CN107893058A - 一种去除疫苗制品中内毒素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种去除疫苗制品中内毒素的方法，属于分离纯化技术领域。所述方法包括第一次脱氧胆酸钠结合超滤的步骤；所述第一次脱氧胆酸钠结合超滤步骤为：先将通过鸡胚培养得到的流感病毒液超滤浓缩、第一次离心纯化后，按其体积的10‑30％加入质量浓度为5‑10％的脱氧胆酸钠溶液进行预处理0.5‑1h，再利用100KD超滤膜超滤、洗滤。利用本发明所述方法共生产疫苗制品89批次，LPS残余全部合格；而利用现有方法共生产疫苗制品共生产疫苗制品90批次，LPS残余不合格批次为3批次。因此，与现有技术相比，本发明所述方法使生产过程更加精确可控，有效消除疫苗中LPS残余量的批间差异，进而提高生产效益。

Description

一种去除疫苗制品中内毒素的方法
技术领域
本发明涉及一种去除疫苗制品中内毒素的方法，属于分离纯化技术领域。
背景技术
内毒素(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种成分，在溶液中，LPS以单体、胶束聚合体、囊状聚合体等形态存在，各形态下分子量区别极大，可从10-大于1000kDa(千道尔顿)跨越式分布，LPS若在注射类药物制剂中超量存在，轻者可引起发热、头痛、伴有恶心、呕吐等反应；严重者可导致血液循环障碍，甚至休克、死亡，因此在注射剂药品中，要求严格控制LPS含量。
LPS热稳定性高，通常采用高热破坏、强酸强碱化学法破坏、活性炭吸附去除，一般药企都选用适合于本制剂物理特性的方法，进行制剂中LPS的去除。
疫苗类生物制剂多属于具备生物活性的蛋白类成分，不耐受高温、不耐受强酸强碱、易被活性炭等多孔类介质吸附，因此，疫苗类生物制品只能通过在生产过程中，需要通过严格的无菌控制，降低LPS的引入几率，确保最终产品的LPS指标合格。
但是对于采用特殊工艺的制品，例如：鸡胚培养的流感疫苗，活体鸡胚本身带有较多的细菌，都会向终端产品中引入LPS，现有鸡胚流感疫苗的工艺为：流感病毒液制备→超滤浓缩→离心纯化→裂解病毒→二次离心纯化→病毒灭活制备疫苗制品。在生产过程中，由接种鸡胚，培养扩增到收获病毒液的过程是易被细菌污染的点位，进而产生大量的LPS，因此必须在之后的工序中，严格控制温度抑制细菌的增殖。
一般的流感病毒分子量为5900-6300kDa，而LPS的分子量为10-大于1000kDa，多以多种聚合形态存在于溶液中，大于1000kDa分子量的囊状聚合体直接影响后续工序对其的去除效果，导致生产批间的差异难于控制。
发明内容
本发明在制备疫苗制品的过程中，应用脱氧胆酸钠进行预处理，并结合超滤洗脱工艺，有效去除内毒素，解决了上述问题。
本发明提供了一种去除疫苗制品中内毒素的方法，所述方法包括第一次脱氧胆酸钠结合超滤的步骤；
所述第一次脱氧胆酸钠结合超滤步骤为：先将通过鸡胚培养得到的流感病毒液超滤浓缩、第一次离心纯化后，按其体积的10-30％加入质量浓度为5-10％的脱氧胆酸钠溶液进行预处理0.5-1h，再利用100KD超滤膜超滤、洗滤。
本发明所述第一次脱氧胆酸钠结合超滤步骤中洗滤的方法优选为：采用pH为7.2-7.6的PBS溶液洗滤。
本发明所述方法优选为包括第二次脱氧胆酸钠结合超滤的步骤；
所述第二次脱氧胆酸钠结合超滤步骤为：先将第一次脱氧胆酸钠结合超滤步骤得到的产品裂解病毒、第二次离心纯化后，按其体积的1-3％加入质量浓度为5-10％的脱氧胆酸钠溶液进行预处理0.5-1h，再利用100KD超滤膜超滤、洗滤。
本发明所述第二次脱氧胆酸钠结合超滤步骤中洗滤的方法优选为：采用pH为7.2-7.6的PBS溶液洗滤。
