CN102634511B - 成熟油菜次生休眠种子rna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及成熟油菜次生休眠种子高质量RNA的快速提取方法。所述的方法选用RNAplantplusreagent植物总RNA提取试剂，通过β-巯基乙醇抑制RNA酶活性、防止酚类物质氧化，应用醋酸钠去除多糖类物质对RNA的影响，并减少抽提次数。使用本发明方法完成油菜次生休眠种子RNA的提取仅需30分钟，且RNA质量好、纯度高，并具有试剂用量少、经济节约等优点，已成功应用于后续的mRNA分离、纯化、建库以及高通量转录组测序。本发明为探明油菜种子次生休眠的分子机制提供了重要的技术保障，同时也可为其他多糖、多酚类植物的成熟休眠种子RNA提取提供技术参考。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及成熟油菜次生休眠种子高质量RNA的快速提取。
背景技术
RNA提取技术不仅是分子生物学的基本实验技术，也是进行分子生物学研究的必要前提。只有分离得到纯度高、完整性好的高质量总RNA，才能用于RT-PCR、cDNA合成、RNA序列分析、纯化mRNA以用于蛋白质体外翻译或构建cDNA文库，以及mRNA差异显示、高通量转录组测序等后续的分子生物学研究。
油菜种子属脂肪质种子，含有大量的脂质、蛋白质、多糖、维生素和多酚等物质，严重影响了RNA的提取。因此油菜种子总RNA的提取比较困难，常规的Trizol Reagent Kit、异硫氰酸胍一步法等已报道的植物组织总RNA提取方法都不适用于油菜种子。目前已有不完全成熟或新鲜的油菜种子RNA提取成功的报道，如华中农业大学的CTAB法（丁勇等.华中农业大学学报.2006，25(5):465-468）、湖南农业大学选用TIANGEN公司裂解液RL并加以优化的方法（严明理等.生物技术通报.2007,6:97-100）等。
然而，我们将上述方法应用于成熟油菜次生休眠（secondary dormancy）种子RNA的提取，在严格控制实验条件情况下却未能获得稳定可靠的提取结果。油菜种子具有显著的次生休眠特性（所谓次生休眠，是指原来不休眠或解除休眠后的种子由于干旱等不适宜环境条件的影响而诱发的休眠），明确油菜种子次生休眠的分子机制，可以为人工调控油菜种子休眠特性提供理论依据。而高质量地提取成熟油菜次生休眠种子的RNA则是研究种子休眠分子机制的重要前提。
抑制内源RNA酶的活性、防止RNA降解是RNA提取的关键技术，特别是在成熟的油菜次生休眠种子RNA提取过程中。因为成熟的油菜种子老健组织部分富含RNA酶，加之种子进入休眠状态后，生理活性大大降低，使得油菜种子RNA的分离效果和完整性都难以保障。而采用已有的新鲜油菜种子或不完全成熟油菜种子RNA提取方法，则存在着试剂消耗量大、提取时间长（1-8.5小时）等缺点，尤其是提取时间过长直接增加了RNA受污染而降解的可能性，并最终导致提取失败。因此，缩短提取时间、抑制内源RNA酶活性、减少与防止RNA降解是成熟油菜次生休眠种子RNA提取的最为核心技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供成熟油菜次生休眠种子高质量RNA的快速提取方法。本发明提供的方案是：选用RNA plant plus reagent植物总RNA提取试剂，通过β-巯基乙醇抑制RNA酶活性、防止酚类物质氧化，应用醋酸钠去除多糖类物质对RNA的影响，并减少抽提次数。按照本方法，完成次生休眠油菜种子RNA的提取仅需30分钟左右，且RNA质量好、纯度高。所述步骤包括：
（1）取0.1g成熟的油菜次生休眠种子放入加有液氮的研钵中，迅速磨成粉末；
（2）将步骤（1）制得的粉末加入含有RNA plant plus植物总RNA提取试剂的离心管，振荡至彻底混匀。室温平放离心管静置，再加入预冷的苯酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）混匀，4℃13000rpm离心4-5min；
（3）将步骤（2）制得的上清液转移至新离心管中，加入预冷的醋酸钠和无水乙醇，倒转2-3次混匀后冰上静置，4℃ 13000rpm离心4min，弃上清，乙醇洗沉淀，室温下干燥，用RNase-free ddH2O溶解沉淀即得。
优选的，所述步骤（2）中每百毫克油菜种子粉末中加入RNA plant plus reagent （TIANGEN公司生产，使用前按照体积比1：4加入β-巯基乙醇与RNAplant plus reagent混合）800μl。优选的，所述的步骤（2）中苯酚-氯仿-异戊醇用量为500μl。
优选的，所述的步骤（2）和步骤（3）中的静置时间为5 min。
