CN110257416A - 一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法 - Google Patents

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徐丽慧
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Abstract

本发明提出了一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，包括：(1)多主棒孢孢子悬浮液的制备步骤；(2)双元载体pCAMBIA1300转化农杆菌AGL1感受态细胞；筛选、鉴定阳性农杆菌转化子；(3)活化上述阳性农杆菌转化子，然后将单菌落转到含利福平和卡那霉素的LB液体培养基中培养；(4)制备阳性农杆菌转化子菌液；(5)混合菌液，并进行孵育；之后在含有乙酰丁香酮的IM培养基中培养；(6)多主棒孢阳性转化子的抗性筛选。本发明的方法转化效率高，操作简单。

Description

一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法
技术领域
本发明涉及遗传转化领域，特别是指一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法。
背景技术
多主棒孢(Corynespora cassiicola(Berk.&Curt.)Wei.)属半知菌亚门棒孢菌属丝状真菌，可侵染黄瓜、番茄、烟草、橡胶、棉花等500多种蔬菜和经济作物，引起叶斑病，每年发生面积超过66.7万公顷，损失超过50亿。致病相关基因的鉴定、克隆和功能分析将有助于揭示该病菌致病的分子机理以及病害的有效防控。目前，可采用PEG介导的原生质体遗传转化方法研究病菌的基因功能。
然而，一方面，PEG介导的原生质体遗传转化方法转化效率低；另一方面，该方法对原生质的质量要求较高，限制了该方法在多主棒孢致病相关基因功能研究上的应用。
有鉴于此，有必要研发一种多主棒孢高效遗传转化方法。
发明内容
本发明提出一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，解决了现有技术中PEG介导的原生质体遗传转化方法转化效率低的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，包括：
(1)多主棒孢孢子悬浮液的制备步骤；
(2)双元载体pCAMBIA1300转化农杆菌AGL1感受态细胞；筛选、鉴定阳性农杆菌转化子；
(3)活化上述阳性农杆菌转化子，然后将单菌落转到含利福平和卡那霉素的LB液体培养基中培养；
(4)取步骤(3)中培养后的菌液，离心收集菌体；用含有乙酰丁香酮的IM培养基洗涤所述菌体，然后再用含有乙酰丁香酮的IM培养基重悬该菌体，将菌体浓度稀释至OD600＝0.2～0.25；之后震荡培养使OD600在0.6～0.8，即为即为阳性农杆菌转化子菌液；
(5)混合步骤(1)制备的多主棒孢孢子悬浮液与步骤(4)制备的阳性农杆菌转化子菌液，并进行孵育；之后在含有乙酰丁香酮的IM培养基中培养；
(6)多主棒孢阳性转化子的抗性筛选：将步骤(5)在选择性CYA培养基上进行抗性筛选，暗箱培养直至出现明显的单菌落，即为候选转化子；所述选择性CYA培养基含有头孢和潮霉素；将所述候选转化子连续在含头孢的CYA培养基上传5代后，接种于PDA培养基上培养并产生分生孢子；制备分生孢子悬浮液并涂布于含潮霉素的选择性PDA培养基上，进一步筛选稳定遗传的多主棒孢阳性转化子。
作为优选的技术方案，所述多主棒孢孢子悬浮液的制备步骤如下：
多主棒孢菌(HG20101029-1)在PDA培养基上25℃培养10d，每天交替进行12h光照、12h黑暗；在PDA培养基中加入ddH2O，用毛笔将孢子洗下来，再用无菌纱布过滤；室温离心收集孢子，用ddH2O重悬孢子，将孢子悬浮液的孢子浓度调成2×105CFU/mL。
作为优选的技术方案，所述LB液体培养基中含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素。
作为优选的技术方案，所述阳性农杆菌转化子的活化条件为：
在含100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的LB平板上28℃活化2d。
作为优选的技术方案，所述LB液体培养基的培养条件为：28℃，200rpm-250rpm振荡培养25～30小时。
作为优选的技术方案，所述步骤(5)中的多主棒孢孢子悬浮液与阳性农杆菌转化子菌液以体积比1～1.5:1～1.5混合。
作为优选的技术方案，所述孵育的条件为28℃，时间为0.5-1小时。
作为优选的技术方案，所述选择性CYA培养基中含有200μg/mL头孢和100μg/mL潮霉素。
作为优选的技术方案，所述步骤(6)中的多主棒孢阳性转化子还包括鉴定的步骤：提取所述阳性转化子DNA，扩增潮霉素编码基因hph验证阳性转化子。
有益效果
本发明的方法操作简单，转化效率高：114～127转化子/106孢子。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的目的是提供一种高效遗传转化的方法。下述实施例中使用的物质均为市售，本发明的贡献在于操作流程和操作条件方面。
