CN102260328B - 结核分枝杆菌的抗原蛋白及应用 - Google Patents
结核分枝杆菌的抗原蛋白及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，与传染病分子诊断技术领域有关。本发明具体涉及三种结核分枝杆菌抗原蛋白的制备及其在制备结核病诊断检测试剂盒中的应用。所述的结核分枝杆菌抗原蛋白，它们的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1，3，5所示，它们编码的蛋白质的氨基酸序列分别如序列表SEQ ID NO：2，4，6所示。生物学试验表明本发明制备的三种结核分枝杆菌抗原蛋白能够在制备结核病诊断检测试剂盒中应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，也涉及到传染病分子诊断技术领域，具体涉及3种结核分枝杆菌抗原蛋白及在制备结核病诊断检测试剂盒中的应用。
背景技术
动物细菌性传染病对人类健康的威胁日益严重，给国民经济和社会稳定造成冲击和影响。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，结核病的主要致病菌)是一种严重危害人类健康的病原菌，全世界有三分之一人口携带处于潜伏状态的结核分枝杆菌，每年大约有两百万人死于结核病(Raviglione M C.The TB epidemic from1992to2002.Tuberculosis(Edinb)，2003，83∶4-14.)。近年来，结核分枝杆菌合并人类免疫缺陷病毒(HIV)感染及多重耐药结核菌株的出现，对人类公共卫生事业的威胁更加严峻。因此，开发结核病及耐药结核病的简单、快速、敏感的诊断技术，成为当前控制结核病的重要策略和手段。
到目前为止，临床上结核病的诊断标准主要是在显微镜下直接观察结核分枝杆菌的痰涂片法。但是，痰标本细菌学检查的灵敏度非常低，临床上主要还根据临床症状和影像学资料来综合诊断结核病。而另一个诊断标准结核杆菌培养作为结核病诊断的“金标准”，需要耗费大量的时间，同时还需要有高水平的技术人员操作，限制了其在临床结核病诊断中的应用。
研究人员利用各种新兴的分子生物学以及现代免疫学理论和技术，已经开发出一些有希望的检测方法，比如快速分枝杆菌全自动培养和检测、噬菌体生物扩增法和噬菌体生物发光法、利用DNA或者RNA的扩增技术、利用新型免疫学方法等。但是，这些技术均需要高成本以及高技术水平的操作人员，限制了它们在低收入国家的推广的和应用，而这些国家的结核病感染率往往都比较高。
鉴于此，本发明申请人根据前期从结核分枝杆菌基因组序列中筛选得到的三个抗原蛋白编码基因，将其在大肠杆菌中克隆表达纯化，并进一步应用于结核病的体外分子诊断。本发明建立了一种快速、低成本、易于操作的基于ELISA技术的结核病诊断方法，该方法与在中国市场上应用较为广泛使用的两种同类试剂盒TB-DOT(上海奥普生物医药有限公司)和TB-check-1(法国VEDA LAB公司)相比，敏感性和特异性都得到了显著提高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，通过分子生物学技术和方法，制备三种适用于诊断检测结核病的新型结核分枝杆菌抗原蛋白，将所述的三种新型抗原蛋白应用于结核病的ELISA诊断检测。
本发明是这样实现的：
申请人前期从结核分枝杆菌基因组序列中筛选得到三个基因片段，它们能够强烈的与结核病人的血清发生反应。它们的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1，3，5所示，它们编码的氨基酸序列分别如序列表SEQ ID NO：2，4，6所示。其中从Rv1987基因(NCBI登录号NP_216503.1，GeneID：885815，基因注释为可能的几丁质酶)中筛选得到如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，序列长度为0.429kb，从Rv3807c基因(NCBI登录号NP_218324.1，GeneID：886134，基因注释为可能的保守的跨膜蛋白)中筛选得到如序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，序列长度为0.498kb，从Rv3887c基因(NCBI登录号 NP_218404.1，GeneID：886211，基因注释为可能的保守的跨膜蛋白)中筛选得到如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，序列长度为1.53kb。申请人通过基因克隆方法，获得含有这三个抗原蛋白的重组大肠杆菌。然后，在大肠杆菌中表达纯化这三个结核分枝杆菌抗原蛋白。最后，利用获得的抗原蛋白进行结核病的检测，并与市售的结核病诊断试剂盒的检测结果进行比较。
