KR20180029450A

KR20180029450A - 증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 속 미생물, 그를 이용하여 셀룰로스를 생산하는 방법 및 상기 미생물을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20180029450A
Application number: KR1020160117368A
Authority: KR
Inventors: 정순천; 윤지애; 강진규; 박진환
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2016-09-12
Filing date: 2016-09-12
Publication date: 2018-03-21
Also published as: US20180072985A1; CN107815435A; EP3293261A1

Abstract

증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 속 미생물, 그를 이용하여 셀룰로스를 생산하는 방법 및 상기 미생물을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 속 미생물, 그를 이용하여 셀룰로스를 생산하는 방법 및 상기 미생물을 생산하는 방법{Gluconacetobacter genus microorganism having enhanced cellulose productivity, method for producing cellulose using the same, and method for producing the microorganism}

증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 속 미생물, 그를 이용하여 셀룰로스를 생산하는 방법 및 상기 미생물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

미생물 배양을 통해 만들어진 셀룰로스는 글루코오스가 β-1,4 글루칸이라는 일차 구조로 존재하고, 이들이 여러 가닥의 피브릴(fibril)의 망상 구조를 이루고 있다. 상기 셀룰로스를 '바이오 셀룰로스 혹은 미생물 셀룰로스'라고도 한다.

이런 미생물 셀룰로스는 식물 셀룰로스와 달리 리그닌이나 헤미셀룰로스가 전혀 없는 순수한 셀룰로스 상태이며 섬유폭도 식물 셀룰로스 보다 100nm이하 수준으로 습윤성, 흡수성, 고강도, 고탄력성, 고내열 등의 특성을 가지고 있다. 이런 특성 때문에 미생물 셀룰로스는 화장품, 의료용, 식이섬유, 음향기기 진동판, 기능성 필름 등의 다양한 산업에 응용되어 개발되고 있다.

미생물 셀룰로스 생산 균주로는 Acetobacter, Agrobacteria, Rhizobia, 또는 Sarcina이 보고되고 있으며 그 중에서 특히 우수한 균주는 Komagataeibacter xylinum ('Gluconacetobacter xylinum'이라고도 함)으로 알려져 있다. 호기적 조건에서 정치 배양하면 배양액 표면에 얇은 막 형태로 3차원 망상 조직의 셀룰로스가 형성된다.

프락토스 비스포스페이트 알돌라제(FBA)는 프락토스-1,6-비스포스페이트(FBP) ⇔ 디히드록시아세톤(DHAP) + 글리세르알데히드 3-포스페이트(G3P)의 반응을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 프락토스 비스포스페이트 알돌라제는 EC 4.1.2.13에 속하는 것일 수 있다.

그러나, 상기한 종래 기술에 의하더라도 증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 재조합 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물에 대한 요구가 있다.

일 양상은 증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 속 미생물을 제공한다.

다른 양상은 상기 미생물을 이용하여 셀룰로스를 생산하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 상기 미생물을 생산하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 세포, 단백질, 또는 효소의 활성의 검출가능한 증가를 나타낼 수 있다. "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 주어진 유전적 변형 (genetic modification)을 갖지 않은 세포, 단백질, 또는 효소 (예, 본래 또는 "야생형 (wild-type)" 세포, 단백질, 또는 효소)와 같은, 동일한 타입의 비교 세포, 단백질, 또는 효소의 수준 보다 더 높은 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포, 단백질, 또는 효소의 활성을 나타낸다. "세포의 활성"이란 세포의 특정 단백질 또는 효소의 활성을 나타낸다. 예를 들면, 상기 변형된 또는 조작된 세포, 단백질, 또는 효소의 활성은 동일 타입의 조작되지 않은 세포, 단백질, 또는 효소, 예를 들면, 야생형 세포, 단백질, 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 세포 중 특정 단백질 또는 효소의 활성은 모세포, 예를 들면, 조작되지 않은 세포 중의 동일 단백질 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 단백질 또는 효소의 증가된 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다.

효소 또는 폴리펩티드의 활성 증가는 발현 증가 또는 비활성 (specific activity)의 증가에 의하여 얻을 수 있다. 상기 발현 증가는 효소 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입되거나 카피 수가 증가되거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자가 도입되는 미생물는 내재적으로 상기 유전자를 포함하는 것, 또는 포함하고 있지 않은 것일 수 있다. 상기 유전자는 그의 발현을 가능하게 하는 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 폴리 아데닐화 부위, 또는 그 조합과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 외부에서 도입되거나 또는 카피 수가 증가되는 폴리뉴클레오티드는 내인성 (endogenous) 또는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 내인성 유전자는 미생물 내부에 포함된 유전물질 상에 존재하던 유전자를 말한다. 외인성 유전자는 외부로부터 세포 내로 도입되는 유전자를 의미하며, 도입되는 유전자는 도입되는 숙주세포에 대해 동종 (homologous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. "이종성 (heterologous)"은 천연 (native)이 아닌 외인성 (foreign)을 의미할 수 있다.

용어 "카피 수 증가 (copy number increase)"는 상기 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있으며, 조작되지 않은 세포에 존재하지 않는 유전자를 유전적 조작에 의해 갖게 되는 경우도 포함한다. 상기 유전자의 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 (transient) 도입이거나 게놈에 삽입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈으로 통합됨으로써 이루어질 수 있다.

상기 유전자의 도입은 형질전환, 형질도입(transfection), 전기천공 (electroporation)과 같은 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다. 상기 유전자는 운반체 (vehicle)를 통하여 도입되거나, 그 자체로서 도입될 수 있다. 본 명세서에 있어서, "운반체"란 연결되어 있는 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 특정한 유전자의 도입을 매개하는 핵산 서열이라는 관점에서, 본 명세서에서 운반체는, 벡터, 핵산 구조체, 및 카세트와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있는 것으로 해석된다. 벡터에는 예를 들면 플라스미드 또는 바이러스 유래 벡터 등이 포함된다. 플라스미드란 추가의 DNA가 연결될 수 있는 원형의 이중가닥 DNA 고리를 포함한다. 벡터에는 예를 들면, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터, 예를 들면, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스, 또는 그 조합이 포함될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 유전자의 조작은 당업계에 공지된 분자생물학적 방법에 의할 수 있다.

