CN116286405A - 一株重组扩展青霉基因工程菌及其构建方法 - Google Patents
一株重组扩展青霉基因工程菌及其构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株扩展青霉基因工程菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。所述扩展青霉基因工程菌为在出发菌中敲除细胞壁完整性和应激组分调控基因WSC1，得到重组扩展青霉基因工程菌；本发明提供的基因工程菌通过侵染梨果致病力实验，发现WSC1的缺失，显著降低了扩展青霉的致病力；同时，敲除WSC1菌株的单位产孢量、菌丝干重相比于出发菌株扩展青霉均显著减少，取得了意想不到的显著效果，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株细胞壁完整性和应激组分调控基因WSC1的扩展青霉基因工程菌及其构建方法。
背景技术
扩展青霉是一种典型的死体营养型病原真菌，具有良好的适应性，在土壤和空气中普遍存在，通常存在于果园地面以及腐烂的水果表面，可侵染多种水果。由扩展青霉引起的青霉病，是梨果采后最常发生的病害，主要危害水晶梨。扩展青霉通过梨果的果柄、萼筒、皮孔或伤口(一部分由机械损伤引起的损伤，一部分由梨果表皮组织结构变化而引起的隐形细胞凋亡)等部位入侵，在适宜条件下，迅速向心室腐烂，并散发出刺鼻的腐烂味道。
此外，扩展青霉侵染梨果时，会分泌展青霉素(PAT)。PAT是一种天然真菌毒素，属于聚酮类代谢物，能使不同种类动物发生急性中毒，症状一般为嗜睡、腹泻、呕血和肺泡出血等，并且PAT对细胞具有遗传毒性和免疫毒性，给人们的健康带来巨大的安全隐患。我们在之前的研究结果中筛选到可能与扩展青霉侵染过程有关的基因WSC1。该基因参与MAPK信号通路，与细胞壁的完整性和应激组分相关，参与产孢调控和常规体壁侵染而影响毒力。
基因敲除是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。它是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。同源重组是其中最经典、应用非常广泛的一种敲除方法，利用同源片段将目的基因截短、删除或者替换，目前已被广泛用于揭示丝状真菌的基因功能。农杆菌转化法具有简单快速、转化效率高和安全有效等特点。
目前尚未有在扩展青霉中敲除WSC1的应用，因此通过农杆菌介导的同源重组技术敲除扩展青霉中的WSC1基因，对其基因功能分析和应用尤为重要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在解决所述问题之一，提供重组扩展青霉基因的构建方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一株重组扩展青霉基因工程菌的制备方法，其是在出发菌中敲除细胞壁完整性和应激组分调控基因WSC1，得到重组扩展青霉基因工程菌。
所述出发菌为扩展青霉；所述细胞壁完整性和应激组分调控基因WSC1核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
所述在出发菌中敲除细胞壁完整性和应激组分调控基因WSC1的方法为农杆菌介导的同源重组技术，将含有细胞壁完整性和应激组分调控基因WSC1的质粒与出发菌共培养。
所述含有细胞壁完整性和应激组分调控基因WSC1的质粒的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
进一步地，本发明公开上述重组扩展青霉基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)以扩展青霉基因组DNA为模板，设计并合成引物扩增该基因上下游片段，得到扩增产物；再将扩增产物与经PacI和Nt.BbvCI酶切后的线性化质粒片段相连接，获得重组质粒；
所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；因设计的引物SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中不含有尿嘧啶(U)修饰，为方便后续利用User酶将WSC1上下游片段、pGKO和HPTBOX片段顺序连接形成重组质粒，在4个序列前面分别加上尿嘧啶(U)修饰如下：GGGTTTAA、GGACTTAA、GGCATTAA、GGTCTTAA；
(2)采用冻融法将步骤(1)所得的重组质粒转化入大肠杆菌DH5α感受态中并均匀涂布于含硫酸卡那霉素的LB培养基中，经培养后选择单菌落，设计并合成引物鉴定转化结果；经验证重组质粒已经成功构建并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞；所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；