生物学试验表明，本发明克隆的上述三个基因编码的抗原蛋白可以作为特异性抗原蛋白应用于结核病的检测。
在本发明的实施例中，申请人提供了三种结核分枝杆菌抗原蛋白的详细制备方法，并描述了这三个抗原蛋白在结核病诊断中的应用前景。
本发明的优点是，操作成本低，并能够快速、便捷、准确的检测结核病。
本发明更详细的技术方案参见《具体实施方式》。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的Rv1987基因片段的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆的Rv1987基因片段编码的蛋白质的氨基酸序列。
序列表SEQ ID NO：3是本发明克隆的Rv3807c基因片段的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：4是本发明克隆的Rv3807c基因片段编码的蛋白质的氨基酸序列。
序列表SEQ ID NO：5是本发明克隆的Rv3887c基因片段的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：6是本发明克隆的Rv3887c基因片段编码的蛋白质的氨基酸序列。
序列表SEQ ID NO：7-12的序列是克隆Rv1987、Rv3807c、Rv3887c三个基因片段的六条引物序列。
图1：本发明的技术流程图。
图2：本发明使用的抗原基因序列在结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组中所处的位置(括号内显示为有下划线的为所述的抗原序列在NCBI数据库中的编号，其后的冒号后的数字为该编号所示序列在结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组中的位置，该位置后显示的加粗斜体字为所述的结核分枝杆菌的菌株号)。
图3：是本发明使用的pET-28a(+)载体图谱。
图4：是本发明的结核分枝杆菌抗原蛋白编码基因的PCR扩增结果。从左到右样品依次是：Marker、Rv1987、Rv3807c、Rv3887c。
图5：是本发明的结核分枝杆菌抗原蛋白编码基因的双酶切验证结果。从左到右样品依次是：Marker、Rv1987、Rv3807c、Rv3887c。
图6：是本发明的结核分枝杆菌抗原蛋白的纯化结果。从左到右样品依次是：Marker、Rv1987、Rv3807c、Rv3887c、Mutiple-antigen(即混合抗原蛋白：将Rv1987、Rv3807c和Rv3887c按浓度比为1∶1∶1的比例混合)。
图7：是本发明的结核分枝杆菌抗原蛋白的western-blot结果。从左到右样品依次是：Rv1987、Rv3807c、Rv3887c。
图8：本发明的结核分枝杆菌抗原蛋白与两种商购的试剂盒(TB-DOT和TB-check-1)在结核病诊断中的敏感性的比较结果。从左到右样品依次是：Mutiple-antigen、Rv3807c、Rv3887c、Rv1987、TB-DOT、TB-check-1。
图9：本发明的结核分枝杆菌抗原蛋白与两种商购的试剂盒(TB-DOT和TB-check-1)在结核病诊断中的特异性的比较结果。从左到右样品依次是：Mutiple-antigen、Rv3807c、Rv1987、Rv3887c、TB-check-1、TB-DOT。
图10：本发明的结核分枝杆菌抗原蛋白与两种商购的试剂盒(TB-DOT和TB-check-1)在结核病诊断 中的准确性的比较结果。从左到右样品依次是：Mutiple-antigen、Rv3807c、Rv3887c、Rv1987、TB—DOT、TB-check-1。
具体实施方式
