CN116813790A - 结核分枝杆菌特异性的重组融合蛋白e35及其应用 - Google Patents
结核分枝杆菌特异性的重组融合蛋白e35及其应用 Download PDFInfo
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- G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
Abstract
本发明提供了一种结核分枝杆菌特异性的重组融合蛋白E35。所述重组融合蛋白包含蛋白ESAT6和蛋白PE35，作为变态反应原，可以灵敏、特异地检测结核分枝杆菌感染并可有效区分结核分枝杆菌感染和卡介苗接种。利用该重组融合蛋白开发的结核分枝杆菌感染检测试剂能够兼顾IGRA检测的特异性以及传统TST检测的灵敏度与适应于大规模筛查的简便性，是具有应用和开发潜力的新一代LTBI筛查和诊断的产品。
Description
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，具体而言，本发明涉及一种结核分枝杆菌特异性融合蛋白及其在结核分枝杆菌感染检测中的应用。
背景技术
根据世界卫生组织(WHO)估算，当前全球约有17亿人感染了结核分枝杆菌，约占全球总人口的23％。在感染了结核分枝杆菌的人群(Latent Tuberculosis Infection，LTBI)中，约有10％-15％的人在一生中的某个时候会发展为结核病，因此对于结核潜伏感染人群的筛查与预防是结核病防治的重要手段。
目前对结核潜伏感染者筛查主要有γ-干扰素释放试验(IGRA)或结核菌素皮试(TST)两类方法。IGRA操作复杂，价格昂贵，不适合大规模人群筛查和贫困地区使用；而传统TST的特异性低，不能区别卡介苗接种与结核杆菌感染，因此需要引入新的、特异性强、操作简便的筛查方法，甄别人群中的结核分枝杆菌感染者。
本领域还采用基因工程技术制备重组结核分枝杆菌蛋白或融合蛋白作为新一代的结核菌素，来筛查结核分枝杆菌感染。这类检测方法一般为基于结核分枝杆菌早期分泌蛋白(ESAT6)和结核分枝杆菌培养过滤蛋白(CFP10)为抗原开发的皮肤试验方法，通常采用ESAT6和CFP10的混合物或由二者制成的融合蛋白。ESAT6全称为“the 6kDa earlysecreted antigenic target produced by Mycobacterium tuberculosis”，是活动性结核感染相关的主要抗原，由大小为288bp的Rv3875基因编码(Genbank：886209)，此基因位于结核杆菌基因组的RD1中。CFP10由Rv3874基因编码，和ESAT6受同一个启动子调控转录，其蛋白也属于ESAT-6家族的成员之一，两者具有相同的免疫学特性。ESAT6和CFP10这2个蛋白在卡介苗和绝大部分环境分枝杆菌中都缺失，因此相对于基于传统蛋白纯化衍生物(purified protein derivative，PPD)的检测方法，基于这两个蛋白的检测方法对结核菌感染具有相对更高的特异性。
但是已有大量研究提示，基于这两个蛋白为抗原的检测或筛查方法存在较大的安全隐患。在目前以ESAT6和CFP10作为抗原的检测试剂中，蛋白组分的含量相对于传统PPD产品要高得多。通常情况下，变态反应原含量越高，越容易引发机体的超敏反应；而已经感染结核的或体质敏感的受试者，在低蛋白量的情况下即有可能发生过敏反应。特别是CFP10，有动物实验研究结果显示，在大剂量应用时，CFP10可引起结核菌素休克；并且，还有研究表明CFP10可刺激TNF-alpha产生，也提示了CFP10作为抗原蛋白的不利之处。但同时，降低试剂中的蛋白含量会导致其灵敏度显著降低。
因此，本领域仍然存在对新型结核分枝杆菌感染检测试剂的需求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新的结核分枝杆菌感染检测试剂，其利用作为变态反应原的新型融合蛋白，在低蛋白用量的情况下以高灵敏度、高特异性检测、诊断或筛查结核分枝杆菌感染，并且有效区分结核分枝杆菌感染和卡介苗接种；同时应具有使用安全、简便的优势。
针对以上问题，本发明的一个目的是提供一种融合蛋白，该融合蛋白作为变态反应原，可以灵敏、特异地检测结核分枝杆菌感染并可有效区分结核分枝杆菌感染和卡介苗接种。本发明的另一个目的是提供包含编码该融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子、包含该核酸分子的重组载体以及包含该重组载体或被该重组载体转化或转染的宿主细胞。本发明的另一个目的是提供制备该融合蛋白的方法。本发明的再一个目的是提供该融合蛋白、核酸分子、重组载体或宿主细胞在制备用于检测结核分枝杆菌感染的试剂中的用途。本发明的又一个目的是提供包含该融合蛋白、核酸分子、重组载体或宿主细胞的用于检测、筛查或诊断结核分枝杆菌感染的试剂盒。
