CN113355348A

CN113355348A - 一种农杆菌介导葡萄灰葡萄孢遗传转化体系的构建方法

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Publication number: CN113355348A
Application number: CN202110799521.8A
Authority: CN
Inventors: 李廷刚; 魏彦锋; 汤小宁; 蒋锡龙
Original assignee: Shandong Grape Research Institute
Current assignee: Shandong Grape Research Institute
Priority date: 2021-07-15
Filing date: 2021-07-15
Publication date: 2021-09-07
Also published as: ZA202105381B

Abstract

本发明提供了一种农杆菌介导葡萄灰葡萄孢遗传转化体系的构建方法，属于遗传转化体系的构建技术领域。在含乙酰丁香酮的共培养培养基中平铺一张支撑介质，将含外源基因的农杆菌菌液与灰葡萄孢的分生孢子液混合涂布至支撑介质上，经共培养，将支撑介质转移至含潮霉素B和头孢噻肟钠的PDA培养基中进行筛选培养得到阳性转化子。本发明建立并优化了农杆菌介导的灰葡萄孢遗传转化体系，通过分析分生孢子浓度、乙酰丁香酮浓度、共培养温度和时间以及潮霉素B以及头孢噻肟钠的浓度，能获得较高遗传转化效率。同时所述方法能获得稳定遗传潮霉素抗性的转化子，得到高比例的单拷贝插入转化子，为今后开展葡萄灰葡萄孢基因功能解析提供基础。

Description

一种农杆菌介导葡萄灰葡萄孢遗传转化体系的构建方法

技术领域

本发明属于遗传转化体系的构建技术领域，具体涉及一种农杆菌介导葡萄灰葡萄孢遗传转化体系的构建方法。

背景技术

灰霉病是葡萄生长及贮存期的重要病害，目前在我国主要由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)侵染所致^[1]。灰葡萄孢在自然界中可侵染200多种植物，包括番茄、丝瓜、草莓、葡萄等^[2]。灰葡萄孢多以菌核在植株或者病残体上越冬，翌年通过分生孢子传播^[3]。在葡萄生长过程中灰葡萄孢可侵染植株嫩茎、叶片、花穗、果实等大部分地上组织，发生严重时，可造成减产60％以上；在葡萄贮藏期灰葡萄孢则是第一大病原菌，一旦发生造成葡萄果粒腐烂，严重影响葡萄贮藏品质，造成严重损失^[4]。灰葡萄孢寄主范围广、变异速度快、抵御不良环境能力强，因此防治极为困难。寻找灰葡萄孢致病基因，探索致病机制，为灰霉病综合防控奠定基础。

遗传转化是研究病原菌致病基因功能的重要技术基础，农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT)是目前应用较为广泛的转化技术^[5]。农杆菌可以侵染真菌细胞，利用所携带的Ti质粒，将T-DNA区随机整合到受体细胞的基因组中，转化过程受到多种小分子多糖及酚类物质等的双重调节，其中乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)可在该过程中起到促进作用^[6]。ATMT技术因其转化受体要求低、操作流程简单、转化效率高、转化子稳定性强、转化子单拷贝插入等优势，目前已在水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、橡胶树炭疽病菌(Colletotrichum musae)等多种病原真菌中得到了较好的应用^[7-10]。

目前，在灰葡萄孢遗传转化研究中，ATMT技术也得到了较好的应用。陶岚利用ATMT技术构建了草莓灰葡萄孢突变体库，并从中筛选出463个致病力异常的转化子^[11]。王璇等通过筛选基于ATMT技术构建的番茄灰葡萄孢突变体库，得到分生孢子产生缺陷转化子BCt78^[12]。范雷等优化了月季灰葡萄孢RoseBc-3的ATMT体系，并筛选获得了6类不同表型转化子^[13]。沈卫锋等利用ATMT技术成功获得了绿色荧光蛋白重组灰葡萄孢^[14]。Zhang等通过筛选番茄灰葡萄孢ATMT突变体库，得到分生孢子产生缺陷转化子BCG183，定位确定候选基因BcKMO，进一步证明该基因可参与调控细胞壁降解酶活性、毒素活性和细胞壁完整性等^[15]。以上研究表明，ATMT技术可以在灰葡萄孢中得到较好应用，但不同寄主灰葡萄孢具有其自身特异性，目前鲜有关于葡萄灰葡萄孢ATMT的相关研究，基于农杆菌介导葡萄灰葡萄孢的遗传转化体系的构建还不完善，导致转化效率不理想。

