KR20220083662A - 고전단 가용화를 통한 거미 실크 단백질의 단리 방법 - Google Patents

고전단 가용화를 통한 거미 실크 단백질의 단리 방법 Download PDF

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KR20220083662A
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로버트 윌리엄 휘틀리
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볼트 쓰레즈, 인크.
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Abstract

요약서
본 내용은 용매의 적용 및 고-전단 미세유동화 방법을 통해 합성 블록 공중합체 단백질을 단리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

고전단 가용화를 통한 거미 실크 단백질의 단리 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 9월 16일자로 제출된 미국 가출원 번호 62/901,053을 우선권으로 주장하며, 이의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통하여 제출된 서열 목록을 포함하며, 이의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 전술한 ASCII 사본은 2020년 9월 16일자로 생성되었으며, BTT-033WO_SL.txt 이름으로 불리며, 크기는 50,960 바이트이다.
배경
거미의 실크 폴리펩티드는 큰 (>150kDa, >1000개 아미노산) 폴리펩티드로써, 이는 다음의 3개 도메인으로 나뉜다: N-말단 비-반복성 도메인 (NTD), 반복 도메인 (REP), 그리고 C-말단 비-반복성 도메인 (CTD). NTD 및 CTD는 상대적으로 작고 (각각 차례로 ~150개의 아미노산, ~100개의 아미노산), 잘-연구되었으며, 폴리펩티드 수성 안정성, pH 민감성 및 응집 시 분자 정렬을 부여하는 것으로 간주된다. NTD는 강력하게 예측되는 분비 테그를 또한 보유하며, 이는 대개 이종성(heterologous) 발현 동안 제거된다. 상기 반복성 영역은 천연 폴리펩티드의 ~90%로 구성되며, 결정질(crystalline) 영역과 무정형 영역으로 폴딩되는데, 차례로 실크 섬유에 강도 및 유연성을 부여한다.
실크 폴리펩티드는 벌, 나방, 거미, 진드기 및 기타 절지 동물을 비롯한 다양한 공급원으로부터 얻는다. 일부 유기체는 특유한 서열, 구조적 요소들 및 기계적 속성들을 가진 여러 실크 섬유를 만든다. 예를 들면, 황금눈 뜨개 거미(orb weaving spiders)는 환경 또는 삶의 주기에에 맞도록 맞춤 섬유로 중합되는 서로 상이한 실크 폴리펩티드 서열을 만드는 6개의 특유 유형의 선(glands)을 보유하고 있다. 상기 섬유의 이름은 이 섬유가 유래하는 선(glands)의 이름을 따서 명명되었으며, 폴리펩티드는 선(glands)의 약어(가령, "Ma"), 스피드로인(spidroin)의 경우 "Sp"(거미 피브로인의 약자)로 표시된다. 오브 위버(orb weavers)에서, 이러한 유형에는 메이저 엠풀레이트(MaSp, dragline이라고도 함), 마이너 엠풀레이(MiSp), 플라겔리폼(Flag), 아시니폼(AcSp), 튜불리폼(TuSp) 및 피리폼(PySp)이 내포된다. 유기체에서 상이한 속 및 종에 걸쳐 섬유 유형, 도메인 및 변이 전반에 걸친 폴리펩티드 서열의 이러한 조합은 재조합 섬유의 상업적 생산에 의해 이용될 수 있는 광범위한 잠재적 속성들을 유도한다. 지금까지, 재조합 실크 작업의 대부분은 메이저 엠풀레이트 스피드로인 (MaSp)에 중점을 두었다.
현재, 재조합 실크 섬유는 상업적으로 이용가능하지 않으며, 소수의 예외를 제외하고, 대장균(Escherichia coli) 및 기타 그람 음성 원핵생물이외 미생물에서 생산되지 않는다. 현재까지 생산된 재조합 실크는 주로 중합된 짧은 실크 시퀀스 모티프 또는 고유 반복 도메인의 단편으로 구성되며, 때로는 NTDs 및/또는 CTDs와 조합된다.
그러나, 일부 경우에서 재조합 실크 폴리펩티드는 생산 및 정제 과정 동안 바람직하지 못한 불용성 응집체(aggregates)를 형성한다. 응집하여 β-쉬트 구조를 형성하는 이들의 능력으로 인하여, 실크 서열 기반의 단백질은 용해화하는 것이 어렵다. 이러한 단백질의 용해화는 생물학적 분자에 대한 가혹한 화학적 조건, 이를 테면, 높은 몰 농도 카오트로프(chaotrope) 용액과 같은 조건을 대개 필요로 한다. 정제 동안 펩티드를 재-용해화시키는 방법은 대개 단백질을 분해하는데, 이로 인하여 낮은 수율과 낮은 점착력(tenacity)의, 촉감이 나쁜 섬유가 만들어지게 된다. 따라서, 실크 단백질의 용해도 및 회수를 증가시키는 이러한 폴리펩티드를 정제해내는 개선된 방법이 필요하다.
다양한 카오트로프 용액을 비롯한, 화학적 용매화가 불충분한 조건에서 높은 에너지 유체 처리기에 의해 생성된 전단, 충격 및 캐비테이션(cavitation)과 같은 높은 물리적 에너지의 적용을 통해, 실크 단백질을 용해화시키는 방법이 본원에서 제공된다.
요약
한 측면에서, 숙주 세포로부터 재조합 거미 실크 단백질을 단리시키는 방법이 본원에서 제공되며, 이 방법은 다음을 포함한다: 재조합 거미 실크 단백질을 포함하는 불용성 덩어리(mass)를 제공하고; 이러한 불용성 덩어리에 용매를 포함하는 수성 용액을 추가하고; 이 불용성 덩어리를 포함하는 수성 용액에 전단력을 가하고, 이로 인하여 이 수성 용액내 재조합 거미 실크 단백질이 용해화된다.
일부 구체예들에서, 상기 전단력은 미세유동화(microfluidization)를 통하여 제공된다.
일부 구체예들에서, 상기 미세유동화는 약 6x106 s-1 ~ 10x106 s-1의 전단율(shear rates)을 생성한다. 일부 구체예들에서, 상기 미세유동화는 적어도 약 6x106 s-1의 전단율을 생성한다. 일부 구체예들에서, 상기 미세유동화는 적어도 약 10x106 s-1의 전단율을 생성한다.
일부 구체예들에서, 상기 미세유동화는 20,000 psi ~ 30,000 psi 사이에서 실행된다. 일부 구체예들에서, 상기 미세유동화는 30,000 psi에서 실행된다. 일부 구체예들에서, 상기 미세유동화는 23,000 psi에서 실행된다.
일부 구체예들에서, 상기 미세유동화기는 M-110P 또는 LM10 미세유동화기이다.
일부 구체예들에서, 상기 미세유동화기는 G10Z 상호작용 챔버를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 미세유동화기는 F12Y 상호작용 챔버를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 전단력은 적어도 두 차례 적용된다. 일부 구체예들에서, 상기 전단력은 세 차례 적용된다. 일부 구체예들에서, 상기 전단력은 적어도 두 차례 적용에서 동일하다. 일부 구체예들에서, 상기 전단력은 적어도 두 차례 적용에서 상이하다.
일부 구체예들에서, 상기 불용성 덩어리는 숙주 세포를 포함하는 세포 배양물로부터 유래되며, 이때 상기 숙주 세포는 재조합 거미 실크 단백질을 발현시킨다.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 상기 세포 배양물로부터 유래된 불용성 덩어리를 수거하는 것을 더 포함하고, 이때 상기 불용성 덩어리는 상기 재조합 거미 실크 단백질을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 용매는 카오트로픽 작용제(chaotropic agent)이다. 일부 구체예들에서, 상기 카오트로픽 작용제는 우레아, 구아니딘 티오시아네이트 (GdnSCN), 또는 구아니딘 클로라이드 (GdnHCL)이다.
일부 구체예들에서, 상기 불용성 덩어리는 용매 부피에 대해 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 또는 30%의 불용성 덩어리로 해당 수성 용액에 추가된다.
일부 구체예들에서, 상기 카오트로픽 작용제는 0.1 - 10M 농도로 해당 수성 용액에 존재한다. 일부 구체예들에서, 상기 수성 용액은 약 10M의 우레아, 약 4M - 8M의 GdnHCl, 또는 약 3M - 6M의 GdnSCN을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 수성 용액은 단지 10M의 우레아를 포함하는 수성 용액, 단지 8M의 GdnHCl를 포함하는 수성 용액, 또는 단지 6M의 GdnSCN을 포함하는 수성 용액의 카오트로픽 활성을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 카오트로픽 활성은 한천-겔화 분석을 이용하여 정량화된다.
일부 구체예들에서, 상기 수성 용액은 3M GdnSCN 85% 부피에 대해 약 15%의 불용성 부분 덩어리를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 수성 용액은 4M GdnHCl 85% 부피에 대해 약 15%의 불용성 부분 덩어리를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 수성 용액은 10M 우레아 85% 부피에 대해 약 15%의 불용성 부분 덩어리를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 불용성 덩어리는 20°~ 30℃ 사이에서 항온처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 불용성 덩어리는 실온에서 항온처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 불용성 덩어리는 30℃를 넘지 않은 온도에서 항온처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 불용성 부분은 60 ~ 120 분 동안 상기 용매를 포함하는 수성 용액에서 항온처리된다.
일부 구체예들에서, 상기 불용성 덩어리는 세포 펠렛을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 세포 펠렛으로부터 유래된 불용성 덩어리의 수집은 상기 숙주 세포의 용해를 포함한다.
일부 구체예들에서, 용해는 열처리, 화학적 처리, 전단 파괴, 물리적 균질화, 초음파처리 또는 화학적 균질화를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 세포 배양물의 불용성 덩어리 수집은 상기 용해된 세포를 원심분리하여, 제 1 세포 펠렛을 얻는 것을 더 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 불용성 덩어리 수집은 다음을 더 포함한다: 상기 세포 펠렛을 10:1의 우레아 부피 대비 펠렛 덩어리 비율에서 4M 우레아를 포함하는 용액과 함께 항온처리하고; 그리고 4M 우레아를 포함하는 용액을 원심분리하여 제 2 세포 펠렛을 수득하고, 그 다음 상기 용매를 포함하는 수성 용액에서 제 2 세포 펠렛을 항온처리한다.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 상기 용액으로부터 재조합 거미 실크 단백질을 단리시키고, 이로써 상기 수성 용액으로부터 단리된 재조합 거미 실크 단백질을 만드는 것을 더 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 재조합 거미 실크 단백질은 상당한 결정질 실크 단백질, 높은 함량의 베타 쉬트 실크 단백질, 또는 낮은 용해도 실크 단백질이다.
일부 구체예들에서, 상기 재조합 거미 실크 단백질은 서열 식별 번호:23에서 제시된 울로보루스 디베르수스(Uloborus diversus) MiSP 단백질을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 재조합 거미 실크 단백질은 비-카오트로픽성(non-chaotropic) 용매에서 90%, 80%, 70%, 60%, 또는 50% 미만의 용해도 임계치를 갖는다.
일부 구체예들에서, 상기 세포 배양물은 곰팡이 세포, 박테리아 세포 또는 효모 세포를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 박테리아 세포는 대장균(Escherichia coli)이다.
일부 구체예들에서, 단리된 재조합 거미 실크 단백질의 양은 ELISA를 이용하여 측정된다. 일부 구체예들에서, 단리된 재조합 거미 실크 단백질의 양은 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 측정된다.
일부 구체예들에서, 상기 단리된 재조합 거미 실크 단백질은 전장의 재조합 거미 실크 단백질이다.
일부 구체예들에서, 상기 단리된 재조합 거미 실크 단백질은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 전장의 재조합 거미 실크 단백질을 포함한다.
일부 구체예들에서, 전장의 재조합 거미 실크 단백질의 양은 ELISA를 이용하여 측정된다. 일부 구체예들에서, 전장의 재조합 거미 실크 단백질의 양은 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 측정된다.
일부 구체예들에서, 상기 단리된 재조합 거미 실크 단백질의 순도는 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 09-95%, 또는 95-100%이다.
또다른 측면에서, 숙주 세포로부터 재조합 거미 실크 단백질을 단리시키는 방법이 본원에서 제공되며, 이 방법은 다음을 포함한다: 재조합 거미 실크 단백질을 포함하는 불용성 덩어리를 제공하고; 이러한 불용성 덩어리에 용매를 포함하는 수성 용액을 추가하고, 이때 상기 수성 용액은 최종 농도 10M 우레아에서 15% (w/v) 불용성 부분을 포함하며; 전단력 미세유동화를 통하여 상기 불용성 덩어리를 포함하는 수성 용액에 전단력을 적용시키고, 이로 인하여 상기 수성 용액에서 상기 재조합 거미 실크 단백질이 용해화되며; 그리고 상기 수성 용액으로부터 상기 재조합 거미 실크 단백질을 단리시키고, 이로써 단리된 재조합 거미 실크 단백질이 생성된다.
또다른 측면에서, 숙주 세포로부터 재조합 거미 실크 단백질을 단리시키는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 다음을 포함한다: 재조합 거미 실크 단백질을 포함하는 불용성 덩어리를 제공하고; 상기 불용성 덩어리를 수성 용액에 추가하고, 이때 상기 수성 용액은 최종 농도 10M 우레아에서 약 15% (w/v) 불용성 부분을 포함하고; 전단력은 미세유동화를 통하여 적용되며, 이때 상기 수성 용액에 제공되는 전단력은 약 10x106 s-1이며 이로써 상기 수성 용액에서 상기 재조합 거미 실크 단백질이 용해화되며; 그리고 상기 수성 용액으로부터 상기 재조합 거미 실크 단백질을 단리시키고, 이로써 단리된 재조합 거미 실크 단백질이 생성된다.
또다른 측면에서, 본원에 기술된 방법들에 의해 만들어진 재조합 거미 실크 단백질을 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다.
일부 구체예들에서, 상기 재조합 거미 실크는 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 전장의 재조합 거미 실크를 포함한다.
또다른 측면에서, 본원에 기술된 방법들에 의해 만들어진 재조합 거미 실크 단백질을 포함하는 실크 섬유가 본원에서 제공된다.
도면의 몇 가지 관점에 대한 간략한 설명
본원에서 기술된 방법들 및 조성물들의 이들 특징 및 다른 특징, 측면 및 이점은 다음의 설명 및 첨부 도면과 관련하여 더 잘 이해 될 것이며: 여기에서:
도 1A는 다양한 상호작용 챔버 유형들에서 압력에 대한 함수로써 산출된 전단력을 나타낸다. 도 1B는 다양한 단일 슬롯(slotted)화된 상호작용 챔버 유형들에서 압력에 대한 함수로써 산출된 유속을 나타낸다.
도 2는 10M 우레아로 추출하고, 미세유동화 프로세싱 이후, 울로보루스 디베르수스(Uloborus diversus) 실크 단백질 MiSp (서열 식별 번호:23)의 SEC 플롯을 나타낸다. 화살표는 MiSp 단백질 피크를 가리킨다.
상세한 설명
정의
청구범위 및 명세서에 사용된 용어는 달리 명시되지 않는 한 다음과 같이 정의된다.
본 명세서에 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 기술된 해당 방법 및 조성물과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어들은 해당 분야의 숙련된 기술자들이 통상적으로 이해하는 의미를 가져야 한다. 더욱이, 내용에서 달리 필요하지 않는 한, 단수형 용어들은 복수형을 포함하며, 복수형 용어들은 단수형을 포함한다. 일반적으로, 본 발명에 기술된 생화학, 효소학, 분자 및 세포 생물학, 미생물학, 유전학 및 폴리펩티드와 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 이의 기술들은 해당 분야에 잘 알려져 있고, 통상적으로 사용되는 것들이다.
본원에서 기술되는 방법 및 기술은 다른 언급이 없는 한, 일반적으로 당업계에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 실행되며, 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고 문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 가령, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, 그리고 2002까지 보충물); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990); Taylor and Drickamer, Introduction to Glycobiology, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp., Freehold, N.J.; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I, CRC Press (1976); Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II, CRC Press (1976); Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999) 참고.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 다른 참고문헌들은 그 전문이 본원의 참고문헌으로 편입된다.
달리 언급이 없는 한, 하기 용어들은 다음과 같은 의미를 가지는 것으로 이해되어야 한다:
"시험관내(in vitro)"라는 용어는 살아있는 유기체, 예를 들어, 조직 배양에서 성장하는 것과 같이 분리되어 성장하는 살아있는 세포에서 발생시키는 과정을 의미한다.
"생체내(in vivo)"라는 용어는 살아있는 유기체에서 일어나는 과정을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "정화시키는(clarifying)"이란 숙주 세포 바이오매스, 예를 들어, 전체 세포, 용해된 세포, 막, 지질, 소기관, 핵, 비-거미 실크 단백질, 또는 임의의 기타 바람직하지 않은 세포 부분 또는 산물, 또는 세포 배양의 임의의 기타 바람직하지 않은 부분을 제거하는 방법을 지칭한다. 정화시키는다는 것은 부분적으로 정제된 또는 단리된 거미 실크 조성물로부터 불순물을 제거하는 것을 또한 지칭한다. 불순물에는 비-거미 실크 단백질, 분해된 거미 실크 단백질, 단백질의 큰 집합체, 정제 및 분리 과정에서 사용되는 화학 물질 또는 기타 바람직하지 않은 물질이 포함될 수 있지만, 이에 국한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "순도(purity)"란 샘플, 가령, 추출된 샘플 안에 부분적 또는 분해 단리된 재조합 거미 실크 단백질, 지질, 단백질, 막 또는 기타 분자와 같은 모든 단리된 성분의 일부로서, 실질적인 전장 단리된 재조합 거미줄 단백질의 양을 지칭한다. 전장의 재조합 단백질은 알려진 이 전장의 단백질의 길이의 적어도 90-100%이다. 일부 구체예들에서, 전장의 재조합 거미 실크 단백질은 알려진 이 전장의 단백질의 길이의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다.
본원에 사용된 용어 "수율(yield)"이란 거미 실크의 출발량과 비교하여, 거미 실크 단백질 및 실질적으로 전장 거미 실크의 단편을 비롯한, 회수된 거미 실크의 총량을 지칭한다.
용어 "전단력(shear force)"이란 본체 또는 질량의 평면 단면 또는 표면에 평행하거나 또는 접선 방향으로 작용하는 힘을 의미한다. 유체의 경우, "전단율(shear rate)"이라는 용어는 유체의 하나의 층이 인접한 층을 통과하는 속도의 변화율을 지칭한다. 예를 들면, 두 개의 평행한 유체 평면이 서로 다른 속도로 이동할 때, 전단율이 발생한다.