优选的，所述的步骤（3）中醋酸钠浓度为3mol/L、pH值为5.2，用量为70μl。
优选的，所述的步骤（3）中无水乙醇用量为1400μl。
优选的，所述的步骤（3）中的乙醇洗沉淀为75%乙醇洗涤，洗涤次数为2次。
本发明与现有技术相比，其有益效果是：现有技术虽然可以提取不完全成熟或新鲜油菜种子的RNA，但却不能成功应用于成熟的油菜次生休眠种子RNA的提取，且试剂消耗量大、提取时间长，直接增加了RNA被降解的可能性。本发明提供的成熟油菜次生休眠种子RNA提取方法，不仅具有新颖性的要求，还具有提取过程省时便捷、提取结果稳定可靠的实用性。因此，本发明为成熟油菜次生休眠种子高质量RNA的快速提取提供了有效方法，同时也为后续的分子生物学研究提供了重要的技术支持。
附图说明
图1为应用本发明提取的RNA琼脂糖凝胶电泳图（泳道1、2、3、4为成熟的油菜次生休眠种子）；
图2为应用前人方法提取的RNA琼脂糖凝胶电泳图（泳道1、2、3、4为成熟的油菜次生休眠种子）；
图3为Aglient Technologies 2100 Bioanalyzer文库质检图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例：成熟油菜次生休眠种子总RNA提取及其标准mRNA文库构建
Ⅰ. 油菜次生休眠种子总RNA提取
（1）取0.1g成熟的油菜次生休眠种子放入加有液氮的研钵中，迅速研磨成粉末；
（2）将步骤（1）制得的粉末加入含有800μl RNA plant plus植物总RNA提取试剂（使用前按照体积比1：4加入β-巯基乙醇与RNAplant plus reagent混合）的离心管，涡旋振荡至彻底混匀。室温下平放离心管静置5 min，再加入500μl预冷的苯酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）混匀，4℃13000rp m离心5min，取上清液；
（3）将步骤（2）制得的上清液转移至一新离心管中，加70μl的3mol/L的醋酸钠和1400μl的无水乙醇，倒转2-3次混匀后冰上放置3-5min，4℃13000rpm离心4min，弃上清，75%乙醇洗沉淀2次，室温下干燥，用RNase-free ddH2O溶解沉淀即得，质检后放置-70℃冰箱备用。
质量检测：应用本方法，得到成熟油菜次生休眠种子RNA150微克，琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，RNA完整性好，260/280为2.05，完全满足后续的分子生物学研究需要（附图1）。而使用前人方法提取休眠种子RNA的质量极不稳定，降解较为严重（附图2）。图1所示为应用本发明提取的RNA琼脂糖凝胶电泳图，泳道1、2、3、4为成熟的油菜次生休眠种子；图2所示为应用前人方法提取的RNA琼脂糖凝胶电泳图，泳道1、2、3、4为成熟的油菜次生休眠种子。
Ⅱ.从总RNA中提取mRNA及mRNA的打断
（1） 决定起始总RNA的量，取0.1-4ug的起始总RNA。用移液枪吸取总RNA 到一个无RNA酶的200ul PCR管中，加入RNase free的无菌水补足至50ul。
（2）加入50ul RNA Purification Beads（纯化珠），混匀。
（3） 65°C反应5min，使RNA变性。
（4）PCR仪温度降到4°C后，取出，室温放置5min。
（5）将EP管置于磁力架上静置5min，吸弃上清。
（6）将EP管从磁力架上取下，加入200ul BWB（磁珠洗涤缓冲液），混匀，置于磁力架上静置5min，弃上清。
（7）从磁力架上取下，加入50ul EB(溴化乙锭)，混匀。
（8）80°C反应2min，待温度降到25°C后，取出置于室温。
（9）加入50ul BBB（磁珠结合缓冲液）,混匀，室温静置5min。
（10）将EP管置于磁力架上静置5min，吸弃上清。
（11）将EP管从磁力架上取下，加入200ul BWB(磁珠洗涤缓冲液)，混匀，置于磁力架上静置5 min，弃上清。
（12）加入19.5ul Elute（洗脱液），Prime（引物），Fragment Mix(片段混合液)，混匀。
（13）94°C反应8 min 将RNA打断，待温度降到4°C后，取出。
Ⅲ.反转录反应
（1）第一链的合成
将上述溶液置于磁力架上5 min，吸取17 ul上清于新的200 ul PCR管中，加入1ul SuperScript II（逆转录酶） 及7ul First Strand Master Mix(第一链合成混合溶液)，混匀。
按照以下程序第一链的合成：
25°C 10min
42°C 50min
70°C 15min
4°C hold(保温)
（2）第二链的合成