参考文献

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发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种农杆菌介导葡萄灰葡萄孢遗传转化体系的构建方法，具有较高的遗传转化效率。

本发明提供了一种农杆菌介导葡萄灰葡萄孢遗传转化体系的构建方法，包括以下步骤：

1)制备含外源基因的农杆菌菌液；

2)在含乙酰丁香酮的共培养培养基中平铺一张支撑介质，将步骤1)中制备的含外源基因的农杆菌菌液与灰葡萄孢的分生孢子液混合涂布至所述支撑介质上，经共培养，将共培养后的支撑介质转移至含潮霉素B和头孢噻肟钠的PDA培养基中进行筛选培养。

优选的，步骤2)中所述含外源基因的农杆菌菌液和灰葡萄孢的分生孢子液的体积比为(0.9～1.1)：(0.9～1.1)；

所述灰葡萄孢的分生孢子液的浓度为1×10⁵～1×10⁶个/mL。

优选的，步骤2)中在共培养培养基中，所述乙酰丁香酮的终浓度为100～300μmol/mL。

优选的，步骤2)中PDA培养基中潮霉素B的浓度为50～100μg/mL；

PDA培养基中头孢噻肟钠的浓度为300～400μg/mL。

优选的，步骤2)中所述共培养的温度为25～30℃；所述共培养的时间为48～72h。

优选的，步骤2)中支撑介质包括玻璃纸或硝酸纤维素膜。

优选的，步骤1)中所述农杆菌的菌株包括根癌农杆菌；

所述根癌农杆菌的菌株为EHA105菌株。

优选的，步骤1)中所述含外源基因的农杆菌菌液的OD₆₀₀值为0.8。

优选的，所述灰葡萄孢的菌株为SYT3-7菌株。

优选的，所述外源基因包括潮霉素磷酸转移酶基因。

本发明提供了一种农杆菌介导葡萄灰葡萄孢遗传转化体系的构建方法，包括以下步骤：制备含外源基因的农杆菌菌液；在含乙酰丁香酮的共培养培养基中平铺一张支撑介质，将步骤1)中制备的含外源基因的农杆菌菌液与灰葡萄孢的分生孢子液混合涂布至所述支撑介质上，经共培养，将共培养后的支撑介质转移至含潮霉素B和头孢噻肟钠的PDA培养基中进行筛选培养。本发明通过将含外源基因的农杆菌菌液与灰葡萄孢的分生孢子液混合后接种至共培养培养基中的支撑介质上，对共转化体系起到支撑作用，便于后续将全部的转化子转移至新的培养基中，提高转移比例，同时，本申请还采用潮霉素B作为灰葡萄孢分生孢子的筛选抗生素，用头孢噻肟钠作为农杆菌的筛选试剂，能够有效提高阳性转化子的筛选准确性性，从而提高遗传转化效率。

进一步的，本领域具体限定了灰葡萄孢的分子孢子的浓度，在其他条件确定下，随着分子孢子浓度的增加得到的阳性转化子的数量提高，在1×10⁵～1×10⁶个/mL的浓度得到较高的转化效率。

进一步的，本领域具体限定了乙酰丁香酮浓度为100～300μmol/mL。实验表明，当不添加AS时，每个培养皿平均仅得到2个转化子；随着AS浓度不断提高所得到的转化子数量不断增加，当AS浓度为200μmol/mL时，每个培养皿平均可得到33个转化子；之后，随着AS浓度不断增加转化子数量不断减少，当AS浓度达到400μmol/mL时，每个培养皿平均得到6个转化子，因此，乙酰丁香酮浓度为200μmol/mL对提高遗传效率最佳。

