JP4642114B2 - 沈降不活化インフルエンザワクチンおよびその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、沈降不活化全粒子インフルエンザワクチンおよびその製造方法に関する。
インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルス科に属する直径約１００ｎｍの粒子サイズを有するＲＮＡエンベロープウイルスであり、内部タンパクの抗原性に基づいて、Ａ、ＢおよびＣ型に分けられる。インフルエンザウイルスは、脂質二重層構造を有するウイルスエンベロープに取り囲まれた内部ヌクレオキャプシドまたは核タンパク質と会合したリボ核酸（ＲＮＡ）のコアと、外部糖タンパク質からなる。ウイルスエンベロープの内層は、主としてマトリックスタンパク質で構成され、外層は大部分が宿主由来脂質物質で構成される。インフルエンザウイルスのＲＮＡは、分節構造をとる。世界中で大流行するインフルエンザは、Ａ型インフルエンザウイルスによるものである。Ａ型は、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）の２種類のエンベロープ糖タンパク質を有し、抗原性の違いによってＨＡでは１６種、ＮＡでは９種の亜型に区別されている。
Ａ型インフルエンザウイルスは、ヒト以外にトリ、ブタ、ウマ等の動物間にも分布するので、ヒトと動物のウイルス間で遺伝子の組換えが起こり、その結果新しい抗原性を有する亜型ウイルス（新型ウイルス）が出現すること、およびこの新型ウイルスが免疫をもたないヒトの集団に大流行をもたらすことが解明されてきた。これまで、スペインインフルエンザ（Ｈｓｗ１Ｎ１）、アジアインフルエンザ（Ｈ２Ｎ２）、香港インフルエンザ（Ｈ３Ｎ２）の流行が知られている。近年、東南アジアを中心としてＨ５Ｎ１亜型の高病原性トリインフルエンザの発生、流行が観測され、これまでに１．５億羽以上の大量の家禽が死滅もしくは淘汰された。さらに、ヒトへの感染例も報告され、２００６年９月現在において確定されただけでも２４６名を数えている。脅威とされるのはその致死率であり、２４６名中１４４名が死亡している。通常、トリインフルエンザウイルスはヒトへは容易に感染しないとされており、基本的にはその性質は変わっていない。しかし、ウイルスが変異によってヒトに対する易感染性を獲得し、ヒトで大流行した場合、未曾有の惨事となるであろう。かかる大流行に向けて、新型インフルエンザワクチンの開発は焦眉の課題である。しかし、１９９７年に香港において初めてヒトにおける感染例が報告されて以来、ワクチン開発が急務と叫ばれながらも容易に進捗しなかった。その最大の原因は、Ｈ５Ｎ１亜型トリインフルエンザウイルスの免疫原性が低いため、従来のインフルエンザワクチンでは十分なワクチン効果を接種者に賦与できない点にある。したがって、免疫原性を高める何らかの方策が必要であった。
インフルエンザワクチンは大きく二つに大別される。一つは、現在利用されているインフルエンザワクチンは、精製ウイルス粒子を脂質エンベロープが可溶化されるように有機溶媒／界面活性剤もしくは他の試薬で分解されたサブビリオンを含むスプリットワクチン（split vaccine）、または精製ＨＡおよびＮＡを含むサブユニットワクチンであり、主として筋肉内、あるいは皮下に投与される。もう一方は、精製されたウイルス粒子をホルマリンなどの薬剤で化学的に不活化したワクチンで、全粒子ワクチンと呼ばれる。この場合、ウイルス遺伝子もしくはウイルスたん白質が化学修飾されることによって感染性を消失するだけであるため、ウイルスは粒子形を保ったままでワクチン抗原となる。全粒子ワクチンは、スプリットワクチンと比較して免疫原性が高いとされ、特に感染を未だ経験したことのない、すなわち免疫記憶を持たないナイーブな個体に対して良好な免疫応答を惹起することが出来る。新型インフルエンザに対してヒトは免疫記憶を有していないので、全粒子ワクチンのこの特徴は有効性の観点から好ましい。しかし、全粒子ワクチンの免疫原性が高い特性はその生物活性が高いことを意味し、接種された際の局所における腫脹、発赤、あるいは発熱などの副反応とも密接に関連している。すなわち、全粒子ワクチンの高い免疫原性を生かしつつ、その副反応を低減させることができる何らかの方法が確立することができれば、有効で安全性の高いワクチンが開発できるものと考えられた。
新型インフルエンザに対するワクチンの剤形として、高い免疫原性を有する全粒子ワクチンが期待された。しかしながらＨ５Ｎ１亜型の場合、この全粒子ワクチンをもってしても、ヒトにおいて良好な免疫応答を惹起できないことが報告され、さらなる免疫原性を向上させる方策が必要となった。
アジュバントは抗原の免疫原性を高めるためにワクチンに添加される免疫増強剤であり、これまでに多くの物質が検討されている。例えば、インフルエンザワクチンの有効性を高めるため、アルミニウムアジュバントの併用も検討されている（特許文献７）。また、ポリオキシエチレンエーテル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標））等の非イオン性界面活性剤を粘膜投与用ワクチンのアジュバントとして使用することも知られている（特許文献８）。
アジュバントとしてはいくつかの候補が上げられるが、ＤＰＴワクチンやＢ型肝炎ワクチンに添加され、長年にわたって広く安全性が認められているアルミアジュバントが最も広く検討されている。アルミアジュバントは免疫賦活作用を有すると共に、抗原を吸着させることにより少量の抗原を局所に留めておく、いわゆるデポジット効果を有しているため、ワクチンの抗原量を低減できるという優れた特性がある。全人類が接種対象となるパンデミックワクチンの場合、ワクチンをいかに多くの人に供給できるかは大きな命題であり、この特性はワクチンの設計上の大きな利点である。したがって、アルミアジュバントをワクチンとして使用するとすれば、抗原のアルミゲルへの吸着性は極めて重要な因子となる。
ＷＯ９１／０３５５２
ＷＯ０１／００４３３３
ＷＯ００／０６００５０
ＷＯ２００１／０８３７９４
ＷＯ２００２／０６７９８３
ＷＯ２００２／０７４３３６
ＷＯ００／０１５２５１
ＷＯ９９／５２５４９
本発明の目的は、新型インフルエンザウイルス、特に免疫原性が低い新型ウイルスに対しても、少ない抗原量で有効かつ副作用反応の少ない沈降不活化全粒子インフルエンザワクチンおよびその製造方法を提供することにある。
本発明者らは、上記問題点に鑑み、鋭意検討した結果、ヒトに対して免疫原性を高め、副作用の少ないアジュバントを不活化ウイルス全粒子と組合せることにより、上記目的を達成しうることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