용어 "가용성 실크 단백질(soluble silk protein)"이란 철저한(rigorous) 원심분리 후, 상청액에 남아있는 단백질을 지칭한다. 이러한 철저한 원심분리의 예는 실온에서 20분 동안 15,000 x g에서 원심분리된 50mL 원추형 원심분리기 튜브에 있는 실크 단백질의 50mL 분취량 샘플이다.
용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)" 또는 "핵산 분자(nucleic acid molecule)"는 길이가 최소한 10개 염기의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 상기 용어에는 DNA 분자 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 또는 합성 DNA) 및 RNA 분자 (예를 들어, mRNA 또는 합성 RNA)뿐만 아니라, 비-천연 뉴클레오티드 유사체, 비-고유 뉴클레오시드간 결합, 또는 둘 모두를 포함하는 DNA 또는 RNA의 유사체가 내포된다. 상기 핵산은 임의의 형상적(topological) 입체형태일 수 있다. 예로써, 상기 핵산은 단일-가닥, 이중-가닥, 삼중-가닥, 사중-가닥, 부분 이중-가닥, 분지형, 헤어핀, 원형 또는 자물쇠(padlocked) 입체형태일 수 있다.
달리 지시되지 않는 한, 그리고 일반적인 형식 "서열 식별 번호:~"로 본 명세서에 기재된 모든 서열, 예로서, "서열 식별 번호: 1을 포함하는 핵산"은 최소한 핵산 일부가 (i) 서열 식별 번호: 1의 서열, 또는 (ii) 서열 식별 번호: 1에 상보적인 서열을 가짐을 지칭한다. 이들 둘 중에서 선택은 내용에 따라 결정된다. 예로써, 핵산이 프로브로 사용되는 경우, 둘 중 하나의 선택은 프로브가 원하는 표적에 상보적이어야 한다는 요건에 따라 결정된다.
"단리된(isolated)" RNA, DNA 또는 혼합 중합체는 자연발생적 숙주 세포에서 고유의 폴리뉴클레오티드를 자연적으로 동반하는 다른 세포 성분, 예를 들어, 자연적으로 결합된 리보솜, 중합 효소 및 게놈 서열로부터 실질적으로 분리된 것이다.
용어 "재조합(recombinant)"이란 (1) 자연 발생 환경으로부터 제거되어 있거나, (2) 당해 유전자가 자연에서 발견되는 이의 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 연합되어 있지 않거나, (3) 자연에서는 연결되지 않은 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되거나, 또는 (4) 실제로는 발생하지 않는 생물분자, 예를 들어, 유전자 또는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "재조합"이란 클로닝된 DNA 단리물, 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드 유사체, 또는 이종(heterologous)시스템에 의해 생물학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드 유사체, 뿐만 아니라 이러한 핵산에 의해 인코드된 폴리펩티드 및/또는 mRNA와 관련하여 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 이종 서열이 유기체 게놈 내 내인성 핵산 서열 (또는 이러한 서열의 인코드된 폴리펩티드 산물)에 인접하여 배치되어, 이러한 내인성 핵산 서열의 발현이 변형되는 경우, 이러한 내인성 핵산 서열은 "재조합"으로 간주된다. 이 문맥에서, 이종(heterologous) 서열은 이종 서열 자체가 내인성인지 (동일한 숙주 세포 또는 이의 자손에서 유래한 것인지) 또는 외인성인지 (다른 숙주 세포 또는 이의 자손에서 유래한 것인지)에 관계없이, 내인성 핵산 서열에 자연적으로 인접하지 않는 서열이다. 예를 들어, 프로모터 서열은 숙주 세포의 게놈 내 유전자의 고유 프로모터로 대체될 수 있고 (예를 들어, 상동성 재조합에 의해), 그 결과 이 유전자는 변경된 발현 패턴을 가진다. 이 유전자는 자연적으로 연접하는 서열들 중 최소한 일부로부터 분리되기 때문에, 이제부터는 "재조합" 상태가 될 것이다. 구체예에서, 이종성(heterologous) 핵산 분자는 해당 유기체에 내생적인 것이 아니다. 추가 구체예들에서, 이종성(heterologous) 핵산 분자는 플라스미드이거나, 또는 상동성 또는 무작위 통합에 의해 숙주 염색체로 통합된 분자다.
핵산은 게놈 내 상응하는 핵산에서 자연적으로 발생하지 않는 임의의 변형을 함유하는 경우, "재조합"으로 또한 간주된다. 예를 들어, 내인성 코딩 서열은, 예를 들어, 인간의 개입에 의해 인공적으로 도입된 삽입, 결실 또는 점 돌연변이를 함유하는 경우, "재조합"으로 간주된다. "재조합 핵산"은 이종성 (heterologous) 부위에서 숙주 세포 염색체에 통합된 핵산 및 에피좀으로 존재하는 핵산 구조체가 또한 내포된다.
핵산 서열과 관련하여 용어 "서열 동일성 퍼센트(percent sequence identity)" 란 최대 상응을 위해 정렬될 때, 동일한 두 개의 서열 내 잔기들 배열의 정량적 값을 지칭한다. 서열 동일성 비교의 길이는 약 9개 이상의 뉴클레오티드, 일반적으로 약 20개 이상의 뉴클레오티드, 보다 일반적으로 약 24개 이상의 뉴클레오티드, 전형적으로 약 28개 이상의 뉴클레오티드, 보다 전형적으로 약 32개 이상의 뉴클레오티드, 그리고 바람직하게는 약 36개 이상의 뉴클레오티드의 스트레치에 걸친 것일 수 있다. 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 해당 분야에 공지된 다수의 상이한 알고리즘이 존재한다. 예로써, 폴리뉴클레오티드 서열은 Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wis의 프로그램인 FASTA, Gap 또는 Bestfit을 사용하여 비교될 수 있다. FASTA는 문제(query) 서열과 검색 서열간의 가장 잘 겹쳐지는 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다. Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990) (본 명세서에 그 전문이 참고문헌으로 포함됨). 예로써, 핵산 서열들 사이의 서열 동일성 퍼센트는 기본 파라미터 (점수화 행렬에 대한 NOPAM 인자 및 워드 크기 6)의 FASTA를 사용하거나 본 명세서에 참고로 포함된 GCG 버전 6.1에 제공된 바와 같은 기본 파라미터를 가지는 갭을 사용하여 결정될 수 있다. 대안적으로, 서열들은 컴퓨터 프로그램, BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Gish and States, Nature Genet. 3:266-272 (1993); Madden et al., Meth. Enzymol. 266:131-141 (1996); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); Zhang and Madden, Genome Res. 7:649-656 (1997)), 특히, blastp 또는 tblastn (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))를 사용하여 비교될 수 있다.
핵산 또는 이의 단편을 지칭할 때, 용어 "실질적 상동성(substantial homology)" 또는 "실질적 유사성(substantial similarity)"이란 상기 논의한 FASTA, BLAST 또는 Gap과 같은 임의의 공지된 서열 동일성 알고리즘으로 측정시, 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실과 함께 또 다른 핵산 (또는 이의 상보적 가닥)과 최적으로 정렬될 경우, 최소한 약 76%, 80%, 85%, 바람직하게는 최소한 약 90%, 그리고 더욱 바람직하게는 최소한 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 뉴클레오티드 염기에서 뉴클레오티드 서열 동일성이 존재함을 의미한다.
핵산 (폴리뉴클레오티드로도 지칭됨)은 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 및 상기의 합성 형태 및 혼합 중합체의 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두를 포함할 수 있다. 이들은 화학적으로 또는 생화학적으로 변형 될 수 있거나, 비-천연 또는 유도체화 된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있으며, 이를 해당 분야의 숙련된 기술자는 쉽게 이해할 것이다. 이러한 변형들에는, 예를 들면, 표지화, 메틸화, 하나 또는 그이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 가령, 비-하전된 링키지 (예컨대, 메틸 포스포네이트, 포스포트라이에스터, 포스포라미데이트, 카바메이트, 등), 하전된 링키지 (예컨대, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 등), 부속 모이어티 (예컨대, 폴리펩티드), 층간삽입물 (예컨대, 아크리딘, 소랄렌, 등), 킬레이터, 알킬레이터, 및 변형된 링키지 (예컨대, 알파 아노머 핵산, 등)가 내포된다. 또한, 수소 결합 및 다른 화학적 상호 작용을 통해 지정된 서열에 결합하는 능력에서 폴리뉴클레오티드를 모방하는 합성 분자가 내포된다. 이러한 분자들은 해당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 펩티드 링키지가 분자의 골격에서 포스페이트 링키지를 대체하는 분자들이 내포된다. 다른 변형은, 예를 들어, 리보스 고리가 가교 모이어티 또는 다른 구조, 가령, "잠금(locked)" 핵산에서 발견되는 변형을 함유하는 유사체가 내포될 수 있다.
핵산 서열에 적용될 때, 용어 "돌연변이된(mutated)"이란 핵산 서열의 뉴클레오티드가 참조 핵산 서열과 비교하여, 삽입, 결실 또는 변경될 수 있음을 의미한다. 유전자좌에서 단일 변경이 이루어질 수 있거나 (점 돌연변이), 또는 단일 유전자좌에서 다수의 뉴클레오티드가 삽입, 결실 또는 변경될 수 있다. 또한, 핵산 서열 내의 임의의 수의 유전자좌에서 하나 이상의 변형이 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 "에러-유발 PCR" (DNA 중합효소의 복제 충실도가 낮은 조건 하에서 PCR을 수행하기 위한 공정, 그 결과 PCR 생성물의 전체 길이를 따라 높은 비율의 점 돌연변이가 수득됨; 예를 들어, Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989) 및 Caldwell and Joyce, PCR Methods Applic. 2: 28-33 참조 (1992)); 그리고 "올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발" (관심있는 임의의 클로닝된 DNA 단편에서 부위-특이적 돌연변이의 생성을 가능하게 하는 과정; 예를 들어, Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241: 53-57 (1988) 참조)와 같은 돌연변이유발 기술을 포함한 (그러나 이에 국한되는 것은 아님) 해당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 돌연변이 될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터(vector)"는 그것이 연결되어 있는 또다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 지칭하고자 한다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드(plasmid)"로서, 이는 일반적으로 추가 DNA 분절이 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하지만, 또한 선형 이중 가닥 분자, 가령, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의한 증폭으로 생성된 것, 또는 제한 효소를 이용하여 원형 플라스미드를 처리함으로써 생성된 것들이 또한 내포된다. 다른 벡터에는 코스미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC) 및 효모 인공 염색체 (YAC)가 내포된다. 또다른 유형의 벡터는 바이러스성 벡터이며, 여기서 추가적인 DNA 분절은 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다 (하기에서 더 상세히 논의됨). 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포 (가령, 숙주 세포에서 기능하는 복제 원점을 가지는 벡터)에서 자율 복제 가능하다. 기타 벡터들은 숙주 세포로 도입될 때, 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있으며, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 바람직한 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터(recombinant expression vectors)" (또는 간단히 "발현 벡터(expression vectors)")라고 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "발현 시스템(expression system)"에는 숙주 세포에서 유전자의 발현을 위한 비히클 또는 벡터, 뿐만 아니라 숙주 염색체 내로 유전자의 안정적인 통합을 초래하는 비히클 또는 벡터가 내포된다.
"작동적으로 연계된(Operatively linked)" 또는 "작동가능하게 연계된(operably linked)" 발현 조절 서열은 발현 조절 서열이 관심 유전자와 인접해 있어 관심 유전자를 제어하는 링키지, 뿐만 아니라 트랜스(trans)로 작용하거나, 또는 일정 거리에서 작용하여 관심 유전자를 조절하는 발현 조절 서열을 지칭한다.
용어 "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 작동적으로 연결된 코딩 서열들의 발현에 영향을 주는데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 발현 조절 서열은 핵산 서열들의 전사, 전사-후 사건 및 해독을 조절하는 서열이다. 발현 조절 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이 싱 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 해독 효율을 향상시키는 서열 (가령, 리보솜 결합 부위); 폴리펩티드 안정성을 향상시키는 서열; 그리고 필요한 경우, 폴리펩티드 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 상이한데; 원핵 생물에서, 이러한 조절 서열에는 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열이 내포된다. "조절 서열(control sequences)"이라는 용어에는 최소한, 그 존재가 발현에 필수적인 모든 성분이 내포되며, 그 존재가 유리한 추가 성분, 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 또한 내포할 수 있는 것으로 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터(promoter)"는 RNA 중합효소가 유전자 전사를 개시하기 위해 결합하는 DNA 영역으로서, mRNA 전사 개시 부위의 5' 방향에 위치하는 것을 의미한다.
용어 "재조합 숙주 세포(recombinant host cell)" (또는 단순히 "숙주 세포")란 본원에서 사용된 바와 같이, 재조합 벡터가 도입된 세포를 지칭하는 것으로 한다. 이러한 용어는 특정 대상 세포, 뿐만 아니라 그러한 세포의 자손을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 특정 변형이 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 여전히 내포된다. 재조합 숙주 세포는 배양하여 성장된 분리된 세포 또는 세포주일 수 있거나 또는 살아있는 조직 또는 유기체에 존재하는 세포일 수 있다.
용어 "폴리펩티드(polypeptide)"에는 자연-발생 단백질과 비-자연 발생 단백질 모두, 그리고 이의 단편, 돌연변이체, 유도체 및 유사체들이 포괄된다. 폴리펩티드는 단량체 또는 중합체일 수 있다. 더욱이, 폴리펩티드는 다수의 상이한 도메인을 포함할 수 있는데, 도메인 각각은 하나 또는 그이상의 별개의 활성을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분자(molecule)"는 소분자, 펩티드, 폴리펩티드, 당, 뉴클레오티드, 핵산, 폴리뉴클레오티드, 지질 등이 내포되나, 이에 국한되지 않는 임의의 화합물을 의미하고, 이러한 화합물은 천연 화합물이거나 또는 합성 화합물일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "블록(block)" 또는 "반복 단위(repeat unit)"는 천연 실크 폴리펩티드 서열에서 반복적으로 발견되고, 기본 반복 실크 폴리펩타이드 서열의 단위로 삼게 되는, 적당한 변형(있을 수 있음)을 갖는 발견되는 천연 실크 폴리펩티드의 대략적으로 12개 이상의 아미노산보다 큰 부분서열을 의미한다. 블록에는 매우 짧은 "모티프(motifs)"가 내포될 수 있지만, 반드시 그런 것은 아니다. 본원에 사용된 바와 같이, "모티프(motifs)"는 다중 블록으로 나타나는 대략적으로 2-10개의 아미노산 서열을 의미한다. 예를 들면, 모티프는 아미노산 서열 GGA, GPG, 또는 AAAAA(서열 식별 번호:38)로 구성될 수 있다. 다수 블록의 서열은 "블록 공-중합체(block co-polymer)"이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "반복 도메인(repeat domain)"이란 실크 폴리펩티드에서 연속성 (공지의 실크 스페이서 요소를 제외하고, 실질적인 비-반복성 도메인에 의해 중단되지 않은) 반복성 세그먼트 세트로부터 선택된 서열을 지칭한다. 고유의 실크 서열은 일반적으로 하나의 반복 도메인을 함유한다. 일부 구체예들에서, 실크 분자 당 하나의 반복 도메인이 있다. 본원에 사용된 것과 같이, "매크로-반복(macro-repeat)"이란 하나 이상의 블록을 포함하는 자연 발생적 반복 아미노산 서열이다. 구체예에서, 매크로-반복은 반복 도메인에서 적어도 2회 반복된다. 추가 구체예에서, 두 번의 반복은 불완전하다. 본원에 사용된 바와 같이, "준(quasi)-반복"이란 블록이 유사하지만, 아미노산 서열이 동일하지 않도록 하나 이상의 블록을 포함하는 아미노산 서열이다.
본원에 사용된 바와 같이, "반복 서열(repeat sequence)" 또는 "R"은 반복성 아미노산 서열을 지칭한다. 구체예에서, 반복 서열에는 매크로-반복 또는 매크로-반복의 단편들이 내포된다. 또다른 구체예에서, 반복 서열에는 블록이 내포된다. 추가 구체예에서, 단일 블록은 두 반복 서열 사이에서 나뉜다.
"약(about)"이라는 용어는 지정 값 및 그 값의 위와 아래 범위를 포괄하는 것을 나타낸다. 특정 구체예들에서, 용어 "약(about)"은 지정 값 ± 10%, ± 5%, 또는 ± 1%을 나타낸다. 특정 구체예들에서, 적용가능할 경우, 용어 "약"이란 지정 값(들) ± 이 값(들)의 하나의 표준 편차를 나타낸다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는, 단수형 부정관사("a," "an") 및 상기(그것)("the")는 문맥에서 달리 명확히 언급이 없는 한, 복수형을 포함함을 유념하여야 한다.
본원에 언급된 범위는 언급된 종점을 포함하는 범위 내의 모든 값에 대한 축약 형으로 이해된다. 예를 들면, 1 ~ 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 및 50으로 구성된 군의 임의의 수의 조합 또는 이의 하위-범위가 내포되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 2-5%의 범위에는 2%와 5%, 그리고 그 사이에 있는 숫자 또는 분수가 내포되는데, 예를 들면 다음과 같다: 2.25%, 2.5%, 2.75%, 3%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4%, 4.25%, 4.5%, 및 4.75%.
재조합 단백질을 용해화시키고, 정제하는 방법
세포 배양물에서 발현된 재조합 거미 실크 단백질은 이들 세포 성분으로부터 정제된 정제되어야 한다. 일부 경우들에서, 상기 실크 단백질은 불용성 세포 찌꺼기 안에 포집되거나, 또는 불용성 실크 단백질 응집체를 형성한다. 불용성 실크 단백질은 정제하기 어렵고, 재조합 실크 단백질 회수가 줄어들게 된다. 또한, 일부 단리된 거미 실크 단백질 고체 또한 불용성일 수 있다. 예를 들면, MBI 18B 실크 파우더는 낮은 용해도를 가지며, 그리고 일부 모델 거미 실크, 이를 테면, U. 디베르수스(U. diversus) MiSp는 불용성이 매우 큰 것으로 알려져 있다. 이러한 경우, 상기 불용성 덩어리, 응집체, 또는 실크 고체에 다양한 방법을 적용시켜, 해당 실크 단백질을 방출시키고, 정제를 위해 이를 용해화시키고, 이로써 상기 재조합 실크 단백질의 회수가 증가될 수 있다. 추가적으로, 실크가 가용성 (즉, 실크 단백질 용해가 열역학적으로 유리한 경우)인 경우에서 조차도, 용해화 속도는 느릴 수 있다. 이러한 느린 속도는 용해화 반응에 필요한 높은 활성화 에너지 때문이거나, 또는 세포 파편 입자로부터 실크 덩어리의 수송이 속도-제한 단계이기 때문일 수 있다. 다음 두 경우, 즉, 실크 응집체가 불용성이거나, 또는 실크는 가용성이지만, 용해화가 느린 경우, 높은 물리적 에너지 공정, 이를 테면, 균질화(homogenization) 또는 미세유동화를 통한 높은 전단력은 실크 단백질의 용해화를 촉진시킬 수 있다. 높은 전단력은 해당 용액에 에너지를 추가하여 반응 속도를 증가시키고 이로써 높은 활성화 에너지를 극복하거나, 또는 세포 입자와 실크 단백질 응집체를 분해시킴으로써 덩어리 전달 효과를 감소시킨다. 따라서, 전단력의 형태로 물리적 에너지를 가하면 용해도가 증가되고, 따라서 재조합 거미줄 단백질의 회수를 증가시킬 수 있다.