进一步的，本发明具体限定了共培养的筛选条件，其中具体限定了潮霉素B的筛选浓度50～100μg/mL。当潮霉素B浓度达到50μg/mL和100μg/mL时，则可以完全抑制灰葡萄孢菌丝的生长，可见50μg/mL。本申请具体限定了头孢噻肟钠的浓度为300～400μg/mL。实验表明，不同浓度头孢噻肟钠对农杆菌抑制作用不同，对照平板上农杆菌生长遍布整个平板，50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的平板上随着浓度不断提高，存活菌落数不断减少，抑制效果不断增强；当浓度增加至300μg/mL时，可完全抑制农杆菌的生长。因此，300μg/mL头孢噻肟钠作为转化子的筛选浓度。

进一步的，本发明具体限定了共培养的条件，具体限定了共培养的温度为25～30℃；共培养的时间为48～72h。实验表明，当共培养温度为15℃时，每培养皿平均可得到7个转化子；随着共培养温度不断升高转化子数量呈现先增加后减少的趋势，当共培养温度为25℃时，转化效率最高，每培养皿平均可得到32个转化子；当共培养温度达到35℃时，每培养皿平均转化子数量则下降到11个。因此25℃为最佳共培养温度。当共培养时间为24h、48h、72h、96h、120h，每皿分别平均可得到18个、33个、34个、26个和22个转化子；其中，共培养时间为48h和72h时转化效率相当，无显著差异，共培养时间越长转化子有多拷贝插入的比例越高，因此，48h为最佳的共培养时间。

附图说明

图1为灰霉病菌在含不同浓度潮霉素B的PDA平板上生长情况，其中(a)CK，(b)5μg/mL，(c)10μg/mL，(d)25μg/mL，(e)50μg/mL，(b)100μg/mL；

图2为农杆菌在不同头孢噻肟钠浓度PDA平板上生长情况，其中(a)CK，(b)50μg/mL，(c)100μg/mL，(d)200μg/mL，(e)300μg/mL，(b)400μg/mL；

图3为不同分生孢子浓度对农杆菌转化效率影响的统计结果；

图4为不同AS浓度对农杆菌转化效率影响的统计结果；

图5为不同共培养温度对农杆菌转化效率影响的统计结果；

图6为不同共培养时间对农杆菌转化效率影响的统计结果；

图7为转化子PCR检测及Southern blot分析结果。

具体实施方式

1)制备含外源基因的农杆菌菌液；

本发明制备含外源基因的农杆菌菌液。

本发明对农杆菌的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知ID农杆菌的种类即可，例如根癌农杆菌。在本发明实施例中，所述根癌农杆菌采用EHA105菌株进行构建遗传转化体系。

本发明对含外源基因的农杆菌的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的重组农杆菌的制备方法即可。在本发明实施例中，优选热击法将pBIG3C质粒转入农杆菌中。同时本发明对所述外源基因的种类也没有特殊限制，采用本领域感兴趣的目标基因均可。为了举例说明，遗传转化效果，以潮霉素磷酸转移酶基因为例加以说明。转化后的农杆菌优选包括筛选。所述筛选优选先采用含有抗生素的固体LB培养基进行筛选，得到阳性菌斑再接种至含卡那霉素的液体基本培养基上振荡培养。所述基本培养的配方优选如下：K-buffer10mL(200g·L^-1K₂HPO₄，145g·L^-1KH₂PO₄，pH 7.0)、M-N buffer 20mL(30g·L^-1MgSO₄·7H₂O，15g·L^-1NaCl)、20％葡萄糖(w/v)10mL、1％CaCl₂·2H₂O(w/v)1mL、0.01％FeSO₄(w/v)10mL、20％NH₄NO₃(w/v)2.5mL、pH 7.0，加蒸馏水定容至1000mL。所述含外源基因的农杆菌菌液的OD₆₀₀值为0.8。

得到含外源基因的农杆菌菌液后，本发明在含乙酰丁香酮的共培养培养基中平铺一张支撑介质，将所述含外源基因的农杆菌菌液与灰葡萄孢的分生孢子液混合涂布至所述支撑介质上，经共培养，将共培养后的支撑介质转移至含潮霉素B和头孢噻肟钠的PDA培养基中进行筛选培养。