向第一链混合液中加入25 ul Second Strand Master Mix(第二链合成混合溶液)，混匀。16°C 恒温孵育1h。
（3）使用AMPure XP beads(磁珠纯化法)纯化
向50ul ds cDNA中加入90ul AMPure XP beads(磁珠纯化试剂)，混匀。室温静置15min，置于磁力架上，室温5min。吸除上清。加入200ul 80%乙醇，室温30s后吸除上清。重复上一步骤。将EP管室温静置15min以晾干，加入52.5ul Resuspension Buffer(重悬液)，混匀。室温2min后，置于磁力架上静置5min。吸出50min上清于新的200ulPCR管中。
Ⅳ.末端修复
（1）配置End Repair Control(末端修复质控)溶液：向99ul Resuspension Buffer(重悬缓冲液)中加入1ul End Repair Control(末端修复质控)溶液，并混匀。
（2）向50ul ds cDNA中加入10ul 上述配好的溶液。
（3）向其中加入40 ul End Repair Mix(末端修复混合溶液)，并混匀
（4）恒温30°C孵育30min 后取出。
（5）使用AMPure XP beads(磁珠纯化法)纯化。
Ⅴ.3'末端腺苷酸化
（1）制备A‐Tailing Control（末端腺苷酸质控）稀释液：1 μl A‐Tailing Control + 99 μl Resuspension Buffer(重悬缓冲液)；
（2） 加2.5 μl 稀释的A‐Tailing Control，充分混匀；
（3）加12.5 μl A‐Tailing Mix（末端腺苷酸混合液）；
（4）37°C 反应 30 min；
（5）立即进行Adapters(接头)连接反应。
Ⅵ.连接 Adapters(接头)
（1） 制备Ligase Control(连接酶质控)稀释液：1 μl Ligase Control(连接酶质控) + 99 μl Resuspension Buffer(重悬缓冲液)；
（2）依次加入2.5 μl Ligase Control(连接酶质控)稀释液，2.5 μl Ligase Mix(连接反应混合液)，2.5 μl Adapter Index，充分混匀；
（3） 30 °C 反应 10 min；
（4） 加 5 μl Stop Ligase Mix(终止连接反应混合液)，充分混匀；
（5） AMPure XP Beads纯化两次，吸上清，‐20°C保存。
Ⅶ.DNA 片段的富集
（1）分别加入 5 μl Primer Cocktail(引物混合物) 和 25 μl Master Mix(预混合液)，充分混匀；
（2） 设置如下 PCR程序：
a. 98°C for 30秒
b. 15 cycles of（循环次数15次）:
98°C for 10秒
60°C for 30 秒
72°C for 30 秒
c. 72°C for 5 分钟
d. 4°C保温
（3） AMPure XP beads纯化，吸上清，‐20°C保存。
质量检测：经Aglient Technologies 2100 Bioanalyzer（安捷伦科技公司 2100自动生物分析系统）检测，文库质检合格，如图3，说明本发明提取的RNA能满足高通量转录组测序的样品要求。
Claims (1)
1.成熟油菜次生休眠种子RNA的提取方法，选用RNA plant plus reagent植物总RNA提取试剂，通过β-巯基乙醇抑制RNA酶活性、防止酚类物质氧化，应用醋酸钠去除多糖类物质对RNA的影响，并减少抽提次数，缩短提取时间， 其步骤包括：
（1）取0.1g成熟的油菜次生休眠种子放入加有液氮的研钵中，迅速磨成粉末；
（2）将步骤（1）制得的粉末加入含有800μl RNA plant plus reagent植物总RNA提取试剂的离心管，涡旋振荡至彻底混匀；室温下平放离心管静置5min，再加入500μl预冷的苯酚-氯仿-异戊醇混匀，4℃13000rpm离心5min，取上清液；其中，所述RNA plant plus reagent为TIANGEN公司生产，使用前按照体积比1:4加入β-巯基乙醇与RNA plant plus reagent混合；所述苯酚-氯仿-异戊醇的比例为25：24：1；
（3）将步骤（2）制得的上清液转移至一新离心管中，加入70μl的3mol/L的醋酸钠和1400μl的无水乙醇，倒转2-3次混匀后冰上静置3-5min，4℃ 13000rpm离心4min，弃上清，75%乙醇洗沉淀2次，室温下干燥，用RNase-free ddH2O溶解沉淀即得。
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