〔１〕炭酸ナトリウムと硫酸アルミニウムカリウムから調製された水酸化アルミニウムゲル及びインフルエンザウイルス全粒子を有効成分として含有する沈降不活化インフルエンザワクチン。
〔２〕インフルエンザウイルス全粒子が界面活性剤及びエーテル類の非存在下にウイルス浮遊液から精製されたものである、〔１〕記載のワクチン。
〔３〕下記の性状を有する〔１〕又は〔２〕に記載のワクチン：
（１）水酸化アルミニウムゲルに対するインフルエンザウイルス全粒子の吸着率が９０％以上である、及び
（２）総ヘマグルチニン活性に対するインフルエンザウイルス全粒子のヘマグルチニン活性が８０％以上である。
〔４〕アルミニウム濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ以上０．８ｍｇ／ｍＬ未満であり、インフルエンザウイルス全粒子の濃度が３．４〜１００μｇ ＨＡ／ｍＬである、〔１〕ないし〔３〕の何れか一項記載のワクチン。
〔５〕水酸化アルミニウムゲルと混合する前のウイルス原液中のインフルエンザウイルスが下記の性状を有する、〔１〕ないし〔４〕の何れか一項記載のワクチン：
（i）ウイルス原液を分析的ショ糖密度勾配遠心法で分析したときに、総ヘマグルチニン活性の８０％以上がウイルス粒子画分に集積する、及び
（ii）ウイルス原液をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに供したときに、２８０ｎｍの吸光スペクトルがショルダーのない単一のピークである。
〔６〕水酸化アルミニウムゲルと混合する前のウイルス原液中のインフルエンザウイルスが、ウイルス原液を２００００〜３００００倍の倍率の電子顕微鏡下で観察したときに、ウイルスの８０％以上が完全な粒子形態を保持している〔１〕ないし〔５〕の何れか一項記載のワクチン。
〔７〕インフルエンザウイルスが、Ｈ２及びＨ４〜１６から選ばれる型とＮ１〜９から選ばれる型との組合せからなる亜型である〔１〕ないし〔６〕の何れか一項記載のワクチン。
〔８〕インフルエンザウイルス全粒子を有効成分として含有する沈降不活化インフルエンザワクチンの製造方法であって、界面活性剤及びエーテル類を含有しない溶媒を用いて下記（１）〜（５）の工程を行うことを特徴とする前記製造方法：
（１）インフルエンザウイルスを培養してウイルス浮遊液を調製する工程、
（２）前記ウイルス浮遊液を濾過又は遠心分離により精製する工程、
（３）前記精製したウイルス液をホルマリンで不活化する工程、
（４）前記不活化したウイルス液を濾過してウイルス原液を調製する工程、及び
（５）前記ウイルス原液中のインフルエンザウイルスを水酸化アルミニウムゲルに吸着させる工程。
〔９〕水酸化アルミニウムゲルが炭酸ナトリウムと硫酸アルミニウムカリウムから調製されたものである、〔８〕記載の製造方法。
〔１０〕インフルエンザウイルスが、Ｈ２及びＨ４〜１６から選ばれる型とＮ１〜９から選ばれる型との組合せからなる亜型である〔８〕又は〔９〕の何れか記載の製造方法。
〔１１〕炭酸ナトリウムと硫酸アルミニウムカリウムから調製された水酸化アルミニウムゲル及びインフルエンザウイルス全粒子を有効成分として含有する沈降不活化インフルエンザワクチンの有効量を対象に投与することを含む、インフルエンザの予防または軽減方法。
〔１２〕インフルエンザウイルス全粒子が界面活性剤及びエーテル類の非存在下にウイルス浮遊液から精製されたものである、〔１１〕記載の方法。
〔１３〕下記の性状を有する〔１１〕または〔１２〕に記載の方法：
（１）水酸化アルミニウムゲルに対するインフルエンザウイルス全粒子の吸着率が９０％以上である、及び
（２）総ヘマグルチニン活性が８０％以上である。
〔１４〕アルミニウム濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ以上０．８ｍｇ／ｍＬ未満であり、インフルエンザウイルス全粒子の濃度が３．４〜１００μｇ ＨＡ／ｍＬである、〔１１〕ないし〔１３〕の何れか一項記載の方法。
〔１５〕水酸化アルミニウムゲルと混合する前のウイルス原液中のインフルエンザウイルスが下記の性状を有する、〔１１〕ないし〔１４〕の何れか一項記載の方法：
（i）ウイルス原液を分析的ショ糖密度勾配遠心法で分析したときに、総ヘマグルチニン活性の８０％以上がウイルス粒子画分に集積する、及び
（ii）ウイルス原液をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに供した時に、２８０ｎｍの吸光スペクトルがショルダーのない単一のピークである。
〔１６〕水酸化アルミニウムゲルと混合する前のウイルス原液中のインフルエンザウイルスが、ウイルス原液を２００００〜３００００倍の倍率の電子顕微鏡下で観察したときに、ウイルスの８０％以上が完全な粒子形態を保持している〔１１〕ないし〔１５〕の何れか一項記載の方法。
〔１７〕インフルエンザウイルスが、Ｈ２およびＨ４〜１６から選ばれる型とＮ１〜９から選ばれる型との組み合わせからなる亜型である〔１１〕ないし〔１６〕の何れか一項記載の方法。
〔１８〕沈降不活化インフルエンザワクチンの製造のための、炭酸ナトリウムと硫酸アルミニウムカリウムから調製された水酸化アルミニウムゲル及びインフルエンザウイルス全粒子の使用。
〔１９〕インフルエンザウイルス全粒子が界面活性剤及びエーテル類の非存在下にウイルス浮遊液から精製されたものである、〔１８〕記載の使用。
〔２０〕下記の性状を有する〔１８〕または〔１９〕に記載の使用：
（１）水酸化アルミニウムゲルに対するインフルエンザウイルス全粒子の吸着率が９０％以上である、及び
（２）総ヘマグルチニン活性が８０％以上である。
〔２１〕アルミニウム濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ以上０．８ｍｇ／ｍＬ未満であり、インフルエンザウイルス全粒子の濃度が３．４〜１００μｇ ＨＡ／ｍＬである、〔１８〕ないし〔２０〕の何れか一項記載の使用。
〔２２〕水酸化アルミニウムゲルと混合する前のウイルス原液中のインフルエンザウイルスが下記の性状を有する、〔１８〕ないし〔２１〕の何れか一項記載の使用：
（i）ウイルス原液を分析的ショ糖密度勾配遠心法で分析したときに、総ヘマグルチニン活性の８０％以上がウイルス粒子画分に集積する、及び
（ii）ウイルス原液をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに供した時に、２８０ｎｍの吸光スペクトルがショルダーのない単一のピークである。