用于实现上述目的的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包含蛋白ESAT6和蛋白PE35。具体而言，由这两个蛋白相融合形成。
PE35是由结核分枝杆菌的RD1区Rv3872基因编码的蛋白质，由99个氨基酸组成。PE35属于PE，和PPE68(Rv3873基因编码的蛋白，属于PPE家族)协同作用，与肺结核感染后的细胞免疫反应相关，能够刺激巨噬细胞产生细胞因子。PE35可以引起CD4和CD8的反应。PE35含有T-细胞表面抗原，并且可以刺激γ-干扰素释放试验(IGRA)中γ-干扰素或者γ-干扰素诱导的IP10的分泌。PE35在卡介苗和常见的环境结核杆菌中缺失。
优选地，在本发明提供的重组融合蛋白中，蛋白ESAT6的氨基酸序列与蛋白PE35的氨基酸序列之间经由连接序列(linker)相连接。根据本发明的具体实施方式，按照所述重组融合蛋白的N端至C端的顺序，蛋白ESAT6的氨基酸序列处于蛋白PE35的氨基酸序列的N端，形成N’-ESAT6-linker-PE35-C’的结构；或者，蛋白ESAT6的氨基酸序列处于蛋白PE35的氨基酸序列的C端，形成N’-PE35-linker-ESAT6-C’的结构。
更优选地，在本发明提供的重组融合蛋白中，蛋白ESAT6的氨基酸序列处于N端，经由连接序列与处于C端的蛋白PE35的氨基酸序列相连接。根据本发明的具体实施方式，所述蛋白ESAT6包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列；和/或，所述蛋白PE35包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
本发明的上下文中使用的术语“同一性”是指两个氨基酸序列(或下文的核苷酸序列)的相似性。“同一性”可以使用本领域公知算法或软件对两个序列进行对比而确定，用百分比(％)表示。
本发明的上下文中使用的术语“至少85％同一性”是指不小于85％的任意数值(不限于整数)的同一性百分比，例如至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、乃至100％同一性。此外，所述“至少85％同一性”所形成的至多15％氨基酸序列的差异可存在于蛋白ESAT6和PE35二者的氨基酸序列之外，或者在二者之间的连接序列中。
优选地，在本发明提供的重组融合蛋白中，所述连接序列为富含GS的柔性连接序列。根据本发明的具体实施方式，所述连接序列包含一个或多个GGGSG，例如(GGGSG)n，n＝1-5，优选n＝1-3，更优选n＝1。
根据本发明的具体实施方式，本发明提供的重组融合蛋白包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
本发明的重组融合蛋白及其结构组件的序列为：
SEQ ID NO:1(E35)：
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFAGGGSGMEKMSHDPIAADIGTQVSDNALHGVTAGSTALTSVTGLVPAGADEVSAQAATAFTSEGIQLLASNASAQDQLHRAGEAVQDVARTYSQIDDGAAGVFAE
SEQ ID NO:2(ESAT6)：
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA
SEQ ID NO:3(PE35)：
MEKMSHDPIAADIGTQVSDNALHGVTAGSTALTSVTGLVPAGADEVSAQAATAFTSEGIQLLASNASAQDQLHRAGEAVQDVARTYSQIDDGAAGVFAE
另一方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明提供的重组融合蛋白的核苷酸序列。所述核苷酸序列可以是DNA序列也可以是RNA序列；相应地，所述核酸分子可以是DNA分子也可以是RNA分子，并且可以是单链的，也可以是双链的。
优选地，本发明提供的核酸分子可以是包含所述核苷酸序列的表达盒。该表达盒能够在宿主细胞中表达编码本发明提供的重组融合蛋白的核苷酸序列，并且还可任选地包括与表达相关的其他功能组件，例如启动子、终止子、增强子等。
