CN111349648A - 一种农杆菌介导外源基因导入蛹虫草细胞的方法 - Google Patents

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杨胜利
杨锡
陈萍
孔潇慧
季小康
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    • C12N3/00—Spore forming or isolating processes

Abstract

本发明公开了一种农杆菌介导外源基因导入蛹虫草细胞的方法，所述方法至少包括以下步骤：将无菌纤维素薄膜贴合在共培养固体培养基表面，然后将蛹虫草孢子悬液与含外源基因的农杆菌菌液等体积混合，涂布于无菌纤维素薄膜上，24℃恒温避光共培养48h后，将混合菌液连同纤维素薄膜转移至选择培养基，在贴合紧密的纤维素薄膜表面倒上一层选择培养基，22～25℃恒温避光培养；取穿透上层选择培养基的菌丝转接至传代培养基中，22～25℃恒温避光培养3～4d，筛选获得含外源基因的蛹虫草；本发明采蛹虫草外源基因遗传转化效率高达100％，成本低，操作简易。

Description

一种农杆菌介导外源基因导入蛹虫草细胞的方法
(一)技术领域
本发明涉及一种农杆菌介导外源基因导入蛹虫草细胞的方法。
(二)背景技术
随着生命科学的蓬勃发展，分子生物学和基因工程技术也取得了长足的进步。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的外源基因转化方法，由于其可导入大片段DNA且导入基因拷贝数低，转化效率高，表达效果好，引起了科研工作者的广泛关注，同时由于具有对仪器和操作技术要求低的优势，被大量应用于植物和真菌基因工程中，用于研究未知基因功能，用于探索各种基因调控元件的机理等。目前，已经在根霉，曲霉，青霉等多种真菌中实现了农杆菌介导转化外源基因。
蛹虫草(Cordyceps militaris(L.:Fr.)Fr.)，俗称北虫草，是北冬虫夏草的简称，也叫蛹虫草或蛹草，是虫草科，虫草属。主产于云南、吉林、辽宁、内蒙古等各地，可以通过寄生或者不寄生的方式得到蛹虫草真菌子实体，是研究虫草属的模式菌株。
利用根癌农杆菌介导的蛹虫草转基因尚未有文献报道。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种农杆菌介导的蛹虫草遗传转化方法，用于填补现有技术中的空白。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种农杆菌介导外源基因导入蛹虫草细胞的方法，所述方法至少包括以下步骤：
将无菌纤维素薄膜密贴合在共培养固体培养基表面，然后将蛹虫草孢子悬液与含外源基因的农杆菌菌液等体积混合，涂布于无菌纤维素薄膜上，24℃恒温避光共培养48h后，将混合菌液连同纤维素薄膜转移至选择培养基，纤维素薄膜紧密贴合无气泡，在贴合紧密的纤维素薄膜表面倒上一层选择培养基，完全覆盖纤维素薄膜，22～25℃(优选25℃)恒温避光培养；取穿透上层选择培养基的菌丝转接至传代培养基中，22～25℃恒温避光培养3～4d(优选25℃、4天，传代5次)，筛选获得含外源基因的蛹虫草；所述共培养固体培养基为IM+200mmol·L-1AS(乙酰丁香酮)；所述选择培养基是IM(琼脂质量浓度为1.5％)+200mg·L-1Hyg B(潮霉素)+200mg·L-1头孢菌素+100mg·L-1Kan(卡那霉素)；所述传代培养基是沙氏培养基(Sabouraud medium)+200mg·L-1Hyg B。
进一步，所述纤维素薄膜选自赛璐玢(cellophane)，硝酸纤维素膜等，优选赛璐玢。
进一步，所述蛹虫草孢子悬液为甘油低温保存孢子悬浮液或新鲜制备的孢子悬浮液，浓度为106～108·mL-1，优选106·mL-1。
进一步，所述蛹虫草孢子悬液按如下方法制备：将蛹虫草CM-001(Cordycepsmilitaris)接种至PDA培养基，24℃恒温避光培养7日，然后于超净工作台上用无菌水反复冲洗PDA培养基表面，得到蛹虫草菌悬液，4层纱布过滤菌悬液除去菌丝体，得到蛹虫草孢子悬浮液。
进一步，所述外源基因为潮霉素抗性基因hph(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)和/或加强型绿色荧光蛋白基因egfp(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。
进一步，所述含外源基因的农杆菌菌液OD600＝0.80，所述含外源基因的农杆菌菌液按如下方法制备：将外源基因的农杆菌划线接种至固体细菌培养基，28℃恒温培养48h，再挑取单菌落接种至液体细菌培养基，180rpm、28℃恒温培养36h，然后将其接种到农杆菌预培养液体培养基中，180rpm、28℃恒温培养6～8h至菌体浓度OD600＝0.80，得到农杆菌菌液；所述固体细菌培养基是LB固体+25mg·L-1Rif+50mg·L-1Kan(利福平)；所述液体细菌培养基为LB液体+25mg·L-1Rif+50mg·L-1Kan；所述农杆菌预培养液体培养基是IM+200mmol·L-1AS(乙酰丁香酮)。
进一步，所述农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL-1。
进一步，优选含外源基因的农杆菌为含质粒PCAMBIA-PgpdA-egfp-Tcbh1-hph-PtrpC的农杆菌，该质粒导入蛹虫草细胞后，使蛹虫草表达绿色荧光蛋白并产生潮霉素抗性。