本发明所述方法优选为包括病毒液制备的步骤、超滤浓缩的步骤、第一次离心纯化的步骤、第一次脱氧胆酸钠结合超滤的步骤、裂解病毒的步骤、第二次离心纯化的步骤、第二次脱氧胆酸钠结合超滤的步骤、病毒灭活制备疫苗制品的步骤；
所述病毒液制备的步骤为：先将流感病毒稀释至3-4个lgEID50/mL，每胚接种0.2mL，33-35℃培养48-72h，再将培养后鸡胚2-8℃冷却12-20h，收集病毒液。
本发明所述超滤浓缩的步骤优选为：将病毒液制备步骤得到的产品利用100-300KD超滤膜超滤浓缩至30-50倍。
本发明所述第一次离心纯化的步骤优选为：将超滤浓缩步骤得到的产品经蔗糖密度梯度离心，通过紫外检测收集病毒液。
本发明所述裂解病毒的步骤优选为：按第一次脱氧胆酸钠结合超滤步骤得到的产品体积的10-30％加入无水乙醚，裂解得到裂解液。
本发明所述第二次离心纯化的步骤优选为：将裂解病毒步骤得到的产品经蔗糖密度梯度离心，通过紫外检测收集病毒液。
本发明所述病毒灭活制备疫苗制品的步骤优选为：按甲醛在第二次脱氧胆酸钠结合超滤步骤得到的产品中终浓度200μg/mL向第二次脱氧胆酸钠结合超滤步骤得到的产品加入质量浓度为0.4％的甲醛溶液，灭活。
本发明有益效果为：
利用本发明所述方法共生产疫苗制品89批次，LPS残余全部合格；而利用现有方法共生产疫苗制品共生产疫苗制品90批次，LPS残余不合格批次为3批次。因此，与现有技术相比，本发明所述方法使生产过程更加精确可控，有效消除疫苗中LPS残余量的批间差异，进而提高生产效益。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下述甲1型流感病毒：A/California/7/2009(NYMC X-181)购于WHO(世界卫生组织)；
下述甲3型流感病毒：A/Hong Kong/4801/2014(NYMC X-263B)购于WHO(世界卫生组织)；
下述乙型流感病毒：B/Brisbane/60/2008(NYMC BX-35)购于WHO(世界卫生组织)；
下述乙型流感病毒：B/Phuket/3073/2013购于WHO(世界卫生组织)。
实施例1
一种去除疫苗制品中内毒素的方法，所述方法包括如下步骤：
①病毒液制备的步骤
先将A/California/7/2009流感病毒稀释至3个lgEID50/mL，每胚接种0.2mL，34℃培养60h，再将培养后鸡胚5℃冷却16h，收集病毒液；
②超滤浓缩的步骤
将步骤①所得产品利用100KD超滤膜超滤浓缩至40倍；
③第一次离心纯化的步骤
将步骤②所得产品经蔗糖密度梯度离心，30000rpm离心5h，通过紫外检测收集病毒液；
④第一次脱氧胆酸钠结合超滤步骤
按步骤③所得产品体积的10％加入质量浓度为10％的脱氧胆酸钠溶液进行预处理1h，再利用100KD超滤膜超滤，采用pH为7.4的PBS溶液洗滤，测试得内毒素去除率为90.5％；
⑤裂解病毒的步骤
按步骤④所得产品体积的20％加入无水乙醚，裂解得到裂解液；
⑥第二次离心纯化的步骤
将步骤⑤所得产品经蔗糖密度梯度离心，30000rpm离心7h，通过紫外检测收集病毒液；
⑦第二次脱氧胆酸钠结合超滤步骤
按步骤⑥所得产品体积的1.5％加入质量浓度为10％的脱氧胆酸钠溶液进行预处理1h，再利用100KD超滤膜超滤，采用pH为7.4的PBS溶液洗滤，测试得内毒素去除率为96.3％；
⑧病毒灭活制备疫苗制品的步骤
按甲醛在步骤⑦所得产品中终浓度200μg/mL向步骤⑦所得产品加入质量浓度为0.4％的甲醛溶液，5℃灭活7d。
实施例2
一种去除疫苗制品中内毒素的方法，所述方法包括如下步骤：