所述硫酸卡那霉素在LB培养基中的终浓度为100μg/mL；所述培养的温度为37℃，时间为12h。
(3)采用冻融法将步骤(2)处理后的重组质粒转化入农杆菌EHA105感受态中并均匀涂布于含有硫酸卡那霉素和利福平的LB培养基中，经培养后选择单菌落，利用核苷酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的引物鉴定转化结果，经验证重组质粒成功转入农杆菌EHA105感受态细胞；
所述硫酸卡那霉素在LB培养基中的终浓度为100μg/mL；利福平在LB培养基中的终浓度为50μg/mL。所述培养的温度为28℃，时间为2d。
(4)工程菌的制备：
(a)培养基的配制：
将硫酸卡那霉素和利福平加入LB液体培养基中，得到含有硫酸卡那霉素和利福平的LB液体培养基，记为培养基A；硫酸卡那霉素和利福平在LB液体培养基中的浓度为100μg/mL和50μg/mL；
将乙酰丁香酮(AS)和吗啉乙磺酸(MES)加入诱导培养基(IM)中，得到含有乙酰丁香酮和吗啉乙磺酸的诱导培养基，记为培养基B；所述乙酰丁香酮和吗啉乙磺酸在诱导培养基(IM)中的浓度为200μmol/L和40mmol/L；
将乙酰丁香酮和吗啉乙磺酸加入完全培养基(CM)中，得到含有乙酰丁香酮和吗啉乙磺酸的CM培养基，记为培养基C；所述乙酰丁香酮和吗啉乙磺酸在CM培养基中的浓度为200μmol/L和40mmol/L；
将头孢噻肟钠和潮霉素B加入PDA培养基中，得到含有头孢噻肟钠和潮霉素B的PDA培养基，记为培养基D；所述头孢噻肟钠和潮霉素B在PDA培养基中的浓度为200μg/mL和100μg/mL；
将潮霉素B加入PDA培养基中，得到含有潮霉素B的PDA培养基，记为培养基E；潮霉素B在PDA培养基中的浓度为100μg/mL。
(b)将经步骤(3)处理后所得的含有重组成功质粒的农杆菌EHA105单菌落种到培养基A中，经第一次培养后得到的培养液，接种到新的培养基A中进行第二次培养，培养至OD600为0.8-1.2，然后进行离心弃去上清，收集沉淀，用培养基B离心洗涤沉淀数次，并培养基B重悬菌沉淀，将其调至OD600＝0.8，得到重悬液；
重悬之后的菌悬液与扩展青霉孢子悬浮液混合，得到混合液，涂布于贴有硝酸纤维素滤膜的培养基C表面进行第三次培养，待膜上长出菌后转接到培养基D进行第四次培养，待长出转化子；再利用同源重组引物对转化子进行PCR检测，能扩增出1500bp目的条带的即为同源重组转化子，再将含有同源重组转化子的菌株在培养基E上连续传代培养，获得纯合同源重组菌株，即为细胞壁完整性和应激组分调控基因WSC1的扩展青霉基因工程菌；所述同源重组引物的序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示。
优选的，步骤(4)的(b)中第一次培养的条件为28℃，180rpm，12h；接种到新的培养基A中的接种量为2％(v/v)；第二次培养的条件为28℃，180rpm；离心的条件为845×g，10～15min；洗涤沉淀数次为2-5次；第三次培养的条件为：25℃、48-60h；第四次培养的条件为：25℃、48-72h；所述菌悬液与扩展青霉孢子悬浮液混合的体积比为1:1，扩展青霉孢子悬浮液的浓度为1×107spores/mL。
本发明获得的有益效果如下：
本发明提供了一种重组扩展青霉基因工程菌的构建方法，在出发菌中敲除细胞壁完整性和应激组分调控基因WSC1，得到重组扩展青霉基因工程菌；结果显示：通过两种菌株侵染梨果致病力图以及两种菌株侵染梨果形成的病斑直径图，发现WSC1的缺失，显著降低了扩展青霉的致病力；同时，敲除WSC1菌株的单位产孢量、菌丝干重相比于出发菌株扩展青霉均显著减少，取得了意想不到的显著效果。
附图说明
图1为WSC1基因上下游片段的PCR扩增电泳图(Marker，分子量标记DL5000；U，WSC1基因上游1000bp片段；D，WSC1基因下游1000bp片段)。
图2为PGKO-HPT质粒酶切线性化的PCR电泳图(Marker，分子量标记DL15000)。
图3为重组质粒图谱。
图4为重组质粒转入大肠杆菌DH5α的PCR电泳图(Marker，分子量标记DL5000；U，重组质粒中上游片段连接鉴定；D，重组质粒中下游片段连接鉴定)。
图5为重组质粒导入农杆菌EHA105的PCR电泳图(Marker，分子量标记DL5000；U，重组质粒中上游片段连接鉴定；D，重组质粒中下游片段连接鉴定)。
图6为疑似同源重组转化子的平板图。
图7为同源重组转化子的PCR电泳图(Marker：5000bp；1U，1D，出发菌株阴性对照；2U，2D，疑似同源转化子电泳结果；3U，3D，重组成功的质粒阳性对照；4，疑似同源转化子中目的基因电泳结果)。
图8为两种菌株菌落生长图。
图9为两种菌株菌落直径分析图。
图10为两种菌株菌丝干重差异图。
图11为两种菌株孢子产量差异图。
图12为两种菌株侵染梨果致病力图。