进一步，所述纤维素薄膜上表面和下表面均有一层1.5～2.5mm(优选2.0mm)的选择培养基。
进一步，所述头孢菌素选自头孢噻吩钠、头孢氨苄、头孢曲松钠、氨苄青霉素中的任意一种。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明采蛹虫草外源基因遗传转化效率高达100％，成本低，操作简易。
(四)附图说明
图1为实施例1未过滤野生蛹虫草孢子悬液照片。
图2为实施例1选择培养时蛹虫草菌丝穿透上层选择培养基的照片。
图3为实施例1传代培养的照片。
图4为实施例1传代培养的另一张照片。
图5为实施例1野生蛹虫草蓝色光激发的荧光照片。
图6为实施例1蛹虫草潮霉素抗性菌株表达绿色荧光蛋白的荧光照片。
图7为实施例1蛹虫草潮霉素抗性菌株DNA验证照片。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1
含质粒PCAMBIA-PgpdA-Tcbh1-hph-PtrpC的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)AGL-1的构建：
利用
Figure BDA0002394834440000031
-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit将潮霉素抗性基因hph基因(SEQ ID NO.1所示)和加强型绿色荧光蛋白基因egfp(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)与载体PCAMBIA-PgpdA-Tcbh1-PtrpC无缝克隆连接，得到质粒PCAMBIA-PgpdA-egfp-Tcbh1-hph-PtrpC溶液，-20℃保存。
取质粒PCAMBIA-PgpdA-egfp-Tcbh1-hph-PtrpC溶液5μL加入到100μL根癌农杆菌AGL-1感受态中，液氮冰冻8s，37℃水浴5min；向感受态中加入800μL LB液体培养基，28℃，180rpm，震荡培养1h；3500rpm离心10min，超净台上弃去上清，保留100μL菌液；重悬菌液涂布于LB固体培养基+25mg·L-1Rif+50mg·L-1Kan，28℃培养36h。
挑取单菌落用HF-check/HR-check引物进行PCR验证，检验转化是否成功，筛选阳性克隆，获得含质粒PCAMBIA-PgpdA-egfp-Tcbh1-hph-PtrpC的根癌农杆菌AGL-1。
实施例2
表1材料来源
Figure BDA0002394834440000032
Figure BDA0002394834440000041
表2各培养基组分
Figure BDA0002394834440000042
所述PDA培养基组成：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15～20g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH。
所述LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0。
所述LB固体培养基组成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15～20g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0。
所述IM培养基组成：0.145％KH2PO4，0.205％K2HPO4，0.06％MgSO4·7H2O，0.03％NaCl，0.01‰CaCl2，0.001‰FeSO4，0.05％NH4NO3，5mL/L甘油，0.2％葡萄糖，5mL/L微量元素储备液，40mL/L MES缓冲液(1mol/L、pH＝5.5)，溶剂为蒸馏水；所述每10ml微量元素储备液组成：ZnSO4·7H2O 0.001g，CuSO4·5H2O 0.001g，H3BO4 0.001g，(NH4)2SO4 0.5g，MnSO4·H2O0.001g，NaMoO4·H2O 0.001g，溶剂为蒸馏水。
所述沙氏培养基组成：蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，葡萄糖40g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。
1、野生蛹虫草孢子悬液
将野生蛹虫草CM-001(Cordyceps militaris)接种至PDA培养基，24℃恒温避光培养7日，然后于超净工作台上用无菌水反复冲洗PDA培养基表面，得到蛹虫草菌悬液，如图1。4层纱布过滤菌悬液除去菌丝体，得到野生蛹虫草孢子悬液。取微量野生蛹虫草孢子悬液用血球计数板确定孢子悬液中蛹虫草孢子浓度。
2、预培养
将冰箱冻存的含质粒PCAMBIA-PgpdA-egfp-Tcbh1-hph-PtrpC的根癌农杆菌AGL-1划线接种至固体细菌培养基(LB固体+25mg·L-1Rif+50mg·L-1Kan)，28℃恒温培养48h，再挑取单菌落接种至液体细菌培养基(LB液体+25mg·L-1Rif+50mg·L-1Kan)，180rpm、28℃恒温培养36h，然后将其接种到农杆菌预培养液体培养基中，180rpm、28℃恒温培养6～8h至菌体浓度OD600＝0.80，得到农杆菌菌液。
3、共培养
取浓度为106/mL蛹虫草孢子悬浮液200μL与等体积OD600＝0.80农杆菌菌液混合均匀，得到混合菌液。
将无菌玻璃纸紧密贴合在共培养固体培养基表面，然后将混合菌液均匀涂布至玻璃纸表面，24℃恒温避光共培养48h。