높은 물리적 에너지 공정, 이를 테면, 전단력, 전단율, 충격 및 캐비테이션 공정의 적용을 통해 재조합 거미줄 단백질을 용해화시키고, 단리 및 정제하는 방법들이 본원에 기술되어 있다. 일부 구체예들에서, 높은 물리적 에너지 공정은 균질화 또는 미세유동화를 통하여 적용된다. 상기 높은 물리적 에너지 공정을 재조합 단백질에 적용시키면, 수성 용액에서 이 단백질의 용해화가 증가되고, 이로써 상기 재조합 단백질의 정제 및 회수가 증가된다.
일부 구체예들에서, 상기 불용성 덩어리는 세포 펠렛이다. 일부 구체예들에서, 상기 불용성 덩어리는 세포 용해물(lysate)이다. 일부 구체예들에서, 상기 불용성 덩어리는 단리된 거미 실크 고체, 덩어리 파우더, 또는 압출물(extrudate)이다. 실크 고체 또는 재조합 실크 고체는 단리된 재조합 거미 실크 조성물, 이를 테면, 섬유, 압출물, 파우더, 또는 펠렛이다. 압출물이란 압출된 재조합 거미 실크 조성물로써, 이것은 방적돌기(spinneret)를 통해 압출된 것이다.
물리적 에너지 및 전단력
물리적 에너지를 상기 불용성 재조합 거미 실크 단백질에 적용하여 해당 단백질의 용해도를 증가시킬 수 있다. 물리적 에너지는 압축 또는 수축, 압력, 유체 흐름, 충격, 캐비테이션, 전단력, 전단율, 전단 변형력(shear stress), 신축(stretching) 또는 이들의 조합과 같은 기계적 힘의 적용을 통해, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적절한 기계적 힘을 통해 불용성 재조합 거미 실크로 전달되는 운동 에너지 또는 기계에너지이다. 기계적 에너지의 이러한 적용은 용액에서 재조합 단백질의 용해도를 증가시킨다. 일반적으로, 재조합 단백질에 제어된 손상을 유도하는 운동에너지 또는 기계적 에너지를 적용하는 임의의 방법을 사용하여 재조합 단백질을 용해화할 수 있다. 불용성 재조합 단백질의 증가된 용해도는 예를 들어, 기계적 압박(strain) 또는 전단력에 의해 유도된 압력에 의한 것일 수 있으며, 이로써 재조합 단백질 또는 세포 용해물은 변형하거나, 수축하거나, 급속하게 신축되거나, 급속하게 압착되거나, 또는 높은 전단 속도의 펄스를 받게 된다.
일부 구체예들에서, 전단력에는 높은 에너지 유체 프로세서(processor)에 의해 생성되는 충격, 캐비테이션 및 난류(turbulent) 혼합과 같은 전단 속도 및 기타 물리적 에너지 공정이 내포되지만 이에 국한되지는 않는다.
일부 구체예들에서, 적용되는 물리적 에너지는 전단율, 전단력, 캐비테이션, 충격, 압력, 초음파처리, 에멀젼, 또는 당업계 공지된 임의의 기타 적합한 적용 방법이다. 일부 측면들에서, 상기 물리적 에너지는 균질화, 미세유동화 미세-에멀젼, 또는 French 프레스를 통하여 적용된다. 일부 구체예들에서, 상기 물리적 에너지는 전단력이다. 일부 구체예들에서, 상기 전단력으로 전단율이 생성된다. 일부 구체예들에서, 상기 물리적 에너지는 압력이다. 일부 구체예들에서, 상기 물리적 에너지는 균질화 또는 미세유동화를 통하여 적용된다. 일부 구체예들에서, 상기 초음파처리는 울트라-초음파처리이다.
물리적 에너지를 적용시킬 수 있는 많은 상이한 기구들이 이용가능한데, 여기에는 높은 에너지 유동 프로세서, 미세유동화기, French 프레스, 고-압력 균질화기, 비드 밀(bead mills), 회전 블렌더(rotary blenders) 및 회전/고정자(rotor/stator) 장치들이 이용가능하다. 본원에서 기술된 일부 구체예들에서, 재조합 단백질들은 미세유동화기를 이용하여 용해화될 수 있다. 미세유동화기는 시판되는 공급처에서 구입할 수 있는데, 이를 테면, Microfluidics Corp (Westwood, MA)에서 제작된 M110EH, M815, M700, LV1, LM10, LM20, M110Y 또는 M110P 미세유동화기들이 있다.
미세유동화기는 호환가능한 고정된-기하학적 상호작용 챔버 (이를 테면, G10Z, H10Z, H30Z, H210Z, L30Z, F20Y, 또는 F12Y 상호작용 챔버)로 구성되며, 이때 흐름은 펌프에 의해 구동된다. 기하학적 Y 상호 작용 챔버에서, 유입되는 흐름은 두 개 또는 그 이상의 흐름으로 분할되고, 가파른 속도 및 압력 구배, 전단, 캐비테이션 및 가열이 일어나도록 고속에서 재결합된다. 상호 작용 챔버 내부의 유체는 높은 유속과 균일한 전단력 적용을 겪고, 이로 인하여 해당 유체에 전단율이 생성되게 된다. 균질화의 강도는 상호작용 챔버의 형상을 변경시키거나, 온도를 변경시키거나, 압력을 변경시키거나, 해당 기기를 통해 동일한 재료를 여러 번 처리하여 변경시킬 수 있다. 유입되는 물질의 농도, 완충액 조성, 해당 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 물리화학적 속성과의 복잡한 상호 작용이 또한 존재한다. 압력, 모세관 직경, 온도, 균질화 통과 횟수 및 완충액 조건을 비롯한, 몇 가지 매개변수들이 재조합 단백질의 용해화에 영향을 미칠 수 있다. 추가적으로, 상호작용 챔버는 단일 채널 (단일 슬롯 상호작용 챔버) 또는 두 개 이상의 채널 (다중-슬롯 상호작용 챔버)을 보유할 수 있다. 다중-슬롯 상호작용 챔버를 사용하여, 이들 상호작용 챔버를 통한 체적 유량을 증가시킴으로써, 더 많은 양의 샘플 가공이 가능할 수 있다. 미세유동화기 챔버 내부의 유체 유속은 50 μm만큼 작은 채널을 통해, 최대 500 m/s에 도달할 수 있다. 유체가 상호작용 챔버를 통하여 이동되기 때문에, 압력의 변화로 전단율의 변화가 초래된다.
당분야에 공지된 임의의 적합한 균질화기 또는 미세유동화기가 이용될 수 있다. 미세유동화기 및 높은 압력 균질화기들은 Microfluidics (Westwood MA), Thomas Scientific (Swedesboro, NJ), CAT Scientific (Paso Robles, CA), 및 Thermo Fisher Scientific를 비롯한 다양한 판매자로부터 상업적으로 이용가능하다. 일부 구체예들에서, 상기 미세유동화기는 Z 유형 상호작용 챔버를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 미세유동화기는 Y 유형 상호작용 챔버를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 미세유동화기는 M-110P 또는 LM10 미세유동화기이다.
미세유동화기 상호작용 챔버와 샘플 프로세싱 압력의 특이적 조합에 의해 생성된 전단율은 해당 챔버 제작자가 제공되는 정보를 통하여 결정될 수 있다. 다양한 단일 슬롯 미세유동화기 브랜드 상호작용 챔버 유형에서 압력에 대한 함수로써 산출된 전단율의 예시들이 도 1A에 나타나 있다. 다양한 단일 슬롯 미세유동화기 브랜드 상호작용 챔버 유형들에서 압력에 대한 함수로써 유속이 도 1B에 나타나 있다. 도 1A 및 1B는 Microfluidics ™에 의해 생성된 2014 Microfluidics Processor User Guide로부터 채택된다. 도 1A에서 나타낸 바와 같이, 상이한 두 챔버에서 동일한 양의 유체 압력 (가령, F12Y 챔버와 L30Z 챔버에서 30,000 psi)으로 이들 챔버에 의해 생성된 전단율의 크기 차이를 초래하는데, 이때 각각 차례로 10x106s-1 대비 2x106s-1이다. 따라서, 상이한 상호작용 챔버들을 통한 유체 흐름 압력의 변화로 상이한 양의 전단력 및 전단율이 초래된다. 그리고, 선택된 상호작용 챔버에서 유체 압력을 변경시킴으로써 전단율이 변화되고, 최적화될 수 있다.
유체 또는 용액에 전단력을 적용시켜 유체 전단율이 생성된다. 일부 구체예들에서, 상기 전단력은 미세유동화기를 통하여 적용된다. 일부 구체예들에서, 상기 미세유동화기에 의해 전단율이 생성된다. 일부 구체예들에서, 상기 전단율은 1x103 s-1 ~ 1x109 s-1이다. 상기 전단율은 약 1x103 s-1, 1.5x103 s-1, 2x103 s-1, 2.5x103 s-1, 3x103 s-1, 3.5x103 s-1, 4x103 s-1, 4.5x103 s-1, 5x103 s-1, 5.5x103 s-1, 6x103 s-1, 6.5x103 s-1, 7x103 s-1, 7.5x103 s-1, 8x103 s-1, 8.5x103 s-1, 9x103 s-1, 9.5x103 s-1, 1x104 s-1, 1.5x104 s-1, 2x104 s-1, 2.5x104 s-1, 3x104 s-1, 3.5x104 s-1, 4x104 s-1, 4.5x104 s-1, 5x104 s-1, 5.5x104 s-1, 6x104 s-1, 6.5x104 s-1, 7x104 s-1, 7.5x104 s-1, 8x104 s-1, 8.5x104 s-1, 9x104 s-1, 9.5x104 s-1, 1x105 s-1, 1.5x105 s-1, 2x105 s-1, 2.5x105 s-1, 3x105 s-1, 3.5x105 s-1, 4x105 s-1, 4.5x105 s-1, 5x105 s-1, 5.5x105 s-1, 6x105 s-1, 6.5x105 s-1, 7x105 s-1, 7.5x105 s-1, 8x105 s-1, 8.5x105 s-1, 9x105 s-1, 9.5x105 s-1, 1x106 s-1, 1.5x106 s-1, 2x106 s-1, 2.5x106 s-1, 3x106 s-1, 3.5x106 s-1, 4x106 s-1, 4.5x106 s-1, 5x106 s-1, 5.5x106 s-1, 6x106 s-1, 6.5x106 s-1, 7x106 s-1, 7.5x106 s-1, 8x106 s-1, 8.5x106 s-1, 9x106 s-1, 9.5x106 s-1, 1x107 s-1, 1.5x107 s-1, 2x107 s-1, 2.5x107 s-1, 3x107 s-1, 3.5x107 s-1, 4x107 s-1, 4.5x107 s-1, 5x107 s-1, 5.5x107 s-1, 6x107 s-1, 6.5x107 s-1, 7x107 s-1, 7.5x107 s-1, 8x107 s-1, 8.5x107 s-1, 9x107 s-1, 9.5x107 s-1, 1x108 s-1, 1.5x108 s-1, 2x108 s-1, 2.5x108 s-1, 3x108 s-1, 3.5x108 s-1, 4x108 s-1, 4.5x108 s-1, 5x108 s-1, 5.5x108 s-1, 6x108 s-1, 6.5x108 s-1, 7x108 s-1, 7.5x108 s-1, 8x108 s-1, 8.5x108 s-1, 9x108 s-1, 9.5x108 s-1, 1x109 s-1일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 전단율은 약 6.5x106 s-1이다. 일부 구체예들에서, 상기 전단율은 약 9.5x106 s-1이다.
상기 압력은 약 500 ~ 50,000 psi일 수 있다. 상기 압력은 적어도 약 500 psi, 750 psi, 1,000 psi, 2,000 psi, 3,000 psi, 4,000 psi, 5,000 psi, 10,000 psi, 15,000 psi, 20,000 psi, 25,000 psi, 20,000 psi, 25,000 psi, 40,000 psi, 45,000 psi, 또는 50,000 psi일 수 있다. 상기 압력은 약 500 ~ 50,000 psi, 500 ~ 1,000 psi, 1,000 ~ 5,000 psi, 5,000 ~ 10,000 psi, 7,500 ~ 12,000 psi, 10,000 ~ 15,000 psi, 15,000 ~ 20,000 psi, 15,000 ~ 22,000, psi, 18,000 ~ 25,000 psi, 18,000 ~ 22,000 psi, 20,000 ~ 25,000 psi, 25,000 ~ 30,000 psi, 27,500 ~ 30,000 psi, 27,500 ~ 32,000 psi, 30,000 ~ 32,000 psi, 30,000 ~ 35,000 psi, 35,000 ~ 40,000 psi, 40,000 ~ 45,000 psi, 또는 45,000 ~ 50,000 psi일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 압력은 약 10,000 psi, 20,000 psi, 23,000 psi, 또는 30,000 psi이다. 일부 구체예들에서, 상기 압력은 약 23,000 psi이다. 일부 구체예들에서, 상기 압력은 약 30,000 psi이다. 한 구체예에서, 상기 압력은 10,000 ~ 30,000 psi이다.
상기 거미 실크 단백질은 물리적 에너지를 통하여 적어도 한 차례 가공될 수 있으며, 즉, 상기 미세유동화기 또는 균질화기로부터 압력, 전단력 및/또는 전단율이 한 차례 해당 거미 실크 단백질에 적용된다. 일부 구체예들에서, 압력, 전단력 및/또는 전단율은 한 차례 적용된다. 상기 거미 실크 단백질은 물리적 에너지를 통하여 한 차례 이상 또한 가공될 수 있으며, 즉, 압력, 전단력 및/또는 전단율은 해당 거미 실크 단백질에 두 차례, 세 차례, 네 차례 또는 그 이상 적용된다. 일부 구체예들에서, 상기 압력, 전단력 및/또는 전단율은 세 차례 적용된다. 일부 구체예들에서, 상기 압력, 전단력 및/또는 전단율은 두 차례 적용된다.
물리적 에너지, 즉, 적용되는 압력, 전단력 및/또는 전단율은 각 반복된 통과(pass) 또는 운영(run) 시에 동일할 수 있다. 예를 들면, 샘플은 제 1 통과, 제 2 통과 및 제 3 통과 시, 30,000 psi에서 가공될 수 있다. 다른 구체예들에서, 상기 압력은 각 통과 또는 운영 상에서 상이할 수 있다. 예를 들면, 샘플은 제 1 통과 시에 30,000 psi, 제 2 통과 시에 23,000 psi, 그리고 제 3 통과 시에 10,000 psi에서 가공될 수 있다. 또다른 실시예에서, 샘플은 제 1 통과 시에 전단율 6.5x106 s-1, 제 2 통과 시에 전단율 9.5x106 s-1 , 그리고 제 3 통과 시에 전단율 5.5x106 s-1로 가공될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 압력은 제곱인치당 절대 압력(psia)이다. 일부 구체예들에서, 상기 압력은 제곱인치당 게이지 압력 (psig)이다.
일부 측면들에서, 물리적 에너지는 초음파처리를 통하여 적용되는 소리 에너지다. 이러한 경우에, 용액에 음파를 가하면 용액에서 캐비테이션이 발생하여, 해당 용액에서 기포의 핵형성(nucleation), 성장 및 붕괴가 발생하고, 이 용액 내 재조합 단백질의 기계적 변형 및 물리적 변형을 야기되고, 따라서 용해도가 증가된다.
용매 및 완충액 조건
상기 재조합 단백질 및 불용성 세포 부분, 펠렛, 또는 용해물의 용액의 완충 조건은 재조합 단백질의 균질화 또는 미세유동화 및 용해화를 최적화시키기 위해 또한 변경될 수 있다. 재조합 실크 폴리펩티드는 이들의 β-쉬트 구조를 응집하고 형성하는 능력으로 인하여, 생산 및 정제 과정 동안 바람직하지 못한 불용성 응집체(aggregates)를 형성한다. 높은 몰 농도의 카오트로프 용액과 같은 이러한 생물학적 분자의 용해화를 위해서는 강력한(harsh) 화학적 조건이 필요하다. 더욱이, 정제 동안 펩티드를 재-용해화하는 데 필요한 조건은 대개 단백질을 분해하는데, 이로 인하여 낮은 수율과, 점착력이 낮고, 촉감이 나쁜 섬유가 만들어지게 된다. 그러나, 미세유동화 또는 균질화와 같은 높은 물리적 에너지의 적용과 낮은 카오트로프 농도의 조합으로 재조합 단백질의 용해도를 증가시키고, 분해를 감소시킬 수 있다.
일부 구체예들에서, 용매를 상기 불용성 세포 부분, 펠렛, 또는 용해물에 추가하여, 상기 재조합 거미 실크 단백질을 용해시킬 수 있다. 당분야에 공지된 임의의 적합한 용매에는 카오트로프 및 유기 용매가 이용될 수 있지만, 이에 국한되지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 용매는 카오트로프이다. 구아니딘 클로라이드 (GdnHCl), 구아니딘 티오시아네이트 (GdnSCN), 구아니딘 이소티오시아네이트, n-부탄올, 에탄올, 과염소산리튬, 아세트산리튬, 염화마그네슘, 페놀, 2-프로판올, 나트륨 도데실 설페이트, 티오요소 및 우레아를 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는 당분야에 공지된 임의의 적합한 카오트로프가 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 용매는 구아니딘 클로라이드 (GdnHCl)이다. 일부 구체예들에서, 상기 용매는 구아니딘 티오시아네이트 (GdnSCN)이다. 일부 구체예들에서, 상기 용매는 우레아이다.
