KR20180101354A - 고정화 바이러스 입자를 포함하는 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고정화 바이러스 입자를 포함하는 백신으로서, 고정화 바이러스 입자의 발열 시험에 있어서의 토끼 3마리에서의 발열 반응의 합이, 고정화 바이러스 입자의 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자에 있어서의 토끼 3마리에서의 발열 반응의 합을 기준으로 하여, 80％ 미만인, 백신에 관한 것이다.

Description

고정화 바이러스 입자를 포함하는 백신

본 발명은 고정화 바이러스 입자를 포함하는 백신에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 바이러스의 입자 구조를 고정화제로 고정화시킴으로써, 부반응을 억제한 고정화 바이러스 입자를 포함하는 백신에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스 및 일본 뇌염 바이러스 등의 바이러스에 의한 감염증은, 바이러스의 종류, 감염된 대상에 따라 중증화되는 경우가 있다. 이와 같은 바이러스에 의한 감염증에 대한 방어, 예방의 방법으로서, 백신의 접종 등이 알려져 있다.

국제 공개 제2016/010081호

J. Infect. Dis. 2009 200(6) 841-848 Vaccine 2009 27(5) 786-791

인플루엔자 바이러스 및 일본 뇌염 바이러스 등의 바이러스에 대한 백신은, 불활화(不活化) 백신과 생백신의 2종류가 제조, 시판되고 있다. 이 중, 불활화 백신은, 정제한 바이러스 입자를 포르말린 등의 불활화제로 처리하여 조제하는 전체 입자 백신과, 정제한 바이러스 입자를 유기 용매 또는 계면 활성제로 파괴(스플릿화)하여 조제하는 스플릿 백신으로 대별된다. 전체 입자 백신은 면역원성이 높고, 감염 예방의 효과 면에서는 우수하다. 그러나, 전체 입자 백신은, 국소 반응 및 발열 반응 등의 부반응이 강하게 나오는 경향이 있다. 한편 스플릿 백신은, 국소 반응이 저감되어, 발열 반응도 거의 없기 때문에 안전성이 우수하다. 그러나, 기초 면역이 성립되어 있지 않은 소아 또는 면역 반응이 쇠약해진 고령자에 있어서, 스플릿 백신의 면역원성은 낮은 경향이 있다. 따라서, 스플릿 백신보다 우수한 유효성(면역원성)이 나타나고, 또한 안전성이 높은 백신의 개발이 요망되고 있다.

본 발명은 상기 사정을 감안하여 이루어진 것으로, 면역원성이 높고, 또한 부반응이 억제된 백신의 제공을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구한 결과, 놀랍게도 바이러스 입자의 입자 구조를 파괴(스플릿화)하지 않고, 고정화제로 고정화시킴으로써, 본래의 바이러스 입자와 동등한 성분 및 구조를 유지한 바이러스 입자(이하, 「고정화 바이러스 입자」라고 하는 경우가 있다)를 포함하는 백신이, 면역원성 시험에 있어서 동등하고, 발열 시험 등의 부반응의 성적에 있어서 우수한 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키는 데에 도달했다.

즉, 본 발명은 이하의 [1]∼[15]를 제공한다.

[1] 고정화 바이러스 입자를 포함하는 백신으로서,

상기 고정화 바이러스 입자의 발열 시험에 있어서의 토끼 3마리에서의 발열 반응의 합이, 상기 고정화 바이러스 입자의 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자에 있어서의 토끼 3마리에서의 발열 반응의 합을 기준으로 하여, 80％ 미만인, 백신.

[2] 상기 고정화 바이러스 입자의 발열 시험에 있어서의 토끼 3마리에서의 발열 반응의 합이 1.3℃ 이하인, [1]에 기재된 백신.

[3] 고정화 바이러스 입자를 포함하는 백신으로서,

상기 고정화 바이러스 입자에 의해 자극을 받은 인간 말초혈 단핵구로부터 산생되는 염증성 사이토카인의 양이, 상기 고정화 바이러스 입자의 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자에 의해 자극을 받은 인간 말초혈 단핵구로부터 산생되는 염증성 사이토카인의 양을 기준으로 하여, 80％ 미만인, 백신.

[4] 상기 고정화 바이러스 입자의 근원이 되는 바이러스 입자가, 오르토믹소 바이러스 입자, 플라비 바이러스 입자, 또는 피코르나 바이러스 입자를 포함하는, [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 백신.

[5] 상기 바이러스 입자가, 인플루엔자 바이러스 입자, 일본 뇌염 바이러스 입자, 또는 A형 간염 바이러스 입자를 포함하는, [4]에 기재된 백신.

[6] 상기 바이러스 입자가 인플루엔자 바이러스 입자를 포함하는, [5]에 기재된 백신.

[7] 상기 인플루엔자 바이러스 입자가, A형 인플루엔자 바이러스 입자, 또는 B형 인플루엔자 바이러스 입자를 포함하는, [6]에 기재된 백신.

[8] 상기 인플루엔자 바이러스 입자가, H1N1 아형주(亞型株), H2N2 아형주, H3N2 아형주, H3N8 아형주, H5N1 아형주, H5N2 아형주, H5N6 아형주, H6N1 아형주, H7N3 아형주, H7N7 아형주, H7N9 아형주, H9N2 아형주, 또는 H10N8 아형주로 분류되는 인플루엔자 바이러스 입자를 포함하는, [6] 또는 [7]에 기재된 백신.

[9] 상기 바이러스 입자가 일본 뇌염 바이러스 입자를 포함하는, [5]에 기재된 백신.

[10] 상기 일본 뇌염 바이러스 입자가, 베이징-1주, 나카야마주, SA14-14-2주, 또는 P3주를 포함하는, [9]에 기재된 백신.

[11] 상기 고정화 바이러스 입자의 표면의 단백질의 0％∼90％가 고정화되어 있지 않은, [1]∼[10] 중 어느 하나에 기재된 백신.

[12] 상기 고정화 바이러스 입자의 근원이 되는 바이러스 입자의 비활성(항원 함량/단백질 함량)에 대한, 상기 고정화 바이러스 입자의 비활성의 상대값이 0％∼95％인, [1]∼[11] 중 어느 하나에 기재된 백신.

[13] 상기 고정화 바이러스 입자가, 상기 고정화 바이러스 입자의 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자의 입자경의 80％∼150％의 평균 입자경을 갖는, [1]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 백신.

[14] 상기 고정화 바이러스 입자를 자당 밀도 구배 원심으로 측정했을 경우에, 자당 농도 35％ 이상에 피크가 검출되는, [1]∼[13] 중 어느 하나에 기재된 백신.

[15] 상기 고정화 바이러스 입자를 고속 액체 크로마토그래피로 측정했을 경우에, 단봉성(單峰性)의 피크가 보이는, [1]∼[14] 중 어느 하나에 기재된 백신.

[16] 마우스에 면역했을 경우, 상기 고정화 바이러스 입자에 특이적인 IgG1보다, 상기 고정화 바이러스 입자에 특이적인 IgG2a를 유도하는, [1]∼[15] 중 어느 하나에 기재된 백신.

또한 본 발명은 이하의 [17]∼[31]을 제공한다.

[17] 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자를 포함하는 현탁액에 고정화제를 첨가하는 공정을 포함하는, 고정화 바이러스 입자의 제조 방법.

[18] 상기 고정화제가 알데히드류를 포함하는, [17]에 기재된 제조 방법.

[19] 상기 알데히드류가, 포름알데히드, 파라포름알데히드, 글루타르알데히드, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는, [18]에 기재된 제조 방법.

[20] 상기 알데히드류가 포름알데히드를 포함하는, [19]에 기재된 제조 방법.

[21] 상기 포름알데히드의 농도가, 상기 현탁액 및 상기 고정화제의 전체량을 기준으로 하여, 0.005∼0.5w/v％인, [20]에 기재된 제조 방법.

[22] 상기 알데히드류가 글루타르알데히드를 포함하는, [19]에 기재된 제조 방법.

[23] 상기 글루타르알데히드의 농도가, 상기 현탁액 및 상기 고정화제의 전체량을 기준으로 하여, 0.001∼0.06w/v％인, [22]에 기재된 제조 방법.

[24] 상기 고정화제가 카르보디이미드류를 포함하는, [17]에 기재된 제조 방법.

[25] 상기 카르보디이미드류가, 디시클로헥실카르보디이미드, 디이소프로필카르보디이미드, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염, 그들의 유사체(類緣體), 및 그들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는, [24]에 기재된 제조 방법.

[26] 상기 카르보디이미드류가 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염을 포함하는, [25]에 기재된 제조 방법.

[27] 상기 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염의 농도가, 상기 현탁액 및 상기 고정화제의 전체량을 기준으로 하여, 0.05∼1500mM인, [26]에 기재된 제조 방법.

[28] 근원이 되는 상기 바이러스 입자가, 배양 세포, 계란 또는 마우스뇌에 감염시켜, 회수된 바이러스 입자인, [17]∼[27] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

[29] 상기 배양 세포가 초대 세포, 또는 주화 세포를 포함하는, [28]에 기재된 제조 방법.

[30] 상기 배양 세포가 Vero 세포, 또는 MDCK 세포를 포함하는, [29]에 기재된 제조 방법.

[31] [17]∼[30] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법에 의해 얻어진 고정화 바이러스 입자를 첨가하는 공정을 포함하는, 백신의 제조 방법.

본 발명에 의하면, 면역원성이 높고, 또한 부반응이 억제된 백신의 제공이 가능해진다.

도 1은, 고정화 인플루엔자 바이러스 입자를 전자 현미경으로 촬영한 사진이다(포르말린 처리).
도 2는, 고정화 인플루엔자 바이러스 입자를 전자 현미경으로 촬영한 사진이다(글루타르알데히드 처리).
도 3은, 고정화 인플루엔자 바이러스 입자를 전자 현미경으로 촬영한 사진이다(EDC 처리).
도 4는, 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자를 전자 현미경으로 촬영한 사진이다(글루타르알데히드 처리).
도 5는, 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자를 전자 현미경으로 촬영한 사진이다(포르말린 처리).
도 6은, 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자를 전자 현미경으로 촬영한 사진이다(EDC 처리).

이하, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대해 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 실시형태에 한정되는 것은 아니다.

(고정화 바이러스 입자를 포함하는 백신)

본 실시형태에 관련된 백신은, 고정화 바이러스 입자를 포함하는 백신으로서, 상기 고정화 바이러스 입자의 발열 시험에 있어서의 토끼 3마리에서의 발열 반응의 합(℃)이, 상기 고정화 바이러스 입자의 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자에 있어서의 토끼 3마리에서의 발열 반응의 합을 기준으로 하여, 저하되고 있다. 또, 상기 백신은, 고정화 바이러스 입자에 의해 자극을 받은 인간 말초혈 단핵구로부터 산생되는 염증성 사이토카인의 양이, 상기 고정화 바이러스 입자의 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자에 의해 자극을 받은 인간 말초혈 단핵구로부터 산생되는 염증성 사이토카인의 양을 기준으로 하여, 저감되고 있다. 즉, 고정화 바이러스 입자를 포함하는 백신의 면역원성은, 스플릿 백신의 면역원성 이상이며, 국소 반응 및 발열 반응 등의 부반응이 스플릿 백신과 동등하게 억제되어 있다. 다른 측면에 있어서, 고정화 바이러스 입자는, 종래의 불활화 바이러스 입자를 포함하는 전체 입자 백신과 비교하여 안정성이 우수하다.

「고정화 바이러스 입자」란, 숙주에의 감염 능력이 없고, 바이러스 입자 표면의 단백질끼리가 가교됨으로써 입자 구조가 고정화되어 있는 바이러스 입자를 의미한다. 고정화 바이러스 입자는, 근원의 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자와 동등한 입자성을 유지하기 때문에, 면역원성이 높다. 고정화 바이러스 입자는, 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자를 고정화제로 처리함으로써 얻어진다. 여기서 「고정화제」란, 공유 결합에 의해 바이러스 입자의 단백질끼리를 가교하는 약제를 의미한다. 예를 들어, 고정화제는, 표면 항원끼리, 표면 항원과 매트릭스 단백질 혹은 막 단백질, 또는 매트릭스 단백질끼리 혹은 막 단백질끼리를 가교시켜, 바이러스 입자의 입자 구조를 유지하는 약제이다.

「불활화 바이러스 입자」란, 숙주에의 감염 능력이 없고, 입자 구조가 고정화되어 있지 않은 바이러스 입자를 의미한다. 불활화 바이러스 입자는, 근원이 되는 바이러스 입자를 불활화제로 처리함으로써 얻어진다. 인플루엔자 바이러스 입자의 경우, 불활화 바이러스 입자는, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 입자를 포함하는 현탁액에, 최종 농도가 0.02v/v％(포름알데히드 환산으로, 0.0072∼0.0076w/v％)가 되도록 포르말린(36∼38w/v％ 포름알데히드 수용액)을 첨가하고, 4℃에서 6주간 반응시킴으로써 얻어진 것이어도 된다. 일본 뇌염 바이러스 입자의 경우, 불활화 바이러스 입자는, 예를 들어, 시판되고 있는 Vero 세포 배양 일본 뇌염 백신 원약(原藥)(화학 및 혈청 요법 연구소 제조, 상품명 「엔세박」, 0.08v/v％ 포르말린으로 불활화제의 일본 뇌염 바이러스 입자를 포함한다)이어도 된다.

발열 시험은, 생물학적 제제 기준(일본국, 후생 노동성 고시 제192호)에서 나타내고 있는 발열 시험법에 준한 방법으로 실시된다. 「발열 반응」이란, 검체를 귀정맥 내에 주사한 후에 측정한 토끼의 체온(「측정값」이라고 하는 경우가 있다)과, 주사하기 전에 측정한 토끼의 체온(「대조 체온」이라고 하는 경우가 있다)의 차(「차체온」이라고 하는 경우가 있다)의 최대값을 의미한다. 여기서, 차체온이 부(負)의 값일 때에는, 발열 반응은 0으로 해석된다.

