JPWO2017122635A1 - 固定化ウイルス粒子を含むワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
[1]固定化ウイルス粒子を含むワクチンであって、
上記固定化ウイルス粒子の発熱試験におけるウサギ3羽での発熱反応の和が、上記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子におけるウサギ3羽での発熱反応の和を基準として、80%未満である、ワクチン。
[2]上記固定化ウイルス粒子の発熱試験におけるウサギ3羽での発熱反応の和が、1.3℃以下である、[1]に記載のワクチン。
[3]固定化ウイルス粒子を含むワクチンであって、
上記固定化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの量が、上記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの量を基準として、80%未満である、ワクチン。
[4]上記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子が、オルソミクソウイルス粒子、フラビウイルス粒子、又はピコルナウイルス粒子を含む、[1]〜[3]のいずれかに記載のワクチン。
[5]上記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子、日本脳炎ウイルス粒子、又はA型肝炎ウイルス粒子を含む、[4]に記載のワクチン。
[6]上記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子を含む、[5]に記載のワクチン。
[7]上記インフルエンザウイルス粒子が、A型インフルエンザウイルス粒子、又はB型インフルエンザウイルス粒子を含む、[6]に記載のワクチン。
[8]上記インフルエンザウイルス粒子が、H1N1亜型株、H2N2亜型株、H3N2亜型株、H3N8亜型株、H5N1亜型株、H5N2亜型株、H5N6亜型株、H6N1亜型株、H7N3亜型株、H7N7亜型株、H7N9亜型株、H9N2亜型株、又はH10N8亜型株に分類されるインフルエンザウイルス粒子を含む、[6]又は[7]に記載のワクチン。
[9]上記ウイルス粒子が、日本脳炎ウイルス粒子を含む、[5]に記載のワクチン。
[10]上記日本脳炎ウイルス粒子が、北京−1株、中山株、SA14−14−2株、又はP3株を含む、[9]に記載のワクチン。
[11]上記固定化ウイルス粒子の表面のタンパク質の0%〜90%が、固定化されていない、[1]〜[10]のいずれかに記載のワクチン。
[12]上記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子の比活性(抗原含量/タンパク質含量)に対する、上記固定化ウイルス粒子の比活性の相対値が、0%〜95%である、[1]〜[11]のいずれかに記載のワクチン。
[13]上記固定化ウイルス粒子が、上記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子の粒子径の80%〜150%の平均粒子径を有する、[1]〜[12]のいずれかに記載のワクチン。
[14]上記固定化ウイルス粒子をショ糖密度勾配遠心で測定した場合に、ショ糖濃度35%以上にピークが検出される、[1]〜[13]のいずれかに記載のワクチン。
[15]上記固定化ウイルス粒子を高速液体クロマトグラフィーで測定した場合に、単峰性のピークが認められる、[1]〜[14]のいずれかに記載のワクチン。
[16]マウスに免疫した場合、上記固定化ウイルス粒子に特異的なIgG1よりも、上記固定化ウイルス粒子に特異的なIgG2aを誘導する、[1]〜[15]のいずれかに記載のワクチン。
[17]元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子を含む懸濁液に固定化剤を加える工程を含む、固定化ウイルス粒子の製造方法。
[18]上記固定化剤が、アルデヒド類を含む、[17]に記載の製造方法。
[19]上記アルデヒド類が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、及びそれらの組合せからなる群から選択される、[18]に記載の製造方法。
[20]上記アルデヒド類が、ホルムアルデヒドを含む、[19]に記載の製造方法。
[21]上記ホルムアルデヒドの濃度が、上記懸濁液及び上記固定化剤の全量を基準として、0.005〜0.5w/v%である、[20]に記載の製造方法。
[22]上記アルデヒド類が、グルタルアルデヒドを含む、[19]に記載の製造方法。
[23]上記グルタルアルデヒドの濃度が、上記懸濁液及び上記固定化剤の全量を基準として、0.001〜0.06w/v%である、[22]に記載の製造方法。
[24]上記固定化剤が、カルボジイミド類を含む、[17]に記載の製造方法。
[25]上記カルボジイミド類が、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩、それらの類縁体及び、それらの組合せからなる群から選択される、[24]に記載の製造方法。
[26]上記カルボジイミド類が、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩を含む、[25]に記載の製造方法。
[27]上記1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩の濃度が、上記懸濁液及び上記固定化剤の全量を基準として、0.05〜1500mMである、[26]に記載の製造方法。
[28]元となる上記ウイルス粒子が、培養細胞、鶏卵又はマウス脳に感染させて、回収されたウイルス粒子である、[17]〜[27]のいずれかに記載の製造方法。
[29]上記培養細胞が、初代細胞、又は株化細胞を含む、[28]に記載の製造方法。
[30]上記培養細胞が、Vero細胞、又はMDCK細胞を含む、[29]に記載の製造方法。
[31][17]〜[30]のいずれかに記載の製造方法によって得られた固定化ウイルス粒子を加える工程を含む、ワクチンの製造方法。
本実施形態に係るワクチンは、固定化ウイルス粒子を含むワクチンであって、上記固定化ウイルス粒子の発熱試験におけるウサギ3羽での発熱反応の和(℃)が、上記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子におけるウサギ3羽での発熱反応の和を基準として、低下している。また、上記ワクチンは、固定化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの量が、上記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの量を基準として、低減している。すなわち、固定化ウイルス粒子を含むワクチンの免疫原性は、スプリットワクチンの免疫原性以上であり、局所反応及び発熱反応等の副反応がスプリットワクチンと同等に抑えられている。他の側面において、固定化ウイルス粒子は、従来の不活化ウイルス粒子を含む全粒子ワクチンと比較して安定性に優れている。
本実施形態に係る固定化ウイルス粒子の製造方法は、元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子に対して粒子構造を固定化する工程を含む。
上記固定化する工程は、元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子を固定化剤で処理する方法が例示され、例えば、元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子を含む懸濁液に固定化剤を加える工程が挙げられる。懸濁液中のウイルス粒子の濃度は、ウイルスの種類、固定化剤の種類及びその濃度等に応じて適宜変更してもよい。例えば、懸濁液中のウイルス粒子の濃度は、ウイルス粒子のタンパク質の濃度として、60〜90μg/mLであってもよいし、300〜3000μg/mLであってもよいし、500〜2500μg/mLであってもよい。
1.インフルエンザウイルス粒子に由来する抗原の調製
(1)FA固定化インフルエンザウイルス粒子の調製
ホルムアルデヒド(FA)処理