일부 구체예들에서, 상기 용매는 물 완충액에서 제형화된다. 일부 구체예들에서, 상기 용매는 50 mM Tris, pH 7.5 완충액에서 제형화된다. 인산 완충 염수(PBS) 또는 Good의 완충액, 이를 테면, Tris, Tricine, MES, PIPES, ACES, MOPS, MOPSO, TES, HEPES, TAPS, Bicine, TES, 비스-트리스 프로판, 비스-트리스 메탄, ADA, HEPBS, CHES, AMP, CAPS, CAPSO, 글리신아미드, 글리실글리신 또는 임의의 기타 적절한 완충액을 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는 당분야에 공지된 임의의 적합한 완충 용액이 이용될 수 있다.
상기 용매 (가령, 아카오트로프((achaotrope))가 불용성 세포 부분, 펠렛, 또는 용해물에 직접 추가될 수 있거나, 또는 수성 완충액의 성분으로써 추가될 수 있다. 상기 수성 완충액에서 상기 용매의 농도는 변경될 수 있으며, 당업자에 의해 결정된다. 일부 구체예들에서, 상기 수성 완충액에서 상기 용매의 농도는 0.01-10 M, 0.01-0.1 M, 0.1-0.5 M, 0.5-1 M, 1-2 M, 2-3 M, 3-4 M, 4-5 M, 5-6 M, 6-7 M, 7-8 M, 8-9 M, 9-10 M, 또는 10 M 이상일 수 있고. 일부 구체예들에서, 상기 수성 완충액에서 상기 용매의 농도는 적어도 약 0.1 M, 0.15 M, 0.2 M, 0.25 M, 0.3 M, 0.35 M, 0.4 M, 0.45 M, 0.5 M, 0.55 M, 0.6 M, 0.65 M, 0.7 M, 0.75 M, 0.8 M, 0.85 M, 0.9 M, 0.95 M, 1 M, 1.5 M, 2 M, 2.5 M, 3 M, 3.5 M, 4 M, 4.5 M, 5 M, 5.5 M, 6 M, 6.5 M, 7 M, 7.5 M, 8 M, 8.5 M, 9 M, 9.5 M, 또는 10 M, 또는 이보다 더 클 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 용매는 질량(mass) 대비 부피의 특정 비율에서 상기 불용성 세포 부분, 펠렛, 또는 용해물에 추가된다. 이러한 구체예에서, 전체 불용성 부분, 펠렛, 또는 용해물 질량이 결정되고, 용매 또는 카오트로프의 특정 농도를 갖는 특이적 부피의 용액이 추가된다. 예를 들면, 세포 펠렛 중량이 측정되고, 카오트로픽 작용제를 포함하는 용액에 현탁되어, 상기 세포 덩어리의 최종 부피는 샘플의 총 부피의 15%가 된다 (가령, 상기 세포 펠렛은 0.75 mg이며, 0.01-10M 카오트로프 용액을 함유하는 4.25 mls의 완충액 용액에 재현탁된다). 또다른 실시예에서, 세포 펠렛 중량이 측정되고, 용매를 포함하는 동일한 부피의 용액에 재현탁되어, 용매 부피에 대한 세포 질량 비율은 50%가 된다.
일부 구체예들에서, 용매 부피에 대한 세포 질량 비율은 1-100%, 1-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 또는 95-100% 세포 질량이다. 일부 구체예들에서, 용매 부피에 대한 세포 질량 비율은 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 세포 질량일 수 있다.
일부 구체예들에서, 용매 부피에 대한 세포 질량 비율은 1-100%, 1-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 또는 95-100% 용매 부피일 수 있다. 일부 구체예들에서, 용매 부피에 대한 세포 질량 비율은 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 용매 부피일 수 있다.
일부 구체예들에서, 수성 완충액 및 불용성 세포 부분, 펠렛, 또는 용해물을 포함하는 용액에서 상기 용매의 최종 농도는 0.01-10 M, 0.01-0.1 M, 0.1-0.5 M, 0.5-1 M, 1-2 M, 2-3 M, 3-4 M, 4-5 M, 5-6 M, 6-7 M, 7-8 M, 8-9 M, 또는 9-10 M일 수 있다. 일부 구체예들에서, 수성 완충액 및 세포 용해물 또는 펠렛을 포함하는 용액에서 상기 용매의 최종 농도는 적어도 약 0.1 M, 0.15 M, 0.2 M, 0.25 M, 0.3 M, 0.35 M, 0.4 M, 0.45 M, 0.5 M, 0.55 M, 0.6 M, 0.65 M, 0.7 M, 0.75 M, 0.8 M, 0.85 M, 0.9 M, 0.95 M, 1 M, 1.5 M, 2 M, 2.5 M, 3 M, 3.5 M, 4 M, 4.5 M, 5 M, 5.5 M, 6 M, 6.5 M, 7 M, 7.5 M, 8 M, 8.5 M, 9 M, 9.5 M, 또는 10 M일 수 있다.
전단 보호제, 점도 조절제 및/또는 소포 구조적 속성들에 영향을 미치는 용질과 같은 추가 완충제 변형도 사용할 수 있다. 균질화 또는 미세유동화의 효율을 개선하기 위해, 부형제, 이를 테면, 막 연화제 및 분자 크라우딩제(molecular crowding agent)가 또한 첨가될 수 있다. 완충액에 대한 기타 변형에는 특정 pH 범위 및/또는 다중 농도의 염, 유기 용매, 소분자, 세제, 양쪽성 이온, 아미노산, 중합체 및/또는 상기 것들중 임의의 조합의 다중 농도가 내포될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 불용성 세포 부분, 펠렛, 또는 용해물은 상기 용매를 포함하는 수성 용액과 함께 항온처리된다. 상기 세포 펠렛 또는 용해물과 상기 용액이 항온처리되는 시간의 양은 변경될 수 있다. 상기 항온처리 시간은 1 분에서 3 시간 (180 분) 이상, 1 분 ~ 60 분, 3 분 ~ 90 분, 60 분 ~ 120 분, 90 분 ~ 150 분, 또는 120 분 ~ 180 분일 수 있다. 상기 항온처리 시간은 적어도 1 분, 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 30 분, 45 분, 60 분, 75 분, 90 분, 105 분, 120 분, 135 분, 150 분, 165 분, 180 분, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 항온처리 시간은 60 분이다. 일부 구체예들에서, 상기 항온처리 시간은 75 분이다. 일부 구체예들에서, 상기 항온처리 시간은 90 분이다. 일부 구체예들에서, 상기 항온처리 시간은 105 분이다. 일부 구체예들에서, 상기 항온처리 시간은 120 분이다.
상기 불용성 세포 부분, 펠렛, 또는 용해물은 상기 수성 용액과 5-70℃에서 항온처리될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 불용성 세포 부분, 펠렛, 또는 용해물은 상기 수성 용액과 5-10℃, 10-20℃, 10-15℃, 15-20℃, 20-30℃, 20-22℃, 20-25℃, 22-27℃, 25-27℃, 25-20℃, 27-30℃, 30-40℃, 40-50℃, 40-45℃, 45-50℃, 50-60℃, 50-55℃, 55-60℃, 60-70℃, 60-65℃, 또는 65-70℃에서 항온처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 불용성 세포 부분, 펠렛, 또는 용해물은 상기 수성 용액과 20-30℃에서 항온처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 불용성 세포 부분, 펠렛, 또는 용해물은 상기 수성 용액과 25℃에서 항온처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 불용성 세포 부분, 펠렛, 또는 용해물은 상기 수성 용액과 실온에서 항온처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 불용성 세포 부분, 펠렛, 또는 용해물은 상기 수성 용액과 30℃를 넘지 않은 온도에서 항온처리된다.
일부 구체예들에서, 상기 재조합 거미 실크 단백질은 숙주 세포의 세포질에서 발현된다. 이 단백질을 단리하기 위해 상기 숙주 세포를 용해시켜 상기 재조합 거미 실크 단백질을 방출시켜야 한다. 상기 숙주 세포를 용해시키기 위한 임의의 적절한 방법이 이용될 수 있는데, 이 방법에는 열 처리, 화학적 처리, 전단 파괴, 물리적 균질화, 초음파처리, 또는 화학적 균질화가 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 화학적 처리에는 원핵 및 진핵 세포의 원형질막을 파괴하는 것으로 알려진 화학 물질 또는 효소, 이를 테면, Triton X-100, Nonidet P-40, CHAPS, 나트륨 도데실 설페이트 (SDS) 또는 기타 적절한 세제와 함께 세포를 항온처리하는 것이 내포된다.
해당 세포를 용해한 후, 상기 재조합 거미 실크 단백질을 포함하는 불용성 부분은 상기 세포 용해물을 원심분리시키고, 이 세포 용해물에서 상기 재조합 거미 실크 단백질을 비롯한 불용성 물질의 세포 펠렛이 형성됨으로써, 수집될 수 있다. 불용성 재조합 단백질을 펠릿화하는 원심분리 속도는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 원심분리기 속도는 100-10,000 x g이다. 일부 구체예들에서, 상기 원심분리 속도는 100 x g, 200 x g, 300 x g, 400 x g, 500 x g, 600 x g, 700 x g, 800 x g, 900 x g, 1000 x g, 2000 x g, 3000 x g, 4000 x g, 5000 x g, 6000 x g, 7000 x g, 8000 x g, 9000 x g, 또는 10,000 x g이다.
일부 경우들에서, 불용성 세포 부분 또는 펠렛은 우레아 용액과 같은 카오트로프로 재현탁되거나 또는 세척된 다음, 다시 원심분리되어 두 번째 세포 펠렛이 생성될 수 있다. 그 다음, 제 2 세포 펠렛은 수성 용매 용액과 항온처리되고, 물리적 힘의 적용을 받아 상기 재조합 거미 실크 단백질은 용해화된다. 세척 용액에서 카오트로프 몰농도(molarity)는 0.1-10 M일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 카오트로프는 우레아이다. 일부 구체예들에서, 상기 카오트로프는 4M 우레아이다.
일부 구체예들에서, 상기 세포 용해물 또는 세포 펠렛으로부터 거미 실크가 아닌 단백질의 생물학적 또는 화학적 불순물이 제거될 수 있다. 상기 세포 용해물 또는 세포 펠렛으로부터 불순물을 제거하는 것은 여과, 흡수 (가령, 목탄 또는 고체 상태 흡수), 투석 및 코아세르베이션(coacervation) 또는 다양한 화학 물질의 사용에 의해 유도된 상 분리에 의해 수행될 수 있다. 다른 구체예들에서, 상(phase) 분리는 코스모트로프(cosmotrope) 및/또는 용액으로부터 단백질을 침전시키는 데 사용되는 화합물을 첨가함으로써, 화학적으로 유도될 수 있다.
일부 구체예들에서, 불순물은 여과, 정밀여과, 정용여과 및/또는 한외여과 (가령, 탈이온수에 대항하여)를 사용하여 제거된다. 정밀여과(microfiltration)에 적합한 막에는 0.1 uM 내지 1 uM가 내포될 수 있다. 한외여과에 적합한 막의 비-제한적 예로는 50 kDa ~ 800 kDa, 100 kDa ~ 800 kDa, 200 kDa ~ 800 kDa, 300 kDa ~ 800 kDa, 400 kDa ~ 800 kDa, 500 kDa ~ 800 kDa, 600 kDa ~ 800 kDa, 700 kDa ~ 800 kDa, 100 kDa ~ 700 kDa, 200 kDa ~ 700 kDa, 300 kDa ~ 700 kDa, 400 kDa ~ 700 kDa, 500 kDa ~ 700 kDa, 600 kDa ~ 700 kDa, 또는 500 kDa ~ 600 kDa의 분자량 컷-오프를 갖는 소수성 막(가령, PES, PS, 셀룰로오스 아세테이트)이 내포된다. 일부 구체예들에서, 한외여과에 의해 농축물(retentate)로서 물 안에 재조합 단백질 슬러리, 그리고 불순물을 포함하는 투과물(permeate)이 생성된다. 한외여과에 적합한 조건 (가령, 막, 온도, 부피 대체)은 투과물 밀도를 최대화하도록 맞춰진 당업계에 공지된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 일부 구체예들에서, 한외여과로 1g/mL ~ 30g/mL 사이의 밀도를 갖는 농축물이 제공된다. 일부 구체예들에서, 한외여과는 농축된 잔류물을 생성하는 농축 단계, 이어서 불순물을 제거하고 물에 현탁된 단백질 슬러리를 생성하는 정용여과 단계를 포함한다. 일부 이러한 구체예들에서, 상기 농축된 농축물은 출발 부피에 대해 2-배 ~ 12-배 부피 양으로 감소되는 농축 비율을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 정용여과에서 3-배 ~ 10-배 사이의 일정한 부피 대체가 제공된다.
실시예에 따라, 그리고 제거하고자 하는 불순물의 종류에 따라, 불순물 제거 방법이 달라질 수 있다. 단리된 재조합 단백질로부터 지질 불순물 제거는 당업계에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방법의 비-제한적인 예로는 목탄 또는 지질에 특이적으로 결합하는 다른 흡수 매질에 대한 흡수가 내포된다. 단리된 재조합 단백질로부터 다당류 불순물 제거는 당업계에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방법의 비-제한적인 예로는 다당류를 가수분해하는 효소로 처리한 후, 한외여과에 의해 생성된 작은 당의 제거가 내포된다. 이러한 효소의 비-제한적인 예로는 글루카나아제, 리티나아제, 만나아제 및 키티나아제가 내포된다.
정량화
단리된 단백질의 회수(수율) 및 순도를 평가하기 위해 상기 단리된 재조합 거미 실크 단백질이 측정되거나, 또는 정량화될 수 있다. 단리된 전장의 재조합 단백질 - 재조합 단백질의 단편들의 양을 측정 또는 정량화시키는데 이용될 수 있는 임의의 적합한 방법에는 다음이 내포되나, 이에 국한되지 않는다: 크기배제 크로마토그래피 (SEC), 효소-연계된 면역흡착 분석(ELISA), SDS-PAGE, 웨스턴 블랏(면역블랏), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), SEC-HPLC, 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS), 또는 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC), 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 적절한 방법, 또는 이들의 임의의 조합. 한 구체예에서, 전장의 재조합 거미 실크 단백질 및 재조합 단백질 단편들의 양은 웨스턴 블랏을 이용하여 측정된다. 또다른 구체예에서, 전장의 재조합 거미 실크 단백질 및 재조합 단백질 단편들의 양은 효소-연계된 면역흡착 분석(ELISA)을 이용하여 측정된다. 또다른 구체예에서, 전장의 재조합 거미 실크 단백질 및 재조합 단백질 단편들의 양은 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 이용하여 측정된다.
일부 구체예들에서, 임의의 적합한 방법에 의해 측정될 때, 상기 단리된 재조합 거미 실크 단백질은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 적어도 100% 전장의 재조합 거미 실크 단백질이다.
일부 구체예들에서, 상기 단리된 재조합 거미 실크 단백질의 순도는 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 또는 95-100%이다. 일부 구체예들에서, 상기 단리된 재조합 거미 실크 단백질의 순도는 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 적어도 100%이다.
일부 구체예들에서, 상기 단리된 재조합 거미 실크 단백질의 순도는 출발 불용성 물질과 비교하였을 때 증가한다. 예를 들면, 출발 불용성 물질이 불용성 또는 가용성이 빈약한 단리된 재조합 거미 실크 단백질 또는 실크 파우더의 경우에는, 상기 단리된 재조합 거미 실크 단백질의 순도는 본원에 설명된 용해화 방법 및 분리 방법을 통해 증가될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 단리된 재조합 거미 실크 단백질의 순도는 상기 출발 물질의 순도와 비교하였을 때, 1-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 또는 95-100% 증가된다. 일부 구체예들에서, 상기 단리된 재조합 거미 실크 단백질의 순도는 상기 출발 물질의 순도와 비교하였을 때, 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100% 증가된다. 일부 구체예들에서, 상기 불용성 물질의 순도는 0-99%, 1-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 또는 95-99.9%이다. 일부 구체예들에서, 상기 불용성 물질의 순도는 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 적어도 99.9%이다.
일부 구체예들에서, 상기 단리된 재조합 거미 실크 단백질은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 전장의 재조합 거미 실크 단백질을 포함한다.
재조합 거미 실크 조성물
US 특허 9,963,554, "Methods and Compositions for Synthesizing Improved Silk Fibers" (본원의 참고자료에 편입됨)에서는 합성 블록 공중합체, 이들의 생산을 위한 재조합 미생물, 그리고 이들 단백질을 포함하는 합성 섬유용 조성물이 개시되어 있다. US 특허 공개 2019/0100740 (2019년 4월 4일자로 공개됨), "Modified Strains for the Production of Recombinant Silk" (본원의 참고자료에 편입됨)에서는 효모 세포에 의해 발현되는 재조합 단백질의 분해를 감소시키기 위해, 선택되거나 또는 유전적으로 조작된 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포, 및 유용한 화합물의 생산을 위한 효모 세포를 배양하는 방법을 개시한다. 단백질을 포함하는 합성 블록 공중합체 및 합성 섬유는 당업자에 의해 대장균(Escherichia coli)에서 또한 생산될 수 있다.
고유의 거미 실크의 몇 가지 유형들이 확인되었다. 각각의 천연 방적 실크 유형의 기계적 속성들은 당해 실크의 분자 조성에 밀접하게 연결되어 있는 것으로 여겨진다. 가령, Garb, J.E., et al., Untangling spider silk evolution with spidroin terminal domains, BMC Evol. Biol., 10:243 (2010); Bittencourt, D., et al., Protein families, natural history and biotechnological aspects of spider silk, Genet. Mol. Res., 11:3 (2012); Rising, A., et al., Spider silk proteins: recent advances in recombinant production, 구조-function relationships and biomedical applications, Cell. Mol. Life Sci., 68:2, pg. 169-184 (2011); 그리고 Humenik, M., et al., Spider silk: understanding the structure-function relationship of a natural fiber, Prog. Mol. Biol. Transl. Sci., 103, pg. 131-85 (2011) 참고. 예를 들면:
아시니폼(aciniform) (AcSp) 실크는 적당히 높은 강도와 적당히 높은 탄력성이 결합된 결과, 높은 인성을 가지는 경향이 있다. AcSp 실크는 종종 폴리 세린 및 GPX의 모티프를 포함하는 큰 블록 ("앙상블 반복") 크기를 특징으로 한다. 튜불리폼(Tubuliform) (TuSp 또는 원통형) 실크는 보통의 강도 및 높은 탄력성으로 인해 큰 직경을 가지는 경향이 있다. TuSp 실크는 폴리 세린 및 폴리 트레오닌 함량 및 짧은 폴리 알라닌 트랙(tracks)을 특징으로 한다. 메이저 엠풀레이트(Major Ampullate) (MaSp) 실크는 높은 강도 및 보통의 탄력성을 가지는 경향이 있다. MaSp 실크는 다음 두 가지 아형들(subtypes) 중 하나 일 수 있다: MaSp1 및 MaSp2. MaSp1 실크는 일반적으로 MaSp2 실크보다 탄력성이 작고, 폴리 알라닌, GX, 및 GGX 모티프로 특징된다. MaSp2 실크는 폴리 알라닌, GGX, 및 GPX 모티프를 특징으로 한다. 마이너 엠풀레이트(Minor Ampullate) (MiSp) 실크는 보통의 강도 및 보통의 탄력성을 가지는 경향이 있다. MiSp 실크는 GGX, GA, 및 폴리 A 모티프로 특징되며, 종종 대략 100개 아미노산의 스페이서(spacer) 요소들을 함유한다. 플라겔리폼(Flagelliform) (Flag) 실크는 매우 높은 탄력성과 보통의 강도를 가지는 경향이 있다. 플래그(Flag) 실크는 보통 GPG, GGX, 및 짧은 스페이서 모티프를 특징으로 한다.