实施例1：结核分枝杆菌抗原蛋白编码基因的PCR扩增
申请人前期从结核分枝杆菌基因组序列中筛选得到三个基因片段，它们能够强烈的与结核病人的血清发生反应。它们的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1，3，5所示，它们编码的氨基酸序列分别如序列表SEQ ID NO：2，4，6所示。其中从Rv1987基因(NCBI登录号NP_216503.1，GeneID：885815，基因注释为可能的几丁质酶)中筛选得到如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，序列长度为0.429kb，从Rv3807c基因(NCBI登录号NP_218324.1，GeneID：886134，基因注释为可能的保守的跨膜蛋白)中筛选得到如序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，序列长度为0.498kb，从Rv3887c基因(NCBI登录号NP_218404.1，GeneID：886211，基因注释为可能的保守的跨膜蛋白)中筛选得到如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，序列长度为1.53kb。
1、结核分枝杆菌抗原蛋白编码基因的引物设计方法：根据NCBI提供的结核分枝杆菌H37Rv(结核分枝杆菌H37Rv菌株的公众获得来源：中国医学细菌保藏管理中心，菌种编号为：93004。网址：http://www.cmccb.org.cn/)基因组核酸序列(NCBI登录号：AL123456.2)获得结核分枝杆菌抗原蛋白编码基因的核苷酸序列，根据编码基因内部的酶切位点，选择基因内部没有的酶切位点组合(使用SacI和NotI的酶切位点组合)，从编码基因的前后各取20bp设计引物，具体引物序列如下(下划线所示为酶切位点序列)：
引物R1987forward：ATAT GAGCTC ATGGCCGGACTGAACATTTA，(见序列表SEQ ID NO：7)
引物R1987reverse：GAGCG GCGGCCGC CTAGGTGCAAGGATATTGCC；(见序列表SEQ ID NO：8)
引物R3807cforward：GATG GAGCTC ATGGTGGCCGTGCAGTCGGC，(见序列表SEQ ID NO：9)
引物R3807creverse：GAGAG GCGGCCGC TCATCTCTTCCGGGCCCTTT；(见序列表SEQ ID NO：10)
引物R3887cforward：TTAT GAGCTC GTGACTGCGCCGCATAAGGT，(见序列表SEQ ID NO：11)
引物R3887creverse：CGAGC GCGGCCGC TTAGTGGCGAAGCCATGCAA。(见序列表SEQ ID NO：12)
对应基因的PCR结果参见图4。PCR反应体系和反应条件如表1和表2：
表1PCR反应体系
表2PCR反应条件
PCR严物回收纯化：
采用上海生物工程技术有限公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收DNA片段，按照UNIQ-10柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒的说明书的步骤进行，具体操作如下：
(1)用1.0％的琼脂糖胶电泳，使目的DNA片段与其它DNA分开，在紫外灯下，用在酒精灯火焰上烧过的手术刀片切下含有目的DNA片段的琼脂块，放入1.5ml灭菌离心管中；
(2)按每100mg琼脂糖胶加入400μl Binding Buffer，置55℃水浴中10分钟，使琼脂糖凝胶彻底融化(加热溶胶时，每2分钟混匀一次)；
(3)将UNIQ-10柱放入收集管中，将融化的胶溶液转移到UNIQ-10柱中，室温静置2分钟，室温8000转/分钟离心1分钟；
(4)倒掉收集管中的废液，向UNIQ-10柱中加入500μl Wash Solution，室温8000转/分钟离心1分钟；
(5)重复步骤4；
(6)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，室温12000转/分钟离心1分钟；
