACGAACGTACCCCA

CAGCAGAGCATTTTCTCTCTGGAAGAACTGTTCCGTCACGAATACACCCATTACCTGCAGGCACGCTATCTGGTTGATGG

TCTGTGGGGTCAGGGCCCGTTCTACGAAAAAAACCGCCTGACCTGGTTCGATGAAGGTACCGCAGAATTCTTCGCTGGCA

GCACCCGTACCTCTGGTGTACTGCCGCGTAAAAGCATCCTGGGCTACCTGGCGAAAGACAAGGTGGATCACCGTTACTCT

CTGAAAAAAACTCTGAACTCCGGTTACGATGATTCTGATTGGATGTTTTACAACTACGGTTTTGCGGTTGCACACTACCT

GTACGAAAAGGATATGCCAACTTTCATCAAGATGAACAAGGCCATCCTGAACACCGACGTGAAGTCTTACGATGAAATCA

TCAAAAAACTGTCCGATGACGCTAACAAAAACACCGAGTATCAGAACCACATCCAGGAACTGGCGGATAAATATCAGGGT

GCGGGCATCCCGCTGGTTAGCGATGACTACCTGAAGGACCACGGCTATAAAAAAGCATCCGAGGTTTACTCTGAAATCTC

TAAAGCGGCATCCCTGACCAACACGTCTGTAACTGCAGAAAAATCTCAGTACTTTAACACCTTTACGCTGCGTGGCACTT

ATACTGGCGAAACTTCTAAAGGTGAGTTCAAAGACTGGGATGAAATGAGCAAAAAACTGGACGGTACCCTGGAAAGCCTG

GCCAAGAACAGCTGGTCCGGTTATAAAACCCTGACCGCATACTTCACCAATTATCGTGTAACCTCCGACAACAAGGTACA

GTATGACGTCGTCTTTCATGGCGTTCTGACTGACAACGCGGATATTAGCAACAACAAAGCTCCTATTGCGAAAGTTACCG

GTCCATCCACCGGTGCAGTTGGTCGTAACATCGAGTTCTCCGGCAAGGATAGCAAAGACGAAGATGGTAAAATCGTCTCC

TATGACTGGGATTTCGGTGACGGTGCGACTTCTCGCGGTAAAAACAGCGTGCACGCTTACAAAAAAGCAGGCACTTATAA

CGTAACTCTGAAAGTGACCGACGATAAAGGCGCTACCGCAACCGAATCTTTCACTATTGAAATCAAAAACGAAGATACCA

CGACTCCGATCACTAAGGAAATGGAGCCGAACGACGACATCAAAGAAGCTAACGGCCCGATCGTAGAGGGCGTTACTGTA

AAAGGTGATCTGAACGGTTCCGACGACGCGGACACCTTCTACTTCGATGTTAAAGAAGACGGCGACGTCACCATCGAACT

GCCTTATTCCGGTAGCAGCAACTTTACTTGGCTGGTTTACAAAGAAGGCGACGATCAGAACCATATTGCAAGCGGTATTG

ATAAAAACAATTCCAAAGTGGGCACCTTCAAGTCTACTAAAGGCCGCCATTACGTGTTCATTTACAAACACGACAGCGCT

TCTAACATTTCTTACTCTCTGAATATCAAGGGCCTGGGTAACGAGAAACTGAAAGAGAAAGAAAACAATGATAGCTCTGA

CAAAGCAACTGTTATCCCGAACTTTAATACTACCATGCAGGGCTCTCTGCTGGGCGATGACTCTCGTGACTACTATAGCT

TCGAAGTCAAAGAGGAAGGTGAAGTTAACATCGAGCTGGACAAAAAAGATGAATTCGGCGTTACCTGGACCCTGCACCCG