각 실크 유형의 속성들은 종마다 다를 수 있으며, 독특한 라이프스타일 (예컨대, 앉아있는 거미줄 스피너 대 베가본드 사냥꾼)을 이끄는 거미 또는 진화적으로 오래된 거미는 위의 설명과 다른 특성을 가진 실크를 생산할 수 있다 (거미 다양성 및 분류의 설명에 관하여, Hormiga, G., and Griswold, C.E., Systematics, phylogeny, and evolution of orb-weaving spiders, Annu. Rev. Entomol. 59, pg. 487-512 (2014); 및 Blackedge, T.A. et al., Reconstructing web evolution and spider diversification in the molecular era, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 106:13, pg. 5229-5234 (2009) 참고). 그러나, 천연 실크 단백질의 반복 도메인과 서열 유사성 및/또는 아미노산 조성 유사성을 가지는 합성 블록 코폴리머 폴리펩티드는 상응하는 천연 실크 섬유의 특성을 재현하는 상업적 규모의 일관된 실크-유사 섬유를 제조하는데 사용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 재조합 거미 실크는 상당한 결정질 실크 단백질, 높은 함량의 베타 쉬트 실크 단백질, 또는 낮은 용해도 실크 단백질이다. 일부 구체예들에서, 상기 재조합 거미 실크 단백질은 비-카오트로픽성 용매에서 95, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 10%, 또는 5% 미만의 용해도 임계치를 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 용해도 임계치는 원심분리 후, 비-카오트로픽성 용매에서 가용성인 단백질의 양이다.
실크 뉴클레오티드 및 펩티드 서열
추정 실크 서열들의 목록은 관련 용어들, 예컨대 "스피드로인(spidroin)", "피브로인(fibroin)", "MaSp"에 관해 GenBank를 검색함으로써 컴파일될 수 있으며, 독립적인 시퀀싱 시도를 통해 수득된 추가 서열들과 함께 풀링(pooled)될 수 있다. 이어서, 서열들은 아미노산으로 해독되고, 중복 엔트리(entries)에 대해 필터링되고, 수작업을 통하여 도메인들 (NTD, REP, CTD)로 분할된다. 일일부 구체예들에서, 후보 아미노산 서열들은 피치아 (코마가타엘라) 파스토리스(Pichia (Komagataella) pastoris)에서의 발현을 위해 최적화된 DNA 서열로 역-해독된다. DNA 서열들은 각각 발현 벡터로 클론되고, 피치아 (코마가타엘라) 파스토리스로 형질전환된다. 일부 구체예들에서, 성공적인 발현 및 분비를 나타내는 다양한 실크 도메인들은 이어서 조합 방식으로 어셈블되어 섬유 형성이 가능한 실크 분자를 형성한다.
실크 폴리펩티드는 특징적으로 비-반복 영역 (예를 들어, C-말단 도메인 및 N-말단 도메인)이 연접된 반복 도메인 (REP)으로 구성된다. 상기 반복 도메인은 계층(hierarchical) 구조를 나타낸다. 이러한 반복 도메인은 일련의 블록들 (반복 유닛으로도 지칭됨)을 포함한다. 실크 반복 도메인 전체에 걸쳐 블록들은, 때로는 완전하게 때로는 불완전하게 (유사(quasi)-반복 도메인을 구성함) 반복된다. 블록들의 길이 및 조성은 상이한 실크 유형에 따라, 그리고 상이한 종들에 걸쳐 달라진다. 표 1은 선택된 종 및 실크 유형들로부터 얻은 블록 서열들의 예를 열거하며, 추가 예들은 Rising, A. et al., Spider silk proteins: recent advances in recombinant production, structure-function relationships and biomedical applications, Cell Mol. Life Sci., 68:2, pg 169-184 (2011); 및 Gatesy, J. et al., Extreme diversity, conservation, and convergence of spider silk fibroin sequences, Science, 291:5513, pg. 2603-2605 (2001)에 제시되어 있다. 일부 경우들에서, 블록들은 규칙적인 패턴으로 배열되어, 해당 실크 서열의 반복 도메인에서 여러 차례 (보통 2-8회) 나타나는 더 큰 매크로(macro)-반복을 형성할 수 있다. 반복 도메인 또는 매크로-반복 내 반복된 블록 및 반복 도메인 내 반복된 매크로-반복은 스페이싱 요소에 의해 분리될 수 있다. 블록 서열들은 폴리A 영역을 수반하는 글리신 풍부 영역을 포함할 수 있다. 짧은 (~1-10개) 아미노산 모티프는 블록 내 여러 번 나타날 수 있다. 일반적으로 관찰되는 모티프의 하위집합이 도 1에 나와 있다. 상이한 천연 실크 폴리펩티드들로부터 얻은 블록들은 원 순열 (circular permutation)을 고려하지 않고, 선택될 수 있다 (즉, 실크 폴리펩티드들 간에 다른 방식으로 유사한 식별된 블록들은 원 순열로 인해 정렬하지 않을 수 있다). 그러므로, 예를 들어, SGAGG (서열 식별 번호: 39)의 "블록"은 본원에 기술된 방법 및 조성물의 목적에 있어, GSGAG (서열 식별 번호: 40)과 그리고 GGSGA (서열 식별 번호: 41)와 동일하며; 이들은 모두 서로 원 순열이다. 주어진 실크 서열에 대해 선택된 특정 순열은 그 무엇보다도 편의상 지정될 수 있다 (보통 G로 시작). NCBI 데이터베이스로부터 얻은 실크 서열들은 블록과 비-반복 영역들로 구분될 수 있다.
표 1: 블록 서열의 샘플
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
특정 구체예에 따른 블록 및/또는 매크로-반복 도메인으로부터 얻은 섬유-형성 블록 공중합체 폴리펩티드는 참고문헌으로 포함된 국제 특허 공개 공보 WO/2015/042164에 기재되어 있다. GenBank와 같은 단백질 데이터베이스 또는 신생경로 (de novo) 시퀀싱을 통해 얻은 천연 실크 서열은 도메인 (N-말단 도메인, 반복 도메인 및 C-말단 도메인) 별로 분류된다. 섬유로의 합성 및 어셈블리를 위해 선택된 N-말단 도메인 및 C-말단 도메인 서열은 천연 아미노산 서열 정보 및 본 명세서에 기재된 다른 변형을 포함한다. 상기 반복 도메인은 중요한 아미노산 정보를 포착하는 동시에 아미노산을 인코드하는 DNA의 크기를 쉽게 합성가능한 단편들로 감소시키는 대표적인 블록, 일반적으로 실크의 유형에 따라 1 내지 8 개의 대표적인 블록을 함유하는 반복 서열로 분해된다. 일부 구체예들에서, 적절하게 형성된 블록 공중합체 폴리펩티드는 최소한 1개의 반복 서열을 포함하는 하나 이상의 반복 도메인을 포함하고, 선택적으로 N-말단 도메인 및/또는 C-말단 도메인에 연접된다.
일부 구체예들에서, 반복 도메인은 적어도 하나의 반복 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 반복 서열은 150-300개 아미노산 잔기이다. 일부 구체예들에서, 상기 반복 서열은 다수의 블록을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 반복 서열은 다수의 매크로-반복을 포함한다. 일부 구체예들에서, 하나의 블록 또는 마크로-반복은 다수의 반복 서열들에 걸쳐 분할된다.
일부 구체예들에서, DNA 어셈블리 요건을 충족시키기 위해, 상기 반복 서열은 글리신으로 시작하고 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W), 시스테인 (C), 히스티딘 (H), 아스파라긴 (N), 메티오닌 (M) 또는 아스파르트산 (D)으로 끝날 수 없다. 일부 구체예들에서, 상기 반복 서열들 중 일부는 천연 서열과 비교하여 변경될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 반복 서열은 (F, Y, W, C, H, N, M 또는 D에서 종료되는 것을 피하기 위해) 폴리펩티드의 C 말단에 세린을 추가함으로써 변경될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 반복 서열은 다른 블록의 상동성 서열로 불완전 블록을 채움으로써 변형될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 반복 서열은 블록들 또는 매크로반복부들의 순서를 재배열함으로써 변형될 수 있다.
일부 구체예들에서, 비-반복성 N-말단 도메인과 C-말단 도메인이 합성을 위해 선택될 수 있다. 일부 구체예들에서, N-말단 도메인은 SignalP에 의해 확인된 바와 같이 선두(leading) 신호 서열의 제거에 의한 것일 수 있다(Peterson, T.N., et. Al., SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions, Nat. Methods, 8:10, pg. 785-786 (2011).
일부 구체예들에서, N-말단 도메인, 반복 서열, 또는 C-말단 도메인 서열은 아겔레놉시스 아페르타 (Agelenopsis aperta), 알리아티푸스 굴로수스 (Aliatypus gulosus), 아포노펠마 세에만니 (Aphonopelma seemanni), 아프토스티추스 종. (Aptostichus sp.) AS217, 아프토스티추스 종. AS220, 아라네우스 디아데마투스 (Araneus diadematus), 아라네우스 겜모이데스 (Araneus gemmoides), 아라네우스 벤트리코수스 (Araneus ventricosus), 아르지오페 아모에나 (Argiope amoena), 아르지오페 아르젠타타 (Argiope argentata), 아르지오페 브루엔니치 (Argiope bruennichi), 아르지오페 트리파스시아타 (Argiope trifasciata), 아티포이데스 리베르시 (Atypoides riversi), 아비쿨라리아 주루엔시스 (Avicularia juruensis), 보트리오시르툼 칼리포르니쿰 (Bothriocyrtum californicum), 데이노피스 스피노사 (Deinopis Spinosa), 디구에티아 카니티에스 (Diguetia canities), 돌로메데스 테네브로수스 (Dolomedes tenebrosus), 유아그루스 치소세우스 (Euagrus chisoseus), 유프로스테놉스 아우스트랄리스 (Euprosthenops australis), 가스테라칸타 맘모사 (Gasteracantha mammosa), 히포칠루스 토렐리 (Hypochilus thorelli), 쿠쿨카니아 히베르날리스 (Kukulcania hibernalis), 라트로덱투스 헤스페루스 (Latrodectus hesperus), 메가헥수라 풀바 (Megahexura fulva), 메테페이라 그란디오사 (Metepeira grandiosa), 네필라 안티포디아나 (Nephila antipodiana), 네필라 클라바타 (Nephila clavata), 네필라 클라비페스 (Nephila clavipes), 네필라 마다가스카리엔시스 (Nephila madagascariensis), 네필라 필리페스 (Nephila pilipes), 네필렌기스 크루엔타타 (Nephilengys cruentata), 파라윅시아 비스트리아타 (Parawixia bistriata), 페우세티아 비리단스 (Peucetia viridans), 플렉트레우리스 트리스티스 (Plectreurys tristis), 포에실로테리아 레갈리스 (Poecilotheria regalis), 테트라그나타 카우아이엔시스 (Tetragnatha kauaiensis), 또는 울로보루스 디베르수스 (Uloborus diversus)에서 유래될 수 있다.
일부 구체예들에서, 실크 폴리펩티드 뉴클레오티드 코딩 서열은 알파 메이팅(mating) 인자 뉴클레오티드 코딩 서열에 작동가능하도록 연결될 수 있다. 일부 구체예들에서, 실크 폴리펩티드 뉴클레오티드 코딩 서열은 또 다른 내인성 또는 이종성 분비 신호 코딩 서열에 작동가능하도록 연결될 수 있다. 일부 구체예들에서, 실크 폴리펩티드 뉴클레오티드 코딩 서열은 3X FLAG 뉴클레오티드 코딩 서열에 작동가능하도록 연결될 수 있다. 일부 구체예들에서, 실크 폴리펩티드 뉴클레오티드 코딩 서열은 다른 친화력(affinity) 태그, 가령, 6-8개의 His 잔기들뉴클레오티드 코딩 서열(서열 식별 번호: 42)에 작동가능하도록 연결된다.
분비 신호
세포로부터 분비되는 단백질의 양은 단백질마다 상당히 가변적이며, 초기 상태에서 단백질에 작동 가능하게 연결된 분비 신호에 부분적으로 의존한다. 다수의 분비 신호가 당업계에 공지되어 있으며, 일부는 분비된 재조합 단백질의 생산에 통상적으로 사용된다. 이들 중 눈에 띄는 것은 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)의 α-메이팅 인자(αMF)의 분비 신호이며, 이는 N-말단 19개-아미노산 신호 펩티드 (본원에서 pre-αMF(sc)라고도 함), 그리고 그 뒤에 오는 70개-아미노산 리더 펩티드(본원에서 pro-αMF(sc)라고도 함)로 구성된다. 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) (pre-αMF(sc)/pro-αMF(sc)로 또한 지칭되는) αMF의 분비 신호에 pro-αMF(sc)의 함입은 단백질의 높은 분비 수율 달성에 중요한 것으로 입증되었다. pre-αMF(sc) 이외의 신호 펩티드에 pro-αMF(sc) 또는 이의 기능적 변이체를 추가하는 것 또한 재조합 단백질의 분비를 달성하는 수단으로 탐구되었지만, 특정 재조합 숙주 세포에서 특정 재조합 단백질에 대한 분비는 증가하지만 기타 재조합 단백질에 대해서는 효과가 없거나 또는 감소하는 등 다양한 정도의 효과를 나타냈다.
다수의 별개의 분비 신호의 사용은 미국 출원 15/724,196에 기재된 바와 같이, 재조합 단백질의 분비 수율을 개선시킬 수 있다. 단 하나의 분비 신호 (가령, pre-αMF(sc)/pro-αMF(sc))에 작동가능하게 연계된 재조합 단백질을 인코딩하는 다중 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포와 비교하였을 때, 적어도 2개의 별개의 분비 신호에 작동가능하게 연계된 재조합 단백질을 인코딩하는 동일한 수의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포는 재조합 단백질의 더 높은 분비 수율을 만든다. 이론에 결부되는 것은 아니지만, 적어도 2개의 별개의 분비 신호의 사용으로 재조합 숙주 세포가 별개의 세포 분비 경로에 관여하여 재조합 단백질의 효율적인 분비에 영향을 미치고, 따라서 임의의 하나의 분비 경로의 과다-포화가 방지될 수 있다.
별개의 분비 신호 중 적어도 하나는 표 2 또는 표 3에서 선택될 수 있는 신호 펩티드를 포함하거나, 또는 표 2 또는 표 3에서 선택되는 신호 펩티드에 대해 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 기능적 변이체이다. 일부 구체예들에서, 상기 기능적 변이체는 1개 또는 2개의 치환된 아미노산을 포함하는 표 2 또는 표 3에서 선택된 신호 펩티드이다. 일부 이러한 구체예들에서, 상기 기능적 변이체는 표 2 또는 표 3에서 선택된 신호 펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 신호 펩티드는 발생초기(nascent) 재조합 단백질의 해독-후 ER로의 전위를 매개한다 (즉, 단백질 합성은 발생초기 재조합 단백질이 ER로 전위되기 전, 해당 세포 세포질에 존재하도록 전위보다 선행된다). 다른 구체예들에서, 상기 신호 펩티드는 발생초기 재조합 단백질의 ER로의 전좌를 해독적으로-동시 매개한다 (즉, 단백질 합성과 ER로의 전좌가 동시에 일어난다). ER로의 동시-해독 전위를 매개하는 신호 펩티드를 사용하는 이점은 신속하게 폴딩되는 경향이 있는 재조합 단백질이 ER로의 전위와, 그리고 그에 따른 분비를 방해하는 입체형태를 취하는 것을 방지한다는 것이다.
표 2 - 분비 신호
Figure pct00005
표 3 - 재조합 분비 신호
Figure pct00006
발현 벡터
본원에 기재된 발현 벡터는 당업계에 공지된 기술의 관점에서 본 명세서의 교시에 따라 생성될 수 있다. 서열, 예를 들어, 벡터 서열 또는 이식유전자를 코딩하는 서열은 Integrated DNA Technologies, Coralville, IA 또는 DNA 2.0, Menlo Park, CA와 같은 회사로부터 상업적으로 얻을 수 있다. 키메라 실크 폴리펩티드의 높은-수준 발현을 지시하는 발현 벡터가 본원에서 예시된다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 대한 또 다른 표준 공급원은 유기체 (예를 들어, 박테리아), 세포, 또는 선택된 조직으로부터 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 선택된 공급원으로부터의 핵산은 일반적으로 연속적인 페놀 및 페놀/클로로포름 추출 후, 에탄올 침전이 내포된 표준 절차에 의해 단리될 수 있다. 침전 후, 상기 폴리뉴클레오티드는 핵산 분자를 단편으로 절단하는 제한 엔도뉴클레아제로 처리될 수 있다. 클로닝을 위한 적절한 크기의 출발 물질을 제공하기 위해, 상기 선택된 크기의 단편들은 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 펄스장 겔 전기영동을 비롯한 다수의 기술에 의해 분리될 수 있다(Care et al.(1984) Nuc. Acid Res. 12:5647-5664; Chu et al.(1986).) Science 234:1582, Smith et al.(1987) Methods in Enzymology 151:461).