A型インフルエンザウイルスH1N1亜型株(A/California/07/2009(X−179A)株、以下、「A/CA株」と記載することがある。)を11日齢の発育鶏卵の漿尿膜腔内に接種し、34℃で2日間培養した。得られた漿尿液を清澄化した後、超遠心分離によってインフルエンザウイルス粒子を沈殿させた。上記インフルエンザウイルス粒子をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で再浮遊させて懸濁液を得た。得られた懸濁液をショ糖密度勾配遠心(RCF=57500(×g)、16時間)で遠心分離し、ショ糖濃度が33%〜50%である画分を回収することによって、インフルエンザ粒子を精製した。精製したインフルエンザウイルス粒子のタンパク質の最終濃度が500μg/mLとなるように、得られた画分を希釈し、懸濁液を得た。その後、最終濃度が0.05〜0.20v/v%(ホルムアルデヒド換算で、0.018〜0.076w/v%)となるようにホルマリン(36〜38w/v%ホルムアルデヒド水溶液)を上記懸濁液に添加し、25℃で1週間反応させた。反応終了後、PBSで反応液を透析し、ホルムアルデヒドを除くことで、固定化インフルエンザウイルス粒子(以下、「FA固定化インフルエンザウイルス粒子」と記載することがある。)を得た。
上記懸濁液に、最終濃度が0.02v/v%(ホルムアルデヒド換算で、0.0072〜0.0076w/v%)となるようにホルマリン(36〜38w/v%ホルムアルデヒド水溶液)を添加し、4℃で6週間〜8週間反応させた。反応終了後、PBSで反応液を透析し、ホルムアルデヒドを除くことで不活化インフルエンザウイルス粒子を得た。同様の方法で、他のインフルエンザウイルス株(亜型株)についても不活化インフルエンザウイルス粒子を調製し、実施例1〜6において比較対照として使用した。
比較対照とするスプリットインフルエンザウイルス抗原(以下、「スプリットインフル抗原」と記載することがある。)は、インフルエンザHAワクチン(化学及血清療法研究所製、商品名「インフルエンザHAワクチン“化血研”」)に含まれる各株の原液を使用した。
生物学的製剤基準(日本国、厚生労働省告示 第192号)に準じて、発熱試験を行った。不活化インフルエンザウイルス粒子、FA固定化インフルエンザウイルス粒子及びスプリットインフル抗原を生理食塩水で希釈し、1mL中のタンパク質含量を240μgとしたものを試料とした。上記試料を、体重1kg当たりにつき1〜3mLをウサギに接種して、6時間後まで発熱の上昇を観察した。試料を接種する前のウサギの体温(対照体温)と接種した後のウサギの体温との差を求め、その差の最大値をそのウサギの発熱反応とした。同様の試験を3羽のウサギに対して行った。ウサギ3羽の発熱反応の和(℃)を表1に示す。
欧州薬局方MONOCYTE−ACTIVATION TESTに準じた方法で、ホルマリン濃度0.05v/v%、0.08v/v%、0.11v/v%で固定したFA固定化インフルエンザウイルス粒子又は不活化インフルエンザウイルス粒子でヒト末梢血単核球(PBMC)を刺激した場合の炎症性サイトカイン(IL−6)の産生量を定量した。具体的には、欧州薬局方MONOCYTE−ACTIVATION TESTにおけるヒトPBMCを最低4ドナー分プールして使用するところを、1ドナー分に変更して測定した。FA固定化インフルエンザウイルス粒子及び不活化インフルエンザウイルス粒子のサイトカインの産生量の結果を表2に示す。FA固定化インフルエンザウイルス粒子におけるIL−6の産生量は、不活化インフルエンザウイルス粒子と比較して十分低いことがわかった。このことから、FA固定化インフルエンザウイルス粒子は、不活化インフルエンザウイルス粒子と比較して、高い安全性を有することが示唆された。
物性評価
1.ショ糖密度勾配遠心法による分析
上記実施例1に準じた方法で、インフルエンザウイルス粒子(A/CA株)のタンパク質の最終濃度が2500μg/mLとなるように、得られた画分を希釈し懸濁液を得た。その後、最終濃度が0.12v/v%となるようにホルマリンを上記懸濁液に添加し、25℃で1週間反応させた。反応液をPBSで透析することによって、FA固定化インフルエンザウイルス粒子を得た。得られたFA固定化インフルエンザウイルス粒子をショ糖密度勾配遠心法によって分析した。検体を15〜60%のショ糖密度勾配に重層し、4℃、18000rpm(57500(×g))で16時間、遠心分離を行った。遠心後、1フラクションあたり0.6mLずつ分画し、各フラクションのショ糖濃度、HA価及びタンパク質濃度を測定した。A/CA株(H1N1亜型株)の結果を表3に示す。スプリットインフル抗原では、タンパク質がショ糖濃度25〜50%に幅広く分布し、ウイルス粒子が分解していることが示された。これに対し、FA固定化インフルエンザウイルス粒子では高いショ糖濃度(44.3%)に単一ピーク(粒子性)として分画されていることが示された。HA活性については10240倍であった。
上記FA固定化インフルエンザウイルス粒子(A/CA株)の形状をさらに詳細に調べるために、電子顕微鏡による観察を実施した。検体を、グルタルアルデヒドを用いて室温で20分間固定した。その後、観察用のイオンコートしたシートメッシュ(日新EM社製)に、固定した検体を載せて約60秒間静置し、2%リンタングステン酸水溶液でネガティブ染色した。染色した検体を、透過型電子顕微鏡(FEIカンパニー社製テクナイG2:加速電圧120kV)を用いて観察、撮影した。
A型インフルエンザウイルスH3N2亜型株(A/New York/39/2012(X−233A)株、以下、「A/NY株」と記載することがある。)及びB型インフルエンザウイルスビクトリア系統株(B/Brisbane/60/2008株株、以下、「B/BR株」と記載することがある。)を元とするFA固定化インフルエンザウイルス粒子を実施例1に準じた方法で作製し、それぞれの平均粒子径をZetasizer Nano ZS(Malvern社製)を用いて解析した。動的光散乱法による液体中の平均粒子径を表4に示す。FA固定化インフルエンザウイルス粒子は平均粒子径が140〜150nm前後で単峰性であった。このことから、FA固定化インフルエンザウイルス粒子の平均粒子径は、不活化インフルエンザウイルス粒子と同等であることがわかった。また、FA固定化インフルエンザウイルス粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。
B型インフルエンザウイルスの山形系統株(B/Massachusetts/02/2012(BX−51B)株(以下、「B/MA株」と記載することがある。))について、上記実施例1に準じた方法でFA固定化インフルエンザウイルス粒子(B/MA株)を作製した。A/CA株(H1N1亜型株)、A/NY株(H3N2亜型株)、及びB/MA株(B型株)について、スプリットインフル抗原、及びFA固定化インフルエンザウイルス粒子の分子量分布測定を、サイズ排除クロマトグラフィー(商品名:TSKgel G6000PWXL(TOSOH社製))を用いて分子量測定を行った(溶離液にはPBSを用いて、流速は0.5ml/minで行った。)。その溶出パターンを表5に示す。FA固定化インフルエンザウイルス粒子は溶出時間16〜17分付近に単峰性のピークが認められた。一方、同じ株由来のスプリットインフル抗原は溶出時間19〜30分付近に三峰性のピークが認められた。
実施例1で調製したFA固定化インフルエンザウイルス粒子(A/CA株)について、以下の手順で、固定化剤での架橋度を分析した。まず、検体にSDS−Buffer(終濃度:Tris 0.76w/v%、SDS 1w/v%、Glycerol 10v/v%、Bromophenol Blue(BPB) 0.01w/v%)と2−メルカプトエタノール(終濃度:0.8v/v%)を添加し、6分間煮沸後、PAGEL NPU−12.5L(ATTO社製、商品名)又はPAGEL NPU−R12.5L(ATTO社製、商品名)を用いて、SDS−PAGEを行った。泳動後、CBB(クマシーブリリアントブルー)染色を行い、LAS3000(富士フイルム株式会社製、商品名)にて画像を取り込んだ。固定化剤による架橋が進むと、ウイルスを構成するタンパク質の一つであるM1タンパク質は、本来のバンドの位置(25〜37kDa)から高分子側へシフトする。そのため、本来の位置に検出されるM1タンパク質のバンド(M1バンド)は薄くなることが示唆されており、これを架橋度の指標とした。具体的には、固定化を行っていないインフルエンザウイルス粒子のM1バンドのデンシトメトリー値に対する、各ホルマリン濃度で処理したFA固定化インフルエンザウイルス粒子の、本来の位置に検出されるM1バンドのデンシトメトリー値の相対値(%)(以下、この相対値を「M1タンパク質残存率」(%)と記載することがある。)を算出した。結果を表6に示す。ホルマリン濃度0.05%、0.08%、0.11%、0.14%で固定したFA固定化インフルエンザウイルス粒子(A/CA株)のM1タンパク質残存率は、それぞれ35.7%、23.8%、11.0%、5.4%であり、ホルマリン濃度が高まるにつれて架橋が促進され、M1タンパク質残存率が低下することが示唆された。