①病毒液制备的步骤
先将A/Hong Kong/4801/2014流感病毒稀释至3个lgEID50/mL，每胚接种0.2mL，34℃培养60h，再将培养后鸡胚5℃冷却16h，收集病毒液；
②超滤浓缩的步骤
将步骤①所得产品利用100KD超滤膜超滤浓缩至40倍；
③第一次离心纯化的步骤
将步骤②所得产品经蔗糖密度梯度离心，30000rpm离心5h，通过紫外检测收集病毒液；
④第一次脱氧胆酸钠结合超滤步骤
按步骤③所得产品体积的20％加入质量浓度为10％的脱氧胆酸钠溶液进行预处理1h，再利用100KD超滤膜超滤，采用pH为7.4的PBS溶液洗滤，测试得内毒素去除率为93.8％；
⑤裂解病毒的步骤
按步骤④所得产品体积的20％加入无水乙醚，裂解得到裂解液；
⑥第二次离心纯化的步骤
将步骤⑤所得产品经蔗糖密度梯度离心，30000rpm离心7h，通过紫外检测收集病毒液；
⑦第二次脱氧胆酸钠结合超滤步骤
按步骤⑥所得产品体积的2.0％加入质量浓度为10％的脱氧胆酸钠溶液进行预处理1h，再利用100KD超滤膜超滤，采用pH为7.4的PBS溶液洗滤，测试得内毒素去除率为96.1％；
⑧病毒灭活制备疫苗制品的步骤
按甲醛在步骤⑦所得产品中终浓度200μg/mL向步骤⑦所得产品加入质量浓度为0.4％的甲醛溶液，5℃灭活7d。
实施例3
一种去除疫苗制品中内毒素的方法，所述方法包括如下步骤：
①病毒液制备的步骤
先将B/Brisbane/60/2008流感病毒稀释至3个lgEID50/mL，每胚接种0.2mL，34℃培养60h，再将培养后鸡胚5℃冷却16h，收集病毒液；
②超滤浓缩的步骤
将步骤①所得产品利用100KD超滤膜超滤浓缩至40倍；
③第一次离心纯化的步骤
将步骤②所得产品经蔗糖密度梯度离心，30000rpm离心5h，通过紫外检测收集病毒液；
④第一次脱氧胆酸钠结合超滤步骤
按步骤③所得产品体积的30％加入质量浓度为10％的脱氧胆酸钠溶液进行预处理1h，再利用100KD超滤膜超滤，采用pH为7.4的PBS溶液洗滤，测试得内毒素去除率为91.9％；
⑤裂解病毒的步骤
按步骤④所得产品体积的20％加入无水乙醚，裂解得到裂解液；
⑥第二次离心纯化的步骤
将步骤⑤所得产品经蔗糖密度梯度离心，30000rpm离心7h，通过紫外检测收集病毒液；
⑦第二次脱氧胆酸钠结合超滤步骤
按步骤⑥所得产品体积的2.5％加入质量浓度为10％的脱氧胆酸钠溶液进行预处理1h，再利用100KD超滤膜超滤，采用pH为7.4的PBS溶液洗滤，测试得内毒素去除率为98.5％；
⑧病毒灭活制备疫苗制品的步骤
按甲醛在步骤⑦所得产品中终浓度200μg/mL向步骤⑦所得产品加入质量浓度为0.4％的甲醛溶液，5℃灭活7d。
实施例4
一种去除疫苗制品中内毒素的方法，所述方法包括如下步骤：
病毒液制备的步骤
先将B/Phuket/3073/2013流感病毒稀释至3个lgEID50/mL，每胚接种0.2mL，34℃培养60h，再将培养后鸡胚5℃冷却16h，收集病毒液；
②超滤浓缩的步骤
将步骤①所得产品利用100KD超滤膜超滤浓缩至40倍；
③第一次离心纯化的步骤
将步骤②所得产品经蔗糖密度梯度离心，30000rpm离心5h，通过紫外检测收集病毒液；
④第一次脱氧胆酸钠结合超滤步骤
按步骤③所得产品体积的15％加入质量浓度为10％的脱氧胆酸钠溶液进行预处理1h，再利用100KD超滤膜超滤，采用pH为7.4的PBS溶液洗滤，测试得内毒素去除率为90.0％；
⑤裂解病毒的步骤
按步骤④所得产品体积的20％加入无水乙醚，裂解得到裂解液；
⑥第二次离心纯化的步骤
将步骤⑤所得产品经蔗糖密度梯度离心，30000rpm离心7h，通过紫外检测收集病毒液；