〔２３〕水酸化アルミニウムゲルと混合する前のウイルス原液中のインフルエンザウイルスが、ウイルス原液を２００００〜３００００倍の倍率の電子顕微鏡下で観察したときに、ウイルスの８０％以上が完全な粒子形態を保持している〔１８〕ないし〔２２〕の何れか一項記載の使用。
〔２４〕インフルエンザウイルスが、Ｈ２およびＨ４〜１６から選ばれる型とＮ１〜９から選ばれる型との組み合わせからなる亜型である〔１８〕ないし〔２３〕の何れか一項記載の使用。
〔２５〕前記〔１〕ないし〔７〕の何れか一項に記載の沈降不活化インフルエンザワクチン、および当該ワクチンをインフルエンザの予防または軽減のために使用し得るか、または使用すべきであることを記載した書類を含む商業的パッケージ。
〔２〕インフルエンザウイルス全粒子が界面活性剤及びエーテル類の非存在下にウイルス浮遊液から精製されたものである、〔１〕記載のワクチン。
〔３〕下記の性状を有する〔１〕又は〔２〕に記載のワクチン：
（１）水酸化アルミニウムゲルに対するインフルエンザウイルス全粒子の吸着率が９０％以上である、及び
（２）総ヘマグルチニン活性に対するインフルエンザウイルス全粒子のヘマグルチニン活性が８０％以上である。
〔４〕アルミニウム濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ以上０．８ｍｇ／ｍＬ未満であり、インフルエンザウイルス全粒子の濃度が３．４〜１００μｇ ＨＡ／ｍＬである、〔１〕ないし〔３〕の何れか一項記載のワクチン。
〔５〕水酸化アルミニウムゲルと混合する前のウイルス原液中のインフルエンザウイルスが下記の性状を有する、〔１〕ないし〔４〕の何れか一項記載のワクチン：
（i）ウイルス原液を分析的ショ糖密度勾配遠心法で分析したときに、総ヘマグルチニン活性の８０％以上がウイルス粒子画分に集積する、及び
（ii）ウイルス原液をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに供したときに、２８０ｎｍの吸光スペクトルがショルダーのない単一のピークである。
〔６〕水酸化アルミニウムゲルと混合する前のウイルス原液中のインフルエンザウイルスが、ウイルス原液を２００００〜３００００倍の倍率の電子顕微鏡下で観察したときに、ウイルスの８０％以上が完全な粒子形態を保持している〔１〕ないし〔５〕の何れか一項記載のワクチン。
〔７〕インフルエンザウイルスが、Ｈ２及びＨ４〜１６から選ばれる型とＮ１〜９から選ばれる型との組合せからなる亜型である〔１〕ないし〔６〕の何れか一項記載のワクチン。
〔８〕インフルエンザウイルス全粒子を有効成分として含有する沈降不活化インフルエンザワクチンの製造方法であって、界面活性剤及びエーテル類を含有しない溶媒を用いて下記（１）〜（５）の工程を行うことを特徴とする前記製造方法：
（１）インフルエンザウイルスを培養してウイルス浮遊液を調製する工程、
（２）前記ウイルス浮遊液を濾過又は遠心分離により精製する工程、
（３）前記精製したウイルス液をホルマリンで不活化する工程、
（４）前記不活化したウイルス液を濾過してウイルス原液を調製する工程、及び
（５）前記ウイルス原液中のインフルエンザウイルスを水酸化アルミニウムゲルに吸着させる工程。
〔９〕水酸化アルミニウムゲルが炭酸ナトリウムと硫酸アルミニウムカリウムから調製されたものである、〔８〕記載の製造方法。
〔１０〕インフルエンザウイルスが、Ｈ２及びＨ４〜１６から選ばれる型とＮ１〜９から選ばれる型との組合せからなる亜型である〔８〕又は〔９〕の何れか記載の製造方法。
〔１１〕炭酸ナトリウムと硫酸アルミニウムカリウムから調製された水酸化アルミニウムゲル及びインフルエンザウイルス全粒子を有効成分として含有する沈降不活化インフルエンザワクチンの有効量を対象に投与することを含む、インフルエンザの予防または軽減方法。
〔１２〕インフルエンザウイルス全粒子が界面活性剤及びエーテル類の非存在下にウイルス浮遊液から精製されたものである、〔１１〕記載の方法。
〔１３〕下記の性状を有する〔１１〕または〔１２〕に記載の方法：
（１）水酸化アルミニウムゲルに対するインフルエンザウイルス全粒子の吸着率が９０％以上である、及び
（２）総ヘマグルチニン活性が８０％以上である。
〔１４〕アルミニウム濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ以上０．８ｍｇ／ｍＬ未満であり、インフルエンザウイルス全粒子の濃度が３．４〜１００μｇ ＨＡ／ｍＬである、〔１１〕ないし〔１３〕の何れか一項記載の方法。
〔１５〕水酸化アルミニウムゲルと混合する前のウイルス原液中のインフルエンザウイルスが下記の性状を有する、〔１１〕ないし〔１４〕の何れか一項記載の方法：
（i）ウイルス原液を分析的ショ糖密度勾配遠心法で分析したときに、総ヘマグルチニン活性の８０％以上がウイルス粒子画分に集積する、及び
（ii）ウイルス原液をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに供した時に、２８０ｎｍの吸光スペクトルがショルダーのない単一のピークである。
〔１６〕水酸化アルミニウムゲルと混合する前のウイルス原液中のインフルエンザウイルスが、ウイルス原液を２００００〜３００００倍の倍率の電子顕微鏡下で観察したときに、ウイルスの８０％以上が完全な粒子形態を保持している〔１１〕ないし〔１５〕の何れか一項記載の方法。
〔１７〕インフルエンザウイルスが、Ｈ２およびＨ４〜１６から選ばれる型とＮ１〜９から選ばれる型との組み合わせからなる亜型である〔１１〕ないし〔１６〕の何れか一項記載の方法。
〔１８〕沈降不活化インフルエンザワクチンの製造のための、炭酸ナトリウムと硫酸アルミニウムカリウムから調製された水酸化アルミニウムゲル及びインフルエンザウイルス全粒子の使用。
〔１９〕インフルエンザウイルス全粒子が界面活性剤及びエーテル類の非存在下にウイルス浮遊液から精製されたものである、〔１８〕記載の使用。
〔２０〕下記の性状を有する〔１８〕または〔１９〕に記載の使用：
（１）水酸化アルミニウムゲルに対するインフルエンザウイルス全粒子の吸着率が９０％以上である、及び
（２）総ヘマグルチニン活性が８０％以上である。
〔２１〕アルミニウム濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ以上０．８ｍｇ／ｍＬ未満であり、インフルエンザウイルス全粒子の濃度が３．４〜１００μｇ ＨＡ／ｍＬである、〔１８〕ないし〔２０〕の何れか一項記載の使用。
〔２２〕水酸化アルミニウムゲルと混合する前のウイルス原液中のインフルエンザウイルスが下記の性状を有する、〔１８〕ないし〔２１〕の何れか一項記載の使用：