图13为两种菌株侵染梨果形成的病斑直径图。
说明：图中ΔWSC1是指敲除WSC1菌株，WT是指出发菌株扩展青霉。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业途径渠道获得。
扩展青霉(Penicillium expansum)，其来源自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为：CGMCC NO.3.15686；
提取出发菌株扩展青霉基因组：使用生工生物工程(上海)股份有限公司提取真菌基因组的试剂盒(Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒)。
IM(诱导培养基)：K2HPO4 2g/L、KH2PO4 1.45g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、NaCl 0.3g/L、CaCl2·2H2O 0.01g/L、H3BO3 0.001g/L、ZnSO4·7H2O 0.001g/L、CuSO4·5H2O 0.001g/L、MnSO4·H2O 0.001g/L、Na2MoO4·2H2O 0.001g/L、NH4NO30.5g/L、glucose 2g/L、FeSO40.001g/L和0.5％甘油。
CM(完全培养基)：与IM培养基组分基本相同，区别是glucose减半，并加入1.5％琼脂粉即得。
实施例1：
一、扩展青霉细胞壁完整性和应激组分调控基因WSC1的敲除菌株构建。
(1)扩展青霉细胞壁完整性和应激组分调控基因WSC1的敲除载体构建
以出发菌株扩展青霉DNA作为模板，利用引物SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6分别扩增WSC1上、下游片段各约1000bp的片段，1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1)并回收片段，最后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序及序列比对；依次利用PacI和Nt.BbvCI酶将pGKO-HPT质粒进行线性化处理，得到pGKO和HPTBOX片段(图2)，分别对其进行凝胶回收；因设计的引物SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQID NO:6中不含有尿嘧啶(U)修饰，为方便后续利用User酶将WSC1上下游片段、pGKO和HPTBOX片段顺序连接形成重组质粒，在4个序列前面分别加上尿嘧啶(U)修饰如下：GGGTTTAA、GGACTTAA、GGCATTAA、GGTCTTAA。
(2)重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞并鉴定阳性克隆
采用冻融法将步骤(1)中构建的重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布到含有100μg/mL硫酸卡那霉素的LB固体培养基上；
同时，将普通大肠杆菌DH5α感受态细胞分别涂布于不含有和含有100μg/mL硫酸卡那霉素的LB固体培养基上，在37℃条件下培养12h，培养长出的单菌落以SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10为引物进行PCR扩增，1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图4)并送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序及序列比对，验证重组质粒是否成功构建并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞；经验证重组质粒已经成功构建并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。
(3)重组质粒转入农杆菌EHA105感受态细胞并鉴定阳性克隆
取1μg步骤(2)中鉴定的重组成功的质粒，采用冻融法转入农杆菌EHA105感受态细胞，涂布于含有100μg/mL硫酸卡那霉素和50μg/mL利福平的LB固体培养基上；
同时将普通农杆菌EHA105感受态细胞分别涂布于不含有和含有100μg/mL硫酸卡那霉素和50μg/mL利福平的LB固体培养上，在28℃培养2d，将长出的单菌落以SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10为引物进行菌落PCR扩增，1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图5)并送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序及序列比对，验证重组质粒是否成功转入农杆菌EHA105感受态细胞；经验证重组质粒成功转入农杆菌EHA105感受态细胞；