발현 벡터 또는 구조체의 뉴클레오티드 성분을 얻는 또다른 방법은 PCR이다. PCR에 대한 일반적인 절차는 MacPherson et al., PCR: A PRACTICAL APPROACH, (IRL Press at Oxford University Press, (1991))에 교시되어 있다. 각 적용 반응에 대한 PCR 조건은 경험적으로 결정할 수 있다. 다수의 매개변수들이 반응의 성공에 영향을 미친다. 이러한 매개변수 중에는 어닐링 온도 및 시간, 연장 시간, Mg2+ 및 ATP 농도, pH, 프라이머, 주형 및 디옥시리보뉴클레오티드의 상대적 농도가 있다. 예시적인 프라이머는 하기 실시예에서 설명된다. 증폭 후, 생성된 단편은 아가로스 겔 전기영동에 의해 검출된 후, 염화 에티듐 착색 및 자외선 조명으로 시각화할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드를 얻는 또 다른 방법은 효소 절단에 의한 것이다. 예를 들면, 뉴클레오티드 서열은 적절한 인지 제한 효소로 적절한 벡터를 분해하여 생성시킬 수 있다. 제한효소 절단된 단편들은 표준 기술을 사용하여, 4개의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)의 존재 하에 대장균(E. coli) DNA 중합효소 I (Klenow)의 큰 단편으로 처리함으로써 블런트(blunt) 말단화될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 적절한 골격(backbones), 예를 들어, 플라스미드에 삽입된다. 예를 들면, 삽입체 및 벡터 DNA는 적절한 조건에서 제한 효소와 접촉되어 각 분자에 상보적이거나 또는 블런트 말단을 생성할 수 있고, 이들은 서로 쌍을 이루고, 리가아제와 결합될 수 있다. 대안으로, 합성 핵산 링커는 폴리뉴클레오티드의 말단에 결찰될 수 있다. 이러한 합성 링커들은 벡터 DNA의 특정 제한 부위에 상응하는 핵산 서열을 함유할 수 있다. 기타 수단들이 공지되어 있고, 당업계에 이용가능하다. 구성성분 폴리뉴클레오티드를 위해 다양한 공급원이 사용될 수 있다.
일부 구체예들에서, R, N 또는 C 서열을 함유하는 발현 벡터는 발현 및/또는 분비를 위해 숙주 유기체로 형질전환된다. 일부 구체예들에서, 상기 발현 벡터는 분비 신호를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 발현 벡터는 종료 신호를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 발현 벡터는 숙주 세포 게놈에 통합되도록 설계되었으며, 다음을 포함한다: 표적 게놈에 대한 상동성 영역, 프로모터, 분비 신호, 태그 (가령, 플래그 태그), 종결/폴리A 신호, 피치아(Pichia)에 대한 선택가능한 마커, 대장균(E. coli)에 대한 선택가능한 마커, 대장균(E. coli)에 대한 복제 기점, 그리고 관심대상의 단편을 방출하는 제한절단 부위.
본 발명의 벡터는 거미줄 단백질 코딩 서열을 숙주 세포 게놈의 특정 위치로 직접 통합하는 표적화 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 표적화 서열의 비-제한적인 예로는 숙주 세포의 게놈에 존재하는 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열이 내포된다. 일부 구체예들에서, 상기 표적화 서열은 숙주 세포 게놈의 반복적 요소와 동일하다. 일부 구체예들에서, 상기 표적화 서열은 숙주 세포 게놈의 전이가능한(transposable) 요소와 동일하다.
일부 구체예들에서, 본원에 기재된 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포가 본원에 제공된다. 일부 구체예들에서, 벡터는 예를 들어, 상동 재조합 또는 표적화된 통합을 통해 재조합 숙주 세포의 게놈(가령, 염색체) 내에 안정적으로 통합된다. 게놈 통합에 적합한 부위의 비-제한적 예로는 사카로마이세스 세레비지애 게놈의 Ty1 유전자좌, 피치아 파스토리스 게놈의 rDNA 및 HSP82 유전자좌, 및 재조합 숙주 세포의 게놈 전체에 흩어져 있는 복제물을 갖는 전위 요소들이 내포된다. 다른 구체예들에서, 상기 벡터들은 재조합 숙주 세포의 게놈 내에 안정적으로 통합되지 않고, 오히려 염색체 외에 존재한다.
숙주 세포 형질전환체
거미 실크 폴리펩티드 및 이의 후손을 발현시키는 핵산 분자 또는 벡터로 형질전환된 숙주 세포가 제공된다. 이들 세포는 자유 복제 벡터일 필요는 없지만, 벡터 상에서 핵산 서열을 또한 담고 있을 수 있다. 다른 구체예들에서, 상기 핵산은 숙주 세포의 게놈에 통합되었다.
일부 구체예들에서, 블록 공중합체 폴리펩티드의 대-규모 생산을 가능하게 하는 미생물 또는 숙주 세포는 다음의 조합이 내포된다: 1) 큰 (>50kDa) 폴리펩티드를 생산하는 능력, 2) 대규모 오염 물질 (가령, 바이러스 및 박테리아 오염)에 대한 내성, 그리고 3) 유기체를 성장시키고 처리하기 위한 기존 노하우는 대규모(1-2000m3) 생물 반응기이다.
일부 구체예들에서, 숙주 세포는 재조합 거미줄 단백질을 세포 내에서 발현하고, 이 단백질은 이 숙주 세포에 남아 있다. 일부 구체예들에서, 숙주 세포는 재조합 거미줄 단백질을 세포 내에서 발현하고, 이 단백질은 분비된다.
다양한 숙주 유기체는 블록 공중합체 폴리펩티드 발현 시스템을 포함하도록 조작/형질전환될 수 있다. 재조합 실크 폴리펩티드의 발현을 위한 바람직한 유기체에는 식물, 조류(algae), 효모, 진균, 그람-양성 및 그람-음성 박테리아가 내포된다. 일부 구체예들에서, 상기 숙주 유기체는 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 아스퍼길러스 아쿨레투스(Aspergillus aculeatus), 아스퍼길러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼길러스 피쿰(Aspergillus ficuum), 아스퍼길러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼길러스 야포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스퍼길러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼길러스 나이져(Aspergillus niger), 아스퍼길러스 오리제(Aspergillus oryzae), 아스퍼길러스 소야(Aspergillus sojae), 아스퍼길러스 투비겐시스(Aspergillus tubigensis), 바실러스 알카로필루스(Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 바실러스 씨르쿨란스(Bacillus circulans), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 라우투스(Bacillus lautus), 바실러스 렌투스(Bacillus lentus), 바실러스 리퀘니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 메탄올리쿠스(Bacillus methanolicus), 바실러스 스테아로테르모필리스(Bacillus stearothermophilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 튜린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 칸디다 보이디니(Candida boidinii), 크리소스포리움 럭노웬스(Chrysosporium lucknowense), 대장균(Escherichia coli), 푸사리움 그라미네룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 클루베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루유베로미세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 미셀리오프토라 터모필리아(Myceliopthora thermophila), 누로스포라 크라사(Neurospora crassa), 오가타에아 폴리모르파(Ogataea polymorpha), 페니실리움 카멤베르티(Penicillium camemberti), 페니실리움 카네센스(Penicillium canescens), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 페니실리움 에메르소니(Penicillium emersonii), 페니실리움 푸니쿨로숨(Penicillium funiculosum), 페니실리움 그리세로세움(Penicillium griseoroseum), 페니실리움 푸르푸로게눔(Penicillium purpurogenum), 페니실리움 로퀘포르티(Penicillium roqueforti), 파네로차에테 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 피치아 앙구스타(Pichia angusta), 피치아 메탄올리카(Pichia methanolica), 피치아(코마가타에라) 파스포리스(Pichia (Komagataella) pastoris), 피치아 폴리모르파(Pichia polymorpha), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis), 리조무코르 미에하이(Rhizomucor miehei), 리조무코르 푸실리우스(Rhizomucor pusillus), 리조푸스 아르히주스(Rhizopus arrhizus), 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans), 사카로미세스 세레비시에(saccharomyces cerevisiae), 쉬반니오미세스 악시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 트리코데르마 하르지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei), 또는 야로비아 피로리티카(Yarrowia lipolytica)이다.
재조합 숙주 세포로서 사용될 수 있는 추가 균주는 당업계에 공지되어 있다. 용어 "재조합 숙주 세포"란 특정 대상 세포 뿐만 아니라 그러한 세포의 자손을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 특정 변형이 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에 사용된 용어 "재조합 숙주 세포"의 범위 내에 여전히 내포된다.
공작된 숙주 세포 계통
재조합 단백질 생산을 위해 널리 사용되는 미생물은 대장균(Escherichia coli) 박테리아다. 그러나, 대장균(Escherichia coli) 균주의 배양 동안, 재조합적으로 발현된 단백질은 불용성일 수 있으며, 그 결과 재조합 단백질의 분리가 잘 되지않고, 수율이 감소될 수 있다. 메탄올자화(methylotrophic) 효모 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)는 재조합 단백질의 생산에 널리 사용된다. P. 파스토리스(P. pastoris)는 높은 세포 밀도로 성장하고, 엄격하게 제어된 메탄올-유도성 트랜스 유전자 발현을 제공하고, 한정된 배지로 효과적으로 이종성 단백질을 분비할 수 있다. 그러나, P. 파스토리스 (P. pastoris) 균주의 배양 동안, 재조합적으로 발현된 단백질은 이들이 분비되기 전에 세포내에서 수집될 수 있어, 재조합 발현 단백질의 단편 및 감소된 수율의 전장 재조합 단백질을 포함하는 단백질의 혼합물을 생성할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에 기재된 프로테아제 활성이 감소된 변형 균주는 실크-유사 폴리펩티드 서열을 재조합적으로 발현시킨다. 일부 구체예들에서, 실크-유사 폴리펩티드 서열은 1) 실크 폴리펩티드 서열에서 유래한 반복 도메인들을 혼합 및 매칭시킴으로써 생성된 블록 코폴리머 폴리펩티드 조성물 및/또는 2) 산업적으로 확장가능한 미생물로부터의 분비에 의해 유용한 섬유를 형성하기에 충분히 큰 크기 (대략 40kDa)를 가지는 블록 공중 합체 폴리펩티드의 재조합 발현이다. 거의 모두 공개된 거미 실크 폴리펩티드의 아미노산 서열들로부터의 서열을 비롯하여, 실크 반복 도메인 단편들로부터 조작된 큰 (대략 40 kDa ~ 대략 100 kDa) 블록 코폴리머 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 변형 미생물에서 발현될 수 있다. 일부 구체예에서, 실크 폴리펩티드 서열은 섬유 형성이 가능한 고도로 발현되고, 분비된 폴리펩티드를 생성하도록 매칭되고 설계된다. 일부 구체예들에서, 숙주 변형된 균주에서 프로테아제 유전자의 녹-아웃(knock-out) 또는 프로테아제 활성의 감소는 실크 유사 폴리펩티드의 분해를 감소시킨다.
일부 구체예들에서, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 프로테아제 활성을 약화시키기 위하여, 이들 효소를 인코드하는 유전자를 불활성화 또는 돌연변이시켜 활성을 감소시키거나 제거한다. 이것은 유전자 조절 요소의 변형을 통한 유전자 자체의 돌연변이 또는 삽입을 통해 이루어질 수 있다. 이것은 표준 효모 유전학 기술을 통해 구현될 수 있다. 이러한 기술의 예는 이중 상동 재조합을 통한 유전자 대체를 포함하며, 여기서 불 활성화될 유전자에 연접하는 상동 영역들은 선별 마커 유전자 (가령, 항생제 내성 유전자 또는 효모 균주의 영양요구성을 보충하는 유전자)에 연접하는 벡터에서 클로닝된다.
대안적으로, 상동성 영역은 PCR-증폭되고 중첩 PCR을 통해 선별 마커 유전자에 연결될 수 있다. 이어서, 이러한 DNA 단편들은 해당 분야에 공지된 방법들, 예컨대, 전기천공법을 통해 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에 형질전환된다. 이어서 선택적 조건하에서 성장하는 형질전환체들을 표준 기술, 예컨대, 게놈 DNA에 대한 PCR 또는 서던 블롯에 의해 유전자 파괴 발생에 대해 분석하였다. 대안적인 실험에서, 유전자 불활성화는 단일 상동 재조합을 통해 구현될 수 있으며, 이 때, 예를 들어, 유전자 ORF의 5 ' 단부는 선별 마커 유전자를 또한 함유하는 프로모터없는 벡터 상에 클로닝된다. 표적 유전자 상동성 단편에서 벡터만을 절단하는 제한 효소에 의한 분해를 통해 이러한 벡터를 선형화할 때, 이러한 벡터는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 내에 형질전환된다. 표적 유전자 부위에서의 통합은 게놈 DNA에서의 PCR 또는 서던 블롯을 통해 확인된다. 이러한 방식으로, 벡터 상에 클로닝된 유전자 단편의 복제가 게놈에서 구현되고, 다음과 같은 표적 유전자 좌위의 2개의 복제물이 생성된다: ORF가 불완전하여, 단축된 비활성 단백질을 발현시키는 제 1 복제물, 및 전사를 유도하는 프로모터가 없는 제 2 복제물.
대안으로, 트랜스포존(transposon) 돌연변이유발을 사용하여 표적 유전자를 불활성화시킨다. 이러한 돌연변이체의 라이브러리는 PCR을 통해 표적 유전자에서의 삽입 발생에 대해 스크리닝될 수 있다.
조작된/녹아웃 균주의 기능적 표현형 (즉, 결핍)은 해당 분야에 공지된 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 프로테아제 활성에서 조작된 균주의 결핍은 해당 분야에 공지된 임의의 다양한 방법, 그 중에서도, 예컨대, 발색 프로테아제 기질의 가수분해 활성 분석, 선택된 프로테아제에 대한 기질 단백질의 밴드 이동 등을 사용하여 확인할 수 있다.
본 명세서에 기재된 프로테아제 활성의 약화는 녹아웃 돌연변이 이외의 메커니즘을 통해 구현될 수 있다. 예를 들면, 원하는 프로테아제는 핵산 서열을 변경하거나, 유전자를 활성이 덜한 프로모터의 제어하에 위치시키거나, 하향 조절하거나, 관심 유전자를 표적으로 하는 간섭 RNA, 리보자임 또는 안티센스 서열을 발현시킴으로써, 또는 해당 분야에 공지된 임의의 다른 기술을 통한 아미노산 서열 변화에 의해 약화될 수 있다. 바람직한 균주에서, PAS_chr4_0584 (YPS1-1) 및 PAS_chr3_1157 (YPS1-2)에서 인코드되는 프로테아제들의 프로테아제 활성은 상기 기재된 임의의 방법에 의해 약화된다. 일부 양상들에서, 메탄올자화 효모 균주, 특히 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 균주 [이때 YPS1-1 및 YPS1-2 유전자는 불활성화되었음]에 대해 기재된다. 일부 구체예들에서, 균주에 의해 발현되는 원하는 단백질 생성물의 프로테아제 활성을 추가로 감소시키기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 추가 프로테아제 암호화 유전자가 녹-아웃될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명에 개시된 P. 파스토리스(P. pastoris) 균주는 실크-유사 폴리펩티드를 발현하기 위해 변형되어 있다. 바람직한 구체예들의 실크-유사 폴리펩티드 제작 방법은 WO 2015/042164, 특히 114-134 단락에 제공되며, 이 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 이 문헌에는 아르지오페 브루엔니치 (Argiope bruennichi) 종과 같은 MaSp2로부터 유래한 재조합 거미 실크 단백질 단편 서열들에 기초한 합성 단백질성 코폴리머가 개시되어 있다. 각각의 반복 유닛의 분자량이 약 20 kDa 이상의, 2 내지 20개 반복 유닛을 포함하는 실크-유사 폴리펩티드가 기재되어 있다. 코폴리머의 각 반복 유닛 내에는 약 60개 이상의 아미노산 잔기가 있고, 이들은 다수의 "유사-반복 유닛"으로 구성되게 된다. 일부 구체예들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드의 반복 단위는 MaSp2 드래그라인(dragline) 실크 단백질 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 가진다.
실시예
하기는 본원에 기재된 방법들을 수행하기 위한 특정 구체예들의 예시이다. 실시예는 오직 설명을 위하여 제공되며, 어떤 방식으로든 본 명세서의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 물론 일부 실험 오차 및 편차가 허용되어야 한다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에서 기술된 방법들의 실시는 숙련된 기술자에게 통상적인 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학적 방법을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 가령, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3 rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992) 참고.
실시예 1: 미세유동화는 재조합 실크 단백질의 용해도를 증가시킨다
다양한 수성 용매 조건에서 불용성 세포 물질의 응집체로부터 모델 실크 단백질을 용해화하기 위해 높은 물리적 에너지가 사용되었다.
모델 실크 UD MiSp 64kDa는 N-말단 히스티딘 육량체(서열 식별 번호: 43)에 연결된 울로보루스 디베르수스(Uloborus diversus) 마이너 앰플레이트 스피드로인 유전자 서열(GenBank: DQ399332.1, 서열 번호 23)에서 유래된 재조합적으로 발현된 64kD 단백질이다. MiSp 단백질을 코딩하는 T7 발현 벡터로 형질전환된 대장균(Escherichia coli ) C41(DE3)(Lucigen)을 사용하여 이 단백질을 발현시켰다. 세포를 최소 배지에서 성장시키고, MiSp 유전자 발현을 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)로 유도하고, 균질화를 통해 용해시켰다. 상기 불용성 세포 용해물 물질을 원심분리하여 펠렛화하였다. 불용성 물질에 4M 우레아 용액을 10:1의 (질량) 비율로 1hr 동안 혼합하고, 원심분리에 의해 이 불용성 분획을 회수하였다. 사용된 균질화 장비는 약 0.7x106 s-1의 전단율을 생성했다. 그러나, 이 UD MiSp 64kD 모델 실크는 불용성이 높은 것으로 알려져 있으며, 이 균질화기에 의해 생성된 전단율은 UD MiSp 64kDa 실크를 용해화하기에 불충분했다.
불용성 실크 단백질을 함유하는 세포 바이오매스 및 펠렛을 수성 완충액(50mM Tris, pH 7.5) 및 선택된 카오트로프-함유 용액에 15% w/v 비율 (세포 펠렛 질량 대비 용액 부피)로 재현탁시켰다. 상기 카오트로프의 최종 농도는 10 M 우레아, 4 M GdnHCl, 8 M GdnHCl, 3 M GdnSCN, 또는 6 M GdnSCN이었으며, 펠렛 밀도는 1 g/l로 추정된다. 용액을 실온에서 적어도 1시간 동안 교반 혼합하여, 물질의 큰 덩어리를 붕괴시켰다. 100mL 분취량은 30,000psi (게이지 압력, M-110P, Microfluidics Inc.)에서 작동되는 F12Y 상호 작용 챔버를 통해 3회 통과하여 처리되었다. 프로세싱 단계 동안 샘플이 가열되는 것을 제한하기 위해, 수조를 사용했다. 대조군으로서, 미세유동화기로 처리하는 대신, 100mL 분취량의 별도 세트를 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
실크 단백질의 용해화는 실온에서 20분 동안 15,000 x g에서 50mL 분취량의 원심분리에 의해 분석되었고, 상청액과 세포 펠렛이 분리되었다. 가용성 실크 단백질은 원심 분리 후, 상층액에 남아있는 실크 단백질로 결정되었다. 세포 펠렛에 남아있는 불용성 실크는 물에서 50 mL의 5 M GdnSCN으로 펠렛을 추출하여 분석했다. 2개의 분획에서 실크의 농도는 항-His6 항체(서열 식별 번호: 43으로 개시되는 "His6")를 사용한 ELISA에 의해 평가되었고, 그 결과는 표 1에 나타낸다.