（i）ウイルス原液を分析的ショ糖密度勾配遠心法で分析したときに、総ヘマグルチニン活性の８０％以上がウイルス粒子画分に集積する、及び
（ii）ウイルス原液をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに供した時に、２８０ｎｍの吸光スペクトルがショルダーのない単一のピークである。
〔２３〕水酸化アルミニウムゲルと混合する前のウイルス原液中のインフルエンザウイルスが、ウイルス原液を２００００〜３００００倍の倍率の電子顕微鏡下で観察したときに、ウイルスの８０％以上が完全な粒子形態を保持している〔１８〕ないし〔２２〕の何れか一項記載の使用。
〔２４〕インフルエンザウイルスが、Ｈ２およびＨ４〜１６から選ばれる型とＮ１〜９から選ばれる型との組み合わせからなる亜型である〔１８〕ないし〔２３〕の何れか一項記載の使用。
〔２５〕前記〔１〕ないし〔７〕の何れか一項に記載の沈降不活化インフルエンザワクチン、および当該ワクチンをインフルエンザの予防または軽減のために使用し得るか、または使用すべきであることを記載した書類を含む商業的パッケージ。
本発明によると、インフルエンザ全粒子を有効成分とし、ヒトに対して少ない抗原量で有効な免疫応答を誘導し、かつ、副反応の少ない新型インフルエンザワクチン、沈降不活化全粒子インフルエンザワクチンを提供することが可能となり、新型インフルエンザの世界的流行に的確に対処することができる。本発明のワクチンは、炭酸ナトリウム及び硫酸アルミニウムカリウムから調製される水酸化アルミニウムゲル（塩）をアジュバントとして含有するため、少ない抗原量でヒトに対して有効な免疫応答を誘導可能であり、インフルエンザワクチンの供給量を十分確保することができる。本発明の沈降不活化全粒子インフルエンザワクチンの製造方法によると、ウイルス粒子の抗原性を良好に維持することにより、有効な免疫応答を誘導し、かつ、副反応の少ない新型インフルエンザワクチンを提供することができる。
本発明は、炭酸ナトリウムと硫酸アルミニウムカリウムから調製された水酸化アルミニウムゲル及びインフルエンザウイルス全粒子を有効成分として含有する沈降不活化インフルエンザワクチンを提供する。
本発明のワクチンは、アジュバントとして、炭酸ナトリウムと硫酸アルミニウムカリウムから調製された水酸化アルミニウムゲルを含有することを特徴とする。かかるゲルを用いることにより、ウイルス全粒子の吸着率が格段に向上し、ヒトに対するワクチンの免疫原性が高められるものである。アジュバントの原料となる炭酸ナトリウム及び硫酸アルミニウムカリウムは、水酸化アルミニウムゲルを調製するために通常用いられる試薬を限定なく使用することができる。硫酸アルミニウムカリウムは、カリミョウバンとも称される硫酸アルミニウムカリウム１２水和物ＡｌＫ（ＳＯ４）２・１２Ｈ２Ｏが好適に用いられる。水酸化アルミニウムゲルの調製方法は後述する。
本発明のワクチンは、抗原としてインフルエンザウイルス全粒子を含有することを特徴とする。本発明において、インフルエンザウイルスは、現在知られているすべての亜型、及び将来単離、同定される亜型をも含む。これまでにヒトでの流行が観察されておらず、今後ヒトへの感染を有効に防止するという観点から、インフルエンザウイルスは、Ｈ１及びＨ３を除くＨ１〜１６（すなわち、Ｈ２及びＨ４〜１６）から選ばれる型とＮ１〜９から選ばれる型との組合せからなる亜型が好ましい。これらの亜型は、新型インフルエンザウイルスとも称される。前記亜型は、Ｈ５、７及び９から選ばれる型とＮ１〜９から選ばれる型との組合せがより好ましい。インフルエンザウイルスは、同一の亜型に属する１種の株であってもよく、同一の亜型に属する２種以上の株であってもよく、別の亜型に属する２種以上の株であってもよい。
本発明において、インフルエンザウイルス全粒子とは、インフルエンザウイルスを培養して得られたウイルス浮遊液からウイルスの形態を保持したままで精製されたウイルス粒子をいう。したがって、本発明のインフルエンザワクチンは、サブビリオンを含むスプリットワクチン、及び精製ＨＡ又はＮＡを含むサブユニットワクチンを除くワクチンを意味し、全粒子ワクチンとも呼ばれる。
本発明者等は、前記のように高い吸着率を有するアジュバントを、前記全粒子ワクチンに対して用いることにより、少ない抗原量で有効かつ副作用反応の少ないワクチンが得られ、特に他のワクチンと比較した場合、ヒト以外の哺乳動物では免疫原性の差が認められない場合でも、ヒトに対する免疫応答で大きな差を生じることを見出し、本発明に至った。
前記インフルエンザウイルス全粒子は、界面活性剤及びエーテル類の非存在下にウイルス浮遊液から精製されたものが好ましい。水酸化アルミニウムゲルとの吸着に供するために精製または濃縮されたインフルエンザウイルス全粒子を含むウイルス液を「ウイルス原液」と称する。インフルエンザウイルスの精製または濃縮方法については、後述する。
本発明のワクチンは、少ない抗原量で有効かつ副反応の少ないワクチンとするためには、以下の（１）及び（２）の性状を有していることが好ましい。
（１）水酸化アルミニウムゲルに対するインフルエンザウイルス全粒子の吸着率が９０％以上である。この吸着率が９０％を超えると、前記のウイルス全粒子との相乗効果が大きくなる。ここで、吸着率とは、水酸化アルミニウムゲルとインフルエンザウイルス全粒子とを生理食塩水中、４〜８℃で一晩混合した後に上清を回収し、上清のヘマグルチニン（ＨＡ）価またはタンパク質質量を測定するか、あるいは、ゲルに吸着したタンパク質質量を測定し、求めた値である。吸着率の詳細な測定方法は、実施例に記載されている。吸着率は、９５％以上がより好ましく、９７％以上がさらに好ましい。なお、吸着率は、ゲルに対してウイルス全粒子が過飽和となる条件で混合した場合は、９０％未満となり得るので、本発明においては、９０％未満の吸着率が得られた場合は、９０％以上となるように適宜抗原量を減らせばよい。
（２）総ヘマグルチニン活性に対するインフルエンザウイルス全粒子のヘマグルチニン活性が８０％以上である。より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは９０％以上である。この割合は次のような操作により測定する。不活化されたウイルス液を、ゲルに吸着させる以前に、ショ糖密度勾配遠心などにより分画する。通常、４０％前後のショ糖濃度にウイルス全粒子は集積するので、この画分にあるヘマグルチニン量をすべての画分のヘマグルチニンで除すことによって求められる。なお、ヘマグルチニン量は赤血球凝集能を指標としたＨＡ価として測定することができる。総ヘマグルチニンの８０％以上がインフルエンザウイルス全粒子上に存在することは、ワクチン中のウイルス粒子の形態がほぼ完全に維持されている指標となる。このような良好な全粒子性が、本発明のワクチンにおいて前記相乗効果を得る上で重要である。