在本发明中，所述共培养培养基的配方优选如下：K-buffer(pH 4.9)0.8mL、M-Nbuffer 20mL、1％CaCl₂·2H₂O(w/v)1mL、20％葡萄糖(w/v)5mL、20％NH₄NO₃(w/v)2.5mL、50％甘油(v/v)10mL、0.01％FeSO₄(w/v)10mL、1mg·mL^-1MES 10mL、1.5％琼脂粉，加蒸馏水定容至1000mL。每个平板装共培养培养基20mL。在共培养培养基中，所述乙酰丁香酮的终浓度为100～300μmol/mL，更优选为150～250μmol/mL，最优选为200μmol/mL。本发明实验证明，在200μmol/mL的基础上，随着浓度继续提高，转化效率却逐渐下降，推测可能是因为过高浓度的AS对转化子产生了毒害作用，抑或是过高浓度的AS抑制了质粒上的外源基因的表达，从而导致转化效率下降。

在本发明中，支撑介质优选包括玻璃纸或硝酸纤维素膜。所述支撑介质为转化子起支撑作用，便于将转化子转移至新的培养皿中。

在本发明中，灰葡萄孢的分生孢子液的制备方法，优选接种于PDA培养基上进行诱导产孢，使用灭菌水洗脱分生孢子，使用三层灭菌滤纸过滤去除菌丝等杂质；离心收集分生孢子，并调节至适宜浓度，保存备用。所述诱导产孢的方法参照李廷刚等报道的方法进行。所述灰葡萄孢的菌株优选为SYT3-7菌株。

在本发明中，所述含外源基因的农杆菌菌液和灰葡萄孢的分生孢子液的体积比优选为(0.9～1.1)：(0.9～1.1)，更优选为1:1。所述灰葡萄孢的分生孢子液的浓度优选为1×10⁵～1×10⁶个/mL，由于高浓度下的分生孢子液往往导致转化子连成片，不容易挑选单个转化子，因此,灰葡萄孢的分生孢子液的浓度更优选为1×10⁵个/mL。

在本发明中，所述共培养的温度优选为25～30℃，更优选为25℃。过低或者过高均会导致转化效率下降。推测这可能是因为灰葡萄孢分生孢子具有自己最适的生长温度。所述共培养的时间优选为48～72h，更优选为48h。共培养时间过短会导致农杆菌未能完成侵染，从而造成转化效率不高。共培养时间过长，也会导致转化效率下降，这或许是因为共培养时间过长导致转化子生活力衰弱，从而影响转化效率。此外，共培养时间过长还易导致转化子中多拷贝插入的现象，为后续开展基因功能研究带来不便。

在本发明中，PDA培养基中潮霉素B的浓度优选为50～100μg/mL，更优选为50～80μg/mL。PDA培养基中头孢噻肟钠的浓度优选为300～400μg/mL，更优选为300μg/mL。本发明对所述PDA培养基没有特殊限制，采用本领域所熟知的PDA培养基即可。所述筛选培养的温度优选为22～25℃，更优选为23℃。所述筛选培养的时间优选为4～6h，更优选为5h。所述筛选培养优选在光暗交替条件下培养。所述光暗交替的周期为光照12h，黑暗12h。光照的光强优选为2500～3500LX，更优选为3000LX。

在本发明中，完成筛选培养后，还优选对筛选得到的转化子进行鉴定。所述鉴定的方法优选为提取转化子的DNA，采用HindIII单酶切，通过转化子Southern blot检测拷贝形式。同时以DNA为模板，PCR扩增hph基因，电泳分析特异性条带。PCR扩增用引物包括hph正向引物：5′-AAAGCCTGAACTCACCGCGACG-3′(SEQ ID NO:1)，hph反向引物：5′-CGGTTTCCACTATCGGCGAGTACTTCTAC-3′(SEQ ID NO:2)。所述PCR的反应体系：PCR buffer2.5μL、PCR mix 2.5μL、hph正向引物1.0μL、hph反向引物1.0μL、Enzyme 0.5μL、模板1.0μL、ddH₂O 16.5μL、总计25.0μL。所述PCR的反应程序：PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸50s，36个循环；72℃延伸6min。

结果表明，灰葡萄孢野生型中无条带，8个转化子中均可扩增得到特异性条带，且大小与对照相同。表明，T-DNA片段已经整合到灰葡萄孢基因组中，并且可以稳定遗传。通过转化子Southern blot检测，表明8个转化子均可杂交得到特异性条带，其中6个转化子为单拷贝插入，2个转化子为双拷贝插入，单拷贝插入比例可达到75％。表明，hph基因已经整合到灰葡萄孢基因组中，且多以单拷贝形式插入，完成遗传转化体系的构建。