구체적으로는, 이하의 순서로 발열 시험이 실시된다. 먼저, 고정화 바이러스 입자를 생리 식염수로 희석시키고, 1㎖ 중의 단백질 함량을 70㎍(일본 뇌염 바이러스 입자의 경우) 또는 240㎍(인플루엔자 바이러스 입자의 경우)로 한 것을 시료로 한다. 상기 시료를, 체중 1㎏당에 대해 1∼3㎖를 토끼에 접종하고, 6시간 후까지 발열의 상승을 관찰한다. 시료를 접종하기 전의 토끼의 체온(대조 체온)과 접종한 후의 토끼의 체온의 차를 구하고, 그 차의 최대값을 그 토끼의 발열 반응으로 한다. 동일한 시험을 3마리의 토끼에 대해 실시하고, 토끼 3마리의 발열 반응의 합(℃)을 구한다.

상기 백신은, 고정화 바이러스 입자의 발열 시험에 있어서의 토끼 3마리에서의 발열 반응의 합이, 고정화 바이러스 입자의 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자에 있어서의 토끼 3마리에서의 발열 반응의 합을 기준으로 하여, 80％ 미만이어도 되고, 60％ 미만이어도 되고, 40％ 미만이어도 되고, 20％ 미만이어도 되고, 10％ 미만이어도 된다. 하한은 특별히 제한은 없지만, 고정화 바이러스 입자의 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자에 있어서의 토끼 3마리에서의 발열 반응의 합을 기준으로 하여, 0％ 이상이어도 되고, 20％ 이상이어도 된다. 발열 반응의 합을 상기 범위로 함으로써, 종래의 불활화 바이러스 입자를 포함하는 전체 입자 백신과 비교하여 부반응이 억제된 백신의 제공이 가능해진다.

상기 백신은, 고정화 바이러스 입자의 발열 시험에 있어서의 토끼 3마리에서의 발열 반응의 합이 1.3℃ 이하이어도 되고, 0.9℃ 이하이어도 되고, 0.5℃ 이하이어도 된다. 하한은 특별히 제한은 없지만, 0℃ 이상이어도 되고, 0.6℃ 이상이어도 된다. 발열 반응의 합을 상기 범위로 함으로써, 종래의 불활화 바이러스 입자를 포함하는 전체 입자 백신과 비교하여 부반응이 억제된 백신의 제공이 가능해진다.

「염증성 사이토카인」이란, 염증에 수반하여 산생되는 사이토카인의 총칭이며, 예를 들어, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-α, IFN-γ 등을 들 수 있다.

「인간 말초혈 단핵구」(PBMC)란, 인간의 말초혈로부터 얻어진 림프구(T세포, B세포, NK세포 등을 포함한다) 및 단구를 의미한다.

염증성 사이토카인의 양은, 유럽 약국방 MONOCYTE-ACTIVATION TEST에 준한 방법으로, 바이러스 입자에 의해 인간 말초혈 단핵구(PBMC)를 자극했을 경우의 염증성 사이토카인의 산생량을 정량함으로써 구해진다. 상기 방법으로는, 유럽 약국방 MONOCYTE-ACTIVATION TEST에 있어서, 후술하는 실시예에 나타내는 측정 조건의 변경을 실시한 방법이어도 된다.

상기 백신은, 고정화 바이러스 입자에 의해 자극을 받은 인간 말초혈 단핵구로부터 산생되는 염증성 사이토카인의 양이, 고정화 바이러스 입자의 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자에 의해 자극을 받은 인간 말초혈 단핵구로부터 산생되는 염증성 사이토카인의 양을 기준으로 하여, 80％ 미만이어도 되고, 60％ 미만이어도 되고, 40％ 미만이어도 되고, 20％ 미만이어도 되고, 10％ 미만이어도 된다. 하한은 특별히 제한은 없지만, 고정화 바이러스 입자의 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자에 의해 자극을 받은 인간 말초혈 단핵구로부터 산생되는 염증성 사이토카인의 양을 기준으로 하여, 0％ 이상이어도 되고, 40％ 이상이어도 된다. 고정화 바이러스 입자에 의해 자극을 받은 인간 말초혈 단핵구로부터 산생되는 염증성 사이토카인의 양을 상기 범위로 함으로써, 종래의 불활화 바이러스 입자를 포함하는 전체 입자 백신과 비교하여 부반응이 억제된 백신의 제공이 가능해진다.

염증성 사이토카인이 IL-1β인 경우, 고정화 바이러스 입자에 의해 자극을 받은 인간 말초혈 단핵구로부터 산생되는 염증성 사이토카인의 농도는, 상기 인간 말초혈 단핵구를 포함하는 배양액을 기준으로 하여, 30pg/㎖ 이하이어도 되고, 20pg/㎖ 이하이어도 된다. 하한은 특별히 제한은 없지만, 0pg/㎖ 이상이어도 되고, 5pg/㎖ 이상이어도 된다. 고정화 바이러스 입자에 의해 자극을 받은 인간 말초혈 단핵구로부터 산생되는 염증성 사이토카인의 농도를 상기 범위로 함으로써, 종래의 불활화 바이러스 입자를 포함하는 전체 입자 백신과 비교하여 부반응이 억제된 백신의 제공이 가능해진다.

염증성 사이토카인이 IL-6인 경우, 고정화 바이러스 입자에 의해 자극을 받은 인간 말초혈 단핵구로부터 산생되는 염증성 사이토카인의 농도는, 상기 인간 말초혈 단핵구를 포함하는 배양액을 기준으로 하여, 50pg/㎖ 이하이어도 되고, 40pg/㎖ 이하이어도 된다. 하한은 특별히 제한은 없지만, 0pg/㎖ 이상이어도 되고, 5pg/㎖ 이상이어도 된다. 고정화 바이러스 입자에 의해 자극을 받은 인간 말초혈 단핵구로부터 산생되는 염증성 사이토카인의 농도를 상기 범위로 함으로써, 종래의 불활화 바이러스 입자를 포함하는 전체 입자 백신과 비교하여 부반응이 억제된 백신의 제공이 가능해진다.

고정화 바이러스 입자의 근원이 되는 바이러스 입자로는, 예를 들어, 폭스 바이러스 입자, 헤르페스 바이러스 입자, 오르토믹소 바이러스 입자, 파라믹소 바이러스 입자, 랍도 바이러스 입자, 코로나 바이러스 입자, 아레나 바이러스 입자, 토가 바이러스 입자, 플라비 바이러스 입자, 부니아 바이러스 입자, 레트로 바이러스 입자, 헤파드나 바이러스 입자, 아데노 바이러스 입자, 파필로마 바이러스 입자, 파포바 바이러스입자, 필로 바이러스 입자, 레오 바이러스 입자, 피코르나 바이러스 입자 및 칼리시 바이러스 입자를 들 수 있다. 상기 오르토믹소 바이러스 입자는, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 입자를 들 수 있다. 상기 플라비 바이러스 입자는, 예를 들어, 일본 뇌염 바이러스 입자를 들 수 있다. 상기 피코르나 바이러스 입자는, 예를 들어, A형 간염 바이러스 입자를 들 수 있다.

인플루엔자 바이러스 입자로는, 예를 들어, A형 인플루엔자 바이러스 입자 및 B형 인플루엔자 바이러스 입자를 들 수 있다. A형 인플루엔자 바이러스 입자의 경우에는, 예를 들어, H1N1 아형주, H2N2 아형주, H3N2 아형주, H3N8 아형주, H5N1 아형주, H5N2 아형주, H5N6 아형주, H6N1 아형주, H7N3 아형주, H7N7 아형주, H7N9 아형주, H9N2 아형주, 또는 H10N8 아형주로 분류되는 인플루엔자 입자를 들 수 있다.

일본 뇌염 바이러스 입자로는, 예를 들어, 일본 뇌염 바이러스 입자의 베이징-1주, 나카야마주(나카야마-요켄주), 또는 SA14-14-2주 및 P3주를 들 수 있다.

고정화 바이러스 입자는, 스플릿 백신과 같이 입자 구조가 파괴되어 있지 않기 때문에, 바이러스 입자에서 유래하는 게놈 핵산(DNA, RNA 등)을 포함한다. 바이러스 입자 유래의 게놈 핵산은 아쥬반트로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 불활화 폴리오바이러스 백신에는 바이러스 게놈 RNA를 포함하는 D항원과, 바이러스 게놈 RNA를 포함하지 않는 C항원이 있다. C항원은 면역원성이 약하여 백신 항원으로서의 효과를 나타내지 않는다. 백신 항원으로서 효과를 갖는 분자종은 D항원뿐이다. 이것은 백신에 내포된 바이러스 게놈 RNA가 그 효과의 발현에 중요한 것을 시사하고 있다. 그 때문에, 본 실시형태에 관련된 백신은, Th1형 응답을 유도할 수 있다. 스플릿 인플루엔자 백신이 Th2형 응답을 유도하는 것과는 대조적이다. 마우스에 있어서 Th1형 응답에 의해 유도되는 IgG2a 서브클래스의 항체는, Th2형 응답에 의해 유도되는 IgG1 서브클래스의 항체보다 인플루엔자 바이러스에 대한 감염 방어능이 우수하다. 이러한 점에서, 상기 백신에 의한 유효성의 추가적인 향상을 기대할 수 있다. 즉, 상기 백신은, 마우스에 면역했을 경우, 고정화 바이러스 입자에 특이적인 IgG1보다, 고정화 바이러스 입자에 특이적인 IgG2a를 유도해도 된다.

고정화 바이러스 입자는, 자당 밀도 구배 원심, 고속 액체 크로마토그래피, 및/또는 동적 광 산란법에 의해 측정했을 경우, 근원의 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자와 실질적으로 동일한 파라미터(예를 들어, 분자량, 평균 입자경, 밀도, 헤마글루티닌(HA) 함량 등)이어도 된다.

예를 들어, 고정화 바이러스 입자가, 근원의 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자의 입자경의 80％∼150％의 평균 입자경을 갖는 고정화 바이러스 입자이어도 되고, 90％∼140％의 평균 입자경을 갖는 고정화 바이러스 입자이어도 된다. 일본 뇌염 바이러스 입자의 경우, 고정화 바이러스 입자가, 근원의 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자의 입자경의 90％∼130％의 평균 입자경을 갖는 고정화 바이러스 입자이어도 되고, 100％∼120％의 평균 입자경을 갖는 고정화 바이러스 입자이어도 된다.

고정화 바이러스 입자가 인플루엔자 바이러스 입자를 근원으로 하는 경우, 고정화 바이러스 입자의 평균 입자경은, 동적 광 산란법으로 측정했을 경우에 150㎚ 전후이어도 되고, 120㎚∼180㎚이어도 되고, 130㎚∼170㎚이어도 된다. 다른 면에 있어서, 고정화 바이러스 입자가 인플루엔자 바이러스 입자를 근원으로 하는 경우, 고정화 바이러스 입자의 평균 입자경은, 동적 광 산란법으로 측정했을 경우에 100㎚ 이상이어도 되고, 120㎚ 이상이어도 되고, 130㎚ 이상이어도 되고, 150㎚ 이상이어도 되고, 170㎚ 이상이어도 된다. 상기 평균 입자경은, 180㎚ 이하이어도 되고, 175㎚ 이하이어도 되고, 170㎚ 이하이어도 된다. 고정화 바이러스 입자가, 일본 뇌염 바이러스 입자를 근원으로 하는 경우, 고정화 바이러스 입자의 평균 입자경은, 동적 광 산란법으로 측정했을 경우에 90㎚ 전후이어도 되고, 80㎚∼110㎚이어도 된다. 다른 측면에 있어서, 고정화 바이러스 입자가, 일본 뇌염 바이러스 입자를 근원으로 하는 경우, 고정화 바이러스 입자의 평균 입자경은, 동적 광 산란법으로 측정했을 경우에 70㎚ 이상이어도 되고, 80㎚ 이상이어도 되고, 90㎚ 이상이어도 된다. 상기 평균 입자경은, 110㎚ 이하이어도 되고, 100㎚ 이하이어도 된다.

고정화 바이러스 입자가, 엔벨로프를 갖는 바이러스 입자를 근원으로 하는 경우, 상기 고정화 바이러스 입자의 지질 성분의 함유량은, 상기 바이러스 입자의 지질 성분의 함유량에 대해 동등해도 된다.

고정화 바이러스 입자는, 자당 밀도 구배 원심으로 측정했을 경우에, 자당 농도 35％ 이상에 피크가 검출되는 고정화 바이러스 입자이어도 되고, 자당 농도 45％ 이상 55％ 이하에 피크가 검출되는 고정화 바이러스 입자이어도 된다. 상기 자당 농도는, 공지된 방법에 의해 구하는 것이 가능하다. 예를 들어, 고정화 바이러스 입자를 포함하는 검체를 15∼60％의 자당 밀도 구배에 중층하고, 4℃, 18000rpm(RCF=57500(×g))으로 16시간, 원심 분리를 실시함으로써 상기 자당 농도를 구할 수 있다.

고정화 바이러스 입자는, 고속 액체 크로마토그래피(사이즈 배제 크로마토그래피(SEC))로 측정했을 경우에, 단봉성의 피크가 보이는 고정화 바이러스 입자이어도 된다. 예를 들어, 사이즈 배제 크로마토그래피(상품명:TSKgel G6000PWXL(TOSOH사 제조) 또는 Superose 6.10/300 GE(GE 헬스케어사 제조))를 사용하여 분자량 측정을 실시하는 경우(용리액:PBS, 유속:0.5㎖/min), 용출 시간 14∼15분 부근에 단봉성의 피크가 보이는, 일본 뇌염 바이러스 입자의 고정화 바이러스 입자이어도 되고, 용출 시간 16∼17분 부근에 단봉성의 피크가 보이는, 인플루엔자 바이러스 입자의 고정화 바이러스 입자이어도 된다.

상기 백신은, 고정화 바이러스 입자 표면의 단백질의 0％∼90％가 고정화되어 있지 않아도 되고, 고정화 바이러스 입자 표면의 단백질의 5％∼80％가 고정화되어 있지 않아도 된다.

고정화 바이러스 입자 표면의 단백질로는, 표면 항원, 매트릭스 단백질, 막 단백질, 및 그들의 조합을 들 수 있다.