ウイルス粒子の形態については次のような方法によっても確認することができる。
i)ウイルス原液をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに供したときに、２８０ｎｍの吸光スペクトルがショルダーのない単一のピークである。吸光スペクトルがショルダーのない単一のピークであるか否かは、当該高速液体クロマトグラフィーで得られるチャートを肉眼で観察し、当該分野における通常の判断基準で確認すればよい。
ii）ウイルス原液を２００００〜３００００倍の倍率の電子顕微鏡下で観察したときに、ウイルスの８０％以上が完全な粒子形態を保持している。ウイルスの完全な粒子形態は、粒子の周りにＨＡおよびＮＡのスパイクが観察されることを指標にして、２０〜３０個程度のウイルスを観察して完全な粒子形態のウイルスの割合を求める。
i)ウイルス原液をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに供したときに、２８０ｎｍの吸光スペクトルがショルダーのない単一のピークである。吸光スペクトルがショルダーのない単一のピークであるか否かは、当該高速液体クロマトグラフィーで得られるチャートを肉眼で観察し、当該分野における通常の判断基準で確認すればよい。
ii）ウイルス原液を２００００〜３００００倍の倍率の電子顕微鏡下で観察したときに、ウイルスの８０％以上が完全な粒子形態を保持している。ウイルスの完全な粒子形態は、粒子の周りにＨＡおよびＮＡのスパイクが観察されることを指標にして、２０〜３０個程度のウイルスを観察して完全な粒子形態のウイルスの割合を求める。
本発明のワクチンは、アルミニウム濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ以上０．８ｍｇ／ｍＬ未満であることが好ましく、０．２ｍｇ／ｍＬ以上０．８ｍｇ／ｍＬ未満であることがより好ましい。前記濃度は、原料としてのカリミョウバンの使用量から計算した値である。あるいは、アルミニウム濃度は、原子吸光分析により求めることも可能である。
本発明のワクチンは、インフルエンザウイルス全粒子の濃度が３．４〜１００μｇ ＨＡ／ｍＬであることが好ましく、１０〜３０μｇ ＨＡ／ｍＬがより好ましい。前記濃度は、ウイルス全粒子タンパク質のＨＡ濃度を測定することにより得られる値である。タンパク質の測定方法は、実施例に記載されている。
本発明のワクチンは、インフルエンザウイルス全粒子及び水酸化アルミニウムゲル以外に、さらに医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。前記担体としては、ワクチンの製造に通常用いられる担体を使用することができ、具体的には、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液およびそれらの組合せがあげられる。また、これに保存剤（例、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤および不活化剤（例、ホルマリン）等が適宜配合される。
本発明のワクチンは、全身に投与されてもよく、局所投与でもよい。全身投与の場合、筋肉内、皮下、皮内等へ注射される。局所投与の場合、鼻腔内、咽頭部への投与があげられ、投与方法としては、噴霧、塗布などがあげられる。
本発明のワクチンの投与対象は、特に限定されず、例えば、ヒトを含む哺乳類、鳥類等があげられる。
本発明のワクチンを用いて、インフルエンザを予防またはその症状を軽減することができる。本発明は、有効免疫感作量の本発明のワクチンを対象に投与する工程を含むインフルエンザの予防または軽減方法を提供する。
ワクチンの投与方法としては、前記例示した通りである。投与量は、対象の年齢、性別、体重等を考慮して決められるが、抗原として、通常１．７〜５０μｇ ＨＡ、好ましくは５〜１５μｇ ＨＡを１回または２回以上投与することができる。好ましくは複数回の投与であり、この場合、１〜４週間の間隔をあけて投与することが好ましい。
また、本発明は、前記沈降不活化インフルエンザワクチンの製造方法を提供する。本発明の製造方法は、抗原としてインフルエンザウイルス全粒子を調製し、アジュバントの水酸化アルミニウムゲルに吸着させる全工程において、界面活性剤及びエーテル類を含有しない溶媒を用いることを特徴とする。ここで、界面活性剤とは、ワクチンの製造分野において通常用いられるあらゆる界面活性剤を意味し、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤などがあげられる。ワクチンの免疫原性を低下させないように、非イオン性界面活性剤が使用されることが多く、例えば、ポリオキシエチレンエーテル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標））などが汎用されている。本発明の製造方法においては、これらの界面活性剤を使用しない。また、エーテル類とは、ワクチンの製造分野において通常用いられるあらゆるエーテルを意味し、ジエチルエーテルなどがあげられる。本発明の製造方法においては、これらのエーテル類を使用しない。
（１）インフルエンザウイルスを培養してウイルス浮遊液を調製する工程
インフルエンザウイルスは、感染動物または患者から単離された株であっても、遺伝子工学的に培養細胞で樹立された組換えウイルスであってもよい。インフルエンザウイルスの培養方法は、鶏卵の尿膜腔内にウイルスを接種して培養してもよく、培養細胞に感染させて培養してもよい。培養条件は、鶏卵の場合は、３０〜３７℃で１〜７日程度であり、培養細胞の場合は、用いる細胞に応じて培地、温度、培養時間が設定される。培養終了後、常法によりウイルス浮遊液を回収する。
インフルエンザウイルスは、感染動物または患者から単離された株であっても、遺伝子工学的に培養細胞で樹立された組換えウイルスであってもよい。インフルエンザウイルスの培養方法は、鶏卵の尿膜腔内にウイルスを接種して培養してもよく、培養細胞に感染させて培養してもよい。培養条件は、鶏卵の場合は、３０〜３７℃で１〜７日程度であり、培養細胞の場合は、用いる細胞に応じて培地、温度、培養時間が設定される。培養終了後、常法によりウイルス浮遊液を回収する。
（２）前記ウイルス浮遊液を濾過又は遠心分離により精製する工程