(4)含有重组质粒的农杆菌EHA105与扩展青霉共培养
(a)培养基的配制：
将硫酸卡那霉素和利福平加入LB液体培养基中，得到含有硫酸卡那霉素和利福平的LB液体培养基，记为培养基A；硫酸卡那霉素和利福平在LB液体培养基中的浓度为100μg/mL和50μg/mL；
将乙酰丁香酮(AS)和吗啉乙磺酸(MES)加入诱导培养基(IM)中，得到含有乙酰丁香酮和吗啉乙磺酸的诱导培养基，记为培养基B；所述乙酰丁香酮和吗啉乙磺酸在诱导培养基中的浓度为200μmol/L和40mmol/L；
将乙酰丁香酮和吗啉乙磺酸加入完全培养基(CM)中，得到含有乙酰丁香酮和吗啉乙磺酸的CM培养基，记为培养基C；所述乙酰丁香酮和吗啉乙磺酸在CM培养基中的浓度为200μmol/L和40mmol/L；
将头孢噻肟钠和潮霉素B加入PDA培养基中，得到含有头孢噻肟钠和潮霉素B的PDA培养基，记为培养基D；所述头孢噻肟钠和潮霉素B在PDA培养基中的浓度为200μg/mL和100μg/mL；
将潮霉素B加入PDA培养基中，得到含有潮霉素B的PDA培养基，记为培养基E；潮霉素B在PDA培养基中的浓度为100μg/mL。
(b)将步骤(3)中鉴定的接含有重组成功质粒的农杆菌EHA105单菌落种到5mL培养基A(含有100μg/mL硫酸卡那霉素和50μg/mL利福平)中，在28℃温度条件下以180rpm培养12h，得到的培养液按2％(v/v)的接种量，转接种到含有相同抗生素的50mL LB液体培养基中，28℃培养至OD600为0.8-1.2，845×g离心10min，弃去上清，收集菌沉淀用培养基B(含有200μmol/L AS和40mmol/L MES)洗涤菌沉淀2次，并使用培养基B重悬菌沉淀，将其调至OD600＝0.8，得到重悬液；再将扩展青霉孢子悬浮液稀释成1×107spores/mL，按体积比1:1与OD600＝0.8的重悬液混合，涂布于贴有硝酸纤维素膜的培养基C(含有200μmol/L AS和40mmol/LMES)上，在25℃条件下培养60h；将膜上长出的菌转接到含有200μg/mL头孢噻肟钠和100μg/mL潮霉素B的PDA培养基(培养基D)上，在25℃条件下培养3d，长出转化子。
(5)转化子的筛选
将步骤(4)中长出的转化子(图6)分别接种到新的含有100μg/mL潮霉素B的PDA培养基(培养基E)上并做好标记，于25℃条件下培养7d，提取各个转化子DNA，以SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14为引物，PCR扩增，1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图7)并送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序及序列比对，确定转化子是否为阳性，经鉴定确认阳性转化子。
(6)遗传稳定性检测
将步骤(5)中鉴定的阳性转化子在不含有潮霉素B的PDA培养基上连续继代培养四代后，接种到含有100μg/mL潮霉素B的PDA培养基上，若能正常生长，则表明该转化子具有遗传稳定性。
二、细胞壁完整性和应激组分调控基因WSC1对扩展青霉的影响。
(1)对扩展青霉菌落直径的影响
将出发菌株扩展青霉、敲除WSC1菌株孢子悬浮液稀释成相同浓度，各取5μL接种到不同的PDA培养基上，25℃培养，并在第2d、3d、4d和5d拍照观察并测定记录菌落直径；
图8为两种菌株菌落生长图，图9为两种菌株菌落直径分析图；实验结果如图8、图9所示，在生长前期菌落直径出现减小现象。
(2)对扩展青霉菌丝干重的影响
将出发菌株扩展青霉、敲除WSC1菌株孢子悬浮液稀释成相同浓度，各取100μL接种到不同的PDB培养基中，于25℃、180rpm进行培养，在接种24h、36h、48h、60h和72h时，每个菌株分别取出3瓶，采用布氏漏斗收集菌丝，-20℃暂存，待各个时间点样品全部取样结束，将全部菌丝样品进行冷冻真空干燥，结束后，采用0.1mg电子分析天平对各个样品进行称量并记录，全程做好标记。
实验结果如图10所示，除24h外，其他时间点敲除WSC1菌株的菌丝干重相比于出发菌株扩展青霉均显著减少。
(3)对扩展青霉孢子产量的影响
将出发菌株扩展青霉、敲除WSC1菌株孢子悬浮液稀释成相同浓度，各取10μL接种到不同的PDA培养基上，25℃培养，并分别在第4d、5d、6d和7d时使用刮孢子器把每个平板上中的孢子全部取出，按照不同的板分别放到含有等量0.02％吐温80的锥形瓶中，涡旋振荡仪充分振荡使其分散(10min)，取10μL点在血球计数板上，盖上载玻片，显微镜观察计数，统计并计算出单位面积(cm2)的产孢量。
图11为两种菌株孢子产量差异图，结果如图11所示，除第4d外，其他时间点敲除WSC1菌株的单位产孢量相比于出发菌株扩展青霉的单位产孢量均显著减少。