바이러스 입자가 인플루엔자 바이러스 입자인 경우, 상기 표면 항원으로는, 예를 들어, 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다아제(NA)를 들 수 있다. 상기 매트릭스 단백질로는, 예를 들어, M1 단백질을 들 수 있다. 상기 막 단백질로는, 예를 들어, M2 단백질을 들 수 있다.

바이러스 입자가 일본 뇌염 바이러스 입자인 경우, 상기 표면 항원으로는, 예를 들어, E 단백질, M 단백질을 들 수 있다.

고정화되어 있지 않은 단백질의 비율을 산출하는 방법으로는, 예를 들어, 대상이 되는 단백질의 본래의 분자량에 있어서의, 고정화 전과 고정화 후의 단백질의 양의 변화율(잔존율)을 구하는 방법을 들 수 있다. 예를 들어, 고정화 바이러스 입자가 인플루엔자 바이러스 입자를 근원으로 하는 경우, 환원 조건하에 있어서의 SDS-PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기 영동)를 실시한 후에, 바이러스의 구성 단백질의 하나인 M1 단백질의 밴드의 진함을 덴시토메트리에 의해 구하고, M1 단백질의 잔존율(％)을 산출하는 방법을 들 수 있다. 이 경우, 고정화제의 농도가 높아짐에 따라, M1 단백질의 잔존율이 저하되는 경향이 있다. 이 방법을 응용함으로써, 고정화제에 의한 가교도 분석을 실시할 수 있다.

본 실시형태에 있어서, 고정화 바이러스 입자가 인플루엔자 바이러스 입자를 근원으로 하는 경우, M1 단백질의 잔존율이 5％∼90％인 고정화 바이러스 입자이어도 되고, M1 단백질의 잔존율이 10％∼80％인 고정화 바이러스 입자이어도 된다. 바꾸어 말하면, M1 단백질의 5％∼90％가 고정화되어 있지 않아도 되고, 10％∼80％가 고정화되어 있지 않아도 된다.

가교도 분석은, 고정화 바이러스 입자의 비활성(항원 함량/단백질 함량)을 구함으로써 실시할 수도 있다. 바이러스 입자의 항원 함량 측정에 사용되는 모노클로날 항체는, 중화 에피토프를 인식하고 있고, 중화 에피토프의 구조 변화가 일어나면 비활성이 저하된다. 이 성질을 이용하여, 고정화를 실시하지 않은 바이러스 입자에 대한, 고정화 바이러스 입자의 비활성의 상대값(％)을 산출하고, 가교도를 평가한다. 본 실시형태에 있어서, 비활성의 상대값은 0∼95％의 범위이다. 고정화 바이러스 입자가 일본 뇌염 바이러스를 근원으로 하는 경우, 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 비활성의 상대값은, 90∼95％이어도 되고, 70∼90％이어도 되고, 50∼70％이어도 된다.

백신에 포함되는 고정화 바이러스 입자의 양은, 바이러스의 종류 또는 투여 대상에 따라 적절히 선택해도 된다. 예를 들어, 인플루엔자 백신에 포함되는 고정화 바이러스 입자의 양(농도)은, 헤마글루티닌 농도로서, 바이러스주당 1∼40㎍HA/㎖이어도 된다.

백신은, 동일한 종류의 바이러스 또는 세균에서 유래하는 항원을 포함하는, 단미(單味) 백신이어도 된다. 백신은, 복수 종류의 바이러스 또는 세균에서 유래하는 항원을 포함하는, 혼합 백신이어도 된다. 백신은, 동일 속의 바이러스 또는 세균으로서, 복수 종류의 형(型)에서 유래하는 항원을 포함하는, 다가 백신이어도 된다. 예를 들어, 백신이 인플루엔자 바이러스 백신인 경우, 고정화 A형 인플루엔자 바이러스 입자 또는 고정화 B형 인플루엔자 바이러스 입자 중 어느 것을 포함하고 있어도 되고, 그것들을 양자 모두 포함하고 있어도 된다. 백신이 일본 뇌염 바이러스 백신인 경우, 세포 배양 유래 또는 마우스뇌 유래 바이러스 중 어느 것을 포함하고 있어도 된다. 상기 인플루엔자 바이러스 백신 또는 일본 뇌염 바이러스 백신은, 다른 바이러스 또는 세균에서 유래하는 항원을 포함하고 있어도 된다. 예를 들어, 디프테리아·백일해·파상풍·불활화 폴리오바이러스 혼합 백신(DPT-IPV 백신)에 혼합되어 있어도 된다.

백신의 제형은, 예를 들어, 액상, 분말상(동결 건조 분말, 건조 분말 등), 캡슐상, 정제, 동결 상태이어도 된다.

백신은, 의약품으로서 허용될 수 있는 담체를 포함하고 있어도 된다. 상기 담체로는, 백신 제조에 통상 사용되는 담체를 제한없이 사용할 수 있다. 구체적으로는, 상기 담체는, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 등장수성 완충액 및 그들의 조합을 들 수 있다. 백신은, 유화제, 보존제(예를 들어, 티메로살), 등장화제, pH 조정제, 불활화제(예를 들어, 포르말린) 등이, 더욱 적절히 배합되어도 된다.

백신의 투여 경로는, 예를 들어, 경피 투여, 설하 투여, 점안 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 경구 투여, 경장 투여, 경비 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 입으로부터 폐로의 흡입 투여이어도 된다.

백신의 투여 방법은, 예를 들어, 시린지, 경피적 패치, 마이크로 니들, 이식 가능한 서방성 디바이스, 마이크로 니들을 부착한 시린지, 무침 장치, 또는 스프레이에 의해 투여하는 방법이어도 된다.

면역원성을 더욱 높이기 위해, 백신은 아쥬반트를 포함해도 된다. 아쥬반트로는, 예를 들어, 알루미늄 아쥬반트 또는 스쿠알렌을 포함하는 수중유형 유탁 아쥬반트(AS03, MF59 등), CpG 및 3-O-탈아실화-4'-모노포스포릴 lipid A(MPL) 등의 Toll형 수용체의 리간드, 사포닌계 아쥬반트, 폴리γ-글루탐산 등의 폴리머계 아쥬반트, 그리고 키토산 및 이눌린 등의 다당류를 들 수 있다.

대상이 되는 포유 동물로는, 예를 들어, 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 염소, 원숭이, 인간 등을 들 수 있다. 본 실시형태에 관련된 백신은, 인간에 대해 사용되어도 되고, 5세 미만의 소아, 65세 이상의 고령자에 대해 사용되어도 된다.

백신은, 투여의 목적, 투여 방법, 투여 대상의 상태(성별, 연령, 체중, 병상 등)에 따라 상이하지만, 인플루엔자 백신이 인간에 대해 투여되는 경우, 1회당, 3.8㎍HA∼30㎍HA의 유효 성분(고정화 바이러스 입자)이 투여되도록 사용되어도 된다.

(고정화 바이러스 입자의 제조 방법)

본 실시형태에 관련된 고정화 바이러스 입자의 제조 방법은, 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자에 대해 입자 구조를 고정화시키는 공정을 포함한다.

백신의 안전성을 높이는 기술로서, 종래부터, 계면 활성제 또는 유기 용매를 사용하여 엔벨로프를 갖는 바이러스 입자를 파괴(스플릿화)하는 방법이 알려져 있다. 그러나, 이러한 방법에서는 입자의 붕괴에 수반하여 백신의 유효성(면역원성)이 저하되는 경향이 있다. 상기 제조 방법에서는, 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자를 바이러스 입자 단백질과의 공유 결합을 일으키는 고정화제로 처리하고 있기 때문에, 바이러스 입자 구조가 유지되고, 결과적으로, 백신의 유효성을 유지하면서, 안전성을 높이는 것이 가능해진다.

상기 제조 방법에는, 숙주를 배양하는 공정, 바이러스를 숙주에게 감염시키는 공정, 숙주 내에서 바이러스를 증식시키는 공정, 숙주로부터 바이러스 입자를 회수하는 공정, 또는 회수된 바이러스 입자를 불활화하는 공정을 추가로 포함하고 있어도 된다.

바이러스 입자는, 숙주에게 바이러스 입자를 감염, 증식시킨 후에, 숙주로부터 회수된 바이러스 입자이어도 된다. 숙주는 바이러스 입자의 종류에 따라 적절히 선택해도 된다. 바이러스 입자를 불활화하는 방법은 공지된 방법을 사용하면 되고, 예를 들어, 포르말린 등의 불활화제로 불활화하는 방법을 들 수 있다. 바이러스 입자가 인플루엔자 바이러스 입자인 경우에는, 숙주로는 예를 들어, 배양 세포, 계란 및 마우스뇌를 들 수 있다. 배양 세포로는, 초대 세포이어도 되고 주화 세포이어도 된다. 배양 세포로는, 예를 들어, Vero 세포 및 MDCK 세포를 들 수 있다.

인플루엔자 바이러스의 감염, 증식 방법으로는, 계란 또는 Vero 세포를 숙주로서 사용하는 방법(Vaccine. 1998 May-Jun;16(9-10):960-8.), Vero 세포를 숙주로서 사용하는 방법(Vaccine. 2007 August 10;25(32):6028-6036.), MDCK 세포를 숙주로서 사용하는 방법(J Virol. 2012 Nov;86(22):12341-50)이, 당업자에게 있어 공지된 방법이다.

바이러스 입자의 고정화

상기 고정화시키는 공정은, 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자를 고정화제로 처리하는 방법이 예시되고, 예를 들어, 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자를 포함하는 현탁액에 고정화제를 첨가하는 공정을 들 수 있다. 현탁액 중의 바이러스 입자의 농도는, 바이러스의 종류, 고정화제의 종류 및 그 농도 등에 따라 적절히 변경해도 된다. 예를 들어, 현탁액 중의 바이러스 입자의 농도는, 바이러스 입자의 단백질의 농도로서, 60∼90㎍/㎖이어도 되고, 300∼3000㎍/㎖이어도 되고, 500∼2500㎍/㎖이어도 된다.

고정화제의 종류는, 바이러스의 종류에 따라 적절히 변경할 수 있다. 예를 들어, 상기 고정화제는, 유기 용매, 알데히드류, 디이미드에스테르, 비스(3,5-디브로모살리실)푸말레이트(DBBF), 카르보디이미드류, 및 그들의 조합을 들 수 있다. 유기 용매로는, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 및 그들의 조합을 들 수 있다. 알데히드류로는, 예를 들어, 포름알데히드(FA)(예를 들어, 포르말린), 파라포름알데히드, 글루타르알데히드(GA), 및 그들의 조합을 들 수 있다. 카르보디이미드류로는, 예를 들어, 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 디이소프로필카르보디이미드(DIC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(EDC), 그들의 유사체 및 그들의 조합을 들 수 있다.

고정화제의 농도는, 바이러스의 종류, 고정화제의 종류에 따라 적절히 변경해도 된다. 고정화제가 포름알데히드를 포함하는 경우, 포름알데히드의 농도는, 바이러스 입자를 포함하는 현탁액 및 고정화제의 전체량을 기준으로 하여, 0.005∼0.5w/v％이어도 된다. 상기 포름알데히드의 농도가 0.005w/v％ 미만인 경우, 고정화가 약해져, 입자 구조가 유지되기 어려운 경향이 있다. 상기 포름알데히드의 농도가 0.5w/v％를 초과하는 경우, 고정화가 강하여, 가교에 의한 화학 수식이 지나치게 진행되는 경향이 있다. HA 활성을 더욱 향상시키는 관점에서, 포름알데히드의 농도는, 상기 현탁액 및 고정화제의 전체량을 기준으로 하여, 0.01∼0.5w/v％이어도 되고, 0.018∼0.152w/v％이어도 되고, 0.029∼0.152w/v％이어도 되고, 0.029∼0.076w/v％이어도 된다. 포름알데히드를 포함하는 고정화제를 사용하는 방법은, 바이러스 입자가 인플루엔자 바이러스 입자, 일본 뇌염 바이러스 입자인 경우에 사용해도 된다.

고정화제가 포르말린(36∼38w/v％ 포름알데히드 수용액)인 경우, 포르말린 농도는, 상기 현탁액 및 고정화제의 전체량을 기준으로 하여, 0.014∼0.4v/v％이어도 되고, 0.05∼0.4v/v％이어도 되고, 0.08∼0.4v/v％이어도 되고, 0.08∼0.2v/v％이어도 된다.

고정화제가 글루타르알데히드를 포함하는 경우, 글루타르알데히드의 농도가, 상기 현탁액 및 고정화제의 전체량을 기준으로 하여, 0.001∼0.06w/v％이어도 되고, 0.002∼0.05w/v％이어도 되고, 0.004∼0.02w/v％이어도 되고, 0.005∼0.01w/v％이어도 된다. 상기 농도가 0.001w/v％ 미만인 경우, 바이러스 입자로서 일본 뇌염 바이러스 입자를 사용했을 때, 입자가 응집되는 경향이 있다. 상기 농도가 0.06w/v％를 초과하는 경우, 바이러스 입자로서 일본 뇌염 바이러스 입자를 사용했을 때, 주요 구조 단백질인 E 단백질의 에피토프가 실활되는 경향이 있다. 고정화제로서 글루타르알데히드를 사용하는 방법은, 바이러스 입자가 인플루엔자 바이러스 입자, 일본 뇌염 바이러스 입자인 경우에 사용해도 된다.

고정화제가 EDC를 포함하는 경우, EDC의 농도가, 상기 현탁액 및 고정화제의 전체량을 기준으로 하여, 0.05∼1500mM이어도 되고, 0.15∼500mM이어도 되고, 5∼50mM이어도 된다. EDC를 포함하는 고정화제를 사용하는 방법은, 바이러스 입자가 인플루엔자 바이러스 입자, 일본 뇌염 바이러스 입자인 경우에 사용해도 된다.

고정화제로 처리할 때의 온도는, 바이러스의 종류, 고정화제의 종류, 고정화제의 농도 등에 따라 적절히 변경해도 된다. 상기 온도는 0℃(빙욕)∼37℃이어도 되고, 4℃∼37℃이어도 되고, 25℃∼37℃이어도 된다.