용어 "모세포 (parent cell)"는 본래 세포 (original cell), 예를 들면, 조작된 미생물에 대하여 동일 타입의 유전적으로 조작되지 않은 세포를 나타낸다. 특정한 유전적 변형에 대하여, 상기 "모세포"는 상기 특정 유전적 변형을 갖지 않은 세포이지만, 다른 상황에 대하여는 동일한 것일 수 있다. 따라서, 상기 모세포는 주어진 단백질 (예를 들면, 프락토스 비스포스페이트 알돌라제와 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질)의 증가된 활성을 갖는 유전적으로 조작된 미생물을 생산하는데 출발 물질 (starting material)로 사용된 세포일 수 있다. 동일한 비교가 다른 유전적 변형에도 적용된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)의 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

본 명세서에 있어서 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가 또는 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드가 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN(NCBI), BLASTP(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign^TM (DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다. 본 명세서에서 달리 언급이 없으면 상기 프로그램을 실행하는데 사용되는 파라미터의 선택은 아래와 같을 수 있다: Ktuple=2, Gap Penalty=4, 및 Gap length penalty=12.

여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어서 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유전적 변형 (genetic modification)"이란 세포의 유전물질의 구성 또는 구조를 인위적으로 변경시키는 것을 포함한다.

본 명세서에 있어서, %은 달리 언급이 없으면 w/w%를 나타낸다.

일 양상은 프락토스 비스포스페이트 알돌라제(FBA)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 재조합 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물을 제공한다.

프락토스 비스포스페이트 알돌라제는 프락토스-1,6-비스포스페이트(FBP) ⇔ 디히드록시아세톤(DHAP) + 글리세르알데히드 3-포스페이트(G3P)의 반응을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 프락토스 비스포스페이트 알돌라제는 EC 4.1.2.13에 속하는 것일 수 있다. 상기 프락토스 비스포스페이트 알돌라제는 외래 또는 내재적인 것일 수 있다. 상기 프락토스 비스포스페이트 알돌라제는 단일 폴리펩티드로 구성된 모노머 형태일 수 있다. 상기 프락토스 비스포스페이트 알돌라제는 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속, Bacillus 속, Mycobacterium 속, Zymomonas 속, Vibrio 속, 및 Escherichia 속 유래의 프락토스 비스포스페이트 알돌라제로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.

상기 프락토스 비스포스페이트 알돌라제는 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드인 것일 수 있다.

상기 미생물에 있어서, 상기 유전적 변형은 프락토스 비스포스페이트 알돌라제를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 프락토스 비스포스페이트 알돌라제 유전자의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 프락토스 비스포스페이트 알돌라제를 코딩하는 유전자가 도입된 것, 예를 들면 벡터와 같은 비히클을 통하여 도입된 것일 수 있다. 상기 프락토스 비스포스페이트 알돌라제를 코딩하는 유전자는 염색체 내 또는 염색체 외에 존재할 수 있다. 도입된 프락토스 비스포스페이트 알돌라제를 코딩하는 유전자는 복수 개, 예를 들면, 2이상, 5이상, 10이상, 10이상, 50이상, 100이상, 또는 1000이상일 수 있다.

상기 미생물은 Gluconacetobacter 속, 예를 들면, G. aggeris , G. asukensis, G. azotocaptans , G. diazotrophicus , G. entanii , G. europaeus , G. hansenii, G. intermedius , G. johannae , G. kakiaceti , G. kombuchae , G. liquefaciens, G. maltaceti , G. medellinensis , G. nataicola , G. oboediens , G. rhaeticus, G. sacchari , G. saccharivorans , G. sucrofermentans , G. swingsii , G. takamatsuzukensis , G. tumulicola , G. tumulisoli , 또는 G. xylinus("Komagataeibacter xylinus"라고도 한다)일 수 있다.

상기 미생물은 글루코스-6-포스페이트를 글루코스-1-포스페이트로 전환하는 것을 촉매하는 포스포글루코뮤타제(phosphoglucomutase)(PGM)의 활성을 증가시키는 유전적 변형, 글루코스-1-포스페이트를 UDP-글루코스로 전환하는 것을 촉매하는 UTP-글루코스-1-포스페이트 우리딜릴트란스퍼라제(UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase)(UPG)의 활성을 증가시키는 유전적 변형, 및 UDP-글루코스를 셀룰로스로 전환하는 것을 촉매하는 셀룰로스 신타제(cellulose synthase)(CS)의 활성을 증가시키는 유전적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전적 변형을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 미생물은 글루코스-6-포스페이트를 글루코스-1-포스페이트로 전환하는 것을 촉매하는 포스포글루코뮤타제를 코딩하는 유전자, 글루코스-1-포스페이트를 UDP-글루코스로 전환하는 것을 촉매하는 UTP-글루코스-1-포스페이트 우리딜릴트란스퍼라제를 코딩하는 유전자, 및 UDP-글루코스를 셀룰로스로 전환하는 것을 촉매하는 셀룰로스 신타제를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 카피 수가 증가된 것일 수 있다.

상기 미생물은 서열번호 4의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖고 포스포글루코뮤타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 서열번호 6의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖고 UTP-글루코스-1-포스페이트 우리딜릴트란스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 카피 수가 증가된 것일 수 있다. 상기 미생물은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자, 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 카피 수가 증가된 것일 수 있다.

다른 양상은 상기한 프락토스 비스포스페이트 알돌라제의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 재조합 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물을 배지 중에서 배양하여 셀룰로스를 생성하는 단계; 및 상기 배양물로부터 상기 셀룰로스를 회수하는 단계를 포함하는 셀룰로스를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 프락토스 비스포스페이트 알돌라제의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 재조합 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물을 배지 중에서 배양하여 셀룰로스를 생성하는 단계를 포함한다. 상기한 재조합 글루콘아세토박터 속 미생물에 대하여는 상기한 바와 같다.

상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 미생물 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다.

상기 배양에 선택되는 산물에 따라 특정한 미생물의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다. 상기 배지는 0.5 % 내지 3%(v/v)의 에탄올을 포함할 수 있다.

상기 배양의 조건은 선택되는 산물, 예를 들면, 셀룰로스 생산에 적합하게 적절히 조절될 수 있다. 상기 배양은 세포 증식을 위하여 호기성 조건에서 이루어질 수 있다. 상기 배양은 교반 없이 정치 배양 (static culture)하는 것일 수 있다. 상기 배양은 상기 미생물의 농도가 저농도에서 배양하는 것일 있다. 상기 미생물의 농도는 셀룰로스의 분비에 방해가 되지 않는 정도의 간격이 주어지도록 하는 농도일 수 있다.