GAATCTAACATCAATGCTCGTATCACCTACGGTCAGGCCGCGGGTAACAAAGTTAGCAACAAAGTGAAGCTGCGTCCTGG

TAAATACTACCTGCTGGTGTACAAATATTCCGGTTCCGGCAATTATGAACTGCGTGTTAACAAAI型胶原蛋白酶氨基酸序列SEQ ID NO.4

IANTNSEKYDFEYLNGLSYTELTNLIKNIKWNQINGLFNYSTGSQKFFGDKNRVQAIINALQESGRTYTADMKGIETFTE

VLRAGFYLGYYNDGLSYLNDRNFQDKCIPAMIAIQKNPNFKLGTAVQDEVITSLGKLIGNASANAEVVNNCVPVLKQFRE

NLNQYAPDYVKGTAVNELIKGIEFDFSGAAYEKDVKTMPWYGKIDPFINELKALGLYGNITSATEWASDVGIYYLSKFGL

YSTNRNDIVQSLEKAVDMYKYGKIAFVAMERITWDYDGIGSNGKKVDHDKFLDDAEKHYLPKTYTFDNGTFIIRAGDKVS

EEKIKRLYWASREVKSQFHRVVGNDKALEVGNADDVLTMKIFNSPEEYKFNTNINGVSTDNGGLYIEPRGTFYTYERTPQ

QSIFSLEELFRHEYTHYLQARYLVDGLWGQGPFYEKNRLTWFDEGTAEFFAGSTRTSGVLPRKSILGYLAKDKVDHRYSL

KKTLNSGYDDSDWMFYNYGFAVAHYLYEKDMPTFIKMNKAILNTDVKSYDEIIKKLSDDANKNTEYQNHIQELADKYQGA

GIPLVSDDYLKDHGYKKASEVYSEISKAASLTNTSVTAEKSQYFNTFTLRGTYTGETSKGEFKDWDEMSKKLDGTLESLA

KNSWSGYKTLTAYFTNYRVTSDNKVQYDVVFHGVLTDNADISNNKAPIAKVTGPSTGAVGRNIEFSGKDSKDEDGKIVSY

DWDFGDGATSRGKNSVHAYKKAGTYNVTLKVTDDKGATATESFTIEIKNEDTTTPITKEMEPNDDIKEANGPIVEGVTV

KGDLNGSDDADTFYFDVKEDGDVTIELPYSGSSNFTWLVYKEGDDQNHIASGIDKNNSKVGTFKSTKGRHYVFIYKHDSA

SNISYSLNIKGLGNEKLKEKENNDSSDKATVIPNFNTTMQGSLLGDDSRDYYSFEVKEEGEVNIELDKKDEFGVTWTLHP

ESNINDRITYGQVDGNKVSNKVKLRPGKYYLLVYKYSGSGNYELRVNKI型胶原蛋白酶突变体A(R929A/F952A/V978A)氨基酸序列SEQ ID NO.5

IANTNSEKYDFEYLNGLSYTELTNLIKNIKWNQINGLFNYSTGSQKFFGDKNRVQAIINALQESGRTYTANDMKGIETFT

EVLRAGFYLGYYNDGLSYLNDRNFQDKCIPAMIAIQKNPNFKLGTAVQDEVITSLGKLIGNASANAEVVNNCVPVLKQFR

ENLNQYAPDYVKGTAVNELIKGIEFDFSGAAYEKDVKTMPWYGKIDPFINELKALGLYGNITSATEWASDVGIYYLSKFG

LYSTNRNDIVQSLEKAVDMYKYGKIAFVAMERITWDYDGIGSNGKKVDHDKFLDDAEKHYLPKTYTFDNGTFIIRAGDKV

SEEKIKRLYWASREVKSQFHRVVGNDKALEVGNADDVLTMKIFNSPEEYKFNTNINGVSTDNGGLYIEPRGTFYTYERTP

QQSIFSLEELFRHEYTHYLQARYLVDGLWGQGPFYEKNRLTWFDEGTAEFFAGSTRTSGVLPRKSILGYLAKDKVDHRYS