고정화제로 처리할 때의 기간(처리 시간)은, 바이러스의 종류, 고정화제의 종류, 고정화제의 농도, 처리의 온도 등에 따라 적절히 변경해도 된다. 상기 기간은, 1일간 내지 4주간이어도 되고, 3일간 내지 4주간이어도 되고, 1주간 내지 4주간이어도 된다. 고정화제로서 EDC를 사용하는 경우, 상기 기간은, 5분간∼24시간이어도 되고, 0.5시간∼24시간이어도 되고, 2시간∼20시간이어도 된다.

고정화제에 의한 가교의 진행을 멈추기 위해, 글리신 등의 아미노산을 사용하여 퀀칭 처리를 실시해도 된다. 또한, 퀀칭 처리는, 백신의 안정성, 면역원성, 및 안전성의 향상을 목적으로 하여 실시하는 경우가 있다.

필요에 따라, 회수한 고정화 바이러스 입자를 정제하는 공정을 추가로 포함하고 있어도 된다. 고정화 바이러스 입자를 정제하는 방법으로는, 공지된 방법에 의해 적절히 실시하는 것이 가능하지만, 예를 들어, 한외 여과막을 사용하여 여과하는 방법을 들 수 있다.

본 실시형태에 관련된 백신의 제조 방법은, 상기 고정화 바이러스 입자의 제조 방법에 의해 얻어진 고정화 바이러스 입자를 첨가하는 공정을 포함한다. 백신의 제조 방법에는, 의약품으로서 허용될 수 있는 담체, 유화제, 보존제, 등장화제, pH 조정제, 불활화제 등을 첨가하는 공정을 추가로 포함하고 있어도 된다.

백신 접종에서는, 실제의 감염시와 동일한 면역의 질과 양을 대상에게 부여할 수 있는 것이 바람직하고, 실제의 감염에 의해 일어나는 면역에 대한 백신에 의해 유도되는 면역의 모방성이 그 효과를 결정한다. 백신 중에는 감염 방어를 위한 항원으로서의 바이러스 단백질이 모두 포함되어 있어도 된다. 바이러스 단백질의 면역원성을 높이기 위한 바이러스 유래의 게놈 핵산의 존재, 바이러스 입자의 크기, 형태 등이, 각각에서 면역 응답에 작용하고 있는 것을 근거로 하면, 최량(最良)의 백신이란 실제의 바이러스에 보다 가까운 성분 및 구조를 갖는 것이라고 본 발명자들은 생각하고 있다. 본 실시형태에 관련된 고정화 바이러스 입자는, 고정화제로 고정화시킬 뿐으로, 그 이외에는 본래의 바이러스 입자와 동등한 성분 및 구조를 갖기 때문에, 면역원성이 높고, 또한 부반응이 억제된 백신의 제공이 가능해진다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 전혀 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

1. 인플루엔자 바이러스 입자에서 유래하는 항원의 조제

(1) FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 조제

포름알데히드(FA) 처리

A형 인플루엔자 바이러스 H1N1 아형주(A/California/07/2009(X-179A) 주, 이하, 「A/CA주」라고 기재하는 경우가 있다)를 11일령의 발육 계란의 장뇨막강 내에 접종하고, 34℃에서 2일간 배양했다. 얻어진 장뇨액을 청징화한 후, 초원심 분리에 의해 인플루엔자 바이러스 입자를 침전시켰다. 상기 인플루엔자 바이러스 입자를 인산 완충 생리 식염수(PBS)로 재부유시켜 현탁액을 얻었다. 얻어진 현탁액을 자당 밀도 구배 원심(RCF=57500(×g), 16시간)으로 원심 분리하고, 자당 농도가 33％∼50％인 획분을 회수함으로써, 인플루엔자 입자를 정제했다. 정제한 인플루엔자 바이러스 입자의 단백질의 최종 농도가 500㎍/㎖가 되도록, 얻어진 획분을 희석시켜, 현탁액을 얻었다. 그 후, 최종 농도가 0.05∼0.20v/v％(포름알데히드 환산으로, 0.018∼0.076w/v％)가 되도록 포르말린(36∼38w/v％ 포름알데히드 수용액)을 상기 현탁액에 첨가하고, 25℃에서 1주간 반응시켰다. 반응 종료 후, PBS로 반응액을 투석하고, 포름알데히드를 제거함으로써, 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(이하, 「FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자」라고 기재하는 경우가 있다)를 얻었다.

(2) 불활화 인플루엔자 바이러스 입자의 조제

상기 현탁액에, 최종 농도가 0.02v/v％(포름알데히드 환산으로, 0.0072∼0.0076w/v％)가 되도록 포르말린(36∼38w/v％ 포름알데히드 수용액)을 첨가하고, 4℃에서 6주간∼8주간 반응시켰다. 반응 종료 후, PBS로 반응액을 투석하고, 포름알데히드를 제거함으로써 불활화 인플루엔자 바이러스 입자를 얻었다. 동일한 방법으로, 다른 인플루엔자 바이러스주(아형주)에 대해서도 불활화 인플루엔자 바이러스 입자를 조제하고, 실시예 1∼6에 있어서 비교 대조로서 사용했다.

(3) 스플릿 인플루엔자 바이러스 항원의 조제

비교 대조로 하는 스플릿 인플루엔자 바이러스 항원(이하, 「스플릿 인플루 항원」이라고 기재하는 경우가 있다)은, 인플루엔자 HA 백신(화학 및 혈청 요법 연구소 제조, 상품명 「인플루엔자 HA 백신 "화혈연"」)에 포함되는 각 주의 원액을 사용했다.

2. 발열 시험

생물학적 제제 기준(일본국, 후생 노동성 고시 제192호)에 준하여, 발열 시험을 실시했다. 불활화 인플루엔자 바이러스 입자, FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자 및 스플릿 인플루 항원을 생리 식염수로 희석시키고, 1㎖ 중의 단백질 함량을 240㎍으로 한 것을 시료로 했다. 상기 시료를, 체중 1㎏당에 대해 1∼3㎖를 토끼에 접종하고, 6시간 후까지 발열의 상승을 관찰했다. 시료를 접종하기 전의 토끼의 체온(대조 체온)과 접종한 후의 토끼의 체온의 차를 구하고, 그 차의 최대값을 그 토끼의 발열 반응으로 했다. 동일한 시험을 3마리의 토끼에 대해 실시했다. 토끼 3마리의 발열 반응의 합(℃)을 표 1에 나타낸다.

FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 모두 1.3℃ 이상의 발열 반응의 합은 보이지 않고, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자와 비교하여 3℃ 이상의 발열 반응의 합의 저하가 보였다. FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 스플릿 인플루 항원과 동일하게, 발열 반응의 합이 충분히 낮은 것을 알 수 있었다. 이러한 점에서도, FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 스플릿 인플루 항원과 동일하게, 높은 안전성을 갖는 것이 시사되었다.

3. 염증성 사이토카인의 산생량의 정량

유럽 약국방 MONOCYTE-ACTIVATION TEST에 준한 방법으로, 포르말린 농도 0.05v/v％, 0.08v/v％, 0.11v/v％로 고정시킨 FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자 또는 불활화 인플루엔자 바이러스 입자로 인간 말초혈 단핵구(PBMC)를 자극했을 경우의 염증성 사이토카인(IL-6)의 산생량을 정량했다. 구체적으로는, 유럽 약국방 MONOCYTE-ACTIVATION TEST에 있어서의 인간 PBMC를 최저 4도너분 풀하여 사용한 것을, 1도너분으로 변경하여 측정했다. FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자 및 불활화 인플루엔자 바이러스 입자의 사이토카인의 산생량의 결과를 표 2에 나타낸다. FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자에 있어서의 IL-6의 산생량은, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자와 비교하여 충분히 낮은 것을 알 수 있었다. 이러한 점에서, FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자와 비교하여, 높은 안전성을 갖는 것이 시사되었다.

[실시예 2]

물성 평가

1. 자당 밀도 구배 원심법에 의한 분석

상기 실시예 1에 준한 방법으로, 인플루엔자 바이러스 입자(A/CA주)의 단백질의 최종 농도가 2500㎍/㎖가 되도록, 얻어진 획분을 희석시켜 현탁액을 얻었다. 그 후, 최종 농도가 0.12v/v％가 되도록 포르말린을 상기 현탁액에 첨가하고, 25℃에서 1주간 반응시켰다. 반응액을 PBS로 투석함으로써, FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자를 얻었다. 얻어진 FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자를 자당 밀도 구배 원심법에 의해 분석했다. 검체를 15∼60％의 자당 밀도 구배에 중층하고, 4℃, 18000rpm(57500(×g))으로 16시간, 원심 분리를 실시했다. 원심 후, 1프랙션당 0.6㎖씩 분획하고, 각 프랙션의 자당 농도, HA가 및 단백질 농도를 측정했다. A/CA주(H1N1 아형주)의 결과를 표 3에 나타낸다. 스플릿 인플루 항원에서는, 단백질이 자당 농도 25∼50％로 폭넓게 분포하여, 바이러스 입자가 분해되고 있는 것이 나타났다. 이에 대해, FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자에서는 높은 자당 농도(44.3％)에 단일 피크(입자성)로서 분획되어 있는 것이 나타났다. HA 활성에 대해서는 10240배였다.

2. 전자 현미경에 의한 해석

상기 FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(A/CA주)의 형상을 더욱 상세하게 조사하기 위해, 전자 현미경에 의한 관찰을 실시했다. 검체를, 글루타르알데히드를 사용하여 실온에서 20분간 고정시켰다. 그 후, 관찰용의 이온 코트한 시트 메시(닛신 EM사 제조)에, 고정시킨 검체를 올려놓고 약 60초간 정치(靜置)시키고, 2％ 인텅스텐산 수용액으로 네거티브 염색했다. 염색한 검체를, 투과형 전자 현미경(FEI 컴퍼니사 제조 테크나이 G2:가속 전압 120㎸)를 사용하여 관찰, 촬영했다.

FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자를 전자 현미경으로 촬영한 사진을 도 1에 나타낸다. FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자와 동일하게 입자 구조가 유지되어 있었다.

3. 동적 광 산란

A형 인플루엔자 바이러스 H3N2 아형주(A/New York/39/2012(X-233A)주, 이하, 「A/NY주」라고 기재하는 경우가 있다) 및 B형 인플루엔자 바이러스 빅토리아 계통주(B/Brisbane/60/2008주, 이하, 「B/BR주」라고 기재하는 경우가 있다)를 근원으로 하는 FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자를 실시예 1에 준한 방법으로 제조하고, 각각의 평균 입자경을 Zetasizer Nano ZS(Malvern사 제조)를 사용하여 해석했다. 동적 광 산란법에 의한 액체 중의 평균 입자경을 표 4에 나타낸다. FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는 평균 입자경이 140∼150㎚ 전후에서 단봉성이었다. 이러한 점에서, FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 평균 입자경은, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자와 동등하다는 것을 알 수 있었다. 또, FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 입자 구조는 유지되어 있으며, 응집체와 같은 불순물은 보이지 않았다.

4. 분자량 분포 측정(SEC)

B형 인플루엔자 바이러스의 야마가타 계통주(B/Massachusetts/02/2012(BX-51B)주(이하, 「B/MA주」라고 기재하는 경우가 있다))에 대해, 상기 실시예 1에 준한 방법으로 FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(B/MA주)를 제조했다. A/CA주(H1N1 아형주), A/NY주(H3N2 아형주), 및 B/MA주(B형주)에 대해, 스플릿 인플루 항원, 및 FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 분자량 분포 측정을, 사이즈 배제 크로마토그래피(상품명:TSKgel G6000PWXL(TOSOH사 제조))를 사용하여 분자량 측정을 실시했다(용리액에는 PBS를 사용하고, 유속은 0.5 ㎖/min으로 실시했다). 그 용출 패턴을 표 5에 나타낸다. FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는 용출 시간 16∼17분 부근에 단봉성의 피크가 보였다. 한편, 동일한 주 유래의 스플릿 인플루 항원은 용출 시간 19∼30분 부근에 삼봉성의 피크가 보였다.

5. 가교도에 의한 분석

실시예 1에서 조제한 FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(A/CA주)에 대해, 이하의 순서로, 고정화제에서의 가교도를 분석했다. 먼저, 검체에 SDS-Buffer(종농도:Tris 0.76w/v％, SDS 1w/v％, Glycerol 10v/v％, Bromophenol Blue(BPB) 0.01w/v％)와 2-메르캅토에탄올(종농도:0.8v/v％)을 첨가하고, 6분간 자비 후, PAGEL NPU-12.5L(ATTO사 제조, 상품명) 또는 PAGEL NPU-R12.5L(ATTO사 제조, 상품명)을 사용하여, SDS-PAGE를 실시했다. 영동 후, CBB(쿠마시브릴리언트블루) 염색을 실시하고, LAS3000(후지 필름 주식회사 제조, 상품명)으로 화상을 취입하였다. 고정화제에 의한 가교가 진행되면, 바이러스를 구성하는 단백질의 하나인 M1 단백질은, 본래의 밴드의 위치(25∼37kDa)로부터 고분자측으로 시프트한다. 그 때문에, 본래의 위치에 검출되는 M1 단백질의 밴드(M1 밴드)는 얇아지는 것이 시사되어 있고, 이것을 가교도의 지표로 했다. 구체적으로는, 고정화를 실시하지 않은 인플루엔자 바이러스 입자의 M1 밴드의 덴시토메트리값에 대한, 각 포르말린 농도로 처리한 FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의, 본래의 위치에 검출되는 M1 밴드의 덴시토메트리값의 상대값(％)(이하, 이 상대값을 「M1 단백질 잔존율」(％)이라고 기재하는 경우가 있다)을 산출했다. 결과를 표 6에 나타낸다. 포르말린 농도 0.05％, 0.08％, 0.11％, 0.14％로 고정시킨 FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(A/CA주)의 M1 단백질 잔존율은, 각각 35.7％, 23.8％, 11.0％, 5.4％이고, 포르말린 농도가 높아짐에 따라 가교가 촉진되어, M1 단백질 잔존율이 저하되는 것이 시사되었다.