又一方面，本发明提供一种重组载体，所述重组载体包含本发明提供的核酸分子。例如，本发明提供的重组载体可以是质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体等任何形式。再如，本发明提供的重组载体可以基于pET系统、pGEX系统、pMAL系统等任何形式。
再一方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明提供的核酸分子或重组载体，或者被所述核酸分子或重组载体转化或转染。根据本发明的具体实施方式，所述宿主细胞可以是大肠杆菌。
还一个方面，本发明提供一种制备所述重组融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
1)构建包含编码所述重组融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子；
2)构建包含步骤1)的核酸分子的重组载体；
3)使用步骤2)的重组载体转化宿主细胞，并使所述核酸分子在宿主细胞中表达所述重组融合蛋白。
任选地，所述方法还包括：
4)回收和纯化步骤3)表达的重组融合蛋白。
又一方面，本发明提供所述重组融合蛋白、核酸分子、重组载体和/或宿主细胞在制备试剂中的用途，所述试剂用于检测、筛查或诊断结核分枝杆菌感染或由结核分枝杆菌感染引起的疾病。优选地，所述试剂为皮肤试验用试剂。优选地，所述结核分枝杆菌感染为活动性结核分枝杆菌感染或潜伏性结核分枝杆菌感染。
再一方面，本发明提供包含所述重组融合蛋白、核酸分子、重组载体和/或宿主细胞的试剂盒，所述试剂盒用于检测、筛查或诊断结核分枝杆菌感染或由结核分枝杆菌感染引起的疾病。优选地，所述试剂盒为皮肤试验用试剂盒。优选地，所述结核分枝杆菌感染为活动性结核分枝杆菌感染或潜伏性结核分枝杆菌感染。
就本发明提供的上述用途或试剂盒，所述结核分枝杆菌感染为活动性结核分枝杆菌感染或潜伏性结核分枝杆菌感染，特别是在中国人群中的结核分枝杆菌感染。
相对于现有技术，本发明的发明人通过大量筛选实验，在卡介苗和绝大部分环境分枝杆菌中都缺失的众多蛋白中筛选出对结核分枝杆菌特异性的蛋白，并以特定构型形成重组融合蛋白。该重组融合蛋白作为变态反应原，可以以低剂量、良好的特异性和高灵敏度进行结核分枝杆菌引起的感染和疾病的检测。利用该重组融合蛋白开发的产品能够兼顾IGRA检测的特异性以及传统TST检测的灵敏度与适应于大规模筛查的简便性，是具有应用和开发潜力的新一代LTBI筛查和诊断的新型产品技术。
具体而言，本发明的发明人通过大量筛选实验，筛选出了蛋白PE35，来取代本领域现有常用的变态反应原中的CFP10，并以特定的ESAT6位于N端而蛋白PE35位于C端的特定构型，形成重组融合蛋白E35。与现有技术中常用的ESAT6与CFP10形成的混合物或融合蛋白(在本发明的上下文中简称为“EC”)作为变态反应原相比，本发明的重组融合蛋白具有意料不到的技术效果。
首先，实验证明，本发明中采用的蛋白PE35比CFP10具有更高的免疫原性，检测效果更佳。除了单独的CFP10和PE35相比较，通过对比融合蛋白E35与再加上CFP10的ESAT6-PE35-CFP10融合蛋白(在本发明的上下文中简称为“E35C”)，后者均没有进一步提高免疫原性，因此可以证实CFP10并不是必需的。
CFP10的去除使用避免了CFP10的潜在安全隐患；而更高免疫原性的PE35的加入使得该变态反应原涵盖了结核分枝杆菌基因组中RD1区域的功能上不相关的两个蛋白。因此，融合蛋白E35不仅保持与EC同样、甚至更佳的高特异性，同时预计将会比EC在诊断不同的人群中有更好的灵敏度。并且，在得到PE35的筛选过程中，本发明的发明人意外地发现，虽然有些蛋白也是属于卡介苗缺失区域的蛋白，但其与ESAT6形成的融合蛋白仍在卡介苗致敏的豚鼠中表现了一定程度的阳性，因此无法良好区分结核感染和卡介苗接种。比如前面提到的PPE68，虽然和PE35同属于RD1区域，并且和PE35功能相近，但是PPE68和ESAT6组成的融合蛋白在卡介苗致敏的豚鼠中表现非常高概率的阳性，因此，不能用于结核感染的皮肤检测。
同时，本发明人意外地发现，PE35单独作为变态反应原时，短至10小时就在结核杆菌致敏的豚鼠中表现了非常强的免疫原性，并且所有测试的4只豚鼠的DTH值均大于10毫米，但12小时后，PE35作为变态反应原的豚鼠的阳性反应消失。而当PE35和ESAT6组成融合蛋白时，E35的DTH阳性反应却一直从10小时持续到72小时，由此表明，PE35更适于与ESAT6组成融合蛋白作为变态反应原。