下面结合实施例对本发明提供的一种农杆菌介导葡萄灰葡萄孢遗传转化体系的构建方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种农杆菌介导葡萄灰葡萄孢遗传转化体系的构建方法

1材料与方法

1.1试验材料

葡萄灰葡萄孢SYT3-7菌株(高毒力菌株)，分离自山东烟台“巨峰”葡萄灰霉病花穗，经鉴定后保存于山东省葡萄研究院病理与病虫害研究室。根癌农杆菌EHA105菌株、质粒pBIG3C(含潮霉素抗性基因)现均保存于山东省葡萄研究院病理与病虫害研究室。

1.2试验方法

1.2.1灰葡萄孢分生孢子制备方法

将葡萄灰葡萄孢SYT3-7菌株接种于PDA培养基上，参照李廷刚等报道的方法(葡萄灰葡萄孢生长及产孢条件研究,李廷刚等,中外葡萄与葡萄酒,2021(2):6-11.)进行诱导产孢；使用灭菌水洗脱分生孢子，使用三层灭菌滤纸过滤去除菌丝等杂质；离心收集分生孢子，并调节至适宜浓度，保存备用。

1.2.2根癌农杆菌菌液制备方法

采用热击法将含hph基因的pBIG3C质粒(该质粒来源参见现有技术：农杆菌介导苹果炭疽病菌的遗传转化及转化子鉴定,王海艳等,中国农业科学,2013,46(9):1799-1807.)转入农杆菌EHA105菌株中；含有抗生素的固体LB培养基筛选，得到阳性菌斑接种于液体基本培养基中，于28℃条件下摇培2d；离心收集菌体，用诱导培养基将菌液稀释至OD₆₀₀值等于0.15，继续培养直至OD₆₀₀值达到0.8。

其中，所述基本培养基为含50μg/mL卡那霉素，基本培养基(MM)：K-buffer 10mL(200g·L^-1K₂HPO₄、145g·L^-1KH₂PO₄，pH 7.0)，M-N buffer 20mL(30g·L^-1MgSO₄·7H₂O、15g·L^-1NaCl)、20％葡萄糖(w/v)10mL、1％CaCl₂·2H₂O(w/v)1mL、0.01％FeSO₄(w/v)10mL、20％NH₄NO₃(w/v)2.5mL，pH 7.0，加蒸馏水定容至1000mL。

诱导培养基(IM)配方如下：K-buffer(pH 4.9)0.8mL、M-N buffer 20mL、1％CaCl₂·2H₂O(w/v)1mL、20％葡萄糖(w/v)10mL、20％NH₄NO₃(w/v)2.5mL、50％甘油(v/v)10mL、0.01％FeSO₄(w/v)10mL、1mg·mL^-1MES 10mL，加蒸馏水定容至1000mL。

1.2.3灰葡萄孢对潮霉素B敏感性测定方法

制备分别含有5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL潮霉素B和300μg/mL的头孢噻肟钠的PDA平板，以不添加潮霉素B的PDA平板作为对照，用打孔器从上述培养灰葡萄孢的培养基上打取菌饼接种在PDA平板中心位置；于23℃光暗交替条件培养3d，观察菌落生长情况，每个处理6个平板，设置3次重复。

1.2.4农杆菌对头孢噻肟钠敏感性测定方法

制备分别含有50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL和400μg/mL头孢噻肟钠和50μg/mL潮霉素B的PDA平板，以不添加头孢噻肟钠的PDA平板作为对照，取已制备的OD₆₀₀值为0.15的农杆菌菌液均匀涂布于平板上；于28℃黑暗条件培养3d，观察菌落生长情况，每个处理6个平板，设置3次重复。