(7)将UNIQ-10柱放入一个灭菌的1.5ml离心管中，在柱子底部的膜中央加20μl ddH2O，室温放置2分钟后，12000转/分钟离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，保存于-20℃备用。
实施例2：构建结核分枝杆菌抗原基因的组氨酸标签融合表达载体
本实施例中使用的通用LB培养基和附加的抗生素卡那霉素(见具体步骤所示)配方参见J.萨姆布鲁克，EF.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002年。
(1)将通过实施例1获得的结核分枝杆菌抗原蛋白编码基因PCR产物和pET28a表达载体(载体图谱见图3)分别经对应限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司)消化；
(2)将通过步骤(1)获得的酶切产物和载体在16℃进行连接过夜；
连接反应的体系见表3：
表3连接反应的体系
(3)连接产物的转化：取100μl DH5α感受态细胞(购自上海超研生物科技有限公司)加入到1.5mlEP管中，加入通过步骤(2)获得的连接产物各5μl并混匀。置冰上30分钟后，42℃热激90秒，冰浴1分钟。加入400μl LB培养基，于37℃200转/分钟振荡培养45分钟。复苏后的大肠杆菌菌液于4000转/分钟离心3分钟，弃去400μl上清，将剩余的100μl重悬并涂布于含有30μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板，37℃倒置培养16h至菌落出现；
(4)分别将得到的转化子接种至LB培养基37℃培养过夜；
(5)质粒的提取：将菌液转入1.5ml离心管内，于4℃12000转/分钟离心1分钟，弃上清，倒立离心管于吸水纸上，使液体流尽。加入100μl冰预冷的溶液I，用移液器反复吹吸使菌体充分悬浮，再加入200μl新鲜配制的溶液II，反复颠倒离心管数次，冰浴5min，最后加入150μl冰预冷的溶液III，温和颠倒离心管数次，冰浴10min。于4℃以12000转/分钟离心6分钟，吸取上清至另一支1.5ml离心管中，加入2倍体积的无水丙醇，混和均匀，室温静置5min。室温12000转/分钟离心6分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇漂洗后，自然干燥。沉淀用20μl ddH2O溶解。即得到结核分枝杆菌抗原基因的组氨酸标签重组表达载体；
(6)重组质粒的双酶切鉴定：分别利用SacI和NotI酶切重组表达质粒，酶切后应出现预期大小的外源片段和载体片断即为正确的重组质粒。重组质粒的双酶切结果参见图5。
实施例3：结核分枝杆菌抗原蛋白在大肠杆菌中诱导表达
本实施例中使用的通用LB培养基和附加的抗生素卡那霉素(见具体步骤所示)配方参见J.萨姆布鲁克，EF.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002年。
(1)将通过实施例2获得的重组质粒分别转化BL21(DE3)菌株(购自上海超研生物科技有限公司)：取100μl BL21(DE3)感受态细胞加入到1.5mlEP管中，加入通过实施例3获得的重组质粒各1μl并混匀。置冰上30分钟后，42℃热激90秒，冰浴1分钟。加入400μl LB培养基，于37℃200转/分钟振荡培养45分钟。复苏后的大肠杆菌菌液于4000转/分钟离心3分钟，弃去400μl上清，将剩余的100μl重悬并涂布于含有30μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板，37℃倒置培养16h至菌落出现；
(2)从步骤(1)转化得到的平板上挑取单菌落接入1ml含有卡那霉素(30μg/ml)的LB培养基中。于37℃摇床培养过夜；
(3)向步骤(2)获得的过夜培养物中加入1ml含有卡那霉素(30μg/ml)以及IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，终浓度1.0mM)的LB培养基。于37℃摇床继续培养12个小时；
(4)将通过步骤(3)获得的培养物转移至1.5ml离心管中，12000转/分钟离心1分钟收集菌体，倒去上清，将菌体于-20℃保存。
实施例4：结核分枝杆菌抗原蛋白的变性纯化