FA固定化インフルエンザウイルス粒子(A/CA株)における免疫原性を、マウスを用いて評価した。ddYマウス(雌性、8週齢)に、スプリットインフル抗原、不活化インフルエンザウイルス粒子、又はFA固定化インフルエンザウイルス粒子(A/CA株)を、タンパク質量として0.8μgの接種量で筋肉内接種した(一群当たり13匹)。免疫3週後にマウスを全採血し、安楽死させた。遠心分離によって血清を得て、「病原体検出マニュアル」(国立感染症研究所編)に従って、HI抗体価を測定した。マウスに筋肉内接種を行った際の免疫原性(HI抗体価(GMT))の結果を表7に示す。FA固定化インフルエンザウイルス粒子(A/CA株)は、スプリットインフル抗原と比較して高い免疫原性であり、不活化インフルエンザウイルス粒子と同等の免疫原性であった。
FA固定化インフルエンザウイルス粒子(A/CA株)における免疫原性を、上記「6.免疫原性1(マウス筋肉内接種)」と同じ手順でマウス皮内接種によって評価した。ddYマウス(雌性、8週齢)に、スプリットインフル抗原、不活化インフルエンザウイルス粒子、又はFA固定化インフルエンザウイルス粒子を、タンパク質量として0.2μgの接種量で皮内接種した(一群当たり5匹)。免疫3週後にマウスを全採血し、安楽死させた。遠心分離によって血清を得て、HI抗体価を測定した。マウスに皮内接種を行った際の免疫原性(HI抗体価(GMT))の結果を表8に示す。FA固定化インフルエンザウイルス粒子は、スプリットインフル抗原と比較して有意に免疫原性が高く、不活化インフルエンザウイルス粒子と同等の免疫原性であった。
A/CA株(H1N1亜型株)、A/NY株(H3N2亜型株)、B/BR株及びB/MA株(B型株)について、スプリットインフル抗原、不活化インフルエンザウイルス粒子、及びFA固定化インフルエンザウイルス粒子の免疫原性を、カニクイザル(雄性又は雌性、17〜25ヶ月齢)を用いて評価した。スプリットインフル抗原、不活化インフルエンザウイルス粒子、又はFA固定化インフルエンザウイルス粒子を、1群当たり8又は9匹に7.5μgHA相当(スプリットインフル抗原のHA量に相当するタンパク質量)の接種量で、21日間隔で2回皮下接種した。2次免疫前、及び2次免疫後21日目に部分採血した。遠心分離によって血清を得て、「病原体検出マニュアル」(国立感染症研究所編)に従って、HI抗体価及び中和抗体価を測定した。免疫原性の結果を、表9(2次免疫後21日目のHI抗体価(GMT))、表10(2次免疫後21日目の中和抗体価(GMT))に示す。HI抗体価では、FA固定化インフルエンザウイルス粒子はスプリットインフル抗原と比較して高い免疫原性を有することがわかった。特に、B/MA株以外では、スプリットインフル抗原と比較して有意に免疫原性が高かった。中和抗体価においても、FA固定化インフルエンザウイルス粒子はスプリットインフル抗原と比較してA型株及びB型株全てにおいて有意に免疫原性が高かった。
抗体サブクラス解析として、上記「6.免疫原性1(マウス筋肉内接種)」で得られたA/CA株(H1N1亜型株)、及びB/MA株(B型株)について、マウスの血清中に含まれる、ウイルス抗原に特異的なIgG1及びIgG2a抗体価を酵素免疫測定(ELISA)法によって測定した。その結果、FA固定化インフルエンザウイルス粒子は、抗原特異的IgG1よりも抗原特異的IgG2aを誘導することが示された(表11、表12)。これは、不活化インフルエンザウイルス粒子と同様の結果であり、スプリットインフル抗原との比較においても、より強いIgG2a誘導傾向が見られた。この結果から、FA固定化インフルエンザウイルス粒子は、液性免疫を活性化するが細胞性免疫をほとんど活性化することができないスプリットインフル抗原に比べて、ワクチンの有効性のさらなる向上が期待できる。
実施例1に準じた方法で調製したFA固定化インフルエンザウイルス粒子(A/NY株)について、以下の手順で、プロテアーゼ処理中の経時的なRNA放出量を評価した。まず、FA固定化インフルエンザウイルス粒子をPBSで希釈し、SDSとProteinase Kを加えて55℃で反応させ、経時的にRNAを抽出した。RNA抽出には、TRIzol LS ReagentとPureLink RNA Mini Kit、PureLink DNase (invitrogen社製、商品名)を用いた。抽出したRNAの含有量は、Quant−iT RiboGreen RNA Reagent and Kit (invitrogen社製、商品名)で測定した。各FA濃度の経時的なRNA含量を表13に示す。その結果、FA濃度依存的にRNA放出が徐放化されていることが示された。FA固定によるRNA放出の徐放化が、炎症性サイトカイン産生を徐放化させ、高い安全性を生み出していることが示唆された。
(1)GA固定化インフルエンザウイルス粒子の調製
1.グルタルアルデヒド(GA)処理
A型インフルエンザウイルス(H3N2亜型株(A/NY株))及びB型インフルエンザウイルス(B型ビクトリア系統株(B/BR株))を実施例1と同様の方法で培養、精製した。精製した各インフルエンザウイルス粒子のタンパク質の最終濃度が1000μg/mLとなるように、各インフルエンザウイルス粒子を希釈し、懸濁液を得た。次に、1w/v%GA溶液を用いて、GA濃度が0.016w/v%又は0.008w/v%となるように希釈した。上記懸濁液と、希釈したGA溶液(0.016w/v%又は0.008w/v%)とを等量混合し、4℃で3日間反応させた。反応終了後、PBSで反応液を透析し、GAを除くことで、固定化インフルエンザウイルス粒子(以下、「GA固定化インフルエンザウイルス粒子」と記載することがある。)を得た。得られたGA固定化インフルエンザウイルス粒子(A/NY株及びB/BR株)の発熱活性を、ウサギ3羽における発熱反応の和で評価する発熱試験、及びヒトPBMCを刺激した場合の炎症性サイトカインの産生量の定量によって評価した。
実施例1と同様の方法によって、発熱試験を行った。不活化インフルエンザウイルス粒子及びGA固定化インフルエンザウイルス粒子(A/NY株及びB/BR株)を生理食塩水で希釈し、1mL中のタンパク質含量を240μgとしたものを試料とした。上記試料を、体重1kg当たりにつき1mLをウサギに接種して、6時間後まで発熱の上昇を観察した。A/NY株のウサギ3羽の発熱反応の和(℃)を表14、B/BR株のウサギ3羽の発熱反応の和(℃)を表15に示す。
欧州薬局方MONOCYTE−ACTIVATION TESTに準じた方法で、GA固定化インフルエンザウイルス粒子又は不活化インフルエンザウイルス粒子でヒトPBMCを刺激した場合のサイトカイン(IL−1β)の産生量を定量した。具体的には、欧州薬局方MONOCYTE−ACTIVATION TESTにおけるヒトPBMCを最低4ドナー分プールして使用するところを、1ドナー分に変更して測定した。GA固定化インフルエンザウイルス粒子(A/NY株及びB/BR株)のサイトカインの産生量の結果を表16、表17に示す。GA固定化インフルエンザウイルス粒子は、不活化インフルエンザウイルス粒子と比較して、炎症性サイトカインの産生量が十分低いことがわかった。このことから、GA固定化インフルエンザウイルス粒子は、スプリットインフル抗原と同様に、高い安全性を有することが示唆された。
物性評価
上記実施例3で得られたGA固定化インフルエンザウイルス粒子の物性を以下の方法で評価した。
GA固定化インフルエンザウイルス粒子(A/NY株)の形状をさらに詳細に調べるために、実施例2と同様の方法で、電子顕微鏡による観察を実施した。代表として、0.008w/v%のGA濃度で4℃、3日間反応させたGA固定化インフルエンザウイルス粒子(A/NY株)を撮影した写真を図2に示す。GA固定化インフルエンザウイルス粒子は粒子構造が保たれており、粒子同士が結合しあった凝集体は認められなかった。
GA固定化インフルエンザウイルス粒子の平均粒子径をZetasizer Nano ZS(Malvern社製)を用いて解析した。動的光散乱法による液体中の平均粒子径を表18に示す。GA固定化インフルエンザウイルス粒子は、平均粒子径が130〜160nm前後で単峰性であった。このことから、GA固定化インフルエンザウイルス粒子の平均粒子径は、元となるウイルス粒子と同等であることが確認された。すなわち、GA固定化インフルエンザウイルス粒子の平均粒子径は単一で変わらないことがわかった。また、GA固定化インフルエンザウイルス粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。