용어, "배양 조건"은 미생물을 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 미생물이 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함할 수 있다. 상기 탄소원은 자화가능한 당으로서, 글루코스, 프락토스, 만노스, 또는 갈락토스를 포함할 수 있다. 상기 질소원은 유기 질소 화합물, 또는 무기 질소 화합물일 수 있다. 상기 질소원은 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염 일 수 있다. 미생물을 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1% 내지 10%의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건이 있다. 대사 경로는 미생물이 실제로 이용 가능한 탄소원 및 질소원에 맞추어 수정될 수 있다.

상기 방법은 상기 배양물로부터 상기 셀룰로스를 회수하는 단계;를 포함한다. 상기 분리는 예를 들면 배지 상단에 형성된 셀룰로스 박막(cellulose pellicle)을 회수하는 것일 수 있다. 상기 셀룰로스 박막은 물리적으로 걷어내거나 배지를 제거함으로써 회수될 수 있다. 상기 분리는 셀룰로스 박막의 모양을 훼손시키지 않고 유지한 채로 회수하는 것일 수 있다.

다른 양상은 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물에 프락토스 비스포스페이트 알돌라제(fructose bisphosphate aldolase:FBA)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 도입하는 단계를 포함하는, 셀룰로스 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 글루콘아세토박터 속 미생물에 프락토스 비스포스페이트 알돌라제를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는, 셀룰로스 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법일 수 있다. 프락토스 비스포스페이트 알돌라제를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계는 상기 유전자를 포함하는 비히클을 상기 미생물에 도입하는 것일 수 있다. 상기 방법에 있어서, 상기 유전적 변형은 상기 유전자를 증폭하는 것, 상기 유전자의 조절 서열을 조작하는 것, 또는 상기 유전자 자체의 서열을 조작하는 것을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조작은 뉴클레오티드의 삽입, 치환, 전환 또는 부가인 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 미생물에 글루코스-6-포스페이트를 글루코스-1-포스페이트로 전환하는 것을 촉매하는 포스포글로뮤타제(phosphoglucomutase)의 활성을 증가시키는 유전적 변형, 글루코스-1-포스페이트를 UDP-글루코스로 전환하는 것을 촉매하는 UTP-글루코스-1-포스페이트 우리딜릴트란스퍼라제(UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase)의 활성을 증가시키는 유전적 변형, 및 UDP-글루코스를 셀룰로스로 전환하는 것을 촉매하는 셀룰로스 신타제(cellulose synthase)의 활성을 증가시키는 유전적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전적 변형을 도입하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 유전적 변형을 도입하는 단계는 서열번호 4의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖고 포스포글루코뮤타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 서열번호 6의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖고 UTP-글루코스-1-포스페이트 우리딜릴트란스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형을 도입하는 단계는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자, 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다.

일 양상에 따른 증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 재조합 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물에 의하면, 셀룰로스를 고효율로 생산하는데 사용할 수 있다.

다른 양상에 따른 셀룰로스를 생산하는 방법에 의하면, 셀룰로스를 효율적으로 생산할 수 있다.

다른 양상에 따른 셀룰로스 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법에 의하면, 셀룰로스 생산능이 증가된 미생물을 효율적으로 제조할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 프락토스 비스포스페이트 알돌라제 유전자를 포함하는 K. xylinus 의 제작 및 셀룰로스의 생산

본 실시예에서는 K. xylinus DSM2325에 외래 또는 내재적 프락토스 비스포스페이트 알돌라제 (FBA) 유전자를 도입하고 상기 유전자가 도입된 미생물을 배양하여 셀룰로스를 생산함으로써, 상기 유전자의 도입이 셀룰로스 생산능에 미치는 영향을 확인하였다.

1. 프락토스 비스포스페이트 알돌라제 유전자의 도입

K.xylinus DSM2325 M9 균주에 K. xylinus DSM2325 GX_1979 유전자 즉, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 도입하였다. 구체적인 도입 과정은 다음과 같다.

(1) 벡터의 제작

pTSa-EX1 벡터(서열번호 11)를 주형으로 하고 F1-F (서열번호 7) 및 F1-R (서열번호 8) 프라이머와 F2-F(서열번호 9) 및 F2-R(서열번호 10) 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여, 각각 1.9kb 및 0.3kb의 PCR 산물을 얻었다. 이 PCR 산물은 벡터의 서열로부터 점 변이(point mutation)을 갖는 것으로 하나의 제한 효소 부위가 제거된 것이다. 이 PCR 산물을 pTSa-EX1 벡터의 BamHI/SalI 제한효소 위치에 In-Fusion GD cloning kit (Takara)를 사용하여 클로닝하여 pTSa-EX11 벡터를 제작하였다.

다음으로, 프락토스 비스포스페이트 알돌라제 GX_1979 유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)은 K. xylinus DSM2325 M9 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머 세트를 프라이머로 이용한 PCR을 수행한 후 겔 추출(gel extraction)을 통해 확보하였다.

상기 유전자의 ORF는 pTSa-EX11 벡터의 SalI 제한효소 위치에 In-Fusion GD cloning kit (Takara)를 사용하여 클로닝하여 과발현 벡터 pTSa-GX1979를 제작하였다.

(2) 형질도입

K. xylinus DSM2325 M9 균주를 2% 글루코스가 첨가된 HS-아가 배지 함유 플레이트에 도말(spreading)한 후 30°C에서 3일간 배양하였다. 이렇게 배양된 균주를 멸균수 2ml를 플러싱하여 콜로니를 풀링하고 이를 50 ml falcon tube로 옮긴 후 2 분 동안 보르텍스(vortex)를 수행하였다. 2% 글루코스 함유 HS 배지-아가 배지는 펩톤 0.5%, 효모추출물(yeast extract) 0.5%, Na₂HPO₄ 0.27%, 시트르산 0.15%, 글루코스 2%, 및 1.5% 박터-아가를 포함한다. 그 후 1% 셀룰라제 (sigma, Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921)를 첨가한 후 30°C, 및 160 rpm에서 2시간 동안 반응시킨 후 1 mM HEPES 버퍼 함유 배지로 세척한 후 15(w/w)% 글리세롤로 3번 세척한 후 1ml 15(w/w)% 글리세롤에 재현탁하였다.