并且，本发明人证明融合蛋白E35在低剂量时即具有较高的灵敏度，甚至只需要EC用量的一半就可以达到比EC高的灵敏度。由此可知，本发明提供的重组融合蛋白在维持高特异性和高灵敏度的同时，还提高了适用的安全性和便捷性。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1：实施例2中变态反应原注射结核杆菌感染豚鼠后的10小时DTH反应结果。其中，E35(1mcg)和E(1mcg)比较P<0.01(极显著差异)；E35(1mcg)和EC(1mcg)比较P>0.05(无显著性差异)。
图2：实施例2中变态反应原注射结核杆菌感染豚鼠后的12小时DTH反应结果。其中，E35(1mcg)和E(1mcg)比较P<0.05(显著差异)；E35(1mcg)和EC(1mcg)比较P>0.05(无显著性差异)。
图3：实施例2中变态反应原注射结核杆菌感染豚鼠后的24小时DTH反应结果。其中，E35(1mcg)和E(1mcg)比较P<0.05(显著差异)；E35(1mcg)和EC(1mcg)比较P>0.05(无显著性差异)。
图4：实施例2中变态反应原降低剂量后注射结核杆菌感染豚鼠免疫豚鼠的24小时和48小时DTH反应结果。其中在结核分枝杆菌感染的结果中，E35(0.5mcg)和EC(1mcg)比较P>0.05(无显著性差异)。
图5：实施例2中变态反应原降低剂量后注射卡介苗免疫豚鼠的24小时和48小时DTH反应结果。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1变态反应原的筛选
为了筛选出高灵敏度以及卡介苗接种后特异性好的重组蛋白，选择结核分枝杆菌基因组的RD1区的Rv3872(PE35，UniProt：P9WIG7)、Rv3873(PPE68，UniProt：P9WHW9)、Rv3874(CFP-10，UniProt：P9WNK5)、Rv3875(ESAT-6，UniProt：P9WNK7)，RD2区的Rv1980c(MPT64，UniProt：P9WIN9)，RD11区的Rv3425(PPE57，UniProt：Q50703)，RD13区的Rv2654c(TB7.7，UniProt：P9WJ11)以及非RD区的Rv2031c(HspX，UniProt：P9WMK1)、Rv0061(DPPD，UniProt：I6X8E6)作为候选蛋白，并以(GGGSG)1-3为连接序列构建这些候选目标蛋白的二蛋白融合蛋白和三蛋白融合蛋白，见表1。重组融合蛋白的制备以EM为例，示于下文的实施例3。
表1进行结核分枝杆菌特异性变态反应原筛选的候选蛋白
如下，将表1中的重组融合蛋白以及单个蛋白用于结核分枝杆菌特异性重组融合蛋白的筛选，并以TB-PPD(北京祥瑞生物制品有限公司，批次：20210412)和EC(安徽智飞龙科马生物制药有限公司，批次：202006006)作为参考品。
1.致敏原与实验动物：
采用结核杆菌弱毒菌H37Ra活菌与卡介菌致敏豚鼠，以重组蛋白作为重组结核杆菌变态反应原。
使用SPF级Hartley豚鼠300-500g，由中国食品药品检定研究院动物中心提供，许可证号：SCXK(京)2017-0005，合格证编号：111251210100093285。
2.动物致敏：
第一次致敏：分别用1ml注射器吸取的致敏原，于豚鼠腹股沟皮下注射，注射剂量0.2ml/只：
(1)结核杆菌H37Ra活菌致敏原50mg/ml致敏豚鼠，分别做好标记。致敏豚鼠于P2动物室饲养；
(2)卡介菌致敏原50mg/ml致敏豚鼠，分别做好标记。致敏豚鼠SPF动物室饲养。
第二次致敏：第一次致敏后2-3周，结核杆菌H37Ra活菌致敏原致敏动物进行第二次致敏。
2.皮试
皮试时间为第一次致敏后5周。具体过程如下：
取结核分枝杆菌(50mg/ml，0.2ml/只)或卡介菌(50mg/ml，0.2ml/只)致敏后5周的豚鼠随机分组，去毛后于背部脊柱两侧相对部位，酒精消毒后，皮内注射0.1mL(含10mcg/ml候选重组蛋白；或者5IU TB-PPD(1mcg/ml)；5U EC参考品(10mcg/ml)。于注射后观察局部硬结的纵径于横径。有反应则记录局部硬结或红晕的纵经与横径。以平均硬结或红晕反应(纵径与横径相加除以2)低于5mm判为阴性，大于或等于5mm判为阳性。
豚鼠皮试实验检测不同抗原诱导结核分枝杆菌感染豚鼠迟发性超敏反应(DTH)或卡介苗免疫豚鼠迟发性超敏反应(DTH)，筛选候选蛋白，每组4只豚鼠重复。注射后观察皮肤反应情况，记录H37Ra致敏或BCG免疫豚鼠DTH反应。