GA固定化インフルエンザウイルス粒子の分子量分布を実施例2と同様の方法(SEC)で測定した。その溶出パターンを表19に示す。スプリットインフル抗原は、溶出時間16〜30分付近に四峰性のピークが認められた。一方、GA固定化インフルエンザウイルス粒子は、溶出時間16〜17分付近に単峰性のピークが認められた。
GA固定化インフルエンザウイルス粒子の固定化剤での架橋度を、実施例2と同様の方法で分析した。B/BR株(B型ビクトリア系統株)の結果を表20に示す。グルタルアルデヒド濃度0.004w/v%、0.008w/v%で固定したGA固定化インフルエンザウイルス粒子のM1タンパク質残存率は、それぞれ23.8%、10.8%であり、グルタルアルデヒド濃度が高まるにつれて架橋が促進され、M1タンパク質残存率が低下することがわかった。
GA固定化インフルエンザウイルス粒子(B/BR株)における免疫原性を、以下の手順で評価した。まず、ddYマウス(雌性、8週齢)に、スプリットインフル抗原、又はGA固定化インフルエンザウイルス粒子をタンパク質量として0.8μgの接種量で筋肉内接種した(一群当たり16匹)。免疫3週後にマウスを全採血し、安楽死させた。遠心分離によって血清を得て、中和抗体価を測定した。代表としてB/BR株(B型ビクトリア系統株)の免疫原性(中和抗体価(GMT))の結果を表21に示す。B型株の場合、GA固定化インフルエンザウイルス粒子は、スプリットインフル抗原と比較して高い免疫原性であった。
抗体サブクラス解析として、上記「5.免疫原性(マウス筋肉内接種)」で得られたマウスの血清中に含まれる、インフルエンザウイルスの抗原に特異的なIgG1及びIgG2a抗体価をELISA法によって測定した。その結果、スプリットインフル抗原とは対照的に、GA固定化インフルエンザウイルス粒子は、抗原特異的IgG1よりも抗原特異的IgG2aを誘導することが示された(表22)。これは、不活化インフルエンザウイルス粒子と同様の結果である。この結果から、GA固定化インフルエンザウイルス粒子は、液性免疫を活性化するが細胞性免疫をほとんど活性化することができないスプリットインフル抗原に比べて、ワクチンの有効性のさらなる向上が期待できる。
(1)EDC固定化インフルエンザウイルス粒子の調製
1.1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC)処理
A型インフルエンザウイルス(H3N2亜型株(A/NY株))及びB型インフルエンザウイルス(ビクトリア系統株B/BR株)を実施例1と同様に培養、精製した。精製した各インフルエンザウイルス粒子のタンパク質の最終濃度がA/NY株は2500μg/mL、B/BR株は500μg/mLとなるように、得られた画分を希釈し、懸濁液を得た。EDC溶液を、0.1〜4MとなるようにPBSで段階希釈し、最終濃度が50〜500mMとなるように懸濁液に添加し、氷冷(0℃)で、2〜20時間反応させた。反応終了後、PBSで反応液を透析し、EDCを除くことで、固定化インフルエンザウイルス粒子(以下、「EDC固定化インフルエンザウイルス粒子」と記載することがある。)を得た。得られたEDC固定化インフルエンザウイルス粒子(A/NY株、B/BR株)の発熱活性を、ウサギ3羽における発熱反応の和で評価する発熱試験、及びヒトPBMCを刺激した場合の炎症性サイトカインの産生量の定量によって評価した。
実施例1と同様の方法によって、発熱試験を行った。EDC固定化インフルエンザウイルス粒子を生理食塩水で希釈し、1mL中のタンパク質含量を240μgとしたものを試料とした。EDC固定化インフルエンザウイルス粒子は、50mM又は500mMのEDC濃度で、氷冷で2時間反応した後、PBSで反応液を透析処理した検体を用いた(A/NY株については、5mMのEDC濃度も実施した。)。また、A/NY株については、5mMのEDC濃度で、4℃で20時間反応した後、PBSで反応液を透析処理した検体も用いた。上記試料を、体重1kg当たりにつき1mLをウサギに接種して、6時間後まで発熱の上昇を観察した。ウサギ3羽の発熱反応の和(℃)を表23、表24に示す。
欧州薬局方MONOCYTE−ACTIVATION TESTに準じた方法で、EDC固定化インフルエンザウイルス粒子又は不活化インフルエンザウイルス粒子でヒトPBMCを刺激した場合のサイトカイン(IL−1β及びIL−6)の産生量を定量した。具体的には、欧州薬局方MONOCYTE−ACTIVATION TESTにおけるヒトPBMCを最低4ドナー分プールして使用するところを、1ドナー分に変更して測定した。A/NY株及びB/BR株のEDC固定化インフルエンザウイルス粒子及び不活化インフルエンザウイルス粒子のサイトカインの産生量の結果を表25、表26に示す。EDC固定化インフルエンザウイルス粒子は、不活化インフルエンザウイルス粒子と比較して、炎症性サイトカイン産生量が十分低いことがわかった。このことから、EDC固定化インフルエンザウイルス粒子は、不活化インフルエンザウイルス粒子と比較して、副反応を抑制しやすいことが示唆された。
物性評価
上記実施例5で得られたEDC固定化インフルエンザウイルス粒子の物性を以下の方法で評価した。
実施例2と同様の方法によって、EDC固定化インフルエンザウイルス粒子をショ糖密度勾配遠心法によって分析した。代表として、50mMのEDC濃度にて、氷冷で2時間反応した後のEDC固定化インフルエンザウイルス粒子(A/NY株(H3N2亜型株))の結果を表27に示す。スプリットインフル抗原では、タンパク質がショ糖濃度25〜50%に幅広く分布し、ウイルス粒子が分解していることが示された。これに対し、EDC固定化インフルエンザウイルス粒子では高いショ糖濃度(47.2%)に単一ピーク(粒子性)として分画されていることが示された。HA活性については10240倍であった。
EDC固定化インフルエンザウイルス粒子の形状を詳細に調べるために、実施例2と同様の方法で、電子顕微鏡による観察を実施した。代表として、500mMのEDC濃度にて、氷浴で2時間反応した後のEDC固定化インフルエンザウイルス粒子を撮影した写真を図3に示す。EDC固定化インフルエンザウイルス粒子は粒子構造が保たれており、抗原同士が結合しあった凝集体は認められなかった。
EDC固定化インフルエンザウイルス粒子の平均粒子径をZetasizer Nano ZS(Malvern社製)を用いて解析した。動的光散乱法による液体中の平均粒子径を表28に示す。EDC固定化インフルエンザウイルス粒子(A/NY株(H3N2亜型株)、B/BR株(B型株))は、平均粒子径が130〜160nm前後で単峰性であった。このことから、EDC固定化インフルエンザウイルス粒子の平均粒子径は、元となるウイルス粒子と同等であることが確認された。すなわち、EDC処理されても固定化インフルエンザウイルス粒子の平均粒子径は単一で変わらないことがわかった。また、EDC固定化インフルエンザウイルス粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。
H3N2亜型株(A/NY株)を元とするEDC固定化インフルエンザウイルス粒子の分子量分布を測定した。測定は、サイズ排除クロマトグラフィー(商品名:TSKgel G6000PWXL(TOSOH社製))を用いて行った(溶離液にはPBSを用いて、流速は0.5ml/minで行った)。その溶出パターンを表29に示す。スプリットインフル抗原は溶出時間16〜30分付近に四峰性のピークが認められた。一方、EDC固定化インフルエンザウイルス粒子は溶出時間16〜17分付近に単峰性のピークが認められた。
実施例5によって調製したEDC固定化インフルエンザウイルス粒子の固定化剤での架橋度を実施例2と同様の方法で分析した。A/NY株(H3N2亜型株)の結果を表30に示す。EDC濃度50mM、500mMで固定したEDC固定化インフルエンザウイルス粒子のM1タンパク質残存率(%)は、それぞれ85.7%、53.4%であり、EDC濃度が高まるにつれて架橋が促進され、M1タンパク質残存率が低下することがわかった。B/BR株(B型ビクトリア系統株)の結果を表31に示す。EDC濃度5mM、50mM、500mMで固定したEDC固定化インフルエンザウイルス粒子のM1タンパク質残存率(%)は、それぞれ85.1%、56.1%、27.2%であった。A/NY株(H3N2亜型株)と同様に、EDC濃度が高まるにつれて架橋が促進され、M1タンパク質残存率が低下することがわかった。