实施例1
一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，包括：
(1)多主棒孢孢子悬浮液的制备步骤；
多主棒孢菌(HG20101029-1)在PDA平皿(直径9cm)上25℃培养10d，每天交替进行12h光照、12h黑暗；(b)每平皿加入5mL ddH2O，用毛笔轻轻地将孢子洗下来，再用三层无菌纱布过滤；(c)7000rpm室温离心5min收集孢子，用ddH2O重悬孢子，将孢子悬浮液的孢子浓度调成2×105CFU/mL。
(2)双元载体pCAMBIA1300转化农杆菌AGL1感受态细胞；筛选、鉴定阳性农杆菌转化子。
(3)将上述阳性农杆菌转化子在含100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的LB平板上28℃活化2d，然后挑单菌落转到15mL含100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，28℃，250rpm振荡培养30h左右。
(4)取步骤(3)中培养后的菌液1mL，1000rpm离心收集菌体；用含有乙酰丁香酮的IM培养基洗涤一次，然后再用含有乙酰丁香酮的IM培养基重悬该菌体，将菌体浓度稀释至OD600＝0.2；之后28℃、250rpm震荡培养6h,使OD600＝0.6～0.8，即为阳性农杆菌转化子菌液。
(5)混合步骤(1)制备的多主棒孢孢子悬浮液与步骤(4)制备的阳性农杆菌转化子菌液按照体积比1:1混合均匀，28℃孵育0.5h；(2)取200μL涂在预先铺有一层无菌玻璃纸的含有乙酰丁香酮的IM平皿上，25℃黑暗共培养3d。
(6)多主棒孢阳性转化子的抗性筛选和鉴定：将共培养后的玻璃纸转移到含200μg/mL头孢和100μg/mL潮霉素的选择性CYA培养基上，进行抗性筛选，25℃黑暗培养至出现明显的单菌落，即为候选转化子；将候选转化子连续在含头孢的CYA培养基上传5代后，接种于PDA平皿上并培养至产生分生孢子，制备孢子悬浮液并涂布于含潮霉素的选择性PDA培养基上，进一步筛选稳定遗传的多主棒孢阳性转化子；提取阳性转化子DNA，扩增潮霉素编码基因hph验证阳性转化子。
实施例2
一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，包括：
(1)多主棒孢孢子悬浮液的制备步骤；
多主棒孢菌(HG20101029-1)在PDA平皿(直径9cm)上25℃培养10d，每天交替进行12h光照、12h黑暗；(b)每平皿加入5mL ddH2O，用毛笔轻轻地将孢子洗下来，再用三层无菌纱布过滤；(c)7000rpm室温离心5min收集孢子，用ddH2O重悬孢子，将孢子悬浮液的孢子浓度调成2×105CFU/mL。
(2)双元载体pCAMBIA1300转化农杆菌AGL1感受态细胞；筛选、鉴定阳性农杆菌转化子。
(3)将上述阳性农杆菌转化子在含100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的LB平板上28℃活化2d，然后挑单菌落转到15mL含100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养28h左右。
(4)取步骤(3)中培养后的菌液1mL，1000rpm离心收集菌体；用含有乙酰丁香酮的IM培养基洗涤一次，然后再用含有乙酰丁香酮的IM培养基重悬该菌体，将菌体浓度稀释至OD600＝0.25；之后28℃、250rpm震荡培养6h，使OD600＝0.6～0.8，即为阳性农杆菌转化子菌液。
(5)混合步骤(1)制备的多主棒孢孢子悬浮液与步骤(4)制备的阳性农杆菌转化子菌液按照体积比1:1.5混合均匀，28℃孵育0.5h；(2)取200μL涂在预先铺有一层无菌玻璃纸的含有乙酰丁香酮的IM平皿上，25℃黑暗共培养3d。
(6)多主棒孢阳性转化子的抗性筛选和鉴定：将共培养后的玻璃纸转移到含200μg/mL头孢和100μg/mL潮霉素的选择性CYA培养基上，进行抗性筛选，25℃黑暗培养至出现明显的单菌落，即为候选转化子；将候选转化子连续在含头孢的CYA培养基上传5代后，接种于PDA平皿上并培养至产生分生孢子，制备孢子悬浮液并涂布于含潮霉素的选择性PDA培养基上，进一步筛选稳定遗传的多主棒孢阳性转化子；提取阳性转化子DNA，扩增潮霉素编码基因hph验证阳性转化子。
实施例3
一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，包括：
(1)多主棒孢孢子悬浮液的制备步骤；
多主棒孢菌(HG20101029-1)在PDA平皿(直径9cm)上25℃培养10d，每天交替进行12h光照、12h黑暗；(b)每平皿加入5mL ddH2O，用毛笔轻轻地将孢子洗下来，再用三层无菌纱布过滤；(c)7000rpm室温离心5min收集孢子，用ddH2O重悬孢子，将孢子悬浮液的孢子浓度调成2×105CFU/mL。
(2)双元载体pCAMBIA1300转化农杆菌AGL1感受态细胞；筛选、鉴定阳性农杆菌转化子。