이렇게 제작된 능력세포(competent cell) 100ul를 2mm electro-cuvette에 옮긴 후 3ug pTSa-GX1979 플라스미드를 첨가한 후 전기천공(electroporation)(2.4 kV, 200Ω, 25μF)을 통해 형질도입(transformation)하였다. 형질도입된 세포를 2% 글로코스 함유 1 ml HS 배지에 재현탁한 후 14ml round-tube로 옮긴 후 30°C, 160 rpm에서 2시간 동안 배양한 후, 2% 글루코스, 1(v/v)% 에탄올, 및 5 ug/ml 테트라시클린이 첨가된 HS-아가 배지 함유 플레이트에 도말한 후 30°C에서 5일 동안 배양하였다.

(3) 글루코스 소모량 및 셀룰로스 생산량의 확인

(2)에서 배양된 균주를 5% 글루코스, 1% 에탄올, 및 5ug/ml 테트라시클린이 첨가된 25 ml HS 배지를 함유한 250ml 플라스크(flask)에 접종하고 30°C, 230 rpm에서 5일 동안 배양하였다. 그 결과, 셀룰로스(이하 "셀룰로스 나노섬유(CNF)"라고도 한다)가 배지와 공기가 접하는 표면에 생성되었다. 이렇게 생성된 CNF는 60°C에서 0.1N NaOH 및 증류수를 사용하여 세척한 후 동결건조를 통해 H₂O를 제거한 후 무게를 측정하였다.

글루코스와 글루코네이트는 Aminex HPX-87H 컬럼 (Bio-Rad, USA)이 장착된 HPLC 분석을 통해 분석하였다. 표 1은 Fba 유전자가 도입된 K. xylinus 균주의 CNF 생산량, 수율, 글루코네이트 수율 및 글루코스 소모량을 나타낸다.

균주	CNF 생산(g/L)	CNF 수율(g/g)	글루코네이트 수율(g/g)	글루코스 소모량(g/L)
pTSa-EX1	1.36	0.07	1.16	18.9
pTSa-GX1979	1.96	0.07	0.99	27.1

표 1에서 pTSa-EX1는 pTSa-EX1 벡터를 포함하는 K.xylinu로서 대조군 균주이며, pTSa-GX1979는 pTSa-GX1979 벡터를 포함한 K.xylinus로서 실험 균주이다. 표 1에 나타낸 바와 같이, FBA GX_1979 유전자가 도입된 K. xylinus 균주의 경우 pTSa-EX1이 도입된 대조군 균주 대비 43.6% CNF 생산이 증가하였다. 표 1에서 수율은 CNF g/글루코스 g 또는 글루코네이트 g/글루코스 g을 나타낸다. 표 1에 나타낸 바와 같이, CNF 수율은 실험군과 대조군이 각각 유사하였다. 대조군 대비 실험군의 글루코네이트 수율이 25% 감소하였다. 또한, 대조군 대비 실험군의 글루코스 소모량이 43.0% 증가하였다. 글루코스 소모량은 글루코스 g/배지 1L를 나타낸다.

실시예 2: 포스포글루코뮤타제 유전자 또는 UTP- 글루코스 -1- 포스페이트 우리 딜릴트란스퍼라제 유전자의 도입

포도당생성(gluconeogenesis)을 통해 생산된 글루코스-6-포스페이트는 포스포글루코뮤타제(이하 "PGM"이라고도 한다) 및 UTP-글루코스-1-포스페이트 우리딜릴트란스퍼라제(이하 "UGP"라고도 한다) 효소에 의하여 셀룰로스 신타제의 기질인 UTP-글루코스로 전환된다. 본 실시예에서는 K. xylinus DSM2325 M9 균주 유래의 PGM 유전자 또는 UGP 유전자가 K.xylinus에 도입하고, 셀룰로스 생산에 미치는 영향을 확인하였다.

(1) 벡터의 제작

PGM GX_1215 유전자(서열번호 3), 및 UGP GX_2556 유전자(서열번호 5)의 오픈 리딩 프레임은 K. xylinus DSM2325 M9 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 14와 15, 및 서열번호 16와 17의 세트를 프라이머로 이용하여 PCR을 수행한 후 겔 추출을 통해 확보하였다. 이렇게 얻어진 각 유전자의 ORF는 pTSa-EX11 벡터의 SalI 제한효소 위치에 In-Fusion GD cloning kit (Takara)를 사용하여 클로닝하여 과발현 벡터를 제작하였다. 이하 이들 벡터를 각각 pTSa-GX1215 및 pTSa-GX2556 벡터라 한다.

(2) 형질도입

K. xylinus DSM2325 M9 균주를 2% 글루코스가 첨가된 HS-아가 배지 함유 플레이트에 도말(spreading)한 후 30°C에서 3일간 배양하였다. 이렇게 배양된 균주를 멸균수 2ml를 플러싱하여 콜로니를 풀링하고 이를 50 ml falcon tube로 옮긴 후 2 분 동안 보르텍스를 수행하였다. 2% 글루코스 함유 HS 배지-아가 배지는 펩톤 0.5%, 효모추출물(yeast extract) 0.5%, Na₂HPO₄ 0.27%, 시트르산 0.15%, 글루코스 2%, 및 1.5% 박터-아가를 포함한다. 그 후 1% 셀룰라제 (sigma, Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921)를 첨가한 후 30°C, 및 160 rpm에서 2시간 동안 반응시킨 후 1 mM HEPES 버퍼 함유 배지로 세척한 후 15(w/w)% 글리세롤로 3번 세척한 후 1ml 15(w/w)% 글리세롤에 재현탁하였다.

이렇게 제작된 능력세포(competent cell) 100ul를 2mm electro-cuvette에 옮긴 후 3ug pTSa-GX1215 또는 pTSa-GX2556 플라스미드를 첨가한 후 전기천공(electroporation)(2.4 kV, 200Ω, 25μF)을 통해 형질도입(transformation)하였다. 형질도입된 세포를 2% 글로코스 함유 1 ml HS 배지에 재현탁한 후 14ml round-tube로 옮긴 후 30°C, 160 rpm에서 2시간 동안 배양한 후, 2% 글루코스, 1(v/w)% 에탄올, 및 5 ug/ml 테트라시클린이 첨가된 HS-아가 배지 함유 플레이트에 도말한 후 30°C에서 5일 동안 배양하였다.

(3) 글루코스 소모량 및 셀룰로스 및 글루코네이트 생산량의 확인

글루코스와 글루코네이트는 HPLC 분석을 통해 분석하였다. 표 4는 PGM 유전자 및 UGP 유전자가 각각 도입된 K. xylinus 균주의 CNF 및 글루코네이트 생산, 글루코스 소모량을 나타낸다.