EDC固定化インフルエンザウイルス粒子における免疫原性を、マウスを用いて評価した。実施例4と同様の方法によって血清を得て、HI抗体価及び中和抗体価を測定した。代表として50mM及び500mMのEDC濃度にて、氷浴で2時間反応した後のEDC固定化インフルエンザウイルス粒子の免疫原性の結果を、表32(A/NY株のHI抗体価(GMT))、表33(A/NY株の中和抗体価(GMT))及び表34(B/BR株の中和抗体価(GMT))に示す。A/NY株(H3N2亜型株)、及びB/BR株(B型ビクトリア系統株)の場合、EDC固定化インフルエンザウイルス粒子はスプリットインフル抗原と比較し有意に高い免疫原性であった。
抗体サブクラス解析として、上記「6.免疫原性(マウス筋肉内接種)」で得られたマウスの血清中に含まれる、ウイルス抗原に特異的なIgG1及びIgG2a抗体価をELISA法によって測定した。その結果、スプリットインフル抗原とは対照的に、EDC固定化インフルエンザウイルス粒子は抗原特異的IgG1よりも抗原特異的IgG2aを誘導することが示された(表35、表36)。この結果から、EDC固定化インフルエンザウイルス粒子は、液性免疫を活性化するが細胞性免疫をほとんど活性化することができないスプリットインフル抗原に比べて、ワクチンの有効性のさらなる向上が期待できる。
EDC固定化インフルエンザウイルス粒子における免疫原性を、カニクイザルを用いて以下の手順で評価した。まず、カニクイザル(雄性又は雌性、29〜35ヶ月齢)に、スプリットインフル抗原、又はEDC固定化インフルエンザウイルス粒子をHA含量として15μgの接種量で皮下接種した(一群当たり8匹)。3週間隔で2回皮下接種し、2次免疫後4週間目に採血した。実施例2と同様の方法によって血清を得て、HI抗体価及び中和抗体価を測定した。代表として5mMのEDC濃度にて、4℃で20時間反応した後のEDC固定化インフルエンザウイルス粒子の免疫原性のHI抗体価(GMT)の結果を表37に示し、中和抗体価(GMT)の結果を表38に示す。A/CA株(H1N1亜型株)、及びA/NY株(H3N2亜型株)、B/MA株(B型山形系統)、B/BR株(B型ビクトリア系統株)において、EDC固定化インフルエンザウイルス粒子はスプリットインフル抗原と比較して有意に免疫原性が高かった。
実施例5によって調製したEDC固定化インフルエンザウイルス粒子の安定性を、苛酷試験の前後における架橋度の変化を指標として評価した。まず、実施例2と同様の方法によってM1タンパク質残存率(%)を算出し、さらに、苛酷試験前のM1タンパク質残存率を100%とした場合の、37℃、1週間の苛酷試験後のM1タンパク質残存率の割合を算出した。A/NY株(H3N2亜型株)の結果を表39に示す。不活化インフルエンザウイルス粒子の苛酷試験後のM1タンパク質残存率は、苛酷試験前に比べて24%上昇した。一方、EDC濃度50、500mMで固定したEDC固定化インフルエンザウイルス粒子の苛酷試験後のM1タンパク質残存率は、苛酷試験前に比べてそれぞれ18%減少し、不活化インフルエンザウイルス粒子よりも変化率が小さく、より安定であることが示唆された。
実施例5によって調製したEDC固定化インフルエンザウイルス粒子の安定性を、苛酷試験の前後におけるHA含量の変化を指標として評価した。まず、一元放射免疫拡散試験(生物学的製剤基準(日本国、厚生労働省告示 第192号))によってHA含量を算出し、さらに、苛酷試験前のHA含量を100%とした場合の、37℃、1週間の苛酷試験後のHA含量の変化率を算出した。A/CA株(H1N1亜型株)、及びA/NY株(H3N2亜型株)、B/MA株(B型山形系統)、B/BR株(B型ビクトリア系統株)の結果を表40に示す。EDC固定化インフルエンザウイルス粒子の苛酷試験後のHA含量の変化率は小さく、安定であることが示唆された。
実施例5によって調製したEDC固定化インフルエンザウイルス粒子の安定性を、5℃、11ヶ月保存の前後における架橋度の変化を指標として評価した。まず、実施例2と同様の方法によってM1タンパク質残存率(%)を算出し、さらに、5℃、11ヶ月保存前のM1タンパク質残存率を100%とした場合の、5℃、11ヶ月保存下でのM1タンパク質残存率の割合を算出した。A/CA株(H1N1亜型株)、及びA/NY株(H3N2亜型株)、B/MA株(B型山形系統)、B/BR株(B型ビクトリア系統株)の結果を表41に示す。EDC固定化インフルエンザウイルス粒子の5℃、11ヶ月保存下でのM1タンパク質残存率の変化率は小さく、安定であることが示唆された。
実施例5によって調製したEDC固定化インフルエンザウイルス粒子の安定性を、5℃、11ヶ月保存の前後におけるHA含量の変化を指標として評価した。まず、一元放射免疫拡散試験(生物学的製剤基準(日本国、厚生労働省告示 第192号))によってHA含量を算出し、さらに、5℃、11ヶ月保存前のHA含量を100%とした場合の、5℃、11ヶ月保存下でのHA含量の変化率を算出した。A/CA株(H1N1亜型株)、及びA/NY株(H3N2亜型株)、B/MA株(B型山形系統)、B/BR株(B型ビクトリア系統株)の結果を表42に示す。EDC固定化インフルエンザウイルス粒子の5℃、11ヶ月保存下でのHA含量の変化率は小さく、安定であることが示唆された。
実施例5によって調製したEDC固定化インフルエンザウイルス粒子の5℃、9ヶ月保存下での安定性を、マウス免疫原性(筋肉内接種)を用いて評価した。実施例4と同様の方法によって血清を得て、HI抗体価及び中和抗体価を測定した。代表として5mMのEDC濃度にて、4℃で20時間反応した後のEDC固定化インフルエンザウイルス粒子の免疫原性のHI抗体価(GMT)の結果を表43に示し、中和抗体価(GMT)の結果を表44に示す。A/CA株(H1N1亜型株)、及びA/NY株(H3N2亜型株)、B/MA株(B型山形系統)、B/BR株(B型ビクトリア系統株)において、EDC固定化インフルエンザウイルス粒子はスプリットインフル抗原と比較して免疫原性が高かった。
抗体サブクラス解析として、上記「13.5℃、9ヶ月保存下での安定性(マウス免疫原性(筋肉内接種))」で得られたマウスの血清中に含まれる、ウイルス抗原に特異的なIgG1及びIgG2a抗体価をELISA法によって測定した。その結果、5℃、9ヶ月保存後においても、スプリットインフル抗原とは対照的に、EDC固定化インフルエンザウイルス粒子は抗原特異的IgG1よりも抗原特異的IgG2aを誘導することが示された(表45)。この結果から、EDC固定化インフルエンザウイルス粒子が活性化させる細胞性免疫は5℃、9ヶ月保存後も維持されていることが期待できる。
実施例5によって調製したEDC固定化インフルエンザウイルス粒子の5℃、10ヶ月保存下での安定性を、カニクイザル免疫原性(皮下接種)を用いて評価した。まず、カニクイザル(雄性又は雌性、29〜35ヶ月齢)に、スプリットインフル抗原、EDC固定化インフルエンザウイルス粒子、及び不活化インフルエンザウイルス粒子をHA含量として15μgの接種量で皮下接種した(一群当たり8匹)。3週間隔で2回皮下接種し、2次免疫後4週間目に採血した。実施例2と同様の方法によって血清を得て、HI抗体価及び中和抗体価を測定した。代表として5mMのEDC濃度にて、4℃で20時間反応した後のEDC固定化インフルエンザウイルス粒子の5℃、10ヶ月保存下でのHI抗体価(GMT)の結果を表46に示し、中和抗体価(GMT)の結果を表47に示す(表46、表47は、それぞれ表37、表38の再掲)。A/CA株(H1N1亜型株)、及びA/NY株(H3N2亜型株)、B/MA株(B型山形系統)、B/BR株(B型ビクトリア系統株)において、EDC固定化インフルエンザウイルス粒子はスプリットインフル抗原と比較して有意に免疫原性が高かった。
実施例5によって調製したEDC固定化インフルエンザウイルス粒子のプロテアーゼ処理中の経時的なRNA放出量を評価した。まず、不活化インフルエンザウイルス粒子及びEDC固定化インフルエンザウイルス粒子をPBSで希釈し、SDSとProteinase Kを加えて55℃で反応させ、経時的にRNAを抽出した。RNA抽出には、TRIzol LS ReagentとPureLink RNA Mini Kit、PureLink DNase (invitrogen社製、商品名)を用いた。抽出したRNAの含有量は、Quant−iT RiboGreen RNA Reagent and Kit (invitrogen社製、商品名)で測定した。代表として、A/NY株(H3N2亜型株)の結果を表48に示す。その結果、不活化インフルエンザウイルス粒子に比べて、EDC固定化インフルエンザウイルス粒子のRNA放出が徐放化されていることが示された。
