CN103341164A - 一种鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物、制剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物、制剂及其制备方法。所述抗原抗体复合制备方法包括以下步骤：（1）制备VP2蛋白作为抗原；（2）利用鸡传染性法氏囊病毒灭活疫苗制备的卵黄抗体作为抗体；（3）将抗原抗体按处方比例进行混合，进行除菌处理即可。所述抗原抗体复合物制剂主要是指将鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物制备成普通液体制剂、油乳剂和固体制剂。本发明中的抗原抗体复合物具有性能稳定、安全性好、动物免疫后产生免疫作用快、免疫力强、保护率高的特点，制备的复合物制剂具有制备简单快捷、使用安全方便的特点。

Description

一种鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物、制剂及制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗原抗体复合物、制剂及制备方法，尤其是一种鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物、制剂及制备方法。

背景技术

鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD）又称鸡传染性腔上囊病，是由传染性法氏囊病毒引起的一种急性、接触传染性疾病。以法氏囊发炎、坏死、萎缩和法氏囊内淋巴细胞严重受损为特征，从而引起鸡的免疫机能障碍，干扰各种疫苗的免疫效果。鸡传染性法氏囊病发病率高，几乎达100%，死亡率低，一般为5%～15%，是目前养禽业最重要的疾病之一。

目前应用于防治鸡传染性法氏囊病的抗感染药品包括抗生素、化学合成药品、中药及其制剂、高免卵黄抗体、各种疫苗和其它抗感染生物制剂。以上药物制剂及疫苗对鸡传染性法氏囊病都有一定的疗效，但是仍存在很多弊端，如抗生素药残大，可以通过食源性污染，引起人类疾病；化学合成药品毒副作用大，干扰机体正常菌群；中药及其制剂药效慢、作用弱、用量大、质量难以稳定以致使用不方便等；高免卵黄抗体对混合感染和继发感染疗效弱；活疫苗最大缺点是潜在的传染性和致病性，并且活疫苗的免疫应激反应会带来后期的饲养问题；灭活疫苗免疫效果不太稳定，而基因工程疫苗的效果又低于活疫苗，同时疫苗还能与母源抗体发生相互作用，受接种方式与时间的影响。

早在1994年，世界家禽临床兽医和传染性法氏囊病专家提出理想的IBD疫苗必备的条件：能与母源抗体共同作用产生早期而且长期有效的保护力；广谱的抗原产生高品质的抗体；在鸡胚胎内或早期能方便、有效且整齐的接种；可在孵化场接种且接种一次就可长期保护；能早期占领法氏囊细胞受体，阻止野毒入侵；对母源抗体低的鸡安全，且可与其他疫苗并用；减少现场免疫应激反应。这就产生了抗原抗体复合物疫苗，它不仅避免了化药、抗生素及中药的弊端，同时避免了疫苗及抗体的弊端，能为禽类健康养殖保驾护航，具备巨大的市场价值和良好的社会效应。

目前，抗原抗体复合物作为病毒性疾病的预防和治疗手段已经在某些领域取得了显著疗效，在禽用抗原抗体复合物开发方面的主要成果包括：何宏轩（专利号：CN200810226023.9）利用禽流感H5N1亚型的灭活全病毒做抗原，利用H5亚型灭活苗制备的高免卵黄抗体做抗体，制备了用于防治禽流感的抗原抗体复合物；易建中（专利号：CN201010166022.7）利用灭活新城疫全病毒上海株和相应的卵黄抗体，制备了一种有效防治新城疫病毒感染的免疫复合物；吴红云（专利号：201210302855.0）利用灭活的鸡传染性支气管炎全病毒和相应的血清抗体，制备了一种鸡传染性支气管炎的抗原抗体复合物；Whitfill（专利号：US539769）制备的鸡传染性法氏囊抗原抗体复合物疫苗制剂现已面市，但是其制备过程中的抗原采用的同样是灭活的全病毒。灭活全病毒在相关产品的生产和使用过程中，存在散毒风险，同时由于在病毒灭活过程中常引入甲醛等化学试剂，易导致受免机体的应激和产生耐受性问题，因此，在抗原抗体复合物制备过程中急需新的特效抗原的引入。