本实施例中使用的缓冲液B、C和E配方参见表4所示。
表4实施例4中使用的缓冲液B、C和E的组分及其配比
(1)向在实施例3中收集的菌体中加入1ml缓冲液B，于37℃摇床孵育过夜，使菌体裂解；
(2)将步骤(1)裂解后的菌体于4℃，16000转/分钟离心1小时，将上清取出到1.5ml离心管；
(3)取20μl镍亲和层析胶珠(购自GE公司)到一个1.5ml离心管，加入1ml磷酸缓冲液(PBS，配方参见上述《分子克隆技术实验指南》，2002年，科学出版社，pH7.4)，轻柔混匀，2000转/分钟离心10秒，小心吸出上清，重复三次；
(4)向步骤(3)的胶珠里加入0.5ml50mM NiSO4，轻柔混匀，2000转/分钟离心10秒，小心吸出上清；
(5)向步骤(4)的胶珠里加入1ml PBS，轻柔混匀，2000转/分钟离心10秒，小心吸出上清，重复三次；
(6)向步骤(5)的胶珠里加入1ml缓冲液B，轻柔混匀，2000转/分钟离心10秒，小心吸出上清；
(7)将步骤(2)获得的上清与步骤(6)获得的胶珠在一个1.5ml离心管中室温混匀1小时，2000转/分钟离心10秒，小心吸出上清；
(8)向步骤(7)的胶珠里加入1ml缓冲液C，轻柔混匀，2000转/分钟离心10秒，小心吸出上清；
(9)向步骤(8)的胶珠里加入50μl缓冲液E，轻柔混匀，2000转/分钟离心10秒，小心吸出上清；
(10)通过步骤(9)获得的上清中即包含结核分枝杆菌抗原蛋白；
(11)结核分枝杆菌抗原蛋白浓度的测定：使用Thermo Scientific NANODROP100Spectrophotometer测定蛋白质的浓度，按照该仪器的使用说明书进行操作。
实施例5：结核分枝杆菌抗原蛋白的SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)和western-blot检测
本实施例中使用的缓冲液配方如下：
2×SDS上样缓冲液(10ml)：称取0.4g SDS，加入1ml Tris-Cl(pH6.8)，2ml1％溴酚蓝，4ml50％甘油，1ml ddH2O，充分搅拌溶解；
1M DTT：称取3.09g DTT粉末，加入20ml的0.01M NaOAc(pH5.2)，溶解后使用0.22μm滤膜过滤除菌，分装成小份，-20℃保存；
30％丙烯酰胺溶液：称取290g丙烯酰胺，10g N，N’-亚甲基双丙烯酰胺，加入600ml ddH2O，充分搅拌溶解，用ddH2O定容至1L，用0.45μm滤膜过滤，与棕色瓶中4℃保存；
2.0M Tris-Cl(pH8.8)：称取242.2g Tris-碱，加入800ml ddH2O，用浓HCl调节pH至8.8，用ddH2O定容至1L；
1.0M Tris-Cl(pH6.8)：称取121.1g Tris-碱，加入800ml ddH2O，用浓HCl调节pH至6.8，用ddH2O定容至1L；
10％SDS：称取10g十二烷基硫酸钠(SDS)，加入80ml ddH2O，68℃加热溶解，滴加浓盐酸调节pH至7.2，用ddH2O定容至100ml；
10％过硫酸铵：称取1g过硫酸铵，加入10ml ddH2O充分搅拌溶解，贮存与4℃；
5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：称取15.1g Tris-碱，94g甘氨酸，5g SDS，用ddH2O定容至1L；
染色液：称取1g考马斯亮蓝R-250，依次加入250ml异丙醇，100ml冰醋酸和650ml ddH2O；
脱色液：100ml醋酸，50ml乙醇，850ml ddH2O；
转移缓冲液：39mM甘氨酸，48mM Tris-碱，0.037％SDS(电泳级)，20％甲醇。(2.9g甘氨酸，5.8gTris-碱，0.37g SDS，200mL甲醇，用ddH2O定容到1L)；
TBS缓冲液：称取8.8g NaCl，加入20ml 1M Tris-Cl(pH8.0)，用ddH2O定容至1L；
TBST缓冲液：在TBS中加入终浓度为0.05％Tween-20；
DAB显色液(购自武汉意德生物技术有限公司)：向1ml ddH2O中分别滴加A液、B液、C液各一滴，混合均匀。
具体实施步骤：
(1)SDS-PAGE电泳样品的制备：取10μl通过实施例4得到的结核分枝杆菌抗原蛋白，加入2×SDS上样缓冲液8μl，1M DTT2μl，混匀后于100℃10min，12000转/分钟离心1分钟；