균주	CNF 생산(g/L)	글루코네이트생산(g/L)	클루코스 소모량(g/L)	CNF 수율(g/g)	글루코네이트 수율(g/g)
pTSa-EX1	1.61	25.14	26.83	0.06	0.94
pTSa-GX1215	1.82	25.25	26.39	0.07	0.96
pTSa-GX2556	2.10	29.22	34.47	0.06	0.85

표 4에서 pTSa-EX1는 pTSa-EX1 벡터를 포함하는 K.xylinus는 대조군 균주이며, pTSa-GX1215은 pTSa-GX1215 벡터를 포함한 K.xylinus, 및 pTSa-GX2556는 pTSa-GX2556 벡터를 포함한 K.xylinus로서 실험 균주이다. 표 4에 나타낸 바와 같이, PGM 유전자 및 UGP 유전자가 도입된 균주는 대조군 대비 CNF 생산이 13.0% 및 30.4% 증가하였다.

<110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> Gluconacetobacter genus microorganism having enhanced cellulose productivity, method for producing cellulose using the same, and method for producing the microorganism <130> PN114710KR <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 362 <212> PRT <213> Gluconacetobacter xylinus DSM2325 M9 <400> 1 Met Ala His Ser Ala Arg Pro Ser Leu Pro Pro Gly Val Val Thr Gly 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Arg Lys Leu Val Ala Thr Cys Cys Ser Glu Gly Tyr Ala 20 25 30 Leu Pro Ala Val Asn Val Val Gly Thr Asp Ser Ile Asn Ala Val Leu 35 40 45 Glu Ala Ala Ala Arg Asn Arg Ser Asp Val Ile Ile Gln Met Ser Asn 50 55 60 Gly Gly Ala Arg Phe Tyr Ala Gly Glu Gly Met Lys Asp Gln His Arg 65 70 75 80 Ala Arg Val Leu Gly Ala Val Ala Ala Ala Arg His Val His Thr Leu 85 90 95 Ala Ala Ala Tyr Gly Val Cys Val Ile Leu His Thr Asp His Ala Asp 100 105 110 Arg Lys Leu Leu Pro Trp Val Ser Asp Leu Ile Asp Glu Ser Glu Ala 115 120 125 Ala Val His Ala Thr Gly Gln Pro Leu Phe Ser Ser His Met Ile Asp 130 135 140 Leu Ser Ala Glu Pro Leu Asp Asp Asn Ile Ala Glu Cys Ala Arg Phe 145 150 155 160 Leu Arg Arg Met Ala Pro Leu Gly Ile Gly Leu Glu Ile Glu Leu Gly 165 170 175 Val Thr Gly Gly Glu Glu Asp Gly Ile Gly His Asp Leu Asp Asp Gly 180 185 190 Ala Asp Asn Ala His Leu Tyr Thr Gln Pro Ala Asp Val Leu Arg Ala 195 200 205 Tyr Asn Glu Leu Ser Pro Leu Gly Phe Val Thr Ile Ala Ala Ser Phe 210 215 220 Gly Asn Val His Gly Val Tyr Ala Pro Gly Asn Val Lys Leu Arg Pro 225 230 235 240 Glu Ile Leu Leu His Ser Gln Gln Ala Val Ser Glu Ala Thr Gly Gln 245 250 255 Gly Glu Arg Pro Leu Ala Leu Val Phe His Gly Gly Ser Gly Ser Glu 260 265 270 Gln Arg Gln Ile Ala Glu Ala Val Ser Tyr Gly Val Phe Lys Met Asn 275 280 285 Ile Asp Thr Asp Ile Gln Phe Ala Phe Ala Glu Gly Val Gly Gly Tyr 290 295 300 Val Leu Glu Asn Pro Glu Ala Phe Arg His Gln Ile Ser Pro Ser Thr 305 310 315 320 Gly Lys Pro Leu Lys Lys Val Tyr Asp Pro Arg Lys Trp Leu Arg Val 325 330 335 Gly Glu Asn Ser Ile Val Ser Arg Leu Asp Gln Thr Phe Ala Asp Leu 340 345 350 Gly Ala Thr Gly Arg Thr Val Ala Ser Ser 355 360 <210> 2 <211> 921 <212> DNA <213> Gluconacetobacter xylinus DSM2325 M9 <400> 2 atgacactga caccgcgggt caaggcaatc cttgaccact acgaaagtga cacgccgggc 60 accaaggcca atctctaccg gctcatgaac accggcaagc tcgcgggtac cggcaagctg 120 gtgatcctgc cggttgacca gggcttcgag cacgggccag gccgctcgtt tgcccccaac 180 ccgcccgcct atgacccgca ttatcactac tcgctggcca tcgaggcggg gctgaacgca 240 ttcgcagccc cgctgggcat gcttgaggcc ggggccggca cgtttgccgg ccagatcccc 300 accattctca aatgcaacag ttccaacagc ctgaccacgc agaagaacca ggccgtgacc 360 ggtacggtcg ccgatgcgct gcggctgggc tgctctgcca tcgggtttac catctacccc 420 gccagcgact accagttcca ccagatggag caactgcgcg agatggcacg cgaggccaag 480 aatgcagggc ttgccgtggt ggtgtggagc tacccgcgtg gcccgatgct cgacaaggcg 540 ggcgagacgg ccatcgacat ctgcgcctat gccgcccata tcgccgccga actcggtgcc 600 cacatcatca aggtcaagcc cccgaccgag gatctgtgcc tgcccgcggc caagaaggtc 660 tatatcgatg agaaggtcga tatcgccacc ctgcccgcgc gaatccacca tgtggtgcag 720 tcggcctttg cgggccgccg catagtgatc ttctcgggtg gcgagcacac caccaccgag 780 cacctgctcg acaccattcg cggcatccat cagggtggcg ggttcggttc gatcatcggg 840 cgcaacacct tccagcgccc acgggccgaa gccctgaagc tgcttggtga cattaccgac 900 atcttcctcc agaaggtctg a 921 <210> 3 <211> 1359 <212> DNA <213> K. xylinus DSM2325 M9 <400> 3 atggtaaaaa caagaaagct gtttggcact gatggcattc ggggcatggc caaccgcttt 60 cccatgacgg tggaagtcgc gcagaagctg ggccaggccg cgggcctgcg cttcatacag 120 ggcacgcacc gccatagcgt gctgctgggc aaggatacgc gcctgtcggg ctatatgatc 180 gaatgcgcgc tggtgtcggg cttcctttcc gccggaatgg acgtgacgct ggtggggccg 240 atgcccaccc cggccattgc catgctcacc cgttccctgc gcgccgatct gggcgtcatg 300 atctcggcgt cgcacaatcc gtatggcgat aacggcatca agctgttcgg ccctgacggg 360 ttcaagctct ccgatgaaac ggaagcgggt attgaagcgg caatgagcga ggacctgacc 420 catatgctcg ccgcccccga ccagatcggc cgggcctcgc gccttaatga cgcggcgggc 480 cggtacgtgg aaagcgccaa gtcctccttc ccccgccgcc tgcggcttga cgggctgcgc 540 atcgtaatcg actgcgccaa cggggcggcc tatcgcgtgg cgcccacggc attgtgggaa 600 ctcggtgcgg aagtggtgcg cataggctgc gaccctgatg gcatcaacat caatgaaggc 660 tgcggctcca cccgccccga ggccctgtgt gctgccgtgc agcgccaccg ggccgatatc 720 ggcatcgccc tcgatggcga tgccgaccgc gtgctgattt ctgatgaaaa gggccgcctg 780 atcgatggcg accagatcct ggcgctgatc tcgcattcat gggcgcggca ggggcggctg 840 tcggggcggc atatcgtggc caccgtcatg tccaacatgg ggcttgagcg ctatctcgag 900 acacaggggc tggaactggt gcgcacggcg gtgggcgatc gctacgtggt ggaaaaaatg 960 cgcgagcttg gcgccaatat cggtggcgag cagtcagggc atatggtgct gtcggatttc 1020 gccaccacgg gcgacgggct ggtggcagcc ctgcaggtac tggctgaagt ggtggagtcc 1080 ggtcgccctg caagcgaggt