得られたウイルス浮遊液は、清澄化のため、遠心分離または濾過を行い、必要に応じて濃縮のために、限外濾過を行う。その後、ウイルス精製のために、ショ糖密度勾配遠心分離等の超遠心を行い、精製ウイルス液を得る。
得られたウイルス浮遊液は、清澄化のため、遠心分離または濾過を行い、必要に応じて濃縮のために、限外濾過を行う。その後、ウイルス精製のために、ショ糖密度勾配遠心分離等の超遠心を行い、精製ウイルス液を得る。
（３）前記精製したウイルス液をホルマリンで不活化する工程
精製ウイルス液は、不活化処理を行う。ウイルスの不活化方法は、ホルマリン処理、紫外線照射、β-プロピオラクトン等があげられるが、ホルマリン処理が好ましい。ホルマリン処理の条件は、適宜設定することができるが、例えば、０．０２ｖ/ｖ％のホルマリン溶液を用いて、低温で数週間インキュベートすることにより行うことができる。
精製ウイルス液は、不活化処理を行う。ウイルスの不活化方法は、ホルマリン処理、紫外線照射、β-プロピオラクトン等があげられるが、ホルマリン処理が好ましい。ホルマリン処理の条件は、適宜設定することができるが、例えば、０．０２ｖ/ｖ％のホルマリン溶液を用いて、低温で数週間インキュベートすることにより行うことができる。
（４）前記不活化したウイルス液を濾過してウイルス原液を調製する工程
本工程においては、ウイルス液を濾過してウイルス原液を調製するが、所望により濾過と同時にウイルスの濃縮をも目的とする。かかる濾過としては、限外濾過などがあげられる。限外濾過は、常法により行うことができる。
本工程においては、ウイルス液を濾過してウイルス原液を調製するが、所望により濾過と同時にウイルスの濃縮をも目的とする。かかる濾過としては、限外濾過などがあげられる。限外濾過は、常法により行うことができる。
（５）前記ウイルス原液中のインフルエンザウイルスを水酸化アルミニウムゲルに吸着させる工程
インフルエンザウイルスと水酸化アルミニウムゲルとの吸着は、ウイルス原液を所定のタンパク質濃度に調整したものと、水酸化アルミニウムゲルの懸濁液とを４〜８℃程度の低温下で数時間〜一晩混合すればよい。水酸化アルミニウムゲルは公知のものを使用することができるが、前記したように、炭酸ナトリウムと硫酸アルミニウムカリウムから調製されたものが好ましい。
インフルエンザウイルスと水酸化アルミニウムゲルとの吸着は、ウイルス原液を所定のタンパク質濃度に調整したものと、水酸化アルミニウムゲルの懸濁液とを４〜８℃程度の低温下で数時間〜一晩混合すればよい。水酸化アルミニウムゲルは公知のものを使用することができるが、前記したように、炭酸ナトリウムと硫酸アルミニウムカリウムから調製されたものが好ましい。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１ ウイルス原液の調製と試作ワクチンの製造（工程Ａ法）
細菌製剤協会共通の方法に従い、ウイルス原液及び試作ワクチンを製造した。その概略を図１に示す。
細菌製剤協会共通の方法に従い、ウイルス原液及び試作ワクチンを製造した。その概略を図１に示す。
比較例１ ウイルス原液の調製と試作ワクチンの製造（工程Ｂ法）
実施例１及び図１において、ウイルス浮遊液の精製の工程にＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を用いること以外は、実施例１と同様にして、ウイルス原液及び試作ワクチンを製造した。その概略を図２に示す。
実施例１及び図１において、ウイルス浮遊液の精製の工程にＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を用いること以外は、実施例１と同様にして、ウイルス原液及び試作ワクチンを製造した。その概略を図２に示す。
実施例２ 水酸化アルミニウムゲルの調製
炭酸ナトリウム（１４３．１ｇ）を９Ｌの生理食塩水に溶解し、濾過し、炭酸ナトリウム溶液を調製した。硫酸アルミニウムカリウム１２水和物（カリミョウバン）（３１６．０ｇ）を９Ｌの生理食塩水に溶解し、濾過し、硫酸アルミニウムカリウム溶液を調製した。得られた炭酸ナトリウム溶液及び硫酸アルミニウムカリウム溶液を混合し、攪拌した。得られた水酸化アルミニウムゲルを洗浄し、本発明のアジュバントとして用いた。
炭酸ナトリウム（１４３．１ｇ）を９Ｌの生理食塩水に溶解し、濾過し、炭酸ナトリウム溶液を調製した。硫酸アルミニウムカリウム１２水和物（カリミョウバン）（３１６．０ｇ）を９Ｌの生理食塩水に溶解し、濾過し、硫酸アルミニウムカリウム溶液を調製した。得られた炭酸ナトリウム溶液及び硫酸アルミニウムカリウム溶液を混合し、攪拌した。得られた水酸化アルミニウムゲルを洗浄し、本発明のアジュバントとして用いた。
比較例２ 水酸化アルミニウムゲルの調製
０．２１Ｍ塩化アルミニウム水溶液（ｐＨ２．９５）５０．０ｍＬを攪拌しながら、０．５０Ｍ ＮａＯＨ水溶液６３．１ｍＬを室温で徐々に滴下し、５５分間添加した。添加完了時のｐＨは９．００であった。前記溶液を室温でさらに３０分間攪拌した。この時のｐＨも９．００であった。攪拌後の溶液を４℃で２１．５時間静置し、水酸化アルミニウムゲル１１３ｍＬ（ｐＨ８．４）を得た。得られた水酸化アルミニウムゲルを４℃、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿物を分取した。前記沈殿物（１２．５ｍＬ）に０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．１）を２９．２５ｍＬ加え、ｐＨが９．４に上昇したことを確認し、１２１℃で２０分間高圧滅菌した。高圧滅菌後の水酸化アルミニウムゲルのｐＨは８．４であった。
０．２１Ｍ塩化アルミニウム水溶液（ｐＨ２．９５）５０．０ｍＬを攪拌しながら、０．５０Ｍ ＮａＯＨ水溶液６３．１ｍＬを室温で徐々に滴下し、５５分間添加した。添加完了時のｐＨは９．００であった。前記溶液を室温でさらに３０分間攪拌した。この時のｐＨも９．００であった。攪拌後の溶液を４℃で２１．５時間静置し、水酸化アルミニウムゲル１１３ｍＬ（ｐＨ８．４）を得た。得られた水酸化アルミニウムゲルを４℃、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿物を分取した。前記沈殿物（１２．５ｍＬ）に０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．１）を２９．２５ｍＬ加え、ｐＨが９．４に上昇したことを確認し、１２１℃で２０分間高圧滅菌した。高圧滅菌後の水酸化アルミニウムゲルのｐＨは８．４であった。
実施例３ 沈降不活化全粒子ワクチンの製造