LKKTLNSGYDDSDWMFYNYGFAVAHYLYEKDMPTFIKMNKAILNTDVKSYDEIIKKLSDDANKNTEYQNHIQELADKYQG

AGIPLVSDDYLKDHGYKKASEVYSEISKAASLTNTSVTAEKSQYFNTFTLRGTYTGETSKGEFKDWDEMSKKLDGTLESL

AKNSWSGYKTLTAYFTNYRVTSDNKVQYDVVFHGVLTDNADISNNKAPIAKVTGPSTGAVGRNIEFSGKDSKDEDGKIVS

YDWDFGDGATSRGKNSVHAYKKAGTYNVTLKVTDDKGATATESFTIEIKNEDTTTPITKEMEPNDDIKEANGPIVEGVTV

SNISYSLNIKGLGNEKLKEKENNDSSDKATVIPNFNTTMQGSLLGDDSADYYSFEVKEEGEVNIELDKKDEAGVTWTLHP

ESNINDRITYGQVDGNKASNKVKLRPGKYYLLVYKYSGSGNYELRVNKI型胶原蛋白酶突变体B(D966A/V973A/D974A)氨基酸序列SEQ ID NO.6

ESNINARITYGQAAGNKVSNKVKLRPGKYYLLVYKYSGSGNYELRVNK

实施例3

本实施例中，取实施例1和实施例2中制备获得的单克隆无菌操作分别接种于含100μg/mL卡那抗性的TB培养基中，37℃220rpm振荡培养至OD600在0.6-0.8之间，IPTG进行诱导，分别放置于18℃振荡培养过夜。取样超声破碎进行SDS-PAGE鉴定，鉴定结果图参考图1。

图1中，第2-3列为未突变的I型胶原蛋白酶鉴定结果；第5-6列为突变体A的鉴定结果；第8-9列为突变体B的鉴定结果。由图1可知，18℃下，TB培养基培养得到的未突变的I型胶原蛋白酶和突变I型胶原蛋白酶突变体均可在上清表达(coll-1114kDa)。

实施例4

按照实施例3的相同的方式放大培养，得到突变和未突变的Ⅰ型胶原蛋白酶重组菌体，称取未突变的重组菌体4g，加入20mlLysisBuffer在冰上使用分散机分散。超声破碎细胞：Ф10探头，功率10％，工作5.5s，停止9.9s，超声破碎30min。20000rpm，4℃离心30min，取上清，0.22μm膜过滤。使用1mlNi-NTA纯化，流动相组分配制参考表1，流速为0.5ml/min，上样结束后使用20mlLysisBuffer冲洗UV和电导至基线。洗脱程序包括：Step1:20％B，10CV，1.5ml/min；Step2:20—80％B，20CV，1.5ml/min；Step3:100％B，15CV，1.5ml/min。

表1

试剂	BufferA	BufferB	BufferC	LysisBuffer
					Tris	50mM	50mM	50mM	50mM
NaCl	50mM	50mM	1M	500mM
					Glycerol	5％	5％	5％	5％
Imidazole	-	500mM	-	-
					pH	7.5	7.5	7.5	7.5

收集的样品进行电泳检测，结果如图2，根据电泳结果把含目的蛋白的样品混在一起超滤浓缩，透析至1×PBS，5mMCaCl，2mM ZnCl，pH7.4的溶液中，钙离子和锌离子作为胶原蛋白酶I型的辅酶，添加到酶溶液中可以提高酶的稳定性和生物活性。

纯化浓缩后的胶原蛋白酶I型，采用BCA测浓度，结果为：R²＝0.996，其浓度为2.693mg/ml，体积为12ml，产量为32.32mg，得率为8.079mg/g菌。

以同样的方式处理突变体A和突变体B的重组菌体，纯化透析后采用BCA法测浓度，突变体A结果为：R²＝0.994，其浓度为1.947mg/ml，体积为13ml产量为25.31mg，得率为6.33mg/g菌；突变体B结果为：R²＝0.996，其浓度为2.826mg/ml，体积为8ml产量为22.61mg，得率为5.65mg/g菌。