结果发现，绝大多数1mcg/0.1ml的重组融合变态反应原样品对结核杆菌感染豚鼠24小时后引起的致敏反应均高于TB-PPD参考品；但是，24小时后对卡介苗致敏的豚鼠的DTH皮试结果中发现以下的融合蛋白：E7.7、C7.7、EC7.7、7.7EC、E68、E68C以及E35C在4只测试的豚鼠中分别有1-4只的豚鼠表现阳性反应。因此这些融合蛋白作为变态反应原，并不能很好地区分结核感染者和卡介苗接种者。尤其含Tb7.7和PPE68的由2-3个蛋白组成的融合蛋白，基本都在卡介苗致敏的豚鼠中表现了一定程度的阳性。虽然理论上Tb7.7和PPE68分别属于RD1和RD13区域，均属于卡介苗缺失区域，但是推测这些蛋白有可能和卡介苗中的其它蛋白存在一定的序列相似性，因此，在卡介苗致敏的豚鼠中也引起了阳性反应。
PE35和ESAT6组成的E35在卡介苗致敏豚鼠中表现为阴性，但是PE35和ESAT6以及CFP10组成的E35C有1/4在卡介苗致敏的豚鼠中表现为阳性。由于以上融合蛋白在卡介苗致敏的豚鼠中的阳性反应，这些融合蛋白在候选目标蛋白中首先被剔除。
实施例2重组融合蛋白E35的检测效果
当用1mcg/0.1ml的单一蛋白ESAT6、CFP10和PE35以及融合蛋白E35和E35C重组变态反应原样品对结核杆菌感染豚鼠引起的致敏反应进行比较时(图1)，本发明人吃惊地发现，仅仅注射10小时后，单一蛋白样品ESAT6和PE35注射的全部4只豚鼠就均产生了非常强的免疫反应，反应强度和TB-PPD参考品相近，而CFP10注射的豚鼠只有1只豚鼠产生了免疫反应，表明了PE35的免疫原性远远高于CFP10。
同时，融合蛋白E35和单一的ESAT6进行对比时，E35注射的豚鼠的反应强度高于单一的ESAT6(平均红晕反应直径17.6mm vs 14.8mm)，并且这个区别有非常显著的统计学的意义(p<0.01)，表明和单一的蛋白ESAT6相比，融合的E35有更强的免疫原性。
更重要的是，通过对豚鼠的免疫反应继续观察，本发明人吃惊的发现，注射12小时后(图2)，单一的PE35注射的豚鼠的DTH反应已经消失。但是融合蛋白E35仍保持非常强的免疫原性，并且E35注射的豚鼠的DTH反应一直高于ESAT6单一蛋白，并且这个差别有统计学的意义(p<0.05)。但是E35C和E35比较，并没有提高免疫原性。继续观察24小时后的注射结果和12小时的结果类似；即，E35融合蛋白的免疫原性一直高于单一的ESAT6(图3)。
由于1mcg/0.1ml E35注射的豚鼠DTH反应远远高于TB-PPD参考品(24小时检测结果为15.5vs 10.6mm)，本实施例中降低重组融合蛋白E35的皮试注射量，在注射后24小时和48小时观察皮肤反应情况，分别记录H37Ra致敏与卡介苗免疫豚鼠DTH反应。实验过程如实施例1所述。
将皮试注射量降低至0.5mcg/0.1ml，注射后24小时和48小时的皮肤测试结果见图4和图5，结果显示，E35重组结核杆菌变态反应原蛋白在使用参考品EC 50％的皮试剂量即可达到优于EC的效果，并且对卡介苗免疫豚鼠呈阴性，再次验证了E35可有效鉴别结核感染与卡介苗免疫。而作为对照，TB-PPD在结核杆菌和卡介苗致敏的豚鼠中均引起致敏反应，因此不能区分结核杆菌感染者和卡介苗接种者。同时，可以看出，E35注射24小时后效果最强烈，但是48小时后的皮试反应仍然可以用作诊断测试。
实施例3重组融合蛋白E35的制备
(1)质粒构建：首先对融合蛋白ESAT6-PE35(E35)的氨基酸序列进行密码子优化为大肠杆菌的密码子，通过该酶切位点克隆至载体pET-28A-SUMO，构建得到重组质粒，命名为PET-28A-SUMO-ESAT6-PE35。
(2)将质粒PET-28A-SUMO-ESAT6-PE35转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，菌株命名为BL21_SUMO-E35。
(3)将BL21_SUMO-E35工程菌接种于5ml含50mcg/ml的硫酸卡那霉素的LB培养基中，置37℃恒温振荡器中过夜培养后，按1％的接种量接种于400ml含50mcg/ml的硫酸卡那霉素的LB培养基中，置37℃恒温振荡器中培养，直到OD600达到0.4-0.5，加入终浓度为0.25mmol/L的IPTG继续在37℃诱导3小时。