(3)将上述阳性农杆菌转化子在含100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的LB平板上28℃活化2d，然后挑单菌落转到15mL含100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，28℃，250rpm振荡培养30h左右。
(4)取步骤(3)中培养后的菌液1mL，1000rpm离心收集菌体；用含有乙酰丁香酮的IM培养基洗涤一次，然后再用含有乙酰丁香酮的IM培养基重悬该菌体，将菌体浓度稀释至OD600＝0.2左右；之后28℃、250rpm震荡培养6h,使OD600＝0.6～0.8，即为阳性农杆菌转化子菌液。
(5)混合步骤(1)制备的多主棒孢孢子悬浮液与步骤(4)制备的阳性农杆菌转化子菌液按照体积比1.5:1混合均匀，28℃孵育1h；(2)取200μL涂在预先铺有一层无菌玻璃纸的含有乙酰丁香酮的IM平皿上，25℃黑暗共培养3d。
(6)多主棒孢阳性转化子的抗性筛选和鉴定：将共培养后的玻璃纸转移到含200μg/mL头孢和100μg/mL潮霉素的选择性CYA培养基上，进行抗性筛选，25℃黑暗培养至出现明显的单菌落，即为候选转化子；将候选转化子连续在含头孢的CYA培养基上传5代后，接种于PDA平皿上并培养至产生分生孢子，制备孢子悬浮液并涂布于含潮霉素的选择性PDA培养基上，进一步筛选稳定遗传的多主棒孢阳性转化子；提取阳性转化子DNA，扩增潮霉素编码基因hph验证阳性转化子。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，其特征在于，包括：
(1)多主棒孢孢子悬浮液的制备步骤；
(2)双元载体pCAMBIA1300转化农杆菌AGL1感受态细胞；筛选、鉴定阳性农杆菌转化子；
(3)活化上述阳性农杆菌转化子，然后将单菌落转到含利福平和卡那霉素的LB液体培养基中培养；
(4)取步骤(3)中培养后的菌液，离心收集菌体；用含有乙酰丁香酮的IM培养基洗涤所述菌体，然后再用含有乙酰丁香酮的IM培养基重悬该菌体，将菌体浓度稀释至OD600＝0.2～0.25；之后震荡培养使OD600在0.6～0.8，即为阳性农杆菌转化子菌液；
(5)混合步骤(1)制备的多主棒孢孢子悬浮液与步骤(4)制备的阳性农杆菌转化子菌液，并进行孵育；之后在含有乙酰丁香酮的IM培养基中培养；
(6)多主棒孢阳性转化子的抗性筛选：将步骤(5)在选择性CYA培养基上进行抗性筛选，暗箱培养直至出现明显的单菌落，即为候选转化子；所述选择性CYA培养基含有头孢和潮霉素；将所述候选转化子连续在含头孢的CYA培养基上传5代后，接种于PDA培养基上培养并产生分生孢子；制备分生孢子悬浮液并涂布于含潮霉素的选择性PDA培养基上，进一步筛选稳定遗传的多主棒孢阳性转化子。
2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，其特征在于，所述多主棒孢孢子悬浮液的制备步骤如下：
多主棒孢菌(HG20101029-1)在PDA培养基上25℃培养10d，每天交替进行12h光照、12h黑暗；在PDA培养基中加入ddH2O，用毛笔将孢子洗下来，再用无菌纱布过滤；室温离心收集孢子，用ddH2O重悬孢子，将孢子悬浮液的孢子浓度调成2×105CFU/mL。
3.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，其特征在于，所述LB液体培养基中含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素。
4.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，其特征在于，所述阳性农杆菌转化子的活化条件为：
在含100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的LB平板上28℃活化2d。
5.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，其特征在于，所述LB液体培养基的培养条件为：28℃，200rpm～250rpm振荡培养25～30小时。
6.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(5)中的多主棒孢孢子悬浮液与阳性农杆菌转化子菌液以体积比1～1.5:1～1.5混合。
7.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，其特征在于，所述孵育的条件为28℃，时间为0.5～1小时。
8.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，其特征在于，所述选择性CYA培养基中含有200μg/mL头孢和100μg/mL潮霉素。
9.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(6)中的多主棒孢阳性转化子还包括鉴定的步骤：提取所述阳性转化子DNA，扩增潮霉素编码基因hph验证阳性转化子。
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