実施例１で得られたウイルス原液と実施例２で得られた水酸化アルミニウムゲルとを混合し、沈降不活化全粒子ワクチンを得た。
実施例１で得られたウイルス原液と実施例２で得られた水酸化アルミニウムゲルとを混合し、沈降不活化全粒子ワクチンを得た。
比較例３ 沈降不活化全粒子ワクチンの製造
比較例１で得られたウイルス原液と比較例２で得られた水酸化アルミニウムゲルとを混合し、沈降不活化全粒子ワクチンを得た。
比較例１で得られたウイルス原液と比較例２で得られた水酸化アルミニウムゲルとを混合し、沈降不活化全粒子ワクチンを得た。
実験例１ ウイルスのゲルへの吸着率
次いで、新型インフルエンザウイルス（ＮＩＢＲＧ−１４株）の不活化全粒子を用いて種々のアルミニウムゲルへの抗原吸着率を検討した。カリミョウバン製水酸化アルミニウムゲル（実施例２）、塩化アルミニウム製水酸化アルミニウムゲル（比較例２）以外に、下記リストの市販水酸化アルミニウムゲルおよびリン酸アルミニウムゲルについても測定を行い、抗原吸着率を比較した。
（実験材料）
（1）アルミニウムゲル：
1）水酸化アルミニウムゲル “Aluminum Hydroxide Gel (A-8222)” （SIGMA製）
13mg-Al/ml
2)水酸化アルミニウムゲル “Alhydrogel (2%）” （Brenntag Biosector製）
10.8mg-Al/ml
3)リン酸アルミニウムゲル “Adju-Phos” （Superfos Biosector製）
4.4mg-Al/ml
（2）ウイルス懸濁液：
ＮＩＢＲＧ−１４株インフルエンザ不活化全粒子ワクチン原液（ＦＰＢＭ Ｚ０４０１、実施例１に記載の方法により調製したもの）
（3）希釈液：
1) ０．０１Ｍ ＰＢＳ （−）
2) 生理食塩水
（実験方法）
上記アルミニウムゲルと上記ウイルス懸濁液を混合し、上清を回収した。上清のタンパク質含量とＨＡ価を測定し、それぞれの吸着率を算出した。
（抗原のアルミニウムゲルへ吸着率の測定方法）
（１）ゲルと抗原の混合
アルミニウムゲル懸濁液（０．３ｍｇ−Ａｌ相当量）、ウイルス懸濁液（１１．７、３３．３、あるいは１００μg-protein相当量）に希釈液を総液量１ｍｌとなるように加え、冷室（４〜８℃）にて一晩混合した。
（２）上清回収
混合液を遠心分離し（トミー微量高速遠心機ＭＣ−１５０，１０００ｒｐｍ、５分）、上清を回収した。回収した上清はタンパク質含量測定用材料あるいはＨＡ価測定用材料とした。
（３）タンパク含量測定
上清のタンパク質含量をMicro BCA Protein Assay Kit（ピアス社）を用いて測定した。標準物質はキット添付のＢＳＡ溶液を使用した。
（４）ＨＡ価測定
上清のＨＡ価は国立感染症研究所「病原体検出マニュアル」の「インフルエンザ ＨＡ価の測定」の項に従い測定した。血球浮遊液は０．５％ニワトリ赤血球浮遊液を用いた。
（５）吸着率算出
各検体の上清中の抗原含量を、ゲルを含まない対照検体の上清中の抗原含量で除して吸着率（％）を算出した。
次いで、新型インフルエンザウイルス（ＮＩＢＲＧ−１４株）の不活化全粒子を用いて種々のアルミニウムゲルへの抗原吸着率を検討した。カリミョウバン製水酸化アルミニウムゲル（実施例２）、塩化アルミニウム製水酸化アルミニウムゲル（比較例２）以外に、下記リストの市販水酸化アルミニウムゲルおよびリン酸アルミニウムゲルについても測定を行い、抗原吸着率を比較した。
（実験材料）
（1）アルミニウムゲル：
1）水酸化アルミニウムゲル “Aluminum Hydroxide Gel (A-8222)” （SIGMA製）
13mg-Al/ml
2)水酸化アルミニウムゲル “Alhydrogel (2%）” （Brenntag Biosector製）
10.8mg-Al/ml
3)リン酸アルミニウムゲル “Adju-Phos” （Superfos Biosector製）
4.4mg-Al/ml
（2）ウイルス懸濁液：
ＮＩＢＲＧ−１４株インフルエンザ不活化全粒子ワクチン原液（ＦＰＢＭ Ｚ０４０１、実施例１に記載の方法により調製したもの）
（3）希釈液：
1) ０．０１Ｍ ＰＢＳ （−）
2) 生理食塩水
（実験方法）
上記アルミニウムゲルと上記ウイルス懸濁液を混合し、上清を回収した。上清のタンパク質含量とＨＡ価を測定し、それぞれの吸着率を算出した。
（抗原のアルミニウムゲルへ吸着率の測定方法）
（１）ゲルと抗原の混合
アルミニウムゲル懸濁液（０．３ｍｇ−Ａｌ相当量）、ウイルス懸濁液（１１．７、３３．３、あるいは１００μg-protein相当量）に希釈液を総液量１ｍｌとなるように加え、冷室（４〜８℃）にて一晩混合した。
（２）上清回収
混合液を遠心分離し（トミー微量高速遠心機ＭＣ−１５０，１０００ｒｐｍ、５分）、上清を回収した。回収した上清はタンパク質含量測定用材料あるいはＨＡ価測定用材料とした。
（３）タンパク含量測定
上清のタンパク質含量をMicro BCA Protein Assay Kit（ピアス社）を用いて測定した。標準物質はキット添付のＢＳＡ溶液を使用した。
（４）ＨＡ価測定
上清のＨＡ価は国立感染症研究所「病原体検出マニュアル」の「インフルエンザ ＨＡ価の測定」の項に従い測定した。血球浮遊液は０．５％ニワトリ赤血球浮遊液を用いた。
（５）吸着率算出
各検体の上清中の抗原含量を、ゲルを含まない対照検体の上清中の抗原含量で除して吸着率（％）を算出した。
（結果）
希釈液に０．０１Ｍ−ＰＢＳを使用した時のタンパク含量、ＨＡ含量から各種市販アルミニウムゲルへの吸着率を算出した結果を表１に示す。
希釈液に０．０１Ｍ−ＰＢＳを使用した時のタンパク含量、ＨＡ含量から各種市販アルミニウムゲルへの吸着率を算出した結果を表１に示す。
不活化されたＮＩＢＲＧ−１４（Ｈ５Ｎ１亜型株）あるいはA/Wyoming/3/2003（Ｈ３Ｎ２亜型株）の塩化アルミニウム製水酸化アルミゲル（比較例２で調製）及びカリミョウバン製水酸化アルミニウムゲル（実施例２で調製）に対する吸着率を比較した。不活化された両ウイルスの最終タンパク質濃度が１００μｇ／ｍＬ、アルミニウムの最終濃度が０．３ｍｇ／ｍＬになるように混和し、室温で１５分間インキュベーションした。遠心によりゲル画分と上澄みを分離し、上澄み中に残存するたん白質質量を測定することにより吸着率を算出した。結果を図１１に示す。A/Wyoming/3/2003はいずれの水酸化アルミゲルにも良好に吸着したが、ＮＩＢＲＧ−１４の塩化アルミニウム製水酸化アルミゲルへの吸着性は劣っており、カリミョウバン製水酸化アルミゲルに対してのみ良好な吸着を示した。このことから、Ｈ５Ｎ１亜型株が抗原である場合、カリミョウバン製水酸化アルミゲルを用いた方がよいことが示された。