4、选择培养
将培养满48h的混合菌液连同玻璃纸转贴到选择培养基表面(涂布菌种面朝上，培养基厚度为2.0mm)，然后在玻璃纸表面再倒上一层选择培养基(培养基厚度为2.0mm)完全覆盖玻璃纸，25℃恒温避光培养4d后，蛹虫草潮霉素抗性菌株菌丝穿透上层选择培养基，如图2。
挑取穿透选择培养基的菌丝，接种至传代培养基(200mg·L-1Hyg B)，25℃恒温避光培养4d，菌丝长出来后转接培养下一代，共培养五代，获得蛹虫草潮霉素抗性菌株菌丝，如图3。传代培养后正常存活，如图4。
5、蛹虫草潮霉素抗性菌株荧光鉴定
挑取蛹虫草CM-001菌丝涂抹至载玻片表面标记为玻片1，蓝色激发光照射下如图5，没有观察到绿色荧光。挑取蛹虫草潮霉素抗性菌株菌丝涂抹至载玻片表面标记为玻片2，蓝色激发光照射下如图6，观察到潮霉素抗性菌株表现出明显的绿色荧光蛋白。
6、蛹虫草潮霉素抗性菌株基因鉴定
将蛹虫草潮霉素抗性菌株接种于沙氏培养基中，于25℃恒温培养箱中倒置培养7d。采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司，产品编号：B518229)以及相关操作说明提取基因组DNA：①取50-100mg新鲜真菌或20mg干燥子实体或菌丝，液氮中充分研磨成粉末后放入到1.5mL离心管中，依次加入400μL BufferDigestion和4μlβ-巯基乙醇，震荡混匀。65℃水浴1h至细胞完全裂解。②加入200μl BufferPF，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。③室温10000rpm离心5min，将上清液(500～550μl)转移到新的1.5ml离心管中。④加入等体积的异丙醇，颠倒5～8次使之充分混匀，室温放置2～3min。室温10000rpm离心5min，弃上清。⑤加入1ml 75％乙醇，颠倒漂洗1～3min，10,000rpm离心2min，弃上清。⑥重复步骤⑤一次。⑦开盖室温倒置5～10min至残留的乙醇完全挥发。⑧得到的DNA用50-100μl TE Buffer溶解。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
取抽提得到的蛹虫草潮霉素抗性菌株基因组DNA，通过潮霉素抗性基因鉴定引物HF-check(5’-CTATTCCTTTGCCCTCGGACGA-3’)和HR-check(5’-ATGCCTGAACTCACCGCGACGT-3’)扩增内部区间序列。
表3 PCR反应体系
试剂 体积(μL)
DNA模板 1
HF 0.5
HR 0.5
PCRMix 5
ddH<sub>2</sub>O 3
Total 10
PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，20个循环，72℃补缺10min，4℃低温保存。
取5μL PCR产物点样于1.2％琼脂糖凝胶，20V·cm-1条件下电泳20分钟，于凝胶成像系统中观察条带，共挑选7株转化子，均显示阳性，电泳结果显示潮霉素抗性基因条带，条带大小1000bp如图7所示。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种农杆菌介导外源基因导入蛹虫草细胞的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1020
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
atgcctgaac tcaccgcgac gtctgtcgag aagtttctga tcgaaaagtt cgacagcgtc 60
tccgacctga tgcagctctc ggagggcgaa gaatctcgtg ctttcagctt cgatgtagga 120
gggcgtggat atgtcctgcg ggtaaatagc tgcgccgatg gtttctacaa agatcgttat 180
gtttatcggc actttgcatc ggccgcgctc ccgattccgg aagtgcttga cattggggaa 240
ttcagcgaga gcctgaccta ttgcatctcc cgccgtgcac agggtgtcac gttgcaagac 300
ctgcctgaaa ccgaactgcc cgctgttctg cagccggtcg cggaggccat ggatgcgatc 360
gctgcggccg atcttagcca gacgagcggg ttcggcccat tcggaccgca aggaatcggt 420
caatacacta catggcgtga tttcatatgc gcgattgctg atccccatgt gtatcactgg 480
caaactgtga tggacgacac cgtcagtgcg tccgtcgcgc aggctctcga tgagctgatg 540
ctttgggccg aggactgccc cgaagtccgg cacctcgtgc acgcggattt cggctccaac 600
aatgtcctga cggacaatgg ccgcataaca gcggtcattg actggagcga ggcgatgttc 660
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tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