实施例5

本实施例中，取实施例4中纯化得到的突变和未突变的重组I型胶原蛋白酶进行酶活检测实验。具体步骤如下：

(1)溶液配制

工作液：取abcam的胶原蛋白酶活性检测试剂盒配制工作液体(名称：CollagenaseActivity Assay试剂盒，货号：ab196999)，取试剂盒中的Collagenase Substrate和Collagenase Assay Buffer按1：1.5的比例混合，得到酶活测定工作液。

阳性酶的配制：将I型阳性酶12500U溶于4mL稀释液中，制成母液浓度为3U/μL。按照浓度梯度逐步稀释，稀释液为PBSpH7.4缓冲液，得到各浓度梯度的阳性酶。

(2)仪器检测

酶标仪预热30min，设置温度为37℃。加入工作液100μL，在345nm处检测吸光值，记为A1。之后在空白组中加入各浓度的酶液1μL，反应10分钟，在345nm处检测吸光值A2。绘制标准曲线见图3。计算样品与空白的OD差值A2-A1，并根据差值求出样品浓度。结果见表2。

表2

注：coll-1为未突变的重组I型胶原蛋白酶，coll-1-A为重组I型胶原蛋白酶突变体A，coll-1-B为重组I型胶原蛋白酶突变体B。

1型未突变胶原蛋白酶原液浓度为2.693mg/mL，平均活力为5.33U/μL,则比活力为(5.33*1000)/2.693＝1979.2U/mg；

重组I型胶原蛋白酶突变体A原液浓度为1.947mg/mL，平均活力为3.58U/μL,则比活力为(3.58*1000)/1.947＝1838.7U/mg；

重组I型胶原蛋白酶突变体B原液浓度为2.826mg/mL，平均活力为3.80U/μL,则比活力为(3.80*1000)/2.826＝1344.7U/mg。

实施例6

本实施例中，取经过纯化的未突变的和突变的重组I型胶原蛋白酶进行碱耐受性测试。具体方法如下:

用1M的氢氧化钠或10％的稀盐酸调整1XPBS溶液的pH，分别至5、6、7、8、9、10，用不同pH的buffer把已测酶活的样品稀释到1U/μL，分别孵育1h，然后按照实施例5的方法测酶活，按照buffer的酸性、中性和碱性分成3组，分别为：pH5-6组，pH7-8组，pH9-10组，并计算每组的平均酶活，由于样品发挥酶活的最适pH范围在7-8，因此以pH7-8组的平均酶活为100％，做归一化处理，I型未突变胶原蛋白酶、突变体A和突变体B在不同pH范围的剩余酶活百分比如表3.

表3

实验结果显示，coll-1-A具有更好的碱耐受性，在碱性较强的环境中例如pH为9-10左右酶活仍然较好，野生型和突变体B，则无法在碱性较强的环境中维持较好的酶活。

实施例7

本实施例中，测定了纯化后所得的重组胶原蛋白酶的内霉素含量。具体实验步骤如下：

(1)器具前处理

首先将实验过程中的玻璃器皿用250℃烘烤50min，塑料离心管用0.5M的NaOH浸泡1h，然后用超纯水冲洗干净。

(2)操作步骤

BCA测定蛋白样品浓度，2-10mg/ml；加1％的TritonX-114，4℃搅拌30min；30℃，水浴30min；将离心机提前调至25℃，12000rpm，离心20min；小心吸取上层的水相，(注意无菌操作)。前述步骤重复2次。

(3)内毒素检测试剂盒(名称：Toxin Sensor Chromogenic LAL Endotoxin AssayKit，货号：L00350(16rnx)，厂家：南京金斯瑞生物科技有限公司)检测内毒素含量，首先是试剂准备：1)LAL：加1.7mL的LAL试剂水重悬，轻轻混匀，-20℃保存一周；2)染色底物：加1.7mL的LAL试剂水重悬，2-8℃避光保存；3)0.46M盐酸：在50mlLAL试剂水中加入2ml浓盐酸，充分混合，最终浓度为0.46M盐酸；4)反应终止液：用10ml的0.46M盐酸重悬color-stabilizer#1。重组后的终止溶液在2-8℃下保存后可稳定一周；5)Color-stabilizer#2and#3：分别用10mL的LAL试剂水重悬，2-8℃保存；6)内毒素标准品：加2mL的LAL试剂水重悬，终浓度10EU/mL2-8℃保存。