実施例5によって調製したEDC固定化インフルエンザウイルス粒子の炎症性サイトカインの経時的な産生量を評価した。方法は、欧州薬局方MONOCYTE−ACTIVATION TESTに準じた。具体的には、欧州薬局方MONOCYTE−ACTIVATION TESTにおけるヒトPBMCを最低4ドナー分プールして使用するところを、1ドナーに変更して測定した。A/NY株(H3N2亜型株)における、不活化インフルエンザウイルス粒子及びEDC固定化インフルエンザウイルス粒子のIL−1β産生量の経時的変化を表49に、IL−6産生量の経時的変化を表50に示す。また、B/BR株(B型ビクトリア系統株)における、不活化インフルエンザウイルス粒子及びEDC固定化インフルエンザウイルス粒子のIL−1β産生量の経時的変化を表51に、IL−6産生量の経時的変化を表52に示す。その結果、不活化インフルエンザウイルス粒子に比べて、EDC固定化インフルエンザウイルス粒子の炎症性サイトカイン産生が徐放化されていることが示された。つまり、EDC固定によって体内でのRNA放出が徐放化され、炎症性サイトカイン産生を遅延させることで、EDC固定化インフルエンザウイルス粒子が高い安全性を有していることが示唆された。
GA固定化日本脳炎ウイルス粒子の調製
1.グルタルアルデヒド処理(ウイルス粒子に対して粒子構造を固定化する工程)
Vero細胞培養日本脳炎ワクチン原薬(化学及血清療法研究所製、商品名「エンセバック」、0.08v/v%ホルマリンで不活化済の日本脳炎ウイルス粒子をタンパク質濃度で60〜90μg/ml含む。以下、「不活化日本脳炎ウイルス粒子」と記載することがある。)に対して、最終濃度が0.005〜0.02w/v%となるようにグルタルアルデヒドを添加し、4℃で3日間反応させた。反応終了後、PBS様溶液(賦活剤である乳糖(終濃度5w/v%)を添加したPBS)で、得られた反応液を透析した。透析によって、グルタルアルデヒドを除くことで、固定化日本脳炎ウイルス粒子(以下、「GA固定化日本脳炎ウイルス粒子」と記載することがある。)を得た。得られたGA固定化日本脳炎ウイルス粒子の発熱活性を、ウサギ3羽における発熱反応の和で評価する発熱試験、ヒトPBMCを刺激した場合の炎症性サイトカインの産生量の定量によって評価した。
実施例1と同様の方法によって、発熱試験を行った。GA固定化日本脳炎ウイルス粒子又は不活化日本脳炎ウイルス粒子を生理食塩水で希釈し、1mL中のタンパク質含量を70μgとしたものを試料とした。上記試料を、体重1kg当たりにつき3mLをウサギに接種して、6時間後まで発熱の上昇を観察した。ウサギ3羽の発熱反応の和(℃)を表53に示す。代表として、0.01w/v%のグルタルアルデヒド濃度で4℃、3日間反応後のGA固定化日本脳炎ウイルス粒子を評価した。
欧州薬局方MONOCYTE−ACTIVATION TESTに準じた方法で、GA固定化日本脳炎ウイルス粒子又は不活化日本脳炎ウイルス粒子でヒトPBMCを刺激した場合のサイトカイン(IL−1β及びIL−6)の産生量を定量した。具体的には、欧州薬局方MONOCYTE−ACTIVATION TESTにおけるヒトPBMCを最低4ドナー分プールして使用するところを、1ドナー分に変更して測定した。その結果を表54に示す。GA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子よりも炎症性サイトカインの産生量が十分低いことがわかった。このことからも、GA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子よりも高い安全性を有することが示唆された。
物性評価
上記実施例7で得られたGA固定化日本脳炎ウイルス粒子の物性を以下の方法で評価した。
GA固定化日本脳炎ウイルス粒子の形状を詳細に調べるために、実施例2と同様の方法で、電子顕微鏡による観察を実施した。代表として、0.01w/v%のグルタルアルデヒド濃度で4℃、3日間反応後のGA固定化日本脳炎ウイルス粒子を撮影した写真を図4示す。GA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、グルタルアルデヒドで固定することで不活化日本脳炎ウイルス粒子と同様に粒子構造が保たれていた。
GA固定化日本脳炎ウイルス粒子の平均粒子径を、Zetasizer Nano ZS(Malvern社製)を用いて解析した。動的光散乱法による液体中の平均粒子径を表55に示す。GA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、平均粒子径が約90nmで単峰性であった。一方、不活化日本脳炎ウイルス粒子は、約80nmで単峰性であった。また、GA固定化日本脳炎ウイルス粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。
GA固定化日本脳炎ウイルス粒子の分子量分布を測定した。測定は、サイズ排除クロマトグラフィー(商品名:Superose 6 10/300 GE(GEヘルスケア社製))を用いて行った(溶離液にはPBSを用いて、流速は0.5ml/minで行った)。その溶出パターンを表56に示す。GA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、溶出時間14〜15分付近に単峰性の主ピークが認められた。また、不活化日本脳炎ウイルス粒子も溶出時間14〜15分付近に単峰性の主ピークが認められた。
抗日本脳炎ウイルス抗体を用いたサンドイッチELISA法によって、抗原の含有量(抗原含量)を以下の手順で測定した。検体中に含まれるE抗原は、抗日本脳炎ウイルスウサギIgG(一次抗体;ポリクローナル抗体)が結合したマイクロプレートに捕捉される。その後、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ(HRP)を結合した抗日本脳炎ウイルスEタンパク質モノクローナル抗体(二次抗体;モノクローナル抗体)を反応させることで、プレートに結合した抗E抗原抗体/E抗原/二次抗体の複合体が形成される。反応せず残った試薬及び検体を洗浄によって除去し、酵素基質液(o−フェニレンジアミン溶液:OPD溶液)と反応させるとE抗原複合体上のHRPが反応し、発色が起きる。OPDの発色の強度は、複合体の量(E抗原量を反映)に比例することを利用し、E抗原含量(抗原含量)を測定した。
実施例7で調製したGA固定化日本脳炎ウイルス粒子について、比活性(抗原含量/タンパク質含量)により、固定化剤での架橋度を評価した。具体的には、抗原含量の測定に使用するモノクローナル抗体(503)は、中和エピトープを認識しており、中和エピトープの構造変化が起こると比活性が低下する。固定化を行っていない不活化日本脳炎ウイルス粒子の比活性に対する、各グルタルアルデヒド濃度で処理したGA固定化日本脳炎ウイルス粒子の比活性の相対値(%)(以下、この相対値を「503抗体反応率」(%)と記載することがある。)を算出した。結果を表58に示す。グルタルアルデヒド濃度0.005w/v%、0.01w/v%、0.02w/v%で固定したGA固定化日本脳炎ウイルス粒子の503抗体反応率は、それぞれ95.1%、74.7%、55.2%であり、グルタルアルデヒド濃度が高まるにつれて架橋が促進され、503抗体エピトープの構造変化による反応率の低下が示唆された。
ddYマウス(雌性、4週齢)に、代表として、0.005若しくは0.01w/v%のグルタルアルデヒド濃度で4℃、3日間反応後のGA固定化日本脳炎ウイルス粒子又は不活化日本脳炎ウイルス粒子を1μg又は0.25μgの接種量で腹腔内接種した(一群当たり10匹)。免疫1週間後に再度免疫し、その1週間後にマウスを全採血し、安楽死させた。遠心分離によって血清を得て、群毎に等量ずつプールし、中和抗体価を「病原体検出マニュアル」(国立感染症研究所編)に従って、測定した。50%プラック減少率から算出した結果を表59に示す。GA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子と比較して同等又はそれ以上の中和抗体価であった。
最終タンパク質濃度が8μg/mLとなるように、PBS様溶液でGA固定化日本脳炎ウイルス粒子及び不活化日本脳炎ウイルス粒子を希釈した。抗原含量を指標に、25℃での保存安定性を評価した。代表として、0.01w/v%のグルタルアルデヒド濃度で4℃、3日間反応後のGA固定化日本脳炎ウイルス粒子又は不活化日本脳炎ウイルス粒子の結果を表60に示す。GA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、25℃保存下では1ヶ月間維持された。一方、不活化日本脳炎ウイルス粒子は、25℃保存下では低下を示した。GA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子と比較し安定性が向上することが示された。