发明内容

本发明的目的在于提供一种使用方便快捷，能安全有效的防治鸡传染性法氏囊病的抗原抗体复合物及其制备方法。这种抗原抗体复合物能与母源抗体共同作用，通过改变抗原的提呈路径，在短时间内刺激机体产生长期有效的保护力，同时与病毒抗原制成的复合物疫苗相比，能有效降低机体的免疫应激反应，在生产和使用过程中会不存在散毒风险。

本发明的目的还在于提供上述鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物制剂及其制备方法，这些制剂具备安全、实用，操作简便的优点。

为实现本发明的上述目的，所采用的技术方案如下：

一种鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物，该抗原抗体复合物由抗原和抗体组成，所述抗原为鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白，所述抗体为法氏囊病毒卵黄抗体。在鸡传染性法氏囊病毒中，VP2蛋白是血清特异性抗原，占总蛋白含量的51%，分子量约为37-40KD，既是IBDV病毒的主要结构蛋白，又是主要宿主保护性抗原，与病毒中和保护性抗体的诱导、毒力的变异、细胞的凋亡等有关，因此VP2蛋白能在抗原抗体复合物中有效取代灭活全病毒做抗原，并杜绝了用全病毒做抗原的复合物在生产和使用过程中存在散毒的可能。目前虽然有利用VP2蛋白制备基因工程疫苗的报道，但是其对受免机体的保护能力较为低下，且免疫期短，将VP2蛋白与卵黄抗体混合制备成抗原抗体复合物，不但能缩短受免鸡体内免疫应答的效应时间，还能延长免疫期。卵黄抗体作为一种重要的免疫制剂，在其生产制备过程中具有无可比拟的优势，首先卵黄抗体受到卵黄的保护，可以长时间储存而几乎不会影响活性，便于批量化提纯卵黄抗体；其次卵黄抗体的产量高、成本低、操作简便，极其适宜于工业化生产；最后在卵黄抗体的收集过程中，无需采血、对供体动物无损伤，符合现代动物保护规则。

在上述抗原抗体复合物中，所述抗原VP2蛋白按常规生物技术手段制备，例如采用克隆表达技术制备VP2蛋白；所述抗体为多价抗体，例如利用鸡传染性法氏囊病毒灭活疫苗制备的高免卵黄抗体。

一种上述抗原抗体复合物的制备方法，其中包括以下步骤：

（1）制备VP2蛋白作为抗原；

（2）利用鸡传染性法氏囊病毒灭活疫苗制备的卵黄抗体作为抗体；

（3）将抗原抗体按处方比例进行混合，进行除菌处理即可。

上述制备方法具体包括以下步骤：

（1）参考GenBank中超强毒株、经典强毒株及弱毒株的VP2基因的共保守区段设计上下游引物，用鸡传染性法氏囊病毒总RNA反转录获得的cDNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物克隆至表达载体后进行VP2蛋白的表达，表达产物经纯化检测后即得抗原；

（2）用鸡传染性法氏囊病灭活疫苗对产蛋鸡进行基础免疫和加强免疫，加强免疫10-14天后收集高免鸡蛋，并进行琼脂双相扩散试验（AGP）检测，分离AGP≥1:64的高免鸡蛋卵黄进行酸化和萃取处理，萃取产物经除菌浓缩后即得抗体；

（3）一种鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物，其特征在于所述抗原抗体复合物是将抗原效价配制到AGP=1:8-1:256和将抗体效价配制到AGP=1:8-1:256的等体积混合物，混合产物经除菌处理后即得抗原抗体复合物。一种鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物，优选将抗原效价配制到AGP=1:64和将卵黄抗体效价配制到AGP=1:64的等体积混合物。

本发明还提供了一种鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物制剂，其特征在于该抗原抗体复合物制剂包括普通液体制剂、油乳剂和固体制剂三种剂型中的一种。