⑦第二次脱氧胆酸钠结合超滤步骤
按步骤⑥所得产品体积的1.0％加入质量浓度为10％的脱氧胆酸钠溶液进行预处理1h，再利用100KD超滤膜超滤，采用pH为7.4的PBS溶液洗滤，测试得内毒素去除率为98.4％；
⑧病毒灭活制备疫苗制品的步骤
按甲醛在步骤⑦所得产品中终浓度200μg/mL向步骤⑦所得产品加入质量浓度为0.4％的甲醛溶液，5℃灭活7d。

Claims (10)

1.一种去除疫苗制品中内毒素的方法，其特征在于：所述方法包括第一次脱氧胆酸钠结合超滤的步骤；
所述第一次脱氧胆酸钠结合超滤步骤为：先将通过鸡胚培养得到的流感病毒液超滤浓缩、第一次离心纯化后，按其体积的10-30％加入质量浓度为5-10％的脱氧胆酸钠溶液进行预处理0.5-1h，再利用100KD超滤膜超滤、洗滤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一次脱氧胆酸钠结合超滤步骤中洗滤的方法为：采用pH为7.2-7.6的PBS溶液洗滤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法包括第二次脱氧胆酸钠结合超滤的步骤；
所述第二次脱氧胆酸钠结合超滤步骤为：先将第一次脱氧胆酸钠结合超滤步骤得到的产品裂解病毒、第二次离心纯化后，按其体积的1-3％加入质量浓度为5-10％的脱氧胆酸钠溶液进行预处理0.5-1h，再利用100KD超滤膜超滤、洗滤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述第二次脱氧胆酸钠结合超滤步骤中洗滤的方法为：采用pH为7.2-7.6的PBS溶液洗滤。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于：所述方法包括病毒液制备的步骤、超滤浓缩的步骤、第一次离心纯化的步骤、第一次脱氧胆酸钠结合超滤的步骤、裂解病毒的步骤、第二次离心纯化的步骤、第二次脱氧胆酸钠结合超滤的步骤、病毒灭活制备疫苗制品的步骤；
所述病毒液制备的步骤为：先将流感病毒稀释至3-4个lgEID50/mL，每胚接种0.2mL，33-35℃培养48-72h，再将培养后鸡胚2-8℃冷却12-20h，收集病毒液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述超滤浓缩的步骤为：将病毒液制备步骤得到的产品利用100-300KD超滤膜超滤浓缩至30-50倍。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述第一次离心纯化的步骤为：将超滤浓缩步骤得到的产品经蔗糖密度梯度离心，通过紫外检测收集病毒液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述裂解病毒的步骤为：按第一次脱氧胆酸钠结合超滤步骤得到的产品体积的10-30％加入无水乙醚，裂解得到裂解液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述第二次离心纯化的步骤为：将裂解病毒步骤得到的产品经蔗糖密度梯度离心，通过紫外检测收集病毒液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述病毒灭活制备疫苗制品的步骤为：按甲醛在第二次脱氧胆酸钠结合超滤步骤得到的产品中终浓度200μg/mL向第二次脱氧胆酸钠结合超滤步骤得到的产品加入质量浓度为0.4％的甲醛溶液，灭活。
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