gtgccgcatg ttcaagccct acccgcaact gctgcgcaac 1140 gtgcgctttg ccgggcgcag cccgttgcat gacccgcagg tgcatgacgc gcgcaaggcg 1200 gcggaaaagc ggctgggcgc gcgcgggcga ctcgtgttgc gtgaaagcgg caccgaaccg 1260 ctggtgcgcg tcatggcgga agccgaggac gaagcgctgg tcaatgcggt ggtcgatgac 1320 atgtgcgagg cgattaccgc catccagatg gcgggctga 1359 <210> 4 <211> 452 <212> PRT <213> K. xylinus DSM2325 M9 <400> 4 Met Val Lys Thr Arg Lys Leu Phe Gly Thr Asp Gly Ile Arg Gly Met 1 5 10 15 Ala Asn Arg Phe Pro Met Thr Val Glu Val Ala Gln Lys Leu Gly Gln 20 25 30 Ala Ala Gly Leu Arg Phe Ile Gln Gly Thr His Arg His Ser Val Leu 35 40 45 Leu Gly Lys Asp Thr Arg Leu Ser Gly Tyr Met Ile Glu Cys Ala Leu 50 55 60 Val Ser Gly Phe Leu Ser Ala Gly Met Asp Val Thr Leu Val Gly Pro 65 70 75 80 Met Pro Thr Pro Ala Ile Ala Met Leu Thr Arg Ser Leu Arg Ala Asp 85 90 95 Leu Gly Val Met Ile Ser Ala Ser His Asn Pro Tyr Gly Asp Asn Gly 100 105 110 Ile Lys Leu Phe Gly Pro Asp Gly Phe Lys Leu Ser Asp Glu Thr Glu 115 120 125 Ala Gly Ile Glu Ala Ala Met Ser Glu Asp Leu Thr His Met Leu Ala 130 135 140 Ala Pro Asp Gln Ile Gly Arg Ala Ser Arg Leu Asn Asp Ala Ala Gly 145 150 155 160 Arg Tyr Val Glu Ser Ala Lys Ser Ser Phe Pro Arg Arg Leu Arg Leu 165 170 175 Asp Gly Leu Arg Ile Val Ile Asp Cys Ala Asn Gly Ala Ala Tyr Arg 180 185 190 Val Ala Pro Thr Ala Leu Trp Glu Leu Gly Ala Glu Val Val Arg Ile 195 200 205 Gly Cys Asp Pro Asp Gly Ile Asn Ile Asn Glu Gly Cys Gly Ser Thr 210 215 220 Arg Pro Glu Ala Leu Cys Ala Ala Val Gln Arg His Arg Ala Asp Ile 225 230 235 240 Gly Ile Ala Leu Asp Gly Asp Ala Asp Arg Val Leu Ile Ser Asp Glu 245 250 255 Lys Gly Arg Leu Ile Asp Gly Asp Gln Ile Leu Ala Leu Ile Ser His 260 265 270 Ser Trp Ala Arg Gln Gly Arg Leu Ser Gly Arg His Ile Val Ala Thr 275 280 285 Val Met Ser Asn Met Gly Leu Glu Arg Tyr Leu Glu Thr Gln Gly Leu 290 295 300 Glu Leu Val Arg Thr Ala Val Gly Asp Arg Tyr Val Val Glu Lys Met 305 310 315 320 Arg Glu Leu Gly Ala Asn Ile Gly Gly Glu Gln Ser Gly His Met Val 325 330 335 Leu Ser Asp Phe Ala Thr Thr Gly Asp Gly Leu Val Ala Ala Leu Gln 340 345 350 Val Leu Ala Glu Val Val Glu Ser Gly Arg Pro Ala Ser Glu Val Cys 355 360 365 Arg Met Phe Lys Pro Tyr Pro Gln Leu Leu Arg Asn Val Arg Phe Ala 370 375 380 Gly Arg Ser Pro Leu His Asp Pro Gln Val His Asp Ala Arg Lys Ala 385 390 395 400 Ala Glu Lys Arg Leu Gly Ala Arg Gly Arg Leu Val Leu Arg Glu Ser 405 410 415 Gly Thr Glu Pro Leu Val Arg Val Met Ala Glu Ala Glu Asp Glu Ala 420 425 430 Leu Val Asn Ala Val Val Asp Asp Met Cys Glu Ala Ile Thr Ala Ile 435 440 445 Gln Met Ala Gly 450 <210> 5 <211> 900 <212> DNA <213> K. xylinus DSM2325 M9 <400> 5 atgagcgaac acggtagcgc aaagccgacc aagggcattc ttctggctgg cgggtcgggc 60 acgcgcctgc accccatgac actggcagtc agcaagcagt tgctgccggt ctatgacaag 120 ccgatgatct tctacccgct ttccacgctc atgctggcgg ggatacgcga tatcatgatc 180 atttccaccc cggccgacct gccgctgttc cgcaggctgc tcggcgatgg ggcggatatg 240 ggtgttacct tcacctaccg cgagcagccc gcgcccgatg gtattgccca ggcttttgtc 300 attgccgatg actggctgga tgattcgccg tgcgggctta ttctgggtga taacctgatc 360 tttgccgacc atctgggcaa gcagatgcgt gcagccgcca cccggccaag cggggccacc 420 gtttttgcct atcaggtgcg tgaccccgag cgttatggcg tggtaagttt tggcgaggac 480 gggcatgcaa tcgatattgt tgaaaaaccc accgaaccca agtcaaactg ggcagtaacg 540 gggctgtatt tttatgatgg tcgcgtgcgt gaatatgcgc gcagcctcag gccctcgccg 600 cgtggcgaac tggaaattac cgacctgaac cgcctttacc tgcagtcgga tgaactgcat 660 gtgcagcgcc ttggccgcgg ctgtgcgtgg cttgatgccg gcatgcccga cagcctgatg 720 caggccgggc agttcgtgca gaccatccag tcccggcagg ggctgctcgt tggctcgccg 780 catgaggtgg ccttccgcat ggggttcatt gatgccgcgg ggcttgaagc ctatgccagg 840 cgcatgatca agaccgaact gggccaggcg ctcatggcca ttgcccatgg cgagggataa 900 900 <210> 6 <211> 299 <212> PRT <213> K. xylinus DSM2325 M9 <400> 6 Met Ser Glu His Gly Ser Ala Lys Pro Thr Lys Gly Ile Leu Leu Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Thr Arg Leu His Pro Met Thr Leu Ala Val Ser Lys 20 25 30 Gln Leu Leu Pro Val Tyr Asp Lys Pro Met Ile Phe Tyr Pro Leu Ser 35 40 45 Thr Leu Met Leu Ala Gly Ile Arg Asp Ile Met Ile Ile Ser Thr Pro 50 55 60 Ala Asp Leu Pro Leu Phe Arg Arg Leu Leu Gly Asp Gly Ala Asp Met 65 70 75 80 Gly Val Thr Phe Thr Tyr Arg Glu Gln Pro Ala Pro Asp Gly Ile Ala 85 90 95 Gln Ala Phe Val Ile Ala Asp Asp Trp Leu Asp Asp Ser Pro Cys Gly 100 105 110 Leu Ile Leu Gly Asp Asn Leu Ile Phe Ala Asp His Leu Gly Lys Gln 115 120 125 Met Arg Ala Ala Ala Thr Arg Pro Ser Gly Ala Thr Val Phe Ala Tyr 130 135 140 Gln Val Arg Asp Pro Glu Arg Tyr Gly Val Val Ser Phe Gly Glu Asp 145 150 155 160 Gly His Ala Ile Asp Ile Val Glu Lys Pro Thr Glu Pro Lys Ser Asn 165 170 175 Trp Ala Val Thr Gly Leu Tyr Phe Tyr Asp Gly Arg Val Arg Glu Tyr 180 185 190 Ala Arg Ser Leu Arg Pro Ser Pro Arg Gly Glu Leu Glu Ile Thr Asp 195 200 205 Leu Asn Arg Leu Tyr Leu Gln Ser Asp Glu Leu His Val Gln Arg Leu 210 215 220 Gly Arg Gly Cys Ala Trp Leu Asp Ala Gly Met Pro Asp Ser Leu Met 225 230 235 240 Gln Ala Gly Gln Phe Val Gln Thr Ile Gln Ser Arg Gln Gly Leu Leu 245 250 255 Val Gly Ser Pro His Glu Val Ala Phe Arg Met Gly Phe Ile Asp Ala 260 265 270 Ala Gly Leu Glu Ala Tyr Ala