(4)收集菌体，加入裂解液(PBS+0.3M NaCl+30mM imidazole+30mg/ml溶菌酶+2mMPMSF)，超声破碎后，高速离心(25,000g，30分钟)，收集上清，然后加入到HIS60镍柱中进行纯化。经过洗杂液(PBS+0.3M NaCl+30mM imidazole)洗掉杂质后，用洗脱液(25mM TrispH8.0，0.5M NaCl，10％glycerol，0.25M imidazole)洗脱SUMO-E35。向洗脱的SUMO-E35中加入SUMO蛋白酶进行酶切过夜，然后重新加入到HIS60镍柱中，切下来的SUMO标签、未完全切割的SUMO-E35以及SUMO蛋白酶全部含有HIS标签，但是E35蛋白不含任何标签，因此在流穿液中。收集流穿液，即得到纯化的融合蛋白E35。
总之，以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
序列表
<110> 安博智联（北京）生物科技有限公司
安博智联（苏州）生物科技有限公司
<120> 结核分枝杆菌特异性的重组融合蛋白E35及其应用
<130> LC21110103
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 1
Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser
1 5 10 15
Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly
20 25 30
Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu
50 55 60
Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly
65 70 75 80
Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Met Glu Lys Met Ser His Asp Pro Ile Ala Ala Asp
100 105 110
Ile Gly Thr Gln Val Ser Asp Asn Ala Leu His Gly Val Thr Ala Gly
115 120 125
Ser Thr Ala Leu Thr Ser Val Thr Gly Leu Val Pro Ala Gly Ala Asp
130 135 140
Glu Val Ser Ala Gln Ala Ala Thr Ala Phe Thr Ser Glu Gly Ile Gln
145 150 155 160
Leu Leu Ala Ser Asn Ala Ser Ala Gln Asp Gln Leu His Arg Ala Gly
165 170 175
Glu Ala Val Gln Asp Val Ala Arg Thr Tyr Ser Gln Ile Asp Asp Gly
180 185 190
Ala Ala Gly Val Phe Ala Glu
195
<210> 2
<211> 95
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）
<400> 2
Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser
1 5 10 15
Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly
20 25 30
Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu
50 55 60
Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly
65 70 75 80
Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala
85 90 95
<210> 3
<211> 99
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）
<400> 3
Met Glu Lys Met Ser His Asp Pro Ile Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gln
1 5 10 15
Val Ser Asp Asn Ala Leu His Gly Val Thr Ala Gly Ser Thr Ala Leu
20 25 30
Thr Ser Val Thr Gly Leu Val Pro Ala Gly Ala Asp Glu Val Ser Ala
35 40 45