1.2.5遗传转化条件优化

在含有不同浓度乙酰丁香酮(AS)的共培养培养基平板上平铺一张玻璃纸，取100μL农杆菌与分生孢子混合液均匀涂布于玻璃纸上，在不同温度条件下，共培养不同时间，后将玻璃纸转移至一灭菌培养皿内，覆盖PDA培养基(内含50μg/mL的潮霉素B和300μg/mL的头孢噻肟钠)，在适宜温度条件下光暗交替培养5d，查看转化子生长情况。其中所用灰葡萄孢分生孢子浓度分别为：1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶个/mL，AS浓度为200μmol/mL，共培养温度为25℃，共培养时间为48h。所用AS浓度分别为：100μmol/mL、200μmol/mL、300μmol/mL、400μmol/mL，以不添加AS共培养培养基平板作为对照，其他参数为分生孢子液的浓度为1×10⁵/mL，共培养温度为25℃，共培养时间为48h；所用共培养温度分别为：15℃、20℃、25℃、30℃、35℃，其他参数为分生孢子液的浓度为1×10⁵/mL，AS浓度为200μmol/mL，共培养时间为48h；所用共培养时间分别为：24h、48h、72h、96h、120h，其他参数为分生孢子液的浓度为1×10⁵/mL，AS浓度为200μmol/mL，共培养温度为25℃。

1.2.6转化子检测与鉴定方法

随机选取8个转化子接种于不含抗生素的PDA平板上，待菌落生长至平板3/4面积时，打取菌饼转接至新的不含抗生素的PDA平板上，连续转接3代。之后打取菌饼，接种至含有50μg/mL潮霉素B的PDA平板上，观察菌落生长情况，实验重复3次；使用CTAB法提取野生型灰葡萄孢和8个转化子的基因组DNA，分别扩增潮霉素磷酸转移酶(hph)基因的特异片段；对野生型灰葡萄孢和8个转化子的基因组DNA进行Hind III单酶切，酶切完成后进行琼脂糖凝胶电泳分析，探针标记与检测方法具体实验步骤参照地高辛标记检测试剂盒(罗氏)说明书进行Souther blot检测。以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增hph基因片段，其中所用引物的序列如下：

PCR扩增用引物包括hph正向引物：5′-AAAGCCTGAACTCACCGCGACG-3′(SEQ ID NO:1)，hph反向引物：5′-CGGTTTCCACTATCGGCGAGTACTTCTAC-3′(SEQ ID NO:2)。所述PCR的反应体系：PCR buffer 2.5μL、PCR mix 2.5μL、hph正向引物1.0μL、hph反向引物1.0μL、Enzyme0.5μL、模板1.0μL、ddH₂O 16.5μL、总计25.0μL。所述PCR的反应程序：PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸50s，36个循环；72℃延伸6min。

1.3数据处理与分析

使用Microsoft Excel 2010及SPSS 19.0进行数据统计分析。

2结果与分析

2.1灰葡萄孢对潮霉素B敏感性测定结果

不同浓度潮霉素B对灰葡萄孢抑制作用测定结果如图1所示。灰葡萄孢菌饼接种后培养3d，与对照相比，5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL潮霉素B可对灰葡萄孢菌丝生长产生不同程度的抑制作用，但仍可以生长；当潮霉素B浓度达到50μg/mL～100μg/mL时，均可以完全抑制灰葡萄孢菌丝的生长。因此，本实施例选择50μg/mL潮霉素B作为转化子的筛选浓度。

2.2农杆菌对头孢噻肟钠敏感性测定

不同浓度头孢噻肟钠对农杆菌抑制作用测定结果如图2所示，农杆菌涂布后培养3d，对照平板上农杆菌生长遍布整个平板，50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的平板上随着浓度不断提高，存活菌落数不断减少，抑制效果不断增强；当浓度增加至300μg/mL时，可完全抑制农杆菌的生长。因此，本实验选择300μg/mL头孢噻肟钠作为转化子的筛选浓度。

2.3分生孢子浓度对转化效率的影响

不同分生孢子浓度对灰葡萄孢转化效率统计结果如图3所示，伴随着分生孢子浓度不断增加，每培养皿得到的转化子数量不断增加。分生孢子浓度为1×10³个/mL、1×10⁴个/mL、1×10⁵个/mL、1×10⁶个/mL，每培养皿可分别依次平均得到3个、9个、14个、31个和67个转化子。基于实验操作和转化子特异性综合考虑，当分生孢子浓度为1×10⁵个/mL时为最适转化浓度。