Claims (10)

1.一种农杆菌介导外源基因导入蛹虫草细胞的方法，其特征在于所述方法至少包括以下步骤：
将无菌纤维素薄膜贴合在共培养固体培养基表面，然后将蛹虫草孢子悬液与含外源基因的农杆菌菌液等体积混合，涂布于无菌纤维素薄膜上，24℃恒温避光共培养48h后，将混合菌液连同纤维素薄膜转移至选择培养基，在贴合紧密的纤维素薄膜表面倒上一层选择培养基，22～25℃恒温避光培养；取穿透上层选择培养基的菌丝转接至传代培养基中，22～25℃恒温避光培养3～4d，筛选获得含外源基因的蛹虫草；所述共培养固体培养基为IM+200mmol·L-1乙酰丁香酮；所述选择培养基是IM+200mg·L-1潮霉素B+200mg·L-1头孢菌素+100mg·L-1卡那霉素；所述传代培养基是沙氏培养基+200mg·L-1潮霉素B。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述蛹虫草孢子悬液浓度为106～108·mL-1。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述蛹虫草孢子悬液按如下方法制备：将蛹虫草(Cordyceps militaris)接种至PDA培养基，24℃恒温避光培养7日，然后于超净工作台上用无菌水反复冲洗PDA培养基表面，得到蛹虫草菌悬液，过滤菌悬液除去菌丝体，得到蛹虫草孢子悬液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含外源基因的农杆菌菌液OD600＝0.80。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含外源基因的农杆菌菌液按如下方法制备：将含外源基因的农杆菌划线接种至固体细菌培养基，28℃恒温培养48h，再挑取单菌落接种至液体细菌培养基，180rpm、28℃恒温培养36h，然后将其接种到农杆菌预培养液体培养基中，180rpm、28℃恒温培养至OD600＝0.80，得到农杆菌菌液；所述固体细菌培养基是LB固体+25mg·L-1利福平+50mg·L-1卡那霉素；所述液体细菌培养基为LB液体+25mg·L-1利福平+50mg·L-1卡那霉素；所述农杆菌预培养液体培养基是IM+200mmol·L-1乙酰丁香酮。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述外源基因为潮霉素抗性基因和/或加强型绿色荧光蛋白基因。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于潮霉素抗性基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所示加强型绿色荧光蛋白基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)AGL-1。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于纤维素薄膜上表面和下表面均有一层1.5～2.5mm的选择培养基。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述头孢菌素选自头孢噻吩钠、头孢氨苄、头孢曲松钠、氨苄青霉素中的任意一种。
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