Arg Arg Met Ile Lys Thr Glu Leu Gly 275 280 285 Gln Ala Leu Met Ala Ile Ala His Gly Glu Gly 290 295 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer F1-F <400> 7 cggcgtagag gatcaggagc ttatcgactg cac 33 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer F1-R <400> 8 ccggcgtaga gaatccacag gacgggtg 28 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer F2-F <400> 9 ctgtggattc tctacgccgg acgcatc 27 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer F2-R <400> 10 aagggcatcg gtcgtcgctc tcccttatg 29 <210> 11 <211> 3128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pTSa-EX1 vector <400> 11 gaattcagcc agcaagacag cgatagaggg tagttatcca cgtgaaaccg ctaatgcccc 60 gcaaagcctt gattcacggg gctttccggc ccgctccaaa aactatccac gtgaaatcgc 120 taatcagggt acgtgaaatc gctaatcgga gtacgtgaaa tcgctaataa ggtcacgtga 180 aatcgctaat caaaaaggca cgtgagaacg ctaatagccc tttcagatca acagcttgca 240 aacacccctc gctccggcaa gtagttacag caagtagtat gttcaattag cttttcaatt 300 atgaatatat atatcaatta ttggtcgccc ttggcttgtg gacaatgcgc tacgcgcacc 360 ggctccgccc gtggacaacc gcaagcggtt gcccaccgtc gagcgccagc gcctttgccc 420 acaacccggc ggccggccgc aacagatcgt tttataaatt tttttttttg aaaaagaaaa 480 agcccgaaag gcggcaacct ctcgggcttc tggatttccg atcacctgta agtcggacgc 540 gatgcgtccg gcgtagagga tccggagctt atcgactgca cggtgcacca atgcttctgg 600 cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg tcgtaaatca ctgcataatt 660 cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt ttgcgccgac atcataacgg 720 ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc atcggctcgt ataatgtgtg 780 gaattgtgag cggataacaa tttcacacag ggacgagcta ttgattgggt accgagctcg 840 aattcgtacc cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg gctgttttgg 900 cggatgagag aagattttca gcctgataca gattaaatca gaacgcagaa gcggtctgat 960 aaaacagaat ttgcctggcg gcagtagcgc ggtggtccca cctgacccca tgccgaactc 1020 agaagtgaaa cgccgtagcg ccgatggtag tgtggggtct ccccatgcga gagtagggaa 1080 ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct 1140 gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg 1200 ttgcgaagca acggcccgga gggtggcggg caggacgccc gccataaact gccaggcatc 1260 aaattaagca gaaggccatc ctgacggatg gcctttttgc cttccgcttc ctcgctcact 1320 gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 1380 atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 1440 caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 1500 cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 1560 taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 1620 ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 1680 tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 1740 gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 1800 ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 1860 aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 1920 agaacagcat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 1980 agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 2040 cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 2100 gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa aggctgtgca ggtcgtaaat cactgcataa 2160 ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac 2220 ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg 2280 tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacata gatctcccgg gtaccgagct 2340 ctctagaaag aaggagggac gagctattga tggagaaaaa aatcactgga tataccaccg 2400 ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc atttcagtca gttgctcaat 2460 gtacctataa ccagaccgtt cagctggata ttacggcctt tttaaagacc gtaaagaaaa 2520 ataagcacaa gttttatccg gcctttattc acattcttgc ccgcctgatg aatgctcatc 2580 cggaattccg tatggcaatg aaagacggtg agctggtgat atgggatagt gttcaccctt 2640 gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa cgttttcatc gctctggagt gaataccacg 2700 acgatttccg gcagtttcta cacatatatt cgcaagatgt ggcgtgttac ggtgaaaacc 2760 tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga atatgttttt cgtctcagcc aatccctggg 2820 tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg ccaatatgga caacttcttc gcccccgttt 2880 tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct gatgccgctg gcgattcagg 2940 ttcatcatgc cgtttgtgat ggcttccatg tcggcagaat gcttaatgaa ttacaacagt 3000 actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaat ttttttaagg cagtttttta aggcagttat 3060 tggtgccctt aaacgcctgg ttgctacgcc tgaataagtg ataataagcg gatgaatggc 3120 agaaattc 3128 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GX1979_F <400> 12 tcctctagag tcgacatgac actgacaccg cg 32 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GX1979_R <400> 13 tgcctgcagg tcgactcaga ccttctggag gaagatg 37 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer gx1215-F <400> 14 tcctctagag tcgacatggt aaaaacaaga aagctgtttg 40 <210> 15 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer gx1215-R <400> 15 tgcctgcagg tcgactcagc ccgccatctg gatg 34 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer gx2556-F <400> 16 tcctctagag tcgacatgag cgaacacggt agc 33 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer gx2556-R <400> 17 tgcctgcagg tcgacttatc cctcgccatg ggc 33