最終タンパク質濃度が8μg/mLとなるように、PBS様溶液でGA固定化日本脳炎ウイルス粒子及び不活化日本脳炎ウイルス粒子を希釈した。Zetasizer Nano ZSを用いた動的光散乱法による液体中の平均粒子径を指標に、25℃での保存安定性を評価した。代表として、0.01w/v%のグルタルアルデヒド濃度で4℃、3日間反応後のGA固定化日本脳炎ウイルス粒子又は不活化日本脳炎ウイルス粒子の結果を表61に示す。GA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、25℃保存下では1ヶ月間維持された。一方、不活化日本脳炎ウイルス粒子は、25℃保存下では増加を示した。これにより、GA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子と比較し安定性が向上することが示された。
最終タンパク質濃度が8μg/mLとなるように、PBS様溶液でGA固定化日本脳炎ウイルス粒子及び不活化日本脳炎ウイルス粒子を希釈した。マウスでの免疫原性(中和抗体価)を指標に、4℃での保存安定性を評価した。代表として、0.01w/v%のグルタルアルデヒド濃度で4℃、15ヶ月間反応後のGA固定化日本脳炎ウイルス粒子又は不活化日本脳炎ウイルス粒子の結果を表62に示す。0ヶ月と15ヶ月後で投与量が異なるものの、GA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、4℃保存下では15ヶ月間維持されることが推察された。一方、不活化日本脳炎ウイルス粒子は、4℃保存下では低下することが推察された。GA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子と比較して、安定性が向上することが推察された。
FA固定化日本脳炎ウイルス粒子の調製
1.ホルマリン処理(ウイルス粒子に対して粒子構造を固定化する工程)
不活化日本脳炎ウイルス粒子に対して、最終濃度が0.014〜0.04v/v%(ホルムアルデヒド換算で、0.005〜0.015w/v%)となるようにホルマリン(36〜38w/v%ホルムアルデヒド水溶液)を添加し、25℃で1週間反応させた。反応終了後、PBS様溶液で反応液を透析し、ホルマリンを除くことで、固定化日本脳炎ウイルス粒子(以下、「FA固定化日本脳炎ウイルス粒子」と記載することがある。)を得た。得られたFA固定化日本脳炎ウイルス粒子の発熱活性を、ヒトPBMCを刺激した場合の炎症性サイトカインの産生量の定量によって評価した。
欧州薬局方MONOCYTE−ACTIVATION TESTに準じた方法で、FA固定化日本脳炎ウイルス粒子又は不活化日本脳炎ウイルス粒子でヒトPBMCを刺激した場合のサイトカイン(IL−1β及びIL−6)の産生量を定量した。具体的には、欧州薬局方MONOCYTE−ACTIVATION TESTにおけるヒトPBMCを最低4ドナー分プールして使用するところを、1ドナー分に変更して測定した。その結果を表63に示す。FA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子よりも炎症性サイトカインの産生量が十分低いことがわかった。このことからも、FA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子よりも高い安全性を有することが示唆された。
物性評価
上記実施例9で得られたFA固定化日本脳炎ウイルス粒子の物性を以下の方法で評価した。
FA固定化日本脳炎ウイルス粒子の形状を詳細に調べるために、実施例2と同様の方法で、電子顕微鏡による観察を実施した。代表として、0.014v/v%のホルマリン濃度で25℃、1週間反応後のFA固定化日本脳炎ウイルス粒子を撮影した写真を示す(図5)。FA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、ホルマリンで固定することで不活化日本脳炎ウイルス粒子と同様に粒子構造が保たれていた。
FA固定化日本脳炎ウイルス粒子の平均粒子径を、Zetasizer Nano ZS(Malvern社製)を用いて解析した。動的光散乱法による液体中の平均粒子径を表64に示す。FA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、平均粒子径が約90nmで単峰性であった。一方、不活化日本脳炎ウイルス粒子は、約80nmで単峰性であった。また、FA固定化日本脳炎ウイルス粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。
FA固定化日本脳炎ウイルス粒子の分子量分布を実施例8と同様の方法(SEC)で測定した。溶出パターンを表65に示す。FA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、溶出時間14〜15分付近に単峰性の主ピークが認められた。また、不活化日本脳炎ウイルス粒子も溶出時間14〜15分付近に単峰性の主ピークが認められた。
抗日本脳炎ウイルス抗体を用いたサンドイッチELISA法によって、抗原の含有量(抗原含量)を実施例8と同様の方法で測定した。
実施例8と同様の方法で、代表として、0.02v/v%のホルマリン濃度で25℃、1週間反応後のFA固定化日本脳炎ウイルス粒子の中和抗体価を測定した。50%プラック減少率から算出した結果を表67に示す。FA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子と比較して同等又はそれ以上の中和抗体価であった。
最終タンパク質濃度が8μg/mLとなるようにPBS様溶液で、FA固定化日本脳炎ウイルス粒子及び不活化日本脳炎ウイルス粒子を希釈した。抗原含量を指標に、37℃での保存安定性を評価した。代表として、0.014v/v%のホルマリン濃度で25℃、1週間反応後の結果を表68に示す。FA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、37℃保存下では1週間維持された。一方、不活化日本脳炎ウイルス粒子は、37℃保存下では低下を示した。FA固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子と比較し安定性が向上することが示された。
EDC固定化日本脳炎ウイルス粒子の調製
1.1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)処理
不活化日本脳炎ウイルス粒子に対して、最終濃度が0.15〜15mMとなるようにEDCを添加し、4℃で2〜20時間反応させた。クエンチング処理を行う場合には、さらにクエンチング剤としてグリシンを、EDCの8倍量(モル質量比)で反応液に添加した。反応終了後、PBS様溶液で反応液を透析し、EDC及びグリシンを除くことで、固定化日本脳炎ウイルス粒子(以下、「EDC固定化日本脳炎ウイルス粒子」と記載することがある。)を得た。得られたEDC固定化日本脳炎ウイルス粒子の発熱活性を、ヒトPBMCを刺激した場合の炎症性サイトカインの産生量の定量によって評価した。
欧州薬局方MONOCYTE−ACTIVATION TESTに準じた方法で、代表として、0.15mM又は1.5mMのEDC濃度で4℃、20時間反応後のEDC固定化日本脳炎ウイルス粒子又は不活化日本脳炎ウイルス粒子でヒトPBMCを刺激した場合のサイトカイン(IL−1β及びIL−6)の産生量を定量した。具体的には、欧州薬局方MONOCYTE−ACTIVATION TESTにおけるヒトPBMCを最低4ドナー分プールして使用するところを、1ドナー分に変更して測定した。その結果を表69に示す。EDC固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子よりも炎症性サイトカイン産生量が十分低いことがわかった。このことからも、EDC固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子よりも高い安全性を有することが示唆された。
物性評価
上記実施例11で得られたEDC固定化日本脳炎ウイルス粒子の物性を以下の方法で評価した。
EDC固定化日本脳炎ウイルス粒子の形状を詳細に調べるために、実施例2と同様の方法で、電子顕微鏡による観察を実施した。代表として、1.5mMのEDC濃度で4℃、20時間反応後のEDC固定化日本脳炎ウイルス粒子を撮影した写真を図6に示す。EDC固定化日本脳炎ウイルス粒子は、EDCで固定することで不活化日本脳炎ウイルス粒子と同様に粒子構造が保たれていた。