上述鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物制剂的制备方法包括以下步骤：

（1）普通液体制剂：取处方量的VP2蛋白及卵黄抗体加入PBS液中，经除菌处理制备而成。

（2）油乳剂：取处方量的VP2蛋白及卵黄抗体加入油佐剂混合乳化，按常规油乳剂疫苗的制备方法制成。

（3）固体制剂：取处方量的VP2蛋白及卵黄抗体加入冻干保护剂中，冻干制成。

本发明获得的抗原抗体复合物具有性能稳定、安全性好、动物免疫后产生免疫作用快、免疫力强、保护率高的特点，制备的复合物制剂具有制备简单快捷、使用安全方便的特点。

附图说明

图1为各组受试鸡免疫后鸡体内在不同时间段的抗体水平图。其中空白对照组为每羽受试鸡肌注0.2ml生理盐水；抗原抗体复合物一组为每羽受试鸡肌注0.2ml抗原抗体复合物一，其中抗原效价为AGP=1:8，抗体效价为AGP=1:256；抗原抗体复合物二组为每羽受试鸡肌注0.2ml抗原抗体复合物二，其中抗原效价为AGP=1:256，抗体效价为AGP=1:8；抗原抗体复合物三组为每羽受试鸡肌注0.2ml抗原抗体复合物三，其中抗原效价为AGP=1:64，抗体效价为AGP=1:64；常规疫苗组为每羽受试鸡肌注处方量的传染性法氏囊病灭活疫苗；VP2蛋白组为每羽受试鸡肌注0.2ml效价为AGP=1:64的VP2蛋白。

图2为抗原抗体复合物、常规疫苗和VP2蛋白对受试鸡群在传染性法氏囊强毒株的攻击下，发病率、死亡率和保护率的比较。其中空白对照组为每羽受试鸡肌注0.2ml生理盐水；常规疫苗组为每羽受试鸡肌注处方量的传染性法氏囊病灭活疫苗；抗原抗体复合物组为每羽受试鸡肌注1ml抗原抗体复合物三，其中抗原效价为AGP=1:64，抗体效价为AGP=1:64；VP2蛋白组为每羽受试鸡肌注1ml效价为AGP=1:64的VP2蛋白。

具体实施方式

为能进一步说明本发明的内容、特点及功效，兹例举以下实施例。

实施例1：鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物

鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物是由抗原和抗体混合而成，其中抗原为利用常规生物技术手段制备鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白，抗体为利用灭活的鸡传染性法氏囊病毒灭活疫苗制备的法氏囊病毒卵黄抗体。

实施例2：鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的制备

利用基因克隆技术，将鸡传染性法氏囊病毒的VP2基因克隆到原核表达载体，转化到原核表达宿主诱导表达后，用亲和层析技术纯化获得VP2蛋白。具体方法是：参考GenBank中及传染性法氏囊病超强毒株、经典强毒株及弱毒株的VP2共保守区段，利用软件Premier 5.0设计VP2基因上下游引物并合成；摘取感染鸡传染性法氏囊病超强毒株（vvIBDV）的SPF鸡的法氏囊组织，将法氏囊组织研磨和匀浆后，利用常规RNA提取技术提取vvIBDV基因组的总RNA并反转录成cDNA；以cDNA为模板，在上述引物的作用下进行VP2基因的扩增并凝胶回收；回收产物和表达载体进行经酶切后连接并将连接产物转化至表达载体；挑取阳性克隆培养、诱导后回收表达菌体；将表达菌体超声裂解后进行亲和层析获得鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白。

实施例3：鸡传染性法氏囊病毒卵黄抗体IgY的制备

收集用鸡传染性法氏囊病灭活疫苗多次免疫的高免蛋鸡所生产的鸡蛋，分离阳性卵黄进行酸化和萃取处理，萃取产物经除菌浓缩后即得卵黄抗体。具体过程是：用鸡传染性法氏囊病灭活疫苗对产蛋鸡进行基础免疫后的第14天和28天，分别进行加强免疫；强化免疫后10～14日开始收集鸡蛋，抽样采用琼脂双相扩散试验（AGP）测定高免鸡蛋卵黄中IBD抗体效价；对AGP≥1:64的高免鸡蛋进行消毒除菌后，分离卵黄；卵黄经酸化灭活后离心取上清并用正辛酸萃取；用0.45μm滤器过滤澄清卵黄萃取液后用0.22μm滤器过滤除菌，过滤产物经截留分子量为100KD超滤膜堆进行浓缩后即得卵黄抗体。