Claims

프락토스 비스포스페이트 알돌라제(fructose bisphosphate aldolase: FBA)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 재조합 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물.
청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변형은 상기 프락토스 비스포스페이트 알돌라제를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키는 유전적 변형인 것인 미생물.
청구항 1에 있어서, 상기 프락토스 비스포스페이트 알돌라제는 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속, Bacillus 속, Mycobacterium 속, Zymomonas 속, Vibrio 속, 및 Escherichia 속 유래 프락토스 비스포스페이트 알돌라제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 미생물.
청구항 2에 있어서, 상기 프락토스 비스포스페이트 알돌라제는 EC 4.1.2.13에 속하는 것인 미생물.
청구항 1에 있어서, 상기 프락토스 비스포스페이트 알돌라제는 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드인 것인 미생물.
청구항 2에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 미생물.
청구항 1에 있어서, Gluconacetobacter xylinus인 것인 미생물.
청구항 1에 있어서, 글루코스-6-포스페이트를 글루코스-1-포스페이트로 전환하는 것을 촉매하는 포스포글루코뮤타제(phosphoglucomutase)(PGM)의 활성을 증가시키는 유전적 변형, 글루코스-1-포스페이트를 UDP-글루코스로 전환하는 것을 촉매하는 UTP-글루코스-1-포스페이트 우리딜릴트란스퍼라제(UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase)(UGP)의 활성을 증가시키는 유전적 변형, 및 UDP-글루코스를 셀룰로스로 전환하는 것을 촉매하는 셀룰로스 신타제(cellulose synthase)(CS)의 활성을 증가시키는 유전적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전적 변형을 포함하는 것인 미생물.
청구항 8에 있어서, 글루코스-6-포스페이트를 글루코스-1-포스페이트로 전환하는 것을 촉매하는 포스포글루코뮤타제(phosphoglucomutase)를 코딩하는 유전자, 글루코스-1-포스페이트를 UDP-글루코스로 전환하는 것을 촉매하는 UTP-글루코스-1-포스페이트 우리딜릴트란스퍼라제(UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase)를 코딩하는 유전자, 및 UDP-글루코스를 셀룰로스로 전환하는 것을 촉매하는 셀룰로스 신타제(cellulose synthase)를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 카피 수가 증가된 것인 미생물.
청구항 8에 있어서, 상기 유전적 변형은 서열번호 4의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖고 포스포글루코뮤타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 서열번호 6의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖고 UTP-글루코스-1-포스페이트 우리딜릴트란스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 카피 수가 증가된 것인 미생물.
청구항 8에 있어서, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자, 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 카피 수가 증가된 것인 미생물.
프락토스 비스포스페이트 알돌라제의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 재조합 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물을 배지 중에서 배양하여 셀룰로스를 생성하는 단계; 및
상기 배양물로부터 상기 셀룰로스를 회수하는 단계를 포함하는 셀룰로스를 생산하는 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 유전적 변형은 상기 프락토스 비스포스페이트 알돌라제를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키는 유전적 변형인 것인 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 프락토스 비스포스페이트 알돌라제는 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속, Bacillus 속, Mycobacterium 속, Zymomonas 속, Vibrio 속, 및 Escherichia 속 유래 프락토스 비스포스페이트 알돌라제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 프락토스 비스포스페이트 알돌라제는 EC 4.1.2.13에 속하는 것인 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 프락토스 비스포스페이트 알돌라제는 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드인 것인 미생물.
청구항 13에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 미생물.
청구항 13에 있어서, 상기 미생물은 G.xylinus인 것인 방법.
청구항 13에 있어서, 상기 미생물은 글루코스-6-포스페이트를 글루코스-1-포스페이트로 전환하는 것을 촉매하는 포스포글루코뮤타제(phosphoglucomutase)의 활성을 증가시키는 유전적 변형, 글루코스-1-포스페이트를 UDP-글루코스로 전환하는 것을 촉매하는 UTP-글루코스-1-포스페이트 우리딜릴트란스퍼라제(UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase)의 활성을 증가시키는 유전적 변형, 및 UDP-글루코스를 셀룰로스로 전환하는 것을 촉매하는 셀룰로스 신타제(cellulose synthase)의 활성을 증가시키는 유전적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전적 변형을 포함하는 것인 방법.
글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물에 프락토스 비스포스페이트 알돌라제(fructose bisphosphate aldolase: FBA)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 도입하는 단계를 포함하는, 셀룰로스 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법.