표 1: 수성 완충액 및 선택된 카오트로프 용액에서 높은 에너지 프로세싱 후, 모델 실크 용해도의 증가. 두 분획에서 실크의 농도는 ELISA에 의해 결정되었다.
Figure pct00007
평가된 모든 조건에서 미세유동화는 가용성 분획에서 실크의 양을 증가시켰다. 주목할 만한 예는 10M 우레아 및 4M GdnHCl 조건이며, 여기에서 무시할 정도의 실크(4M GdnHCl에서 6% 또는 10M 우레아에서 0%)는 대조군에서 용해되었지만, 그러나 75% 이상은 미세유동화 프로세싱 후에 용해되었다. 추가적으로, 3M 및 6M GdnSCN 완충액 모두 미세유동화 후 100% 용해화된 실크 단백질을 생성했으며, 반면 동일한 카오트로픽 농도를 사용한 대조군 처리로는 실크를 완전히 용해시키지 못했다. 따라서, 미세유동화의 사용으로 실크 단백질 용해화에 필요한 카오트로프 농도가 낮아졌다.
가용성 분획에서 실크 단백질의 존재는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 또한 확인되었다. SEC HPLC를 사용하여 10M 우레아 단독(대조군 라인)과 비교하여, 10M 우레아 및 미세유동화(높은 에너지 라인)로 추출된 단백질 샘플의 가용성 분획을 비교했다 (도 2). 모델 실크 단백질(MiSp 피크)의 용출 시간은 정제된 단백질 표준으로 확인되었다(데이터는 표시되지 않음). 컬럼은 변성 이동상(5 M GdnSCN)으로 운용되었고, 용리액은 굴절률 검출기로 검출되었다. 미세유동화 전단력의 적용으로 우레아 단독과 비교하였을 때, 실크 단백질의 용해화 및 회수는 상당히 증가된다. 용해화된 실크 단백질의 순도는 일부 샘플에 대한 SEC 피크 % 굴절률 곡선(RU) 면적을 산출하여 평가되었다. 선택된 샘플들의 순도는 표 2에 나타낸다.
Figure pct00008
실시예 2: 전단율 압력 최적화
다음으로, 미세유동화의 상호작용 챔버 크기 및 압력을 변경하여, 실크 용해화를 평가했다.
실크 단백질을 함유하는 불용성 세포 바이오매스를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고, 10M 우레아의 최종 농도로 우레아에 현탁시켰다. 샘플은 제조업체 (Microfluidics Processor User Guide, Microfluidics, Inc)가 설명한 바와 같이, 상호작용 챔버 유형 및 작동 압력에 의해 제어되는 두 가지 상이한 전단율로 처리되었다. 구체적으로, 6.5 x 106 s-1 (G10Z 상호작용 챔버, 23,000 psi, Microfluidics Inc. LM10) 또는 9.5 x 106 s-1 (F12Y 상호작용 챔버, 30,000 psi, Microfluidics Inc. M-110P)의 예측된 전단율을 표적으로 삼았다. 실크 단백질의 용해화는 실시예 1에 기술된 원심분리 프로토콜에 의해 분석되었다. 가용성 또는 불용성 분획의 실크 농도는 이전에 설명한 대로 SEC HPLC에 의해 평가되었다: 실크 농도를 산출하기 위해, 소 혈청 알부민 단백질 표준을 사용하여 SEC 굴절률 피크의 면적으로 실크 단백질이 측정되었다.
표 3은 두 가지 처리 후, 실크의 용해화를 보여준다. 전단율을 9.5 x 106 s-1로 증가시키면 용해화된, 실크 단백질의 수율은 6.5 x 106 s-1의 더 낮은 속도에서 처리된 샘플과 비교하여, 40% 증가했다(23,000psi를 사용시 47% 수율과 비교하여, 30,000psi 사용시 66% 수율). 따라서, 더 높은 전단율은 실크 단백질 용해화 및 회수를 증가시켰다.
표 3: 실크 단백질을 10M Urea로 용해화할 때, 전단 속도를 변화시키는 효과. SEC HPLC 피크 면적으로부터 실크 농도가 추정되었다. 수율은 회수된 실크 단백질의 양을 출발 물질의 실크 단백질 총량으로 정규화한 양이다. 출발 물질에서 실크 단백질의 총량은 5M GdnSCN과의 항온처리를 통해 추출되었다.
Figure pct00009
본 발명이 특히 바람직한 구체예들과 다양한 대안적인 구체예들을 참조하여 도시되고 설명되었지만, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 형태 및 세부 사항의 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 관련 기술 분야의 숙련자들은 이해할 것이다.
본 명세서의 본문 내에 인용된 모든 참고 문헌, 등록된 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 전체적으로 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> BOLT THREADS, INC. <120> METHODS FOR ISOLATING SPIDER SILK PROTEINS VIA HIGH SHEAR SOLUBILIZATION <130> BTT-033WO <140> <141> <150> 62/901,053 <151> 2019-09-16 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 181 <212> PRT <213> Aliatypus gulosus <400> 1 Gly Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Ile Ile Thr Thr Lys Ser Ala Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala Ala Ala Asp Ala Ser Ala Ala Ala Thr Ala Ser Ala Ala 20 25 30 Ser Arg Ser Ser Ala Asn Ala Ala Ala Ser Ala Phe Ala Gln Ser Phe 35 40 45 Ser Ser Ile Leu Leu Glu Ser Gly Tyr Phe Cys Ser Ile Phe Gly Ser 50 55 60 Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Ile Ala Ser Ala Ala Ser Arg 65 70 75 80 Ala Ala Ala Glu Ser Asn Gly Tyr Thr Thr His Ala Tyr Ala Cys Ala 85 90 95 Lys Ala Val Ala Ser Ala Val Glu Arg Val Thr Ser Gly Ala Asp Ala 100 105 110 Tyr Ala Tyr Ala Gln Ala Ile Ser Asp Ala Leu Ser His Ala Leu Leu 115 120 125 Tyr Thr Gly Arg Leu Asn Thr Ala Asn Ala Asn Ser Leu Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Ala Tyr Ala Phe Ala Asn Ala Ala Ala Gln Ala Ser 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Ser Ser Phe Ala Ser Ala Val Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala 35 40 45 Ser Ala Ser Ala Ala Ser Ser Ala Tyr Ala Gln Ser Ala Ala Ala Gln 50 55 60 Ala Gln Ala Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gln Ala Ala Ala Gln Ser Ala 65 70 75 80 Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Ser Ala Gly Ala Gly Ala Ser Ala Gly 85 90 95 Ala Gly Ala Val Ala Gly Ala Gly Ala Val Ala Gly Ala Gly Ala Val 100 105 110 Ala Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ser Gln Ala Ala Ala Ser Ser Ser 115 120 125 Ala Ser Ala Val Ala Ser Ala Phe Ala Gln Ser Ala Ser Tyr Ala Leu 130 135 140 Ala Ser Ser Ser Ala Phe Ala Asn Ala Phe Ala Ser Ala Thr Ser Ala 145 150 155 160 Gly Tyr Leu Gly Ser Leu Ala Tyr Gln Leu Gly Leu Thr Thr Ala Tyr 165 170 175 Asn Leu Gly Leu Ser Asn Ala Gln Ala Phe Ala Ser Thr Leu Ser Gln 180 185 190 Ala Val Thr Gly Val Gly Leu 195 <210> 7 <211> 171 <212> PRT <213> Nephila clavipes <400> 7 Gly Ala Thr Ala Ala Ser Tyr Gly Asn Ala Leu Ser Thr Ala Ala Ala 1 5 10 15 Gln Phe Phe Ala Thr Ala Gly Leu Leu Asn Ala Gly Asn Ala Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Ser Ser 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200 205 Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly 210 215 220 Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Gly 225 230 235 240 Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Gly Thr 245 250 255 Thr Ile Ile Glu Asp Leu Asp Ile Thr Ile Asp Gly Ala Asp Gly Pro 260 265 270 Ile Thr Ile Ser Glu Glu Leu Pro Ile Ser Gly Ala Gly Gly Ser Gly 275 280 285 Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Val Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro 290 295 300 Gly Gly Val Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro Gly Gly Val Gly Pro Gly 305 310 315 320 Gly Ser Gly Pro Gly Gly Val Gly Pro Gly Gly Ala Gly Gly Pro Tyr 325 330 335 Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Pro 340 345 350 Gly Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly 355 360 365 Gly Pro Gly Gly Ala Gly Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gly Glu Gly Pro 370 375 380 Gly Gly Ala Gly Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gly Ala Gly Gly Pro Tyr 385 390 395 400 Gly Pro Gly Gly Ala Gly Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gly Glu Gly Gly 405 410 415 Pro Tyr Gly Pro 420 <210> 10 <211> 376 <212> PRT <213> Latrodectus hesperus <400> 10 Gly Ile Asn Val Asp Ser Asp Ile Gly Ser Val Thr Ser Leu Ile Leu 1 5 10 15 Ser Gly Ser Thr Leu Gln Met Thr Ile Pro Ala Gly Gly Asp Asp Leu 20 25 30 Ser Gly Gly Tyr Pro Gly Gly Phe Pro Ala Gly Ala Gln Pro Ser Gly 35 40 45 Gly Ala Pro Val Asp Phe Gly Gly Pro Ser Ala Gly Gly Asp Val Ala 50 55 60 Ala Lys Leu Ala Arg Ser Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Ser Gly Val 65 70 75 80 Phe Arg Ala Ala Phe Asn Ser Arg Val Ser Thr Pro Val Ala Val Gln 85 90 95 Leu Thr Asp Ala Leu Val Gln Lys Ile Ala Ser Asn Leu Gly Leu Asp 100 105 110 Tyr Ala Thr Ala Ser Lys Leu Arg Lys Ala Ser Gln Ala Val Ser Lys 115 120 125 Val Arg Met Gly Ser Asp Thr Asn Ala Tyr Ala Leu Ala Ile Ser Ser 130 135 140 Ala Leu Ala Glu Val Leu Ser Ser Ser Gly Lys Val Ala Asp Ala Asn 145 150 155 160 Ile Asn Gln Ile Ala Pro Gln Leu Ala Ser Gly Ile Val Leu Gly Val 165 170 175 Ser Thr Thr Ala Pro Gln Phe Gly Val Asp Leu Ser Ser Ile Asn Val 180 185 190 Asn Leu Asp Ile Ser Asn Val Ala Arg Asn Met Gln Ala Ser Ile Gln 195 200 205 Gly Gly Pro Ala Pro Ile Thr Ala Glu Gly Pro Asp Phe Gly Ala Gly 210 215 220 Tyr Pro Gly Gly Ala Pro Thr Asp Leu Ser Gly Leu Asp Met Gly Ala 225 230 235 240 Pro Ser Asp Gly Ser Arg Gly Gly Asp Ala Thr Ala Lys Leu Leu Gln 245 250 255 Ala Leu Val Pro Ala Leu Leu Lys Ser Asp Val Phe Arg Ala Ile Tyr 260 265 270 Lys Arg Gly Thr Arg Lys Gln Val Val Gln Tyr Val Thr Asn Ser Ala 275 280 285 Leu Gln Gln Ala Ala Ser Ser Leu Gly Leu Asp Ala Ser Thr Ile Ser 290 295 300 Gln Leu Gln Thr Lys Ala Thr Gln Ala Leu Ser Ser Val Ser Ala Asp 305 310 315 320 Ser Asp Ser Thr Ala Tyr Ala Lys Ala Phe Gly Leu Ala Ile Ala Gln 325 330 335 Val Leu Gly Thr Ser Gly Gln Val Asn Asp Ala Asn Val Asn Gln Ile 340 345 350 Gly Ala Lys Leu Ala Thr Gly Ile Leu Arg Gly Ser Ser Ala Val Ala 355 360 365 Pro Arg Leu Gly Ile Asp Leu Ser 370 375 <210> 11 <211> 200 <212> PRT <213> Argiope trifasciata <400> 11 Gly Ala Gly Tyr Thr Gly Pro Ser Gly Pro Ser Thr Gly Pro Ser Gly 1 5 10 15 Tyr Pro Gly Pro Leu Gly Gly Gly Ala Pro Phe Gly Gln Ser Gly Phe 20 25 30 Gly Gly Ser Ala Gly Pro Gln Gly Gly Phe Gly Ala Thr Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Ala Gly Leu Ile Ser Arg Val Ala Asn Ala Leu Ala Asn Thr Ser 50 55 60 Thr Leu Arg Thr Val Leu Arg Thr Gly Val Ser Gln Gln Ile Ala Ser 65 70 75 80 Ser Val Val Gln Arg Ala Ala Gln Ser Leu Ala Ser Thr Leu Gly Val 85 90 95 Asp Gly Asn Asn Leu Ala Arg Phe Ala Val Gln Ala Val Ser Arg Leu 100 105 110 Pro Ala Gly Ser Asp Thr Ser Ala Tyr Ala Gln Ala Phe Ser Ser Ala 115 120 125 Leu Phe Asn Ala Gly Val Leu Asn Ala Ser Asn Ile Asp Thr Leu Gly 130 135 140 Ser Arg Val Leu Ser Ala Leu Leu Asn Gly Val Ser Ser Ala Ala Gln 145 150 155 160 Gly Leu Gly Ile Asn Val Asp Ser Gly Ser Val Gln Ser Asp Ile Ser 165 170 175 Ser Ser Ser Ser Phe Leu Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ala Ser Tyr Ser 180 185 190 Gln Ala Ser Ala Ser Ser Thr Ser 195 200 <210> 12 <211> 357 <212> PRT <213> Uloborus diversus <400> 12 Gly Ala Ser Ala Ala Asp Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Ser Val Ala 1 5 10 15 Thr Ser Leu Gln Ser Asn Gly Val Leu Thr Ala Ser Asn Val Ser Gln 20 25 30 Leu Ser Asn Gln Leu Ala Ser Tyr Val Ser Ser Gly Leu Ser Ser Thr 35 40 45 Ala Ser Ser Leu Gly Ile Gln Leu Gly Ala Ser Leu Gly Ala Gly Phe 50 55 60 Gly Ala Ser Ala Gly Leu Ser Ala Ser Thr Asp Ile Ser Ser Ser Val 65 70 75 80 Glu Ala Thr Ser Ala Ser Thr Leu Ser Ser Ser Ala Ser Ser Thr Ser 85 90 95 Val Val Ser Ser Ile Asn Ala Gln Leu Val Pro Ala Leu Ala Gln Thr 100 105 110 Ala Val Leu Asn Ala Ala Phe Ser Asn Ile Asn Thr Gln Asn Ala Ile 115 120 125 Arg Ile Ala Glu Leu Leu Thr Gln Gln Val Gly Arg Gln Tyr Gly Leu 130 135 140 Ser Gly Ser Asp Val Ala Thr Ala Ser Ser Gln Ile Arg Ser Ala Leu 145 150 155 160 Tyr Ser Val Gln Gln Gly Ser Ala Ser Ser Ala Tyr Val Ser Ala Ile 165 170 175 Val Gly Pro Leu Ile Thr Ala Leu Ser Ser Arg Gly Val Val Asn Ala 180 185 190 Ser Asn Ser Ser Gln Ile Ala Ser Ser Leu Ala Thr Ala Ile Leu Gln 195 200 205 Phe Thr Ala Asn Val Ala Pro Gln Phe Gly Ile Ser Ile Pro Thr Ser 210 215 220 Ala Val Gln Ser Asp Leu Ser Thr Ile Ser Gln Ser Leu Thr Ala Ile 225 230 235 240 Ser Ser Gln Thr Ser Ser Ser Val Asp Ser Ser Thr Ser Ala Phe Gly 245 250 255 Gly Ile Ser Gly Pro Ser Gly Pro Ser Pro Tyr Gly Pro Gln Pro Ser 260 265 270 Gly Pro Thr Phe Gly Pro Gly Pro Ser Leu Ser Gly Leu Thr Gly Phe 275 280 285 Thr Ala Thr Phe Ala Ser Ser Phe Lys Ser Thr Leu Ala Ser Ser Thr 290 295 300 Gln Phe Gln Leu Ile Ala Gln Ser Asn Leu Asp Val Gln Thr Arg Ser 305 310 315 320 Ser Leu Ile Ser Lys Val Leu Ile Asn Ala Leu Ser Ser Leu Gly Ile 325 330 335 Ser Ala Ser Val Ala Ser Ser Ile Ala Ala Ser Ser Ser Gln Ser Leu 340 345 350 Leu Ser Val Ser Ala 355 <210> 13 <211> 32 <212> PRT <213> Euprosthenops australis <400> 13 Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Arg Tyr Gly Gln Gly Ala Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 30 <210> 14 <211> 42 <212> PRT <213> Tetragnatha kauaiensis <400> 14 Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gln Gly 1 5 10 15 Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Ser Gly Leu Gly Gly Ala Gly Gln Gly 20 25 30 Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 35 40 <210> 15 <211> 42 <212> PRT <213> Argiope aurantia <400> 15 Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ala Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ser Gln Gly 1 5 10 15 Pro Gly Ser Gly Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Leu Gly Pro Tyr Gly 20 25 30 Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 35 40 <210> 16 <211> 46 <212> PRT <213> Deinopis spinosa <400> 16 Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gly 1 5 10 15 Gln Tyr Gly Pro Gly Thr Gly Gln Gln Gly Gln Gly Pro Ser Gly Gln 20 25 30 Gln Gly Pro Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 35 40 45 <210> 17 <211> 42 <212> PRT <213> Nephila clavata <400> 17 Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Leu Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly 1 5 10 15 Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ala Gly Tyr Gly Pro Ser Gly Leu Ser Gly 20 25 30 Pro Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 35 40 <210> 18 <211> 174 <212> PRT <213> Deinopis Spinosa <400> 18 Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Thr Gly Tyr Gly Gly Gly Ala Gly Tyr Gly Thr Gly Ser Gly Ala 20 25 30 Gly Tyr Gly Ala Gly Val Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly 35 40 45 Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Gly 50 55 60 Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Thr Gly Tyr Gly Ala Gly Ala 65 70 75 80 Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 85 90 95 Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala 100 105 110 Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Val Ala Gly Ala Gly Ala 115 120 125 Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala 130 135 140 Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala 145 150 155 160 Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Arg Ala Gly Ala Gly Gly 165 170 <210> 19 <211> 149 <212> PRT <213> Latrodectus hesperus <400> 19 Gly Gly Gly Tyr Gly Arg Gly Gln Gly Ala Gly Ala Gly Val Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ile Ala Arg Ala Gly Gly 20 25 30 Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Gln Gly Ala Gly Ala 35 40 45 Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Gln Gly 50 55 60 Ala Gly Gly Tyr Gly Arg Gly Gln Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 65 70 75 80 Gly Ala Gly Ala Arg Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala 85 90 95 Ala Gly Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala 100 105 110 Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala 115 120 125 Ala Ser Ala Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Gly Tyr Gly 130 135 140 Gln Gly Gln Gly Ala 145 <210> 20 <211> 161 <212> PRT <213> Nephila clavipes <400> 20 Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Tyr Gly Arg Gly Ala Gly Ala Gly 1 5 10 15 Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly 20 25 30 Ala Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Ala Gly Ala 35 40 45 Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala 50 55 60 Gly Tyr Ser Arg Gly Gly Arg Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly 65 70 75 80 Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly 85 90 95 Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Arg Gly Ala Gly Ala Gly Ala 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly 130 135 140 Tyr Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala 145 150 155 160 Ala <210> 21 <211> 186 <212> PRT <213> Nephilengys cruentata <400> 21 Gly Ala Gly Ala Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Ser Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ser Gly Ala Ala Ala 20 25 30 Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Thr 35 40 45 Gly Gln Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 50 55 60 Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Arg Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 65 70 75 80 Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Ala Gly Gln Gly Tyr Gly Ala 85 90 95 Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Asp Gly Ala Gly Ala 100 105 110 Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Arg Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 115 120 125 Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Ala 130 135 140 Gly Gln Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala 145 150 155 160 Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Ala Gly Gln Gly Tyr Gly Ala 165 170 175 Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala 180 185 <210> 22 <211> 132 <212> PRT <213> Uloborus diversus <400> 22 Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ala Gly Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ser Ala Gly Ser 20 25 30 Ala Ile Asn Thr Gln Thr Val Thr Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ser Gln 35 40 45 Ser Ser Ala Ala Ala Thr Gly Ala Gly Tyr Gly Thr Gly Ala Gly Thr 50 55 60 Gly Ala Ser Ala Gly Ala Ala Ala Ser Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly 65 70 75 80 Gly Gln Ala Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ser Ala Arg Ala Ala 85 90 95 Gly Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser 100 105 110 Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Tyr Gly Ala 115 120 125 Gly Ala Ala Ala 130 <210> 23 <211> 198 <212> PRT <213> Uloborus diversus <400> 23 Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Arg Gly Gln Ala Gly Tyr Ile Gln Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ala Ser Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Val Gly Tyr Gly 20 25 30 Gly Gln Ala Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ser Ala Gly Ala Ala 35 40 45 Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Arg Gln Ala Gly Tyr Gly Gln Gly 50 55 60 Ala Gly Ala Ser Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Arg 65 70 75 80 Gln Ala Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ser Ala Gly Ala Ala Ala 85 90 95 Ala Gly Ala Asp Ala Gly Tyr Gly Gly Gln Ala Gly Tyr Gly Gln Gly 100 105 110 Ala Gly Ala Ser Ala Gly Ala Ala Ala Ser Gly Ala Gly Ala Gly Tyr 115 120 125 Gly Gly Gln Ala Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ser Ala Gly Ala 130 135 140 Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Leu Gly Gln Ala Gly Tyr Gly 145 150 155 160 Gln Gly Ala Gly Ala Ser Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly 165 170 175 Tyr Gly Gly Gln Ala Gly Tyr Gly Gln Gly Thr Gly Ala Ala Ala Ser 180 185 190 Ala Ala Ala Ser Ser Ala 195 <210> 24 <211> 190 <212> PRT <213> Araneus ventricosus <400> 24 Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly 1 5 10 15 Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Ala Gly Gln Gly Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Ala 35 40 45 Gly Gly Ala Gly Gln Gly Tyr Gly Ala Gly Leu Gly Gly Gln Gly Gly 50 55 60 Ala Gly Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala 65 70 75 80 Arg Gln Gly Gly Leu Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Tyr Gly Ala 85 90 95 Gly Leu Gly Gly Gln Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Ala Ala Ala Ala 100 105 110 Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu 115 120 125 Gly Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Ala Gly Gln Gly Gly 130 135 140 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly 145 150 155 160 Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly 165 170 175 Arg Gln Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 180 185 190 <210> 25 <211> 166 <212> PRT <213> Dolomedes tenebrosus <400> 25 Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gln Gly Ser Tyr Gly Gly Gln Gly Gly Tyr 1 5 10 15 Gly Gln Gly Gly Ala Gly Ala Ala Thr Ala Thr Ala Ala Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Gly Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Gly Leu Gly 35 40 45 Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 50 55 60 Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly 65 70 75 80 Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala 85 90 95 Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly 100 105 110 Gly Tyr Gly Gln Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 115 120 125 Ala Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly 130 135 140 Gly Leu Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala 145 150 155 160 Ala Ser Ala Ala Ala Ala 165 <210> 26 <211> 177 <212> PRT <213> Nephilengys cruentata <400> 26 Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly 20 25 30 Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Ala 35 40 45 Gly Gln Gly Gly Tyr Glu Gly Pro Gly Ala Gly Gln Gly Ala Gly Ala 50 55 60 Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu 65 70 75 80 Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala 85 90 95 Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala 100 105 110 Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln 115 120 125 Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Ala Ala Ala Ala Ala 130 135 140 Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gly Gln 145 150 155 160 Gly Gly Tyr Gly Arg Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 165 170 175 Ala <210> 27 <211> 174 <212> PRT <213> Nephilengys cruentata <400> 27 Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly 20 25 30 Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Ala 35 40 45 Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gln Gly Ala Gly Ala 50 55 60 Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu 65 70 75 80 Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala 85 90 95 Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly 100 105 110 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly 115 120 125 Leu Gly Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala 130 135 140 Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gly 145 150 155 160 Gln Gly Ala Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala 165 170 <210> 28 <211> 22 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 28 Met Phe Ser Leu Lys Ala Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu Val Ser 1 5 10 15 Ala Asn Gln Val Ala Ala 20 <210> 29 <211> 23 <212> PRT <213> Pichia pastoris <400> 29 Met Ser Phe Ser Ser Asn Val Pro Gln Leu Phe Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Leu Thr Asn Ile Val Ser Gly 20 <210> 30 <211> 20 <212> PRT <213> Pichia pastoris <400> 30 Met Lys Leu Ser Thr Asn Leu Ile Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ser Ala 1 5 10 15 Val Val Ser Ala 20 <210> 31 <211> 18 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 31 Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala 1 5 10 15 Leu Gly <210> 32 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 32 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Leu Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Asp Lys Arg Glu Ala Glu Ala 85 <210> 33 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 33 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala 85 <210> 34 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 34 Met Phe Ser Leu Lys Ala Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu Val Ser 1 5 10 15 Ala Asn Gln Val Ala Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu 20 25 30 Thr Ala Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu 35 40 45 Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn 50 55 60 Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu 65 70 75 80 Glu Gly Val Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala 85 90 <210> 35 <211> 93 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 35 Met Ser Phe Ser Ser Asn Val Pro Gln Leu Phe Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Leu Thr Asn Ile Val Ser Gly Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp 20 25 30 Glu Thr Ala Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu 35 40 45 Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn 50 55 60 Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys 65 70 75 80 Glu Glu Gly Val Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala 85 90 <210> 36 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Met Lys Leu Ser Thr Asn Leu Ile Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ser Ala 1 5 10 15 Val Val Ser Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala 20 25 30 Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp 35 40 45 Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu 50 55 60 Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly 65 70 75 80 Val Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala 85 90 <210> 37 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 37 Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala 1 5 10 15 Leu Gly Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln Ile 20 25 30 Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp 35 40 45 Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu Phe 50 55 60 Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser 65 70 75 80 Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala 85 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 <210> 39 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Ser Gly Ala Gly Gly 1 5 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Gly Ser Gly Ala Gly 1 5 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Gly Gly Ser Gly Ala 1 5 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic His tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> This sequence may encompass 6-8 residues <400> 42 His His His His His His His His 1 5 <210> 43 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 43 His His His His His His 1 5

Claims (54)

  1. 숙주 세포로부터 재조합 거미 실크 단백질을 단리시키는, 다음을 포함하는 방법:
    a. 재조합 거미 실크 단백질을 포함하는 불용성 덩어리를 제공하고;
    b. 이러한 불용성 덩어리에 용매를 포함하는 수성 용액을 추가하고;
    c. 이 불용성 덩어리를 포함하는 수성 용액에 전단력을 가하고, 이로 인하여 이 수성 용액내 재조합 거미 실크 단백질이 용해화된다.
  2. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 전단력은 미세유동화를 통하여 적용되는, 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 이때 상기 미세유동화로 약 6x106 s-1 ~ 10x106 s-1의 전단율이 생성되는, 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 이때 상기 미세유동화로 적어도 약 6x106 s-1의 전단율이 생성되는, 방법.
  5. 청구항 2에 있어서, 이때 상기 미세유동화로 적어도 약 10x106 s-1의 전단율이 생성되는, 방법.
  6. 청구항 2-5에 있어서, 이때 상기 미세유동화는 20,000 psi ~ 30,000 psi에서 실행되는, 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 이때 상기 미세유동화는 30,000 psi에서 실행되는, 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 이때 상기 미세유동화는 23,000 psi에서 실행되는, 방법.
  9. 상기 청구항들중 임의의 항에 있어서, 이때 상기 미세유동화기는 M-110P 또는 LM10 미세유동화기인, 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 이때 상기 미세유동화기는 G10Z 상호작용 챔버를 포함하는, 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 이때 상기 미세유동화기는 F12Y 상호작용 챔버를 포함하는, 방법.
  12. 상기 청구항들중 임의의 항에 있어서, 이때 상기 전단력은 적어도 두 차례 적용되는, 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 이때 상기 전단력은 적어도 세 차례 적용되는, 방법.
  14. 청구항 12에 있어서, 이때 상기 전단력은 적어도 두 차례 적용에서 동일한, 방법.
  15. 청구항 12에 있어서, 이때 상기 전단력은 적어도 두 차례 적용에서 상이한, 방법.
  16. 상기 청구항들중 임의의 항에 있어서, 이때 상기 불용성 덩어리는 숙주 세포를 포함하는 세포 배양물로부터 유래되며, 이때 상기 숙주 세포는 재조합 거미 실크 단백질을 발현시키는, 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 세포 배양물로부터 유래된 불용성 덩어리의 수집을 더 포함하고, 이때 상기 불용성 덩어리는 상기 재조합 거미 실크 단백질을 포함하는, 방법.
  18. 청구항 1-17중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 용매는 카오트로픽 작용제인, 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 이때 상기 카오트로픽 작용제는 우레아, 구아니딘 티오시아네이트 (GdnSCN), 또는 구아니딘 클로라이드 (GdnHCL)인, 방법.
  20. 청구항 1-19중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 불용성 덩어리는 용매 부피에 대해 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 또는 30%의 불용성 덩어리로 해당 수성 용액에 추가되는, 방법.
  21. 청구항 19 또는 20에 있어서, 이때 상기 카오트로픽 작용제는 0.1 - 10M 농도로 해당 수성 용액에 존재하는, 방법.
  22. 청구항 19 또는 20에 있어서, 이때 상기 수성 용액은 약 10M 우레아, 약 4M - 8M GdnHCl, 또는 약 3M - 6M GdnSCN을 포함하는, 방법.
  23. 청구항 19 또는 20에 있어서, 이때 상기 수성 용액은 단지 10M의 우레아를 포함하는 수성 용액, 단지 8M의 GdnHCl를 포함하는 수성 용액, 또는 단지 6M의 GdnSCN을 포함하는 수성 용액의 카오트로픽 활성을 포함하는, 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 이때 상기 카오트로픽 활성은 한천-겔화 분석을 이용하여 정량화되는, 방법.
  25. 청구항 20에 있어서, 이때 상기 수성 용액은 약 15% 불용성 부분 덩어리와 85% 부피의 3M GdnSCN를 포함하는, 방법.
  26. 청구항 20에 있어서, 이때 상기 수성 용액은 약 15% 불용성 부분 덩어리와 85% 부피의 4M GdnHCl을 포함하는, 방법.
  27. 청구항 20에 있어서, 이때 상기 수성 용액은 약 15% 불용성 부분 덩어리와 85% 부피의 10M 우레아를 포함하는, 방법.
  28. 청구항 1-27중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 불용성 덩어리는 20℃ ~ 30℃에서 항온처리되는, 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 이때 상기 불용성 덩어리는 실온에서 항온처리되는, 방법.
  30. 청구항 28에 있어서, 이때 상기 불용성 덩어리는 30℃를 넘지 않는 온도에서 항온처리되는, 방법.
  31. 청구항 1-30중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 불용성 부분은 상기 용매를 포함하는 수성 용액에서 60 ~ 120 분 동안 항온처리되는, 방법.
  32. 청구항 1-31중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 불용성 덩어리는 세포 펠렛을 포함하는, 방법.
  33. 청구항 1-32중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 세포 펠렛으로부터 유래된 불용성 덩어리의 수집은 상기 숙주 세포를 용해시키는 것을 포함하는, 방법.
  34. 청구항 33에 있어서, 이때 용해는 열 처리, 화학적 처리, 전단 파괴, 물리적 균질화, 초음파처리, 또는 화학적 균질화를 포함하는, 방법.
  35. 청구항 33 내지 34에 있어서, 이때 상기 세포 배양물의 불용성 덩어리의 수집은 제 1 세포 펠렛을 획득하기 위해, 상기 용해된 세포를 원심분리하는 것을 더 포함하는, 방법.
  36. 청구항 1-35중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 불용성 덩어리 수집 다음을 더 포함하는, 방법:
    a. 상기 세포 펠렛을 10:1의 우레아 부피 대비 펠렛 덩어리 비율에서 4M 우레아를 포함하는 용액과 항온처리하고; 그리고
    b. 4M 우레아를 포함하는 용액을 원심분리하여 제 2 세포 펠렛을 수득하고, 그 다음 상기 용매를 포함하는 수성 용액에서 제 2 세포 펠렛을 항온처리한다.
  37. 청구항 1-36중 임의의 한 항에 있어서, 상기 재조합 거미 실크 단백질을 상기 수성 용액으로 단리시키는 것을 더 포함하며, 이로 인하여 단리된 재조합 거미 실크 단백질이 생성되는, 방법.
  38. 청구항 1-37중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 재조합 거미 실크 단백질은 상당한 결정질 실크 단백질, 높은 함량의 베타 쉬트 실크 단백질, 또는 낮은 용해도 실크 단백질인, 방법.
  39. 청구항 38에 있어서, 이때 상기 재조합 거미 실크 단백질은 서열 식별 번호:23에서 제시된 울로보루스 디베르수스(Uloborus diversus) MiSP 단백질을 포함하는, 방법.
  40. 청구항 38에 있어서, 이때 상기 재조합 거미 실크 단백질은 비-카오트로픽성(non-chaotropic) 용매에서 90%, 80%, 70%, 60%, 또는 50% 미만의 용해도 임계치를 갖는, 방법.
  41. 청구항 1-40중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 세포 배양물은 곰팡이, 박테리아 또는 효모 세포를 포함하는, 방법.
  42. 청구항 1-41중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 박테리아 세포는 대장균(Escherichia coli)인, 방법.
  43. 상기 청구항들중 임의의 항에 있어서, 이때 단리된 재조합 거미 실크 단백질의 양은 ELISA를 이용하여 측정되는, 방법.
  44. 청구항 1-43중 임의의 한 항에 있어서, 이때 단리된 재조합 거미 실크 단백질의 양은 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 측정되는, 방법.
  45. 청구항 1-44중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 단리된 재조합 거미 실크 단백질은 전장의 재조합 거미 실크 단백질인, 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 이때 상기 단리된 재조합 거미 실크 단백질은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 전장의 재조합 거미 실크 단백질을 포함하는, 방법.
  47. 청구항 45에 있어서, 이때 전장의 재조합 거미 실크 단백질의 양은 ELISA를 이용하여 측정되는, 방법.
  48. 청구항 45에 있어서, 이때 전장의 재조합 거미 실크 단백질의 양은 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 측정되는, 방법.
  49. 청구항 1-48중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 단리된 재조합 거미 실크 단백질의 순도는 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 09-95%, 또는 95-100%인, 방법.
  50. 숙주 세포로부터 재조합 거미 실크 단백질을 단리시키는, 다음을 포함하는 방법:
    a. 재조합 거미 실크 단백질을 포함하는 불용성 덩어리를 제공하고;
    b. 이러한 불용성 덩어리에 용매를 포함하는 수성 용액을 추가하고, 이때 상기 수성 용액은 최종 10M 우레아 농도에서 15% (w/v) 불용성 부분을 포함하고;
    c. 전단력은 미세유동화를 통하여 상기 불용성 덩어리를 포함하는 수성 용액에 적용되고, 이로써 상기 수성 용액에서 상기 재조합 거미 실크 단백질이 용해화되며; 그리고
    d. 상기 수성 용액으로부터 상기 재조합 거미 실크 단백질을 단리시키고, 이로써 단리된 재조합 거미 실크 단백질이 생성된다.
  51. 숙주 세포로부터 재조합 거미 실크 단백질을 단리시키는, 다음을 포함하는 방법:
    a. 재조합 거미 실크 단백질을 포함하는 불용성 덩어리를 제공하고;
    b. 상기 불용성 덩어리를 수성 용액에 추가하고, 이때 상기 수성 용액은 최종 농도 10M 우레아에서 약 15% (w/v) 불용성 부분을 포함하고;
    c. 전단력은 미세유동화를 통하여 적용되며, 이때 상기 수성 용액에 적용되는 전단력은 약 10x106 s-1이며, 이로써 상기 수성 용액에서 상기 재조합 거미 실크 단백질이 용해화되며; 그리고
    d. 상기 수성 용액으로부터 상기 재조합 거미 실크 단백질을 단리시키고, 이로써 단리된 재조합 거미 실크 단백질이 생성된다.
  52. 청구항 1-51중 임의의 한 항에 따라 생성된 재조합 거미 실크 단백질을 포함하는 조성물.
  53. 청구항 52에 있어서, 이때 상기 재조합 거미 실크는 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 전장의 재조합 거미 실크를 포함하는, 조성물.
  54. 청구항 1-53중 임의의 한 항에 따라 생성된 재조합 거미 실크 단백질을 포함하는 실크 섬유.
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