2.4乙酰丁香酮浓度对转化效率的影响

不同AS浓度对灰葡萄孢转化效率统计结果如图4所示，当不添加AS时，每个培养皿平均仅得到2个转化子；随着AS浓度不断提高所得到的转化子数量不断增加，当AS浓度为200μmol/mL时，每个培养皿平均可得到33个转化子；之后，随着AS浓度不断增加转化子数量不断减少，当AS浓度达到400μmol/mL时，每个培养皿平均得到6个转化子。因此，AS浓度为200μmol/mL时为最佳转化浓度。

2.5共培养温度对转化效率的影响

不同共培养温度对灰葡萄孢转化效率统计结果如图5所示，当共培养温度为15℃时，每培养皿平均可得到7个转化子；随着共培养温度不断升高转化子数量呈现先增加后减少的趋势，当共培养温度为25℃时，转化效率最高，每培养皿平均可得到32个转化子；当共培养温度达到35℃时，每培养皿平均转化子数量则下降到11个。因此，25℃为最佳共培养温度。

2.6共培养时间对转化效率的影响

不同共培养时间对灰葡萄孢转化效率统计结果如图6所示，当共培养时间为24h、48h、72h、96h、120h，每皿分别平均可得到18个、33个、34个、26个和22个转化子；其中，共培养时间为48h和72h时转化效率相当，无显著差异，共培养时间越长转化子有多拷贝插入的比例越高，因此，48h为最适共培养时间。

2.7转化子稳定性检测及分子鉴定

随机选取8个转化子，遗传稳定性检测结果显示，在含有50μmol/mL潮霉素B的PDA培养基平板上所有转化子均可正常生长。潮霉素磷酸转移酶基因特异片段扩增结果如图7中(a)所示，灰葡萄孢野生型中无条带，8个转化子中均可扩增得到特异性条带，且大小与对照相同。表明，T-DNA片段已经整合到灰葡萄孢基因组中，并且可以稳定遗传。

转化子Southern blot检测结果如图7中(b)所示，灰葡萄孢野生型中未杂交到任何条带，8个转化子均可杂交得到特异性条带，其中6个转化子为单拷贝插入，2个转化子为双拷贝插入，单拷贝插入比例可达到75％。表明，hph基因已经整合到灰葡萄孢基因组中，且多以单拷贝形式插入。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 山东省葡萄研究院

<120> 一种农杆菌介导葡萄灰葡萄孢遗传转化体系的构建方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaagcctgaa ctcaccgcga cg 22

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cggtttccac tatcggcgag tacttctac 29

Claims

1.一种农杆菌介导葡萄灰葡萄孢遗传转化体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备含外源基因的农杆菌菌液；

2)在含乙酰丁香酮的共培养培养基中平铺一张支撑介质，将步骤1)中所述含外源基因的农杆菌菌液与灰葡萄孢的分生孢子液混合涂布至所述支撑介质上，经共培养，将共培养后的支撑介质转移至含潮霉素B和头孢噻肟钠的PDA培养基中进行筛选培养。

2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤2)中所述含外源基因的农杆菌菌液和灰葡萄孢的分生孢子液的体积比为(0.9～1.1)：(0.9～1.1)；

所述灰葡萄孢的分生孢子液的浓度为1×10⁵～1×10⁶个/mL。

3.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤2)中在共培养培养基中，所述乙酰丁香酮的终浓度为100～300μmol/mL。

4.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤2)中PDA培养基中潮霉素B的浓度为50～100μg/mL；

PDA培养基中头孢噻肟钠的浓度为300～400μg/mL。

5.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤2)中所述共培养的温度为25～30℃；所述共培养的时间为48～72h。

6.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤2)中支撑介质包括玻璃纸或硝酸纤维素膜。

7.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤1)中所述农杆菌的菌株包括根癌农杆菌；

所述根癌农杆菌的菌株为EHA105菌株。

8.根据权利要求1或7所述构建方法，其特征在于，步骤1)中所述含外源基因的农杆菌菌液的OD₆₀₀值为0.8。

9.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述灰葡萄孢的菌株为SYT3-7菌株。

10.根据权利要求1～7和9任意一项所述所述构建方法，其特征在于，所述外源基因包括潮霉素磷酸转移酶基因。