6. 면역원성 1(마우스 근육내 접종)

FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(A/CA주) 에 있어서의 면역원성을, 마우스를 사용하여 평가했다. ddY 마우스(자성, 8주령)에, 스플릿 인플루 항원, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자, 또는 FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(A/CA주)를, 단백질량으로서 0.8㎍의 접종량으로 근육내 접종했다(1군(群)당 13마리). 면역 3주 후에 마우스를 전체 채혈하고, 안락사시켰다. 원심 분리에 의해 혈청을 얻고, 「병원체 검출 매뉴얼」(국립 감염증 연구소편)에 따라, HI 항체가를 측정했다. 마우스에 근육내 접종을 실시했을 때의 면역원성(HI 항체가(GMT))의 결과를 표 7에 나타낸다. FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(A/CA주)는, 스플릿 인플루 항원과 비교하여 높은 면역원성이며, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자와 동등한 면역원성이었다.

7. 면역원성 2(마우스 피내 접종)

FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(A/CA주)에 있어서의 면역원성을, 상기 「6. 면역원성 1(마우스 근육내 접종)」과 동일한 순서로 마우스 피내 접종에 의해 평가했다. ddY 마우스(자성, 8주령)에, 스플릿 인플루 항원, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자, 또는 FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자를, 단백질량으로서 0.2㎍의 접종량으로 피내 접종했다(1군당 5마리). 면역 3주 후에 마우스를 전체 채혈하고, 안락사시켰다. 원심 분리에 의해 혈청을 얻고, HI 항체가를 측정했다. 마우스에 피내 접종을 실시했을 때의 면역원성(HI 항체가(GMT))의 결과를 표 8에 나타낸다. FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 스플릿 인플루 항원과 비교하여 유의하게 면역원성이 높고, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자와 동등한 면역원성이었다.

8. 면역원성 3(필리핀원숭이 피하 접종)

A/CA주(H1N1 아형주), A/NY주(H3N2 아형주), B/BR주 및 B/MA주(B형주)에 대해, 스플릿 인플루 항원, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자, 및 FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 면역원성을, 필리핀원숭이(웅성 또는 자성, 17∼25개월령)를 사용하여 평가했다. 스플릿 인플루 항원, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자, 또는 FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자를, 1군당 8 또는 9마리에 7.5㎍HA 상당(스플릿 인플루 항원의 HA량에 상당하는 단백질량)의 접종량으로, 21일 간격으로 2회 피하 접종했다. 2차 면역 전, 및 2차 면역 후 21일째에 부분 채혈했다. 원심 분리에 의해 혈청을 얻고, 「병원체 검출 매뉴얼」(국립 감염증 연구소편)에 따라, HI 항체가 및 중화 항체가를 측정했다. 면역원성의 결과를, 표 9(2차 면역 후 21일째의 HI 항체가(GMT)), 표 10(2차 면역 후 21일째의 중화 항체가(GMT))에 나타낸다. HI 항체가에서는, FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는 스플릿 인플루 항원과 비교하여 높은 면역원성을 갖는 것을 알 수 있었다. 특히, B/MA주 이외에서는, 스플릿 인플루 항원과 비교하여 유의하게 면역원성이 높았다. 중화 항체가에 있어서도, FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는 스플릿 인플루 항원과 비교하여 A형주 및 B형주 모두에 있어서 유의하게 면역원성이 높았다.

9. 항체 서브클래스 해석

항체 서브클래스 해석으로서, 상기 「6. 면역원성 1(마우스 근육내 접종)」에서 얻어진 A/CA주(H1N1 아형주), 및 B/MA주(B형주)에 대해, 마우스의 혈청 중에 포함되는, 바이러스 항원에 특이적인 IgG1 및 IgG2a 항체가를 효소 면역 측정(ELISA)법에 의해 측정했다. 그 결과, FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 항원 특이적 IgG1보다 항원 특이적 IgG2a를 유도하는 것이 나타났다(표 11, 표 12). 이것은, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자와 동일한 결과이며, 스플릿 인플루 항원과의 비교에 있어서도, 보다 강한 IgG2a 유도 경향이 보였다. 이 결과로부터, FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 액성 면역을 활성화하지만 세포성 면역을 거의 활성화할 수 없는 스플릿 인플루 항원에 비해, 백신의 유효성의 추가적인 향상을 기대할 수 있다.

10. RNA 방출량의 평가

실시예 1에 준한 방법으로 조제한 FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(A/NY주)에 대해, 이하의 순서로, 프로테아제 처리 중의 시간 경과적인 RNA 방출량을 평가했다. 먼저, FA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자를 PBS로 희석시키고, SDS와 Proteinase K를 첨가하고 55℃에서 반응시켜, 시간 경과적으로 RNA를 추출했다. RNA 추출에는, TRIzol LS Reagent와 PureLink RNA Mini Kit, PureLink DNase(invitrogen사 제조, 상품명)를 사용하였다. 추출한 RNA의 함유량은, Quant-iT RiboGreen RNA Reagent and Kit(invitrogen사 제조, 상품명)로 측정했다. 각 FA 농도의 시간 경과적인 RNA 함량을 표 13에 나타낸다. 그 결과, FA 농도 의존적으로 RNA 방출이 서방화되어 있는 것이 나타났다. FA 고정에 의한 RNA 방출의 서방화가, 염증성 사이토카인 산생을 서방화시켜, 높은 안전성을 가져오는 것이 시사되었다.

[실시예 3]

(1) GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 조제

1. 글루타르알데히드(GA) 처리

A형 인플루엔자 바이러스(H3N2 아형주(A/NY주)) 및 B형 인플루엔자 바이러스(B형 빅토리아 계통주(B/BR주))를 실시예 1과 동일한 방법으로 배양, 정제했다. 정제한 각 인플루엔자 바이러스 입자의 단백질의 최종 농도가 1000㎍/㎖가 되도록, 각 인플루엔자 바이러스 입자를 희석시켜, 현탁액을 얻었다. 다음으로, 1w/v％ GA 용액을 사용하여, GA 농도가 0.016w/v％ 또는 0.008w/v％가 되도록 희석시켰다. 상기 현탁액과, 희석시킨 GA 용액(0.016w/v％ 또는 0.008w/v％)을 등량 혼합하고, 4℃에서 3일간 반응시켰다. 반응 종료 후, PBS로 반응액을 투석하고, GA를 제거함으로써, 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(이하, 「GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자」라고 기재하는 경우가 있다)를 얻었다. 얻어진 GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(A/NY주 및 B/BR주)의 발열 활성을, 토끼 3마리에 있어서의 발열 반응의 합으로 평가하는 발열 시험, 및 인간 PBMC를 자극했을 경우의 염증성 사이토카인의 산생량의 정량에 의해 평가했다.

2. 발열 시험

실시예 1과 동일한 방법에 의해, 발열 시험을 실시했다. 불활화 인플루엔자 바이러스 입자 및 GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(A/NY주 및 B/BR주)를 생리 식염수로 희석시키고, 1㎖ 중의 단백질 함량을 240㎍으로 한 것을 시료로 했다. 상기 시료를, 체중 1㎏당에 대해 1㎖를 토끼에 접종하고, 6시간 후까지 발열의 상승을 관찰했다. A/NY주의 토끼 3마리의 발열 반응의 합(℃)을 표 14, B/BR주의 토끼 3마리의 발열 반응의 합(℃)을 표 15에 나타낸다.

GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 모두 1.3℃ 이상의 발열 반응의 합은 보이지 않고, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자를 기준으로 하여 2.5℃ 이상 또는 3℃ 이상의 발열 반응의 합의 저하가 보였다. GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 발열 반응의 합이 충분히 낮은 것을 알 수 있었다. 이러한 점에서도, GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자와 비교하여, 높은 안전성을 갖는 것이 시사되었다.

3. 염증성 사이토카인의 산생량의 정량

유럽 약국방 MONOCYTE-ACTIVATION TEST에 준한 방법으로, GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자 또는 불활화 인플루엔자 바이러스 입자로 인간 PBMC를 자극했을 경우의 사이토카인(IL-1β)의 산생량을 정량했다. 구체적으로는, 유럽 약국방 MONOCYTE-ACTIVATION TEST에 있어서의 인간 PBMC를 최저 4도너분 풀하여 사용한 것을, 1도너분으로 변경하여 측정했다. GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(A/NY주 및 B/BR주)의 사이토카인의 산생량의 결과를 표 16, 표 17에 나타낸다. GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자와 비교하여, 염증성 사이토카인의 산생량이 충분히 낮은 것을 알 수 있었다. 이러한 점에서, GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 스플릿 인플루 항원과 동일하게, 높은 안전성을 갖는 것이 시사되었다.

[실시예 4]

물성 평가

상기 실시예 3에서 얻어진 GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 물성을 이하의 방법으로 평가했다.

1. 전자 현미경에 의한 해석

GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(A/NY주)의 형상을 더욱 상세하게 조사하기 위해, 실시예 2와 동일한 방법으로, 전자 현미경에 의한 관찰을 실시했다. 대표적으로, 0.008w/v％의 GA 농도로 4℃, 3일간 반응시킨 GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(A/NY주)를 촬영한 사진을 도 2에 나타낸다. GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는 입자 구조가 유지되어 있으며, 입자끼리가 서로 결합한 응집체는 보이지 않았다.

2. 동적 광 산란

GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 평균 입자경을 Zetasizer Nano ZS(Malvern사 제조)를 사용하여 해석했다. 동적 광 산란법에 의한 액체 중의 평균 입자경을 표 18에 나타낸다. GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 평균 입자경이 130∼160㎚ 전후에서 단봉성이었다. 이러한 점에서, GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 평균 입자경은, 근원이 되는 바이러스 입자와 동등하다는 것이 확인되었다. 즉, GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 평균 입자경은 단일하고 변함없는 것을 알 수 있었다. 또, GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 입자 구조는 유지되어 있으며, 응집체와 같은 불순물은 보이지 않았다.

3. 분자량 분포 측정(SEC)

GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 분자량 분포를 실시예 2와 동일한 방법(SEC)으로 측정했다. 그 용출 패턴을 표 19에 나타낸다. 스플릿 인플루 항원은, 용출 시간 16∼30분 부근에 사봉성의 피크가 보였다. 한편, GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 용출 시간 16∼17분 부근에 단봉성의 피크가 보였다.

4. 가교도에 의한 분석

GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 고정화제에서의 가교도를, 실시예 2와 동일한 방법으로 분석했다. B/BR주(B형 빅토리아 계통주)의 결과를 표 20에 나타낸다. 글루타르알데히드 농도 0.004w/v％, 0.008w/v％로 고정시킨 GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 M1 단백질 잔존율은, 각각 23.8％, 10.8％이고, 글루타르알데히드 농도가 높아짐에 따라 가교가 촉진되어, M1 단백질 잔존율이 저하되는 것을 알 수 있었다.

5. 면역원성(마우스 근육내 접종)

GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(B/BR주)에 있어서의 면역원성을, 이하의 순서로 평가했다. 먼저, ddY 마우스(자성, 8주령)에, 스플릿 인플루 항원, 또는 GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자를 단백질량으로서 0.8㎍의 접종량으로 근육내 접종했다(1군당 16마리). 면역 3주 후에 마우스를 전체 채혈하고, 안락사시켰다. 원심 분리에 의해 혈청을 얻고, 중화 항체가를 측정했다. 대표적으로 B/BR주(B형 빅토리아 계통주)의 면역원성(중화 항체가(GMT))의 결과를 표 21에 나타낸다. B형주의 경우, GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 스플릿 인플루 항원과 비교하여 높은 면역원성이었다.

6. 항체 서브클래스 해석

항체 서브클래스 해석으로서, 상기 「5. 면역원성(마우스 근육내 접종)」으로 얻어진 마우스의 혈청 중에 포함되는, 인플루엔자 바이러스의 항원에 특이적인 IgG1 및 IgG2a 항체가를 ELISA법에 의해 측정했다. 그 결과, 스플릿 인플루 항원과는 대조적으로, GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 항원 특이적 IgG1보다 항원 특이적 IgG2a를 유도하는 것이 나타났다(표 22). 이것은, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자와 동일한 결과이다. 이 결과로부터, GA 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 액성 면역을 활성화하지만 세포성 면역을 거의 활성화할 수 없는 스플릿 인플루 항원에 비해, 백신의 유효성의 추가적인 향상을 기대할 수 있다.

[실시예 5]

(1) EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 조제

1.1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드염산염(EDC) 처리

A형 인플루엔자 바이러스(H3N2 아형주(A/NY주)) 및 B형 인플루엔자 바이러스(빅토리아 계통주 B/BR주)를 실시예 1과 동일하게 배양, 정제했다. 정제한 각 인플루엔자 바이러스 입자의 단백질의 최종 농도가 A/NY주는 2500㎍/㎖, B/BR주는 500㎍/㎖가 되도록, 얻어진 획분을 희석시켜, 현탁액을 얻었다. EDC 용액을, 0.1∼4M이 되도록 PBS로 단계 희석시키고, 최종 농도가 50∼500mM이 되도록 현탁액에 첨가하고, 빙랭(0℃)에서, 2∼20시간 반응시켰다. 반응 종료 후, PBS로 반응액을 투석하고, EDC를 제거함으로써, 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(이하, 「EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자」라고 기재하는 경우가 있다)를 얻었다. 얻어진 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(A/NY주, B/BR주)의 발열 활성을, 토끼 3마리에 있어서의 발열 반응의 합으로 평가하는 발열 시험, 및 인간 PBMC를 자극했을 경우의 염증성 사이토카인의 산생량의 정량에 의해 평가했다.

2. 발열 시험

실시예 1과 동일한 방법에 의해, 발열 시험을 실시했다. EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자를 생리 식염수로 희석시키고, 1㎖ 중의 단백질 함량을 240㎍으로 한 것을 시료로 했다. EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 50mM 또는 500mM의 EDC 농도로, 빙랭에서 2시간 반응한 후, PBS로 반응액을 투석 처리한 검체를 사용했다(A/NY주에 대해서는 5mM의 EDC 농도도 실시했다). 또, A/NY주에 대해서는, 5mM의 EDC 농도로, 4℃에서 20시간 반응한 후, PBS로 반응액을 투석 처리한 검체도 사용하였다. 상기 시료를, 체중 1㎏당에 대해 1㎖를 토끼에 접종하고, 6시간 후까지 발열의 상승을 관찰했다. 토끼 3마리의 발열 반응의 합(℃)을 표 23, 표 24에 나타낸다.

EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 모든 EDC 처리 조건에서 1.3℃ 이상의 발열 반응의 합은 보이지 않았다. 이러한 점에서도, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 스플릿 인플루 항원과 동일하게, 높은 안전성을 갖는 것이 시사되었다.

3. 염증성 사이토카인의 산생량의 정량

유럽 약국방 MONOCYTE-ACTIVATION TEST에 준한 방법으로, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자 또는 불활화 인플루엔자 바이러스 입자로 인간 PBMC를 자극했을 경우의 사이토카인(IL-1β 및 IL-6)의 산생량을 정량했다. 구체적으로는, 유럽 약국방 MONOCYTE-ACTIVATION TEST에 있어서의 인간 PBMC를 최저 4도너분 풀하여 사용한 것을, 1도너분으로 변경하여 측정했다. A/NY주 및 B/BR주의 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자 및 불활화 인플루엔자 바이러스 입자의 사이토카인의 산생량의 결과를 표 25, 표 26에 나타낸다. EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자와 비교하여, 염증성 사이토카인 산생량이 충분히 낮은 것을 알 수 있었다. 이러한 점에서, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자와 비교하여, 부반응을 억제하기 쉬운 것이 시사되었다.

[실시예 6]

물성 평가

상기 실시예 5에서 얻어진 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 물성을 이하의 방법으로 평가했다.

1. 자당 밀도 구배 원심법에 의한 분석

실시예 2와 동일한 방법에 의해, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자를 자당 밀도 구배 원심법에 의해 분석했다. 대표적으로, 50mM의 EDC 농도로, 빙랭에서 2시간 반응한 후의 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(A/NY주(H3N2 아형주))의 결과를 표 27에 나타낸다. 스플릿 인플루 항원에서는, 단백질이 자당 농도 25∼50％로 폭넓게 분포하여, 바이러스 입자가 분해되어 있는 것이 나타났다. 이에 대해, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자에서는 높은 자당 농도(47.2％)에 단일 피크(입자성)로서 분획되어 있는 것이 나타났다. HA 활성에 대해서는 10240배였다.

2. 전자 현미경에 의한 해석

EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 형상을 상세하게 조사하기 위해, 실시예 2와 동일한 방법으로, 전자 현미경에 의한 관찰을 실시했다. 대표적으로, 500mM의 EDC 농도로, 빙욕에서 2시간 반응한 후의 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자를 촬영한 사진을 도 3에 나타낸다. EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는 입자 구조가 유지되어 있으며, 항원끼리가 서로 결합한 응집체는 보이지 않았다.

3. 동적 광 산란

EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 평균 입자경을 Zetasizer Nano ZS(Malvern사 제조)를 사용하여 해석했다. 동적 광 산란법에 의한 액체 중의 평균 입자경을 표 28에 나타낸다. EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자(A/NY주(H3N2 아형주), B/BR주(B형주))는, 평균 입자경이 130∼160㎚ 전후에서 단봉성이었다. 이러한 점에서, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 평균 입자경은, 근원이 되는 바이러스 입자와 동등하다는 것이 확인되었다. 즉, EDC 처리되어도 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 평균 입자경은 단일하고 변함없는 것을 알 수 있었다. 또, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 입자 구조는 유지되어 있으며, 응집체와 같은 불순물은 보이지 않았다.

4. 분자량 분포 측정(SEC)

H3N2 아형주(A/NY주)를 근원으로 하는 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 분자량 분포를 측정했다. 측정은, 사이즈 배제 크로마토그래피(상품명:TSKgel G6000PWXL(TOSOH사 제조))를 사용하여 실시하였다(용리액에는 PBS를 사용하고, 유속은 0.5㎖/min으로 실시하였다). 그 용출 패턴을 표 29에 나타낸다. 스플릿 인플루 항원은 용출 시간 16∼30분 부근에 사봉성의 피크가 보였다. 한편, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는 용출 시간 16∼17분 부근에 단봉성의 피크가 보였다.

5. 가교도에 의한 분석

실시예 5에 의해 조제한 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 고정화제에서의 가교도를 실시예 2와 동일한 방법으로 분석했다. A/NY주(H3N2 아형주)의 결과를 표 30에 나타낸다. EDC 농도 50mM, 500mM으로 고정시킨 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 M1 단백질 잔존율(％)은, 각각 85.7％, 53.4％이고, EDC 농도가 높아짐에 따라 가교가 촉진되어, M1 단백질 잔존율이 저하되는 것을 알 수 있었다. B/BR주(B형 빅토리아 계통주)의 결과를 표 31에 나타낸다. EDC 농도 5mM, 50mM, 500mM으로 고정시킨 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 M1 단백질 잔존율(％)은, 각각 85.1％, 56.1％, 27.2％였다. A/NY주(H3N2 아형주)와 동일하게, EDC 농도가 높아짐에 따라 가교가 촉진되어, M1 단백질 잔존율이 저하되는 것을 알 수 있었다.

6. 면역원성 (마우스 근육내 접종)

EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자에 있어서의 면역원성을, 마우스를 사용하여 평가했다. 실시예 4와 동일한 방법에 의해 혈청을 얻고, HI 항체가 및 중화 항체가를 측정했다. 대표적으로 50mM 및 500mM의 EDC 농도로, 빙욕에서 2시간 반응한 후의 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 면역원성의 결과를, 표 32(A/NY주의 HI 항체가(GMT)), 표 33(A/NY주의 중화 항체가(GMT)) 및 표 34(B/BR주의 중화 항체가(GMT))에 나타낸다. A/NY주(H3N2 아형주), 및 B/BR주(B형 빅토리아 계통주)의 경우, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는 스플릿 인플루 항원과 비교하여 유의하게 높은 면역원성이었다.

7. 항체 서브클래스 해석

항체 서브클래스 해석으로서, 상기 「6. 면역원성(마우스 근육내 접종)」으로 얻어진 마우스의 혈청 중에 포함되는, 바이러스 항원에 특이적인 IgG1 및 IgG2a 항체가를 ELISA법에 의해 측정했다. 그 결과, 스플릿 인플루 항원과는 대조적으로, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는 항원 특이적 IgG1 보다 항원 특이적 IgG2a를 유도하는 것이 나타났다(표 35, 표 36). 이 결과로부터, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는, 액성 면역을 활성화시키지만 세포성 면역을 거의 활성화시킬 수 없는 스플릿 인플루 항원에 비해, 백신의 유효성의 추가적인 향상을 기대할 수 있다.

8. 면역원성 (필리핀원숭이 피하 접종)

EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자에 있어서의 면역원성을, 필리핀원숭이를 사용하여 이하의 순서로 평가했다. 먼저, 필리핀원숭이(웅성 또는 자성, 29∼35개월령)에, 스플릿 인플루 항원, 또는 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자를 HA 함량으로서 15㎍의 접종량으로 피하 접종했다(1군당 8마리). 3주 간격으로 2회 피하 접종하고, 2차 면역 후 4주째에 채혈했다. 실시예 2와 동일한 방법에 의해 혈청을 얻고, HI 항체가 및 중화 항체가를 측정했다. 대표적으로 5mM의 EDC 농도로, 4℃에서 20시간 반응한 후의 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 면역원성의 HI 항체가(GMT)의 결과를 표 37에 나타내고, 중화 항체가(GMT)의 결과를 표 38에 나타낸다. A/CA주(H1N1 아형주), 및 A/NY주(H3N2 아형주), B/MA주(B형 야마가타 계통), B/BR주(B형 빅토리아 계통주)에 있어서, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는 스플릿 인플루 항원과 비교하여 유의하게 면역원성이 높았다.

9. 가혹 시험 전후의 안정성 (가교도에 의한 분석)

실시예 5에 의해 조제한 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 안정성을, 가혹 시험의 전후에 있어서의 가교도의 변화를 지표로 하여 평가했다. 먼저, 실시예 2와 동일한 방법에 의해 M1 단백질 잔존율(％)을 산출하고, 또한 가혹 시험 전의 M1 단백질 잔존율을 100％로 했을 경우의, 37℃, 1주간의 가혹 시험 후의 M1 단백질 잔존율의 비율을 산출했다. A/NY주(H3N2 아형주)의 결과를 표 39에 나타낸다. 불활화 인플루엔자 바이러스 입자의 가혹 시험 후의 M1 단백질 잔존율은, 가혹 시험 전에 비해 24％ 상승했다. 한편, EDC 농도 50, 500mM으로 고정시킨 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 가혹 시험 후의 M1 단백질 잔존율은, 가혹 시험 전에 비해 각각 18％ 감소하고, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자보다 변화율이 작고, 보다 안정적인 것이 시사되었다.

10. 가혹 시험에서의 안정성 (일원 방사 면역 확산 시험에 의한 분석)

실시예 5에 의해 조제한 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 안정성을, 가혹 시험의 전후에 있어서의 HA 함량의 변화를 지표로 하여 평가했다. 먼저, 일원 방사 면역 확산 시험(생물학적 제제 기준(일본국, 후생 노동성 고시 제192호))에 의해 HA 함량을 산출하고, 또한 가혹 시험 전의 HA 함량을 100％로 했을 경우의, 37℃, 1주간의 가혹 시험 후의 HA 함량의 변화율을 산출했다. A/CA주(H1N1 아형주), 및 A/NY주(H3N2 아형주), B/MA주(B형 야마가타 계통), B/BR주(B형 빅토리아 계통주)의 결과를 표 40에 나타낸다. EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 가혹 시험 후의 HA 함량의 변화율은 작고, 안정적인 것이 시사되었다.

11. 5℃, 11개월 보존하에서의 안정성 (가교도에 의한 분석)

실시예 5에 의해 조제한 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 안정성을, 5℃, 11개월 보존의 전후에 있어서의 가교도의 변화를 지표로 하여 평가했다. 먼저, 실시예 2와 동일한 방법에 의해 M1 단백질 잔존율(％)을 산출하고, 또한 5℃, 11개월 보존 전의 M1 단백질 잔존율을 100％로 했을 경우의, 5℃, 11개월 보존하에서의 M1 단백질 잔존율의 비율을 산출했다. A/CA주(H1N1 아형주), 및 A/NY주(H3N2 아형주), B/MA주(B형 야마가타 계통), B/BR주(B형 빅토리아 계통주)의 결과를 표 41에 나타낸다. EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 5℃, 11개월 보존하에서의 M1 단백질 잔존율의 변화율은 작고, 안정적인 것이 시사되었다.

12. 5℃, 11개월 보존하에서의 안정성 (일원 방사 면역 확산 시험에 의한 분석)

실시예 5에 의해 조제한 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 안정성을, 5℃, 11개월 보존의 전후에 있어서의 HA 함량의 변화를 지표로 하여 평가했다. 먼저, 일원 방사 면역 확산 시험(생물학적 제제 기준(일본국, 후생 노동성 고시 제192호)) 에 의해 HA 함량을 산출하고, 또한 5℃, 11개월 보존 전의 HA 함량을 100％로 했을 경우의, 5℃, 11개월 보존하에서의 HA 함량의 변화율을 산출했다. A/CA주(H1N1 아형주), 및 A/NY주(H3N2 아형주), B/MA주(B형 야마가타 계통), B/BR주(B형 빅토리아 계통주)의 결과를 표 42에 나타낸다. EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 5℃, 11개월 보존하에서의 HA 함량의 변화율은 작고, 안정적인 것이 시사되었다.

13. 5℃, 9개월 보존하에서의 안정성 (마우스 면역원성(근육내 접종))

실시예 5에 의해 조제한 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 5℃, 9개월 보존하에서의 안정성을, 마우스 면역원성(근육내 접종)을 사용하여 평가했다. 실시예 4와 동일한 방법에 의해 혈청을 얻고, HI 항체가 및 중화 항체가를 측정했다. 대표적으로 5mM의 EDC 농도로, 4℃에서 20시간 반응시킨 후의 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 면역원성의 HI 항체가(GMT)의 결과를 표 43에 나타내고, 중화 항체가(GMT)의 결과를 표 44에 나타낸다. A/CA주(H1N1 아형주), 및 A/NY주(H3N2 아형주), B/MA주(B형 야마가타 계통), B/BR주(B형 빅토리아 계통주)에 있어서, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는 스플릿 인플루 항원과 비교하여 면역원성이 높았다.

14. 5℃, 9개월 보존하에서의 안정성 (항체 서브클래스)

항체 서브클래스 해석으로서, 상기 「13. 5℃, 9개월 보존하에서의 안정성 (마우스 면역원성(근육내 접종))」으로 얻어진 마우스의 혈청 중에 포함되는, 바이러스 항원에 특이적인 IgG1 및 IgG2a 항체가를 ELISA법에 의해 측정했다. 그 결과, 5℃, 9개월 보존 후에 있어서도, 스플릿 인플루 항원과는 대조적으로, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는 항원 특이적 IgG1보다 항원 특이적 IgG2a를 유도하는 것이 나타났다(표 45). 이 결과로부터, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자가 활성화시키는 세포성 면역은 5℃, 9개월 보존 후에도 유지되어 있는 것을 기대할 수 있다.