(4)对扩展青霉致病力的影响
将出发菌株扩展青霉、敲除WSC1菌株孢子悬浮液均稀释成1×107spores/mL，采用无菌打孔器(5mm×5mm)在梨果的中间部位均匀打3个伤口，每个伤口接种30μL敲除WSC1菌株孢子悬浮液作为处理组，以接种等量出发菌株的梨果作为对照组，25℃贮藏，于不同时间点进行观察并测量伤口处的腐烂直径。
ΔWSC1是指敲除WSC1菌株，WT是指出发菌株扩展青霉。
图12为两种菌株侵染梨果致病力图，图13为两种菌株侵染梨果形成的病斑直径图；结果如图12所示，出发菌株扩展青霉感染梨果的病斑明显要大于敲除WSC1菌株后感染梨果的病斑；同时结和图13来看，从48h到120h，出发菌株扩展青霉感染梨果的病斑直径与敲除WSC1菌株后感染梨果的病斑直径存在显著性差异。所以通过结果可以得知WSC1的缺失，显著降低了扩展青霉的致病力。
虽然本发明已以比较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的为准。
SEQ ID NO:1
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SEQ ID NO:2重组质粒序列
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引物上游序列
SEQ ID NO:3(WSC1xsU-F:)cagagtcatcaagatagagggaaaaa
SEQ ID NO:4(WSC1xsU-R:)ggtgtgctcgatcgataatttatta
引物下游序列
SEQ ID NO:5(WSC1xsD-F:)cttcgaaatgacaactttctcgac
SEQ ID NO:6(WSC1xsD-R:)caagatgaactaatacaagcctgaaaa
重组质粒鉴定上游序列
SEQ ID NO:7(WSC1jdU-F:)gacccaattacaccctttgcg(21)61.9SEQ ID NO:8(WSC1jdU-R:)ctcgttcctgtctgctaataagagtc(26)60.6重组质粒鉴定下游序列
SEQ ID NO:9(WSC1jdD-F:)gccgacatcaccgatggg(18)62.2SEQ ID NO:10(WSC1jdD-R:)gttggtcaagaggaacatattgaatatt(28)61.2转化子鉴定上游序列
SEQ ID NO:11(U-HPT-F:)gtatgaagggtggaatgtttccc
SEQ ID NO:12(U-HPT-R:)atatccacgccctcctacatcg
转化子鉴定下游序列
SEQ ID NO:13(HPT-D-F:)ctcaagcctacaggacacacattc
SEQ ID NO:14(HPT-D-R:)aagagtgtagaatgccaggattga
Claims (10)
1.一株重组扩展青霉基因工程菌，其特征在于，在出发菌中敲除细胞壁完整性和应激组分调控基因WSC1，得到重组扩展青霉基因工程菌。
2.根据权利要求1所述的重组扩展青霉基因工程菌，其特征在于，所述出发菌为扩展青霉Penicillium expansum。
3.根据权利要求1所述的重组扩展青霉基因工程菌，其特征在于，所述细胞壁完整性和应激组分调控基因WSC1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求1所述的重组扩展青霉基因工程菌，其特征在于，在出发菌中敲除细胞壁完整性和应激组分调控基因WSC1的方法为农杆菌介导的同源重组技术，将含有细胞壁完整性和应激组分调控基因WSC1的质粒与出发菌共培养。
5.根据权利要求4所述的重组扩展青霉基因工程菌，其特征在于，所述含有细胞壁完整性和应激组分调控基因WSC1的质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
6.根据权利要求1所述的重组扩展青霉基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)以扩展青霉基因组DNA为模板，设计并合成引物扩增该基因上下游片段，再将扩增产物与经PacI和Nt.BbvCI酶切后的线性化质粒片段相连接，获得重组质粒；所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示；因设计的引物SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6中不含有尿嘧啶修饰，为方便后续利用User酶将WSC1上下游片段、pGKO和HPTBOX片段顺序连接形成重组质粒，在4个序列前面分别加上尿嘧啶修饰如下：GGGTTTAA，GGACTTAA，GGCATTAA，GGTCTTAA；