EDC固定化日本脳炎ウイルス粒子の平均粒子径を、Zetasizer Nano ZS(Malvern社製)を用いて解析した。動的光散乱法による液体中の平均粒子径を表70に示す。EDC固定化日本脳炎ウイルス粒子は、平均粒子径が約90nmで単峰性であった。一方、不活化日本脳炎ウイルス粒子は、約80nmで単峰性であった。また、EDC固定化日本脳炎ウイルス粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。
EDC固定化日本脳炎ウイルス粒子の分子量分布を実施例8と同様の方法で測定した。溶出パターンを表71に示す。EDC固定化日本脳炎ウイルス粒子は、溶出時間14〜15分付近に単峰性の主ピークが認められた。また、不活化日本脳炎ウイルス粒子も溶出時間14〜15分付近に単峰性の主ピークが認められた。
抗日本脳炎ウイルス抗体を用いたサンドイッチELISA法によって、抗原の含有量(抗原含量)を実施例8と同様の方法で測定した。代表として、1.5mMのEDC濃度で4℃、20時間反応後のEDC固定化日本脳炎ウイルス粒子、及び、不活化日本脳炎ウイルス粒子それぞれの抗原含有量を表72に示す。EDC固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子と同等の抗原が含まれていた。
実施例8と同様の方法で、EDC固定化日本脳炎ウイルス粒子の中和抗体価を測定した。50%プラック減少率から算出した結果を表73に示す。代表として、1.5mMのEDC濃度で4℃で2時間反応後にクエンチング剤としてグリシンを、EDCの8倍量(モル質量比)で反応液に添加したEDC固定化日本脳炎ウイルス粒子を評価したところ、不活化日本脳炎ウイルス粒子と比較して同等又はそれ以上の中和抗体価であった。
最終タンパク質濃度が8μg/mLとなるようにPBS様溶液で、EDC固定化日本脳炎ウイルス粒子及び不活化日本脳炎ウイルス粒子を希釈した。抗原含量を指標に、25℃、37℃での保存安定性を評価した。結果を表74、表75に示す。EDC固定化日本脳炎ウイルス粒子は、25℃保存下では1ヶ月間及び37℃保存下では1週間維持された。一方、不活化日本脳炎ウイルス粒子は、25℃保存下、37℃保存下のいずれにおいても、抗原含量の低下を示した。EDC固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子と比較して安定性が向上することが示された。
Claims (31)
- 固定化ウイルス粒子を含むワクチンであって、
前記固定化ウイルス粒子の発熱試験におけるウサギ3羽での発熱反応の和が、前記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子におけるウサギ3羽での発熱反応の和を基準として、80%未満である、ワクチン。 - 前記固定化ウイルス粒子の発熱試験におけるウサギ3羽での発熱反応の和が、1.3℃以下である、請求項1に記載のワクチン。
- 固定化ウイルス粒子を含むワクチンであって、
前記固定化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの量が、前記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの量を基準として、80%未満である、ワクチン。 - 前記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子が、オルソミクソウイルス粒子、フラビウイルス粒子、又はピコルナウイルス粒子を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子、日本脳炎ウイルス粒子、又はA型肝炎ウイルス粒子を含む、請求項4に記載のワクチン。
- 前記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子を含む、請求項5に記載のワクチン。
- 前記インフルエンザウイルス粒子が、A型インフルエンザウイルス粒子、又はB型インフルエンザウイルス粒子を含む、請求項6に記載のワクチン。
- 前記インフルエンザウイルス粒子が、H1N1亜型株、H2N2亜型株、H3N2亜型株、H3N8亜型株、H5N1亜型株、H5N2亜型株、H5N6亜型株、H6N1亜型株、H7N3亜型株、H7N7亜型株、H7N9亜型株、H9N2亜型株、又はH10N8亜型株に分類されるインフルエンザウイルス粒子を含む、請求項6又は7に記載のワクチン。
- 前記ウイルス粒子が、日本脳炎ウイルス粒子を含む、請求項5に記載のワクチン。
- 前記日本脳炎ウイルス粒子が、北京−1株、中山株、SA14−14−2株、又はP3株を含む、請求項9に記載のワクチン。
- 前記固定化ウイルス粒子の表面のタンパク質の0%〜90%が、固定化されていない、請求項1〜10のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子の比活性(抗原含量/タンパク質含量)に対する、前記固定化ウイルス粒子の比活性の相対値が、0〜95%である、請求項1〜11のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記固定化ウイルス粒子が、前記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子の粒子径の80%〜150%の平均粒子径を有する、請求項1〜12のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記固定化ウイルス粒子をショ糖密度勾配遠心で測定した場合に、ショ糖濃度35%以上にピークが検出される、請求項1〜13のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記固定化ウイルス粒子を高速液体クロマトグラフィーで測定した場合に、単峰性のピークが認められる、請求項1〜14のいずれか一項に記載のワクチン。
- マウスに免疫した場合、前記固定化ウイルス粒子に特異的なIgG1よりも、前記固定化ウイルス粒子に特異的なIgG2aを誘導する、請求項1〜15のいずれか一項に記載のワクチン。
- 元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子を含む懸濁液に固定化剤を加える工程を含む、固定化ウイルス粒子の製造方法。
- 前記固定化剤が、アルデヒド類を含む、請求項17に記載の製造方法。
- 前記アルデヒド類が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項18に記載の製造方法。
- 前記アルデヒド類が、ホルムアルデヒドを含む、請求項19に記載の製造方法。
- 前記ホルムアルデヒドの濃度が、前記懸濁液及び前記固定化剤の全量を基準として、0.005〜0.5w/v%である、請求項20に記載の製造方法。
- 前記アルデヒド類が、グルタルアルデヒドを含む、請求項19に記載の製造方法。
- 前記グルタルアルデヒドの濃度が、前記懸濁液及び前記固定化剤の全量を基準として、0.001〜0.06w/v%である、請求項22に記載の製造方法。
- 前記固定化剤が、カルボジイミド類を含む、請求項19に記載の製造方法。
- 前記カルボジイミド類が、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩、それらの類縁体及び、それらの組合せからなる群から選択される、請求項24に記載の製造方法。
- 前記カルボジイミド類が、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩を含む、請求項25に記載の製造方法。
- 前記1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩の濃度が、前記懸濁液及び前記固定化剤の全量を基準として、0.05〜1500mMである、請求項26に記載の製造方法。
- 元となる前記ウイルス粒子が、培養細胞、鶏卵又はマウス脳に感染させて、回収されたウイルス粒子である、請求項17〜27のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記培養細胞が、初代細胞、又は株化細胞を含む、請求項28に記載の製造方法。
- 前記培養細胞が、Vero細胞、又はMDCK細胞を含む、請求項29に記載の製造方法。
- 請求項17〜30のいずれか一項に記載の製造方法によって得られた固定化ウイルス粒子を加える工程を含む、ワクチンの製造方法。
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