(2)SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制及电泳：
13.5％的分离胶配制体系见表5：
表5实施例5中分离胶的组分及其配比
将各成分加入后迅速混合，加入制胶板中，表面覆盖一层异丙醇。室温放置凝固后，倒去异丙醇，用ddH2O冲洗反复冲洗，吸水纸吸干。
浓缩胶的配置体系见表6：
表6实施例5中浓缩胶的组分及其配比
将各成分加入后迅速混合，加入分离胶的上面，灌满后插入加样梳。待浓缩胶凝固后，取下梳子；将凝胶固定于电泳装置上，加入足够量的Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入各样品；电压80V，电泳15分钟，至溴酚蓝进入分离胶；电压120V，至溴酚蓝泳出胶底面，终止电泳。
(3)聚丙烯酰胺凝胶染色与脱色(如果进行western-blot则跳过此步骤)：卸下凝胶，用考马斯亮蓝R-250染色液染色30分钟，再用脱色液进行脱色，观察结果。
(4)结核分枝杆菌抗原蛋白的western-blot检测：转膜：切出6张滤纸和1张硝酸纤维膜(NC膜)，滤纸和膜的大小要和步骤(2)的凝胶大小相同；将硝酸纤维膜在转移缓冲液中浸泡5分钟；在另一浅托盘中加入少量转移缓冲液，将6张滤纸浸泡于其中；在电极的负极面上，依次放3层滤纸、聚丙烯酰胺凝胶、硝酸纤维膜和3层滤纸；彻底排除各层间的气泡；将电极的负极面盖到膜胶复合体上；将电转移槽放于冰浴中，连接电源，恒流250mA，转移2小时；
(5)封闭：将NC膜置于5％的脱脂奶粉中，室温封闭1小时；
(6)洗膜：弃封闭液，用1×TBST洗NC膜3次，每次5分钟；
(7)一抗孵育：将NC膜放入用1×TBST稀释的兔抗His-tag抗体(稀释体积比1∶5000)(购自武汉飞羿科技有限公司)，室温孵育1小时；
(8)洗膜：取出NC膜，用1×TBST洗膜3次，每次5分钟；
(9)二抗孵育：将NC膜转入用1×TBST稀释的辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG抗体(稀释体积比为1∶5000)(购自武汉意德生物技术有限公司)，室温孵育1小时；
(10)洗膜：取出NC膜，用1×TBST洗膜3次，每次5分钟；
(11)洗膜：取出NC膜，用1×TBS洗膜3次，每次5分钟；
(12)显色：将NC膜置于新配置的DAB显色液中，待蛋白条带显色后，用水冲洗以终止反应。
结核分枝杆菌抗原蛋白的SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)结果见图6。
结核分枝杆菌抗原蛋白的western-blot检测结果见图7。
实施例6：结核分枝杆菌抗原蛋白在结核病诊断中的应用(间接法ELISA)
本实施例中使用的缓冲液配方如下：
包被液：0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲液(Na2CO3：1.59g；NaHCO3：2.93g；用蒸馏水定容到1L)；
洗涤液：含0.05％吐温-20的PBS溶液(PBS配方参见J.萨姆布鲁克，EF.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002年)；
封闭液：含5％脱脂牛奶的洗涤液；
终止液：2M H2SO4；
具体实施步骤：
(1)包被：用包被液将通过实施例5纯化得到的结核分枝杆菌抗原蛋白稀释至500ng/ml，用微量移液器吸取稀释好的样品加入ELISA板内，每孔100μl，4℃过夜；
(2)洗涤：次日从4℃取出步骤(1)的ELISA板，甩干内容物，向孔内加入洗涤液，每孔200μl，静置3分钟，甩干，再加洗涤液，如此泡洗三次，最后一次甩干后，将ELISA板朝下放在滤纸上反复拍打干净；
(3)封闭：向步骤(2)的ELISA板中加入封闭液，每孔200μl，37℃温育30分钟；
(4)洗涤：同步骤(2)的方法；
(5)加入一抗反应：向步骤(4)的ELISA板中加入人血清(湖北省武汉市医疗救治中心惠赠，96份临床阳性血清，24份临床阴性血清)稀释液(其中稀释液的配方参照洗涤液的配方，即含0.05％吐温-20的PBS溶液，其中PBS配方参见J.萨姆布鲁克，EF.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002年)稀释体积比1∶50)，每孔100μl，37℃温育30分钟；