(4)内毒素检测

内毒素标曲：先将内毒素溶液稀释至1EU/mL，然后将内毒素溶液分别稀释至0.1,0.05,0.025、0.01EU/mL或是1、0.5、0.25、0.1EU/mL；在去内毒素管中分别加入100μL的标准品、样品和无热源的水；每管中加100μLLAL溶液；37℃孵育10min，然后加100μL底物37℃孵育6min；加500μLcolor-stabilizer#1，然后加500μLcolor-stabilizer#2，然后加500μLcolor-stabilizer#3；吸200μL溶液加入96孔板，在545nm处读吸光值，用水作对照。内毒素测定标准曲线图见图4。

样品检测前处理：每管样品取200uL，加入ETDA至终浓度5mM，煮沸20min，灭活胶原蛋白酶，离心取上清进行内毒素检测。

定量检测结果如下表4，除内毒素以后，I型胶原蛋白酶的内毒素含量均低于0.25EU/mL(大于等于该值为阳性，小于为阴性)，可判定该去除内毒素的工艺简单、可行，清除后的不同批次样品均合格。

表4

样品	减去空白	ln(x)	内毒素含量(EU/mL)
				阳性对照	0.9125
I型-1	0.6106	-2.8433	0.058
				I型-2	0.7050	-2.4529	0.086
I型-3	0.7297	-2.3507	0.095
				I型-4	0.6967	-2.4872	0.084
I型-5	0.7080	-2.4404	0.087
				I型-6	0.6975	-2.4839	0.084
I型-7	0.7322	-2.3404	0.096
				I型-8	0.7360	-2.3246	0.098

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims

1.一种I型胶原蛋白酶突变体，其特征在于，所述I型胶原蛋白酶突变体的氨基酸序列选自以下任一种：

(i)如SEQ ID NO.4所示序列的氨基酸序列；和

(ii)与如SEQ ID NO.4所示序列的同源性大于95％的氨基酸序列。

2.一种编码I型胶原蛋白酶的分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：

(i)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的多核苷酸；

(iii)与(i)或(ii)中所述的序列互补的多核苷酸。

3.一种编码如权利要求1所述的I型胶原蛋白酶突变体的分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：

(i)如SEQ ID NO.5所示的多核苷酸；

(ii)与如SEQ ID NO.5所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和

(iii)与(i)或(ii)中所述的序列互补的多核苷酸。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求2或3所述的多核苷酸。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，优选为pET-28a(+)。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求4或5所述的表达载体；或者

所述宿主细胞的基因组中整合有如权利要求1所述的多核苷酸。

7.一种制备I型胶原蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

使含有如权利要求1所述的多核苷酸载体转化宿主细胞；

培养所述宿主细胞，以表达所述I型胶原蛋白酶或其突变体。

8.一种制备I型胶原蛋白酶突变体的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

使含有如权利要求2所述的多核苷酸载体转化宿主细胞；

培养所述宿主细胞，以表达所述I型胶原蛋白酶或其突变体。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，使用TB培养基培养所述的宿主细胞；

和/或，在温度为16至19℃下培养所述宿主细胞；

和/或，培养所述宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因；

和/或，培养所述宿主细胞时，通过IPTG诱导以表达出目的蛋白。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1所述的多核苷酸I型胶原蛋白酶突变体；或者

如权利要求2或3所述的多核苷酸；或者

如权利要求4或5所述的表达载体；或者

如权利要求6所述的宿主细胞；或者

根据权利要求7至9任一项所述的方法所制备的重组I型胶原蛋白酶。