15. 5℃, 10개월 보존하에서의 안정성 (필리핀원숭이 면역원성(피하 접종))

실시예 5에 의해 조제한 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 5℃, 10개월 보존하에서의 안정성을, 필리핀원숭이 면역원성(피하 접종)을 사용하여 평가했다. 먼저, 필리핀원숭이(웅성 또는 자성, 29∼35개월령)에, 스플릿 인플루 항원, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자, 및 불활화 인플루엔자 바이러스 입자를 HA 함량으로서 15㎍의 접종량으로 피하 접종했다(1군당 8마리). 3주 간격으로 2회 피하 접종하고, 2차 면역 후 4주째에 채혈했다. 실시예 2와 동일한 방법에 의해 혈청을 얻고, HI 항체가 및 중화 항체가를 측정했다. 대표적으로 5mM의 EDC 농도로, 4℃에서 20시간 반응한 후의 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 5℃, 10개월 보존하에서의 HI 항체가(GMT)의 결과를 표 46에 나타내고, 중화 항체가(GMT)의 결과를 표 47에 나타낸다(표 46, 표 47은 각각 표 37, 표 38의 재게(再揭)). A/CA주(H1N1 아형주), 및 A/NY주(H3N2 아형주), B/MA주(B형 야마가타 계통), B/BR주(B형 빅토리아 계통주)에 있어서, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자는 스플릿 인플루 항원과 비교하여 유의하게 면역원성이 높았다.

16. RNA 방출량의 평가

실시예 5에 의해 조제한 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 프로테아제 처리 중의 시간 경과적인 RNA 방출량을 평가했다. 먼저, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자 및 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자를 PBS로 희석시키고, SDS와 Proteinase K를 첨가하고 55℃에서 반응시켜, 시간 경과적으로 RNA를 추출했다. RNA 추출에는, TRIzol LS Reagent와 PureLink RNA Mini Kit, PureLink DNase(invitrogen사 제조, 상품명)를 사용하였다. 추출한 RNA의 함유량은, Quant-iT RiboGreen RNA Reagent and Kit(invitrogen사 제조, 상품명)로 측정했다. 대표적으로, A/NY주(H3N2 아형주)의 결과를 표 48에 나타낸다. 그 결과, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자에 비해, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 RNA 방출이 서방화되어 있는 것이 나타났다.

17. 염증성 사이토카인 산생량의 평가

실시예 5에 의해 조제한 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 염증성 사이토카인의 시간 경과적인 산생량을 평가했다. 방법은, 유럽 약국방 MONOCYTE-ACTIVATION TEST에 준했다. 구체적으로는, 유럽 약국방 MONOCYTE-ACTIVATION TEST에 있어서의 인간 PBMC를 최저 4도너분 풀하여 사용한 것을, 1도너로 변경하여 측정했다. A/NY주(H3N2 아형주)에 있어서의, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자 및 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 IL-1β 산생량의 시간 경과적 변화를 표 49에, IL-6 산생량의 시간 경과적 변화를 표 50에 나타낸다. 또, B/BR주(B형 빅토리아 계통주)에 있어서의, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자 및 EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 IL-1β 산생량의 시간 경과적 변화를 표 51에, IL-6 산생량의 시간 경과적 변화를 표 52에 나타낸다. 그 결과, 불활화 인플루엔자 바이러스 입자에 비해, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자의 염증성 사이토카인 산생이 서방화되어 있는 것이 나타났다. 요컨대, EDC 고정에 의해 체내에서의 RNA 방출이 서방화되어, 염증성 사이토카인 산생을 지연시킴으로써, EDC 고정화 인플루엔자 바이러스 입자가 높은 안전성을 가지고 있는 것이 시사되었다.

[실시예 7]

GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 조제

1. 글루타르알데히드 처리 (바이러스 입자에 대해 입자 구조를 고정화시키는 공정)

Vero 세포 배양 일본 뇌염 백신 원약(화학 및 혈청 요법 연구소 제조, 상품명 「엔세박」, 0.08v/v％ 포르말린으로 불활화제의 일본 뇌염 바이러스 입자를 단백질 농도로 60∼90㎍/㎖ 포함한다. 이하, 「불활화 일본 뇌염 바이러스 입자」라고 기재하는 경우가 있다.)에 대해, 최종 농도가 0.005∼0.02w/v％가 되도록 글루타르알데히드를 첨가하고, 4℃에서 3일간 반응시켰다. 반응 종료 후, PBS형 용액(부활제인 락토오스(종농도 5w/v％)을 첨가한 PBS)으로, 얻어진 반응액을 투석했다. 투석에 의해, 글루타르알데히드를 제거함으로써, 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자(이하, 「GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자」라고 기재하는 경우가 있다)를 얻었다. 얻어진 GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 발열 활성을, 토끼 3마리에 있어서의 발열 반응의 합으로 평가하는 발열 시험, 인간 PBMC를 자극했을 경우의 염증성 사이토카인의 산생량의 정량에 의해 평가했다.

2. 발열 시험

실시예 1과 동일한 방법에 의해 발열 시험을 실시했다. GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자 또는 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자를 생리 식염수로 희석시키고, 1㎖ 중의 단백질 함량을 70㎍으로 한 것을 시료로 했다. 상기 시료를, 체중 1㎏당에 대해 3 ㎖를 토끼에 접종하고, 6시간 후까지 발열의 상승을 관찰했다. 토끼 3마리의 발열 반응의 합(℃)을 표 53에 나타낸다. 대표적으로, 0.01w/v％의 글루타르알데히드 농도로 4℃, 3일간 반응 후의 GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자를 평가했다.

GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 1.3℃ 이상의 발열 반응의 합은 보이지 않고, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자와 비교하여 1.6℃ 이상의 발열 반응의 합의 저하가 보였다. 이러한 점에서도, GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 높은 안전성을 갖는 것이 시사되었다.

3. 염증성 사이토카인의 산생량의 정량

유럽 약국방 MONOCYTE-ACTIVATION TEST에 준한 방법으로, GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자 또는 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자로 인간 PBMC를 자극했을 경우의 사이토카인(IL-1β 및 IL-6)의 산생량을 정량했다. 구체적으로는, 유럽 약국방 MONOCYTE-ACTIVATION TEST에 있어서의 인간 PBMC를 최저 4도너분 풀하여 사용한 것을, 1도너분으로 변경하여 측정했다. 그 결과를 표 54에 나타낸다. GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자보다 염증성 사이토카인의 산생량이 충분히 낮은 것을 알 수 있었다. 이러한 점에서도, GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자보다 높은 안전성을 갖는 것이 시사되었다.

[실시예 8]

물성 평가

상기 실시예 7에서 얻어진 GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 물성을 이하의 방법으로 평가했다.

1. 전자 현미경에 의한 해석

GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 형상을 상세하게 조사하기 위해, 실시예 2와 동일한 방법으로, 전자 현미경에 의한 관찰을 실시했다. 대표적으로, 0.01w/v％의 글루타르알데히드 농도로 4℃, 3일간 반응 후의 GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자를 촬영한 사진을 도 4에 나타낸다. GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 글루타르알데히드로 고정시킴으로써 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자와 동일하게 입자 구조가 유지되어 있었다.

2. 동적 광 산란

GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 평균 입자경을, Zetasizer Nano ZS(Malvern사 제조)를 사용하여 해석했다. 동적 광 산란법에 의한 액체 중의 평균 입자경을 표 55에 나타낸다. GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 평균 입자경이 약 90㎚로 단봉성이었다. 한편, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 약 80㎚로 단봉성이었다. 또, GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 입자 구조는 유지되어 있으며, 응집체와 같은 불순물은 보이지 않았다.

3. 분자량 분포 측정(SEC)

GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 분자량 분포를 측정했다. 측정은, 사이즈 배제 크로마토그래피(상품명:Superose 6 10/300GE(GE 헬스케어사 제조))를 사용하여 실시했다(용리액에는 PBS를 사용하고, 유속은 0.5㎖/min으로 실시했다). 그 용출 패턴을 표 56에 나타낸다. GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 용출 시간 14∼15분 부근에 단봉성의 주피크가 보였다. 또, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자도 용출 시간 14∼15분 부근에 단봉성의 주피크가 보였다.

4. 항원의 함유량

항일본 뇌염 바이러스 항체를 사용한 샌드위치 ELISA법에 의해, 항원의 함유량(항원 함량)을 이하의 순서로 측정했다. 검체 중에 포함되는 E항원은, 항일본 뇌염 바이러스 토끼 IgG(1차 항체;폴리클로날 항체)가 결합한 마이크로 플레이트에 포착된다. 그 후, 서양고추냉이 유래 퍼옥시다아제(HRP)를 결합한 항일본 뇌염 바이러스 E단백질 모노클로날 항체(이차 항체;모노클로날 항체)를 반응시킴으로써, 플레이트에 결합한 항E항원 항체/E항원/이차 항체의 복합체가 형성된다. 반응하지 않고 남은 시약 및 검체를 세정에 의해 제거하고, 효소 기질액(o-페닐렌디아민 용액:OPD 용액)과 반응시키면 E항원 복합체 상의 HRP가 반응하여, 발색이 일어난다. OPD의 발색의 강도는, 복합체의 양(E항원량을 반영)에 비례하는 것을 이용하여, E항원 함량(항원 함량)을 측정했다.

GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자, 및 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자 각각의 항원 함유량을 표 57에 나타낸다. 대표적으로, 0.01w/v％의 글루타르알데히드 농도로 4℃, 3일간 반응 후의 GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자를 평가한 결과, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자와 동등한 항원이 포함되어 있었다.

5. 비활성에 의한 분석

실시예 7에서 조제한 GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자에 대해, 비활성(항원 함량/단백질 함량)에 의해, 고정화제에서의 가교도를 평가했다. 구체적으로는, 항원 함량의 측정에 사용하는 모노클로날 항체(503)는, 중화 에피토프를 인식하고 있고, 중화 에피토프의 구조 변화가 일어나면 비활성이 저하된다. 고정화를 실시하지 않은 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자의 비활성에 대한, 각 글루타르알데히드 농도로 처리한 GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 비활성의 상대값(％)(이하, 이 상대값을 「503 항체 반응률」(％)이라고 기재하는 경우가 있다)을 산출했다. 결과를 표 58에 나타낸다. 글루타르알데히드 농도 0.005w/v％, 0.01w/v％, 0.02w/v％로 고정시킨 GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 503 항체 반응률은, 각각 95.1％, 74.7％, 55.2％이고, 글루타르알데히드 농도가 높아짐에 따라 가교가 촉진되어, 503 항체 에피토프의 구조 변화에 의한 반응률의 저하가 시사되었다.

6. 면역원성(마우스 복강내 접종)

ddY 마우스(자성, 4주령)에, 대표적으로, 0.005 혹은 0.01w/v％의 글루타르알데히드 농도로 4℃, 3일간 반응 후의 GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자 또는 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자를 1㎍ 또는 0.25㎍의 접종량으로 복강내 접종했다(1군당 10마리). 면역 1주일 후에 다시 면역하고, 그 1주일 후에 마우스를 전체 채혈하고, 안락사시켰다. 원심 분리에 의해 혈청을 얻고, 군마다 등량씩 풀하고, 중화 항체가를 「병원체 검출 매뉴얼」(국립 감염증 연구소편)에 따라 측정했다. 50％ 플라크 감소율로부터 산출한 결과를 표 59에 나타낸다. GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자와 비교하여 동등 또는 그 이상의 중화 항체가였다.

7. 가속 시험에서의 안정성(항원 함량)

최종 단백질 농도가 8㎍/㎖가 되도록, PBS형 용액으로 GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자 및 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자를 희석시켰다. 항원 함량을 지표로, 25℃에서의 보존 안정성을 평가했다. 대표적으로, 0.01w/v％의 글루타르알데히드 농도로 4℃, 3일간 반응 후의 GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자 또는 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자의 결과를 표 60에 나타낸다. GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 25℃ 보존하에서는 1개월간 유지되었다. 한편, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 25℃ 보존하에서는 저하를 나타냈다. GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자와 비교하여 안정성이 향상되는 것이 나타났다.

8. 가속 시험에서의 안정성(동적 광 산란)

최종 단백질 농도가 8㎍/㎖가 되도록, PBS형 용액으로 GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자 및 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자를 희석시켰다. Zetasizer Nano ZS를 사용한 동적 광 산란법에 의한 액체 중의 평균 입자경을 지표로, 25℃에서의 보존 안정성을 평가했다. 대표적으로, 0.01w/v％의 글루타르알데히드 농도로 4℃, 3일간 반응 후의 GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자 또는 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자의 결과를 표 61에 나타낸다. GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 25℃ 보존하에서는 1개월간 유지되었다. 한편, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 25℃ 보존하에서는 증가를 나타냈다. 이로써, GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자와 비교하여 안정성이 향상되는 것이 나타났다.

9. 4℃ 보존하에서의 안정성(면역원성)

최종 단백질 농도가 8㎍/㎖가 되도록, PBS형 용액으로 GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자 및 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자를 희석시켰다. 마우스에서의 면역원성(중화 항체가)을 지표로, 4℃에서의 보존 안정성을 평가했다. 대표적으로, 0.01w/v％의 글루타르알데히드 농도로 4℃, 15개월간 반응 후의 GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자 또는 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자의 결과를 표 62에 나타낸다. 0개월과 15개월 후에서 투여량이 상이하지만, GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 4℃ 보존하에서는 15개월간 유지되는 것이 추찰되었다. 한편, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 4℃ 보존하에서는 저하되는 것이 추찰되었다. GA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자와 비교하여, 안정성이 향상되는 것이 추찰되었다.

[실시예 9]

FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 조제

1. 포르말린 처리(바이러스 입자에 대해 입자 구조를 고정화시키는 공정)

불활화 일본 뇌염 바이러스 입자에 대해, 최종 농도가 0.014∼0.04v/v％(포름알데히드 환산으로, 0.005∼0.015w/v％)가 되도록 포르말린(36∼38w/v％ 포름알데히드 수용액)을 첨가하고, 25℃에서 1주간 반응시켰다. 반응 종료 후, PBS형 용액으로 반응액을 투석하고, 포르말린을 제거함으로써, 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자(이하, 「FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자」라고 기재하는 경우가 있다)를 얻었다. 얻어진 FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 발열 활성을, 인간 PBMC를 자극했을 경우의 염증성 사이토카인의 산생량의 정량에 의해 평가했다.