(6)洗涤：同步骤(2)的方法；
(7)加入二抗反应：向步骤(6)的ELISA板中加入辣根过氧化物标记的山羊抗人IgG抗体(购自武汉意德生物技术有限公司)稀释液(稀释体积比1∶5000)，每孔100μl，37℃温育30分钟；
(8)洗涤：同步骤(2)的方法；
(9)显色：向步骤(8)的ELISA板中加入TMB底物显色(购自武汉意德生物技术有限公司)，每孔100μl，37℃避光30分钟；
(10)终止反应：向步骤(9)的ELISA板每孔中加入终止液100μl，终止显色反应；
(11)结果读取：利用酶标仪读取OD450的值。
(12)结果分析：
平均值：临床阴性血清OD450值的平均值(xi：第i份血清的OD450值)；
标准差：临床阴性血清OD450值的标准差；
临界值(cut-off value)计算：临床阴性血清OD450值的平均值加上2倍的标准差；
临界值＝平均值+2×标准差
阳性：临床阳性血清中OD450值大于临界值的样本为阳性样本；
敏感性：临床阳性血清中OD450值大于临界值的样本数占临床阳性血清总数的比例；
阴性：临床阴性血清中OD450值小于临界值的样本为阴性样本；
特异性：临床阴性血清中OD450值小于临界值的样本数占临床阴性血清总数的比例；
准确性：
ELISA检测结果(OD450值)如表7所示。
表7结核病检测结果表
说明：1、表7中第6栏-第7栏中的符号“+”，“-”号分别表示阳性或阴性。
2、表7第5栏的Mutiple-antigen(混合抗原蛋白)的制备方法见《附图说明》中图6的说明。
表7结果的统计分析如表8所示。
表8结核病检测结果统计分析表
实施例7：用TB-DOT试剂盒进行结核病的检测(对比试验)
采用上海奥普生物医药有限公司的结核分枝杆菌抗体诊断试剂盒(胶体金法)，按照试剂盒的说明书的步骤进行，具体操作如下：
(1)在反应板的反应孔中间，加入2滴封闭液，等待薄膜吸入；
(2)取40μl新鲜的血清标本，加入反应孔中间，等待薄膜吸入；
(3)在反应孔中间加入6滴洗涤液，等待薄膜吸入；
(4)在反应孔中间加入2滴金标液，等待薄膜吸入；
(5)在反应孔中间加入6滴洗涤液，等待薄膜吸入，目测结果；
(6)结果判定：阳性：质控点显示红色，反应孔中间有红色斑点出现；阴性：质控点显示红色，反应孔中间无红色斑点出现或仅为痕迹。
TB-DOT检测结果如表7所示。
统计分析结果如表8所示。
实施例8：用TB-check-1试剂盒进行结核病的检测(对比试验)
采用法国VEDA LAB公司生产的结核杆菌检测试剂盒TB-check-1，一步免疫层析法检测结核杆菌，按照试剂盒的说明书的步骤进行，具体操作如下：
(1)测试前将样本与TB-check-1板块放于室温，使其恢复至室温；
(2)顺袋沿缺口撕开包装袋，取出试剂板；
(3)在试剂板上标上病人编号；
(4)用滴管吸取样本(血清)，垂直加一滴(25μl)至样本孔中；
(5)加150μl稀释液至样本孔中；
(6)15分钟观察结果；
(7)结果判定：阴性：C处有一根线条；阳性：除C处有一根线条，T处亦有一条清晰可辨的线条；试验无效：如C处无线条出现，则试验无效，另取试剂板重复试验。
TB-check-1检测结果如表7所示。
统计分析结果如表8所示。
本发明通过克隆表达结核分枝杆菌的抗原蛋白(Rv1987，Rv3807c和Rv3887c)，将它们用于结核病的诊断，证明了这3种抗原蛋白单独使用或者混合使用(Multiple-antigen)均具有较好的诊断准确性。与两个商购的结核病检测试剂盒的检测效果进行比较，这3种抗原蛋白均具有更强的敏感性、特异性和准确性(比较结果见图8、9、10)，是很好的特异性抗原蛋白，可以作为开发研制快速特异诊断结核病试剂盒的候选抗原。
Claims (1)
1.一种结核分枝杆菌抗原蛋白在制备结核病诊断检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的结核分枝杆菌抗原蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
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