实施例4：鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白抗原效价的测定

用琼脂扩散试验测定鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白抗原效价。其具体操作方法是：制备含有1%硫柳汞的1%琼脂平板；在平板上进行梅花形打孔；将VP2蛋白进行倍比稀释后分别加注到梅花形孔组的外周孔，中心孔用鸡传染性法氏囊病病毒标准阳性血清注满；把琼脂平板加盖后置于湿盒中，37℃作用24～48h；将中心孔与外周孔之间出现白色沉淀线的最大稀释倍数作为鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的抗原效价。

实施例5：鸡传染性法氏囊病毒卵黄抗体效价的测定

用琼脂扩散试验测定鸡传染性法氏囊病毒卵黄抗体效价。其具体操作方法是：制备含有1%硫柳汞的1%琼脂平板；在平板上进行梅花形打孔；将卵黄抗体进行倍比稀释后分别加注到梅花形孔组的外周孔，中心孔用鸡传染性法氏囊病病毒标准抗原注满；把琼脂平板加盖后置于湿盒中，37℃作用24～48h；将中心孔与外周孔之间出现白色沉淀线的最大稀释倍数作为鸡传染性法氏囊病毒卵黄抗体的效价。

实施例6：鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物的制备一

具体制备方法按以下步骤操作：

（1）配制鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的抗原效价为AGP=1:8。

（2）配制鸡传染性法氏囊病毒卵黄抗体的效价为AGP=1:256。

（3）将上述配制的VP2抗原和卵黄抗体进行等体积混合。

（4）混合产物经除菌处理后即得抗原抗体复合物一。

实施例7：鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物的制备二

具体制备方法按以下步骤操作：

（1）配制鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的抗原效价为AGP=1:256。

（2）配制鸡传染性法氏囊病毒卵黄抗体的效价为AGP=1:8。

（3）将上述配制的VP2抗原和卵黄抗体进行等体积混合。

（4）混合产物经除菌处理后即得抗原抗体复合物二。

实施例8：鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物的制备三

具体制备方法按以下步骤操作：

（1）配制鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的抗原效价为AGP=1:64。

（2）配制鸡传染性法氏囊病毒卵黄抗体的效价为AGP=1:64。

（3）将上述配制的VP2抗原和卵黄抗体进行等体积混合。

（4）混合产物经除菌处理后即得抗原抗体复合物三。

实施例9：鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物制剂

向VP2蛋白及卵黄抗体的混合物中加入油佐剂混合乳化的产物即为鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物的油乳剂。

实施例10：鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物制剂的制备方法

取处方量的VP2蛋白及卵黄抗体加入油佐剂混合乳化，按常规油乳剂疫苗的制备方法制成。

实施例11：免疫实验

取1日龄SPF鸡60羽，随机分为六组，暂养一日后，分别进行如下操作：

第一组：设为空白对照组，每羽肌注0.2ml生理盐水。

第二组：设为抗原抗体复合物一组，每羽肌注0.2ml抗原抗体复合物一。

第三组：设为抗原抗体复合物二组，每羽肌注0.2ml抗原抗体复合物二。

第四组：设为抗原抗体复合物三组，每羽肌注0.2ml抗原抗体复合物三。

第五组：设为常规疫苗组，每羽肌注处方量的传染性法氏囊病灭活疫苗。

第六组：设为VP2蛋白组，每羽肌注0.2ml效价为AGP=1:64的VP2蛋白。

上述各组在肌注免疫后15天，按相同剂量加强免疫一次。每隔一周随机取上述免疫鸡只，测其血清的抗体水平。取测得的各组血清抗体平均效价绘制图1。结果表明：注射抗原抗体复合物的鸡体内开始产生免疫应答的时间要早于常规疫苗组和VP2蛋白组；其中注射抗原抗体复合物三的鸡体内产生免疫应答的效应时间最短，抗体效价上升最快；注射抗原抗体复合物一、抗原抗体复合物二和常规疫苗的鸡体内在不同时期的抗体效价水平相当。