2. 염증성 사이토카인의 산생량의 정량

유럽 약국방 MONOCYTE-ACTIVATION TEST에 준한 방법으로, FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자 또는 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자로 인간 PBMC를 자극했을 경우의 사이토카인(IL-1β 및 IL-6)의 산생량을 정량했다. 구체적으로는, 유럽 약국방 MONOCYTE-ACTIVATION TEST에 있어서의 인간 PBMC를 최저 4도너분 풀하여 사용한 것을, 1도너분으로 변경하여 측정했다. 그 결과를 표 63에 나타낸다. FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자보다 염증성 사이토카인의 산생량이 충분히 낮은 것을 알 수 있었다. 이러한 점에서도, FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자보다 높은 안전성을 갖는 것이 시사되었다.

[실시예 10]

물성 평가

상기 실시예 9에서 얻어진 FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 물성을 이하의 방법으로 평가했다.

1. 전자 현미경에 의한 해석

FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 형상을 상세하게 조사하기 위해, 실시예 2와 동일한 방법으로, 전자 현미경에 의한 관찰을 실시했다. 대표적으로, 0.014v/v％의 포르말린 농도로 25℃, 1주간 반응 후의 FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자를 촬영한 사진을 나타낸다(도 5). FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 포르말린으로 고정시킴으로써 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자와 동일하게 입자 구조가 유지되어 있었다.

2. 동적 광 산란

FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 평균 입자경을, Zetasizer Nano ZS(Malvern사 제조)를 사용하여 해석했다. 동적 광 산란법에 의한 액체 중의 평균 입자경을 표 64에 나타낸다. FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 평균 입자경이 약 90㎚로 단봉성이었다. 일방, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 약 80㎚로 단봉성이었다. 또, FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 입자 구조는 유지되어 있으며, 응집체와 같은 불순물은 보이지 않았다.

3. 분자량 분포 측정(SEC)

FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 분자량 분포를 실시예 8과 동일한 방법(SEC)으로 측정했다. 용출 패턴을 표 65에 나타낸다. FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 용출 시간 14∼15분 부근에 단봉성의 주피크가 보였다. 또, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자도 용출 시간 14∼15분 부근에 단봉성의 주피크가 보였다.

4. 항원의 함유량

항일본 뇌염 바이러스 항체를 사용한 샌드위치 ELISA법에 의해, 항원의 함유량(항원 함량)을 실시예 8과 동일한 방법으로 측정했다.

FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자, 및 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자 각각의 항원 함유량을 표 66에 나타낸다. 대표적으로, 0.014v/v％ 및 0.02v/v％의 포르말린 농도로 25℃, 1주간 반응 후의 FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자를 평가한 결과, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자와 동등한 항원이 포함되어 있었다.

5. 면역원성(마우스 복강내 접종)

실시예 8과 동일한 방법으로, 대표적으로, 0.02v/v％의 포르말린 농도로 25℃, 1주간 반응 후의 FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 중화 항체가를 측정했다. 50％ 플라크 감소율로부터 산출한 결과를 표 67에 나타낸다. FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자와 비교하여 동등 또는 그 이상의 중화 항체가였다.

6. 가혹 시험에서의 안정성(항원 함량)

최종 단백질 농도가 8㎍/㎖가 되도록 PBS형 용액으로, FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자 및 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자를 희석시켰다. 항원 함량을 지표로, 37℃에서의 보존 안정성을 평가했다. 대표적으로, 0.014v/v％의 포르말린 농도로 25℃, 1주간 반응 후의 결과를 표 68에 나타낸다. FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 37℃ 보존하에서는 1주간 유지되었다. 한편, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 37℃ 보존하에서는 저하를 나타냈다. FA 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자와 비교하여 안정성이 향상되는 것이 나타났다.

[실시예 11]

EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 조제

1.1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(EDC) 처리

불활화 일본 뇌염 바이러스 입자에 대해, 최종 농도가 0.15∼15mM이 되도록 EDC를 첨가하고, 4℃에서 2∼20시간 반응시켰다. 퀀칭 처리를 실시하는 경우에는, 추가로 퀀칭제로서 글리신을, EDC의 8배량(몰 질량비)으로 반응액에 첨가했다. 반응 종료 후, PBS형 용액으로 반응액을 투석하고, EDC 및 글리신을 제거함으로써, 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자(이하, 「EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자」라고 기재하는 경우가 있다)를 얻었다. 얻어진 EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 발열 활성을, 인간 PBMC를 자극했을 경우의 염증성 사이토카인의 산생량의 정량에 의해 평가했다.

2. 염증성 사이토카인의 산생량의 정량

유럽 약국방 MONOCYTE-ACTIVATION TEST에 준한 방법으로, 대표적으로, 0.15mM 또는 1.5mM의 EDC 농도로 4℃, 20시간 반응 후의 EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자 또는 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자로 인간 PBMC를 자극했을 경우의 사이토카인(IL-1β 및 IL-6)의 산생량을 정량했다. 구체적으로는, 유럽 약국방 MONOCYTE-ACTIVATION TEST에 있어서의 인간 PBMC를 최저 4도너분 풀하여 사용한 것을, 1도너분으로 변경하여 측정했다. 그 결과를 표 69에 나타낸다. EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자보다 염증성 사이토카인 산생량이 충분히 낮은 것을 알 수 있었다. 이러한 점에서도, EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자보다 높은 안전성을 갖는 것이 시사되었다.

[실시예 12]

물성 평가

상기 실시예 11에서 얻어진 EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 물성을 이하의 방법으로 평가했다.

1. 전자 현미경에 의한 해석

EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 형상을 상세하게 조사하기 위해, 실시예 2와 동일한 방법으로, 전자 현미경에 의한 관찰을 실시했다. 대표적으로, 1.5mM의 EDC 농도로 4℃, 20시간 반응 후의 EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자를 촬영한 사진을 도 6에 나타낸다. EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, EDC로 고정시킴으로써 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자와 동일하게 입자 구조가 유지되어 있었다.

2. 동적 광 산란

EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 평균 입자경을, Zetasizer Nano ZS(Malvern사 제조)를 사용하여 해석했다. 동적 광 산란법에 의한 액체 중의 평균 입자경을 표 70에 나타낸다. EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 평균 입자경이 약 90㎚로 단봉성이었다. 한편, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 약 80㎚로 단봉성이었다. 또, EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 입자 구조는 유지되어 있으며, 응집체와 같은 불순물은 보이지 않았다.

3. 분자량 측정(SEC)

EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 분자량 분포를 실시예 8과 동일한 방법으로 측정했다. 용출 패턴을 표 71에 나타낸다. EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 용출 시간 14∼15분 부근에 단봉성의 주피크가 보였다. 또, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자도 용출 시간 14∼15분 부근에 단봉성의 주피크가 보였다.

4. 항원의 함유량

항일본 뇌염 바이러스 항체를 사용한 샌드위치 ELISA법에 의해, 항원의 함유량(항원 함량)을 실시예 8과 동일한 방법으로 측정했다. 대표적으로, 1.5mM의 EDC 농도로 4℃, 20시간 반응 후의 EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자, 및 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자 각각의 항원 함유량을 표 72에 나타낸다. EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자와 동등한 항원이 포함되어 있었다.

5. 면역원성(마우스 복강내 접종)

실시예 8과 동일한 방법으로, EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자의 중화 항체가를 측정했다. 50％ 플라크 감소율로부터 산출한 결과를 표 73에 나타낸다. 대표적으로, 1.5mM의 EDC 농도로 4℃에서 2시간 반응 후에 퀀칭제로서 글리신을, EDC의 8배량(몰 질량비)으로 반응액에 첨가한 EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자를 평가한 결과, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자와 비교하여 동등 또는 그 이상의 중화 항체가였다.

6. 안정성(항원 함량)

최종 단백질 농도가 8㎍/㎖가 되도록 PBS형 용액으로, EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자 및 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자를 희석시켰다. 항원 함량을 지표로, 25℃, 37℃에서의 보존 안정성을 평가했다. 결과를 표 74, 표 75에 나타낸다. EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 25℃ 보존하에서는 1개월간 및 37℃ 보존하에서는 1주간 유지되었다. 한편, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 25℃ 보존하, 37℃ 보존하 중 어느 것에 있어서도, 항원 함량의 저하를 나타냈다. EDC 고정화 일본 뇌염 바이러스 입자는, 불활화 일본 뇌염 바이러스 입자와 비교하여 안정성이 향상되는 것이 나타났다.

산업상 이용가능성

본 발명은 의약품의 분야, 특히 백신의 분야에 있어서 유용하다.

Claims (31)

1. 고정화 바이러스 입자를 포함하는 백신으로서,
   상기 고정화 바이러스 입자의 발열 시험에 있어서의 토끼 3마리에서의 발열 반응의 합이, 상기 고정화 바이러스 입자의 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자에 있어서의 토끼 3마리에서의 발열 반응의 합을 기준으로 하여, 80％ 미만인, 백신.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 고정화 바이러스 입자의 발열 시험에 있어서의 토끼 3마리에서의 발열 반응의 합이 1.3℃ 이하인, 백신.
3. 고정화 바이러스 입자를 포함하는 백신으로서,
   상기 고정화 바이러스 입자에 의해 자극을 받은 인간 말초혈 단핵구로부터 산생되는 염증성 사이토카인의 양이, 상기 고정화 바이러스 입자의 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자에 의해 자극을 받은 인간 말초혈 단핵구로부터 산생되는 염증성 사이토카인의 양을 기준으로 하여, 80％ 미만인, 백신.
4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 고정화 바이러스 입자의 근원이 되는 바이러스 입자가, 오르토믹소 바이러스 입자, 플라비 바이러스 입자, 또는 피코르나 바이러스 입자를 포함하는, 백신.
5. 청구항 4에 있어서,
   상기 바이러스 입자가, 인플루엔자 바이러스 입자, 일본 뇌염 바이러스 입자, 또는 A형 간염 바이러스 입자를 포함하는, 백신.
6. 청구항 5에 있어서,
   상기 바이러스 입자가 인플루엔자 바이러스 입자를 포함하는, 백신.
7. 청구항 6에 있어서,
   상기 인플루엔자 바이러스 입자가, A형 인플루엔자 바이러스 입자, 또는 B형 인플루엔자 바이러스 입자를 포함하는, 백신.
8. 청구항 6 또는 청구항 7에 있어서,
   상기 인플루엔자 바이러스 입자가, H1N1 아형주, H2N2 아형주, H3N2 아형주, H3N8 아형주, H5N1 아형주, H5N2 아형주, H5N6 아형주, H6N1 아형주, H7N3 아형주, H7N7 아형주, H7N9 아형주, H9N2 아형주, 또는 H10N8 아형주로 분류되는 인플루엔자 바이러스 입자를 포함하는, 백신.
9. 청구항 5에 있어서,
   상기 바이러스 입자가 일본 뇌염 바이러스 입자를 포함하는, 백신.
10. 청구항 9에 있어서,
    상기 일본 뇌염 바이러스 입자가, 베이징-1주, 나카야마주, SA14-14-2주, 또는 P3주를 포함하는, 백신.
11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고정화 바이러스 입자의 표면의 단백질의 0％∼90％가 고정화되어 있지 않은, 백신.
12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고정화 바이러스 입자의 근원이 되는 바이러스 입자의 비활성(항원 함량/단백질 함량)에 대한, 상기 고정화 바이러스 입자의 비활성의 상대값이 0∼95％인, 백신.
13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고정화 바이러스 입자가, 상기 고정화 바이러스 입자의 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자의 입자경의 80％∼150％의 평균 입자경을 갖는, 백신.
14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고정화 바이러스 입자를 자당 밀도 구배 원심으로 측정했을 경우에, 자당 농도 35％ 이상에 피크가 검출되는, 백신.
15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고정화 바이러스 입자를 고속 액체 크로마토그래피로 측정했을 경우에, 단봉성의 피크가 보이는, 백신.
16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    마우스에 면역했을 경우, 상기 고정화 바이러스 입자에 특이적인 IgG1보다, 상기 고정화 바이러스 입자에 특이적인 IgG2a를 유도하는, 백신.
17. 근원이 되는 바이러스 입자 또는 대응하는 불활화 바이러스 입자를 포함하는 현탁액에 고정화제를 첨가하는 공정을 포함하는, 고정화 바이러스 입자의 제조 방법.
18. 청구항 17에 있어서,
    상기 고정화제가 알데히드류를 포함하는, 제조 방법.
19. 청구항 18에 있어서,
    상기 알데히드류가, 포름알데히드, 파라포름알데히드, 글루타르알데히드, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는, 제조 방법.
20. 청구항 19에 있어서,
    상기 알데히드류가 포름알데히드를 포함하는, 제조 방법.
21. 청구항 20에 있어서,
    상기 포름알데히드의 농도가, 상기 현탁액 및 상기 고정화제의 전체량을 기준으로 하여, 0.005∼0.5w/v％인, 제조 방법.
22. 청구항 19에 있어서,
    상기 알데히드류가 글루타르알데히드를 포함하는, 제조 방법.
23. 청구항 22에 있어서,
    상기 글루타르알데히드의 농도가, 상기 현탁액 및 상기 고정화제의 전체량을 기준으로 하여, 0.001∼0.06w/v％인, 제조 방법.
24. 청구항 19에 있어서,
    상기 고정화제가 카르보디이미드류를 포함하는, 제조 방법.
25. 청구항 24에 있어서,
    상기 카르보디이미드류가, 디시클로헥실카르보디이미드, 디이소프로필카르보디이미드, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염, 그들의 유사체, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는, 제조 방법.
26. 청구항 25에 있어서,
    상기 카르보디이미드류가 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염을 포함하는, 제조 방법.
27. 청구항 26에 있어서,
    상기 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염의 농도가, 상기 현탁액 및 상기 고정화제의 전체량을 기준으로 하여, 0.05∼1500mM인, 제조 방법.
28. 청구항 17 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서,
    근원이 되는 상기 바이러스 입자가, 배양 세포, 계란 또는 마우스뇌에 감염시키고, 회수된 바이러스 입자인, 제조 방법.
29. 청구항 28에 있어서,
    상기 배양 세포가 초대 세포 또는 주화 세포를 포함하는, 제조 방법.
30. 청구항 29에 있어서,
    상기 배양 세포가 Vero 세포, 또는 MDCK 세포를 포함하는, 제조 방법.
31. 청구항 17 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어진 고정화 바이러스 입자를 첨가하는 공정을 포함하는, 백신의 제조 방법.

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