Gln Ala Ala Thr Ala Phe Thr Ser Glu Gly Ile Gln Leu Leu Ala Ser
50 55 60
Asn Ala Ser Ala Gln Asp Gln Leu His Arg Ala Gly Glu Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Val Ala Arg Thr Tyr Ser Gln Ile Asp Asp Gly Ala Ala Gly Val
85 90 95
Phe Ala Glu
Claims (14)
1.一种重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包含蛋白ESAT6和蛋白PE35。
2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，在所述重组融合蛋白中，蛋白ESAT6的氨基酸序列与蛋白PE35的氨基酸序列之间经由连接序列(linker)相连接。
3.根据权利要求1或2所述的重组融合蛋白，其特征在于，按照所述重组融合蛋白的N端至C端的顺序，蛋白ESAT6的氨基酸序列处于蛋白PE35的氨基酸序列的N端，形成N’-ESAT6-linker-PE35-C’的结构；或者，蛋白ESAT6的氨基酸序列处于蛋白PE35的氨基酸序列的C端，形成N’-PE35-linker-ESAT6-C’的结构。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组融合蛋白，其特征在于，蛋白ESAT6的氨基酸序列处于N端，经由连接序列与处于C端的蛋白PE35的氨基酸序列相连接；
优选地，所述蛋白ESAT6包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列；和/或，
所述蛋白PE35包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组融合蛋白，其特征在于，在所述重组融合蛋白中，所述连接序列为富含GS的柔性连接序列；
优选地，所述连接序列包含一个或多个GGGSG，例如(GGGSG)n，n＝1-5，优选n＝1-3，更优选n＝1。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
7.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码权利要求1至6中任一项所述的重组融合蛋白的核苷酸序列。
8.根据权利要求7所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为包含所述核苷酸序列的表达盒，所述表达盒任选地还包含与所述核苷酸序列表达相关的其他功能组件。
9.一种重组载体，所述重组载体包含权利要求7或8所述的核酸分子。
10.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求7或8所述的核酸分子或权利要求9所述的重组载体，或者被所述核酸分子或重组载体转化或转染。
11.一种制备权利要求1至6中任一项所述的重组融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
1)构建包含编码所述重组融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子；
2)构建包含步骤1)的核酸分子的重组载体；
3)使用步骤2)的重组载体转化宿主细胞，并使所述核酸分子在宿主细胞中表达所述重组融合蛋白；
任选地，所述方法还包括：
4)回收和纯化步骤3)表达的重组融合蛋白。
12.权利要求1至6中任一项所述的重组融合蛋白、权利要求7或8所述的核酸分子、权利要求9所述的重组载体和/或权利要求10所述的宿主细胞在制备试剂中的用途，所述试剂用于检测、筛查或诊断结核分枝杆菌感染或由结核分枝杆菌感染引起的疾病。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述试剂为皮肤试验用试剂；
优选地，所述结核分枝杆菌感染为活动性结核分枝杆菌感染或潜伏性结核分枝杆菌感染。
14.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1至6中任一项所述的重组融合蛋白、权利要求7或8所述的核酸分子、权利要求9所述的重组载体和/或权利要求10所述的宿主细胞。
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