(2)采用冻融法将步骤(1)所得的重组质粒转化入大肠杆菌DH5α感受态中并均匀涂布于含硫酸卡那霉素的LB培养基中，经培养后选择单菌落，设计并合成引物鉴定转化结果；经验证重组质粒已经成功构建并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞；所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10所示；
(3)采用冻融法将步骤(2)处理后的重组质粒转化入农杆菌EHA105感受态中并均匀涂布于含有硫酸卡那霉素和利福平的LB培养基中，经培养后选择单菌落，然后利用核苷酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的引物鉴定转化结果，经验证重组质粒成功转入农杆菌EHA105感受态细胞；所述硫酸卡那霉素在LB培养基中的终浓度为100μg/mL；利福平在LB培养基中的终浓度为50μg/mL；所述培养的温度为28℃，时间为2d；
(4)工程菌的制备：
(a)培养基的配制：
将硫酸卡那霉素和利福平加入LB液体培养基中，得到含有硫酸卡那霉素和利福平的LB液体培养基，记为培养基A；
将乙酰丁香酮和吗啉乙磺酸加入诱导培养基中，得到含有乙酰丁香酮和吗啉乙磺酸的诱导培养基，记为培养基B；
将乙酰丁香酮和吗啉乙磺酸加入CM培养基中，得到含有乙酰丁香酮和吗啉乙磺酸的CM培养基，记为培养基C；
将头孢噻肟钠和潮霉素B加入PDA培养基中，得到含有头孢噻肟钠和潮霉素B的PDA培养基，记为培养基D；
将潮霉素B加入PDA培养基中，得到含有潮霉素B的PDA培养基，记为培养基E；
(b)将经步骤(3)处理后所得的含有重组成功质粒的农杆菌EHA105单菌落种到培养基A中，经第一次培养后得到的培养液，接种到新的培养基A中进行第二次培养，培养至OD600为0.8-1.2，然后进行离心弃去上清，收集沉淀，用培养基B离心洗涤沉淀数次，并使用培养基B重悬菌沉淀，将其调至OD600＝0.8，得到重悬液；
重悬之后的菌悬液与1×107的扩展青霉孢子悬浮液混合，得到混合液，涂布于贴有硝酸纤维素滤膜的培养基C表面进行第三次培养，待膜上长出菌后转接到培养基D进行第四次培养，待长出转化子；再利用同源重组引物对转化子进行PCR检测，能扩增出1500bp目的条带的即为同源重组转化子，再将含有同源重组转化子的菌株在培养基E上连续传代培养，获得纯合同源重组菌株，即为细胞壁完整性和应激组分调控基因WSC1的扩展青霉基因工程菌；所述同源重组引物的序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示。
7.根据权利要求6所述的重组扩展青霉基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述硫酸卡那霉素在LB培养基中的终浓度为100μg/mL；所述培养的温度为37℃，时间为12h。
8.根据权利要求6所述的重组扩展青霉基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述硫酸卡那霉素在LB培养基中的终浓度为100μg/mL；利福平在LB培养基中的终浓度为50μg/mL；所述培养的温度为28℃，时间为2d。
9.根据权利要求6所述的重组扩展青霉基因工程菌的构建方法，其特征在于，优选的，步骤(4)的(a)中硫酸卡那霉素和利福平在LB液体培养基中的终浓度为100μg/mL和50μg/mL；
所述乙酰丁香酮和吗啉乙磺酸在诱导培养基中的浓度为200μmol/L和40mmol/L；
所述乙酰丁香酮和吗啉乙磺酸在CM培养基中的浓度为200μmol/L和40mmol/L；
所述头孢噻肟钠和潮霉素B在PDA培养基中的浓度为200μg/mL和100μg/mL；
所述培养基E，潮霉素B在PDA培养基中的浓度为100μg/mL。
10.根据权利要求6所述的重组扩展青霉基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(4)的(b)中第一次培养的条件为28℃、180rpm、12h；接种到新的培养基A中的接种量为2％(v/v)；第二次培养的条件为28℃、180rpm；离心的条件为845×g、10～15min；洗涤沉淀数次为2-5次；第三次培养的条件为：25℃、48-60h；第四次培养的条件为：25℃、48-72h；所述菌悬液与扩展青霉孢子悬浮液混合的体积比为1:1，扩展青霉孢子悬浮液的浓度为1×107spores/mL。
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| CN (1) | CN116286405A (zh) |
-
2023
- 2023-03-15 CN CN202310246580.1A patent/CN116286405A/zh active Pending
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