实施例12：攻毒试验

取三周龄SPF鸡80羽，随机分为四组，暂养一日后，分别进行如下操作：

第一组：设为空白对照组，每羽肌注1ml生理盐水。

第二组：设为常规疫苗组，每羽肌注处方量的传染性法氏囊病灭活疫苗。

第三组：设为抗原抗体复合物组，每羽肌注1ml抗原抗体复合物三。

第四组：设为VP2蛋白组，每羽肌注1ml效价为AGP=1:64的VP2蛋白。

上述各组受试鸡在肌注免疫后7天，每羽鸡用0.2ml的IBDV GX-07株强毒点眼（含100LD50），15天后，对各组存活受试鸡按相同剂量加强免疫一次，统计各实验组受试鸡的发病率和死亡率并计算保护率，所得实验结果绘制图2。结果表明：抗原抗体复合物组受试鸡的死亡率最低，保护率高达95%，而空白对照组受试鸡的死亡率高达100%。

Claims (9)

1.一种鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物，其特征在于该抗原抗体复合物由抗原和抗体组成，所述抗原为鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白，所述抗体为传染性法氏囊病毒卵黄抗体。

2.根据权利要求1所述的一种鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物，其特征在于所述抗原抗体复合物是将抗原效价配制到AGP=1:8-1:256和将抗体效价配制到AGP=1:8-1:256的等体积混合物。

3.根据权利要求1或2所述的一种鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物，其特征在于是将抗原效价配制到AGP=1:64和将卵黄抗体效价配制到AGP=1:64的等体积混合物。

4.根据权利要求1或2所述的一种鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）制备VP2蛋白作为抗原；

（2）利用鸡传染性法氏囊病毒灭活疫苗制备的卵黄抗体作为抗体；

（3）将抗原抗体按处方比例进行混合，进行除菌处理即可。

5.根据权利要求4所述的一种鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物的制备方法，其特征于，制备VP2蛋白的具体步骤为：参考GenBank中超强毒株、经典强毒株及弱毒株的VP2基因的共保守区段设计上下游引物，用鸡传染性法氏囊病毒总RNA反转录获得的cDNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物克隆至表达载体后进行VP2蛋白的表达，表达产物经纯化检测后即得抗原；制备卵黄抗体的具体步骤为：用鸡传染性法氏囊病灭活疫苗对产蛋鸡进行基础免疫和加强免疫，加强免疫10-14天后收集高免鸡蛋，并进行琼脂双相扩散试验（AGP）检测，分离AGP≥1:64的高免鸡蛋卵黄进行酸化和萃取处理，萃取产物经除菌浓缩后即得抗体；抗原抗体混合的具体步骤为：将抗原抗体进行倍比稀释，用琼脂糖扩散试验分别测定抗原抗体效价，选用抗原抗体效价分别为1:8-1:256的样品，等体积比进行混合，混合产物经除菌处理后即得抗原抗体复合物。

6.一种鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物制剂，其特征在于该抗原抗体复合物制剂包括普通液体制剂、油乳剂和固体制剂三种剂型中的一种。

7.根据权利要求6所述的一种鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物普通液体制剂的制备方法，其特征在于包括以下制备过程：取处方量的VP2蛋白及卵黄抗体加入PBS液中，经除菌处理制备而成。

8.根据权利要求6所述的一种鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物油乳剂的制备方法，其特征在于包括以下制备过程：取处方量的VP2蛋白及卵黄抗体加入油佐剂混合乳化，按常规油乳剂疫苗的制备方法制成。

9.根据权利要求6所述的一种鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物固体制剂的制备方法，其特征在于包括以下制备过程：取处方量的VP2蛋白及卵黄抗体加入冻干保护剂中，冷冻真空干燥制成。

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