実験例２ ワクチンの動物における免疫原性
調製法の異なる水酸化アルミニウム塩によるアジュバント効果を比較評価するため、水酸化アルミニウムゲル（比較例２で調製）とカリミョウバンを原料とする水酸化アルミニウムゲル（実施例２で調製）の２種類のアルミゲルを添加した不活化ウイルス抗原を調製した。これら抗原をｄｄＹマウスに１匹あたり０．５、０．０５μｇ（たん白質質量）になるように３週間隔で２回免疫した。２次免疫２週間後に採血を行い、得られた血清を用いてＨＩ抗体価を測定した（図３）。
図３より、いずれの投与群においても、カリミョウバン製水酸化アルミニウムゲルをアジュバントとして用いた方が高い抗体応答を示した。
調製法の異なる水酸化アルミニウム塩によるアジュバント効果を比較評価するため、水酸化アルミニウムゲル（比較例２で調製）とカリミョウバンを原料とする水酸化アルミニウムゲル（実施例２で調製）の２種類のアルミゲルを添加した不活化ウイルス抗原を調製した。これら抗原をｄｄＹマウスに１匹あたり０．５、０．０５μｇ（たん白質質量）になるように３週間隔で２回免疫した。２次免疫２週間後に採血を行い、得られた血清を用いてＨＩ抗体価を測定した（図３）。
図３より、いずれの投与群においても、カリミョウバン製水酸化アルミニウムゲルをアジュバントとして用いた方が高い抗体応答を示した。
参考例１ ワクチンのヒトにおける有効性
比較例３（Ｂ法）で製造した沈降新型インフルエンザワクチン治験薬を用いて２０歳〜４０歳の健康成人男性を対象に第Ｉ相試験を実施した。このワクチンを３週間間隔で皮下に２回接種を行った。抗原量は１回接種当たり１．７μｇ ＨＡ（低用量）、５μｇ ＨＡ（中用量）及び１５μｇ ＨＡ（高用量）の３種類で比較した。ウイルスに対する感染防御能を強く反映する中和抗体価をワクチン接種前後で比較して指標とした。その結果、図４に示すように１５μｇ ＨＡのワクチンを２回投与した後でも、抗体価１：４０以上の陽転率は４０％以下で満足行くものではなかった。
比較例３（Ｂ法）で製造した沈降新型インフルエンザワクチン治験薬を用いて２０歳〜４０歳の健康成人男性を対象に第Ｉ相試験を実施した。このワクチンを３週間間隔で皮下に２回接種を行った。抗原量は１回接種当たり１．７μｇ ＨＡ（低用量）、５μｇ ＨＡ（中用量）及び１５μｇ ＨＡ（高用量）の３種類で比較した。ウイルスに対する感染防御能を強く反映する中和抗体価をワクチン接種前後で比較して指標とした。その結果、図４に示すように１５μｇ ＨＡのワクチンを２回投与した後でも、抗体価１：４０以上の陽転率は４０％以下で満足行くものではなかった。
参考例２ ワクチンの動物における有効性
実施例３（Ａ法）及び比較例３（Ｂ法）でそれぞれ製造した新型インフルエンザワクチンのマウス及びウサギにおける免疫原性をＨＩ抗体価を指標に評価した。マウスを用いた実験では、各群８〜１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、０．０４〜３μｇ ＨＡ／匹になるように不活化ウイルス抗原を含む水酸化アルミニウムゲル（アラム）アジュバントワクチンを３週間隔で下肢筋肉内に２回接種した。二次免疫１４日後のマウス血清のＨＩ抗体価を測定し、各群１０匹の平均ＨＩ抗体価を表に示した。ウサギを用いた実験においては、各群３匹の白色家兎の筋肉内へそれぞれのワクチンを１５μｇ ＨＡ投与した。その結果、表２に示すように、実験動物ではＡ法、Ｂ法で製造したワクチンの免疫原性の差を見分けることはできなかった。
実施例３（Ａ法）及び比較例３（Ｂ法）でそれぞれ製造した新型インフルエンザワクチンのマウス及びウサギにおける免疫原性をＨＩ抗体価を指標に評価した。マウスを用いた実験では、各群８〜１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、０．０４〜３μｇ ＨＡ／匹になるように不活化ウイルス抗原を含む水酸化アルミニウムゲル（アラム）アジュバントワクチンを３週間隔で下肢筋肉内に２回接種した。二次免疫１４日後のマウス血清のＨＩ抗体価を測定し、各群１０匹の平均ＨＩ抗体価を表に示した。ウサギを用いた実験においては、各群３匹の白色家兎の筋肉内へそれぞれのワクチンを１５μｇ ＨＡ投与した。その結果、表２に示すように、実験動物ではＡ法、Ｂ法で製造したワクチンの免疫原性の差を見分けることはできなかった。
実験例３ 電子顕微鏡による観察
実施例１（Ａ法）、比較例１（Ｂ法）でそれぞれ製造した原液を、フォルムバール膜を張った電子顕微鏡観察用グリッドに載せ、２％リンタングステン酸にて染色後、加速電圧１２０ＫＶにて観察した（図５）。その結果、粒子の周りにＨＡ及びＮＡのスパイクが観察される粒子を完全粒子とした場合、Ａ法で製造した原液では８０％以上が完全粒子であったのに対して、Ｂ法で製造した原液では完全粒子はほとんど認められなかった。
実施例１（Ａ法）、比較例１（Ｂ法）でそれぞれ製造した原液を、フォルムバール膜を張った電子顕微鏡観察用グリッドに載せ、２％リンタングステン酸にて染色後、加速電圧１２０ＫＶにて観察した（図５）。その結果、粒子の周りにＨＡ及びＮＡのスパイクが観察される粒子を完全粒子とした場合、Ａ法で製造した原液では８０％以上が完全粒子であったのに対して、Ｂ法で製造した原液では完全粒子はほとんど認められなかった。
実験例４ ショ糖密度勾配遠心分離
実施例１（Ａ法）、比較例１（Ｂ法）でそれぞれ製造した原液について分析的ショ糖密度勾配遠心分離を実施した。
１５〜６０％のショ糖密度勾配にたん白質濃度１８０μｇ／ｍＬの原液１ｍＬを重層し、４℃、１８０００ｒｐｍで約１６時間遠心分離した。フラクションあたり約０．５ｍＬ分画し、各フラクションのショ糖濃度、ＨＡ活性及びたん白質濃度を測定した。ＨＡ価はニワトリ赤血球を用いて３回測定し、その幾何平均値をグラフ化した。たん白質濃度については、各フラクション５０μＬをＰＶＤＦ膜にトランスファーした後にクマジーブリリアントブルーで染色し、デンシトメトリーにより解析した（図６）。
それぞれの原液において、ショ糖濃度約４０％の画分にＨＡ活性及びたん白質のピークが認められた。Ａ法ではアプライしたＨＡ活性の８０％以上がウイルスピークに集積したが、Ｂ法では集積率は５０％以下に留まった。また、Ｂ法ではショ糖濃度約１７％の画分においてもたん白質のピークが認められたが、ＨＡ活性は認められなかった。
実施例１（Ａ法）、比較例１（Ｂ法）でそれぞれ製造した原液について分析的ショ糖密度勾配遠心分離を実施した。
１５〜６０％のショ糖密度勾配にたん白質濃度１８０μｇ／ｍＬの原液１ｍＬを重層し、４℃、１８０００ｒｐｍで約１６時間遠心分離した。フラクションあたり約０．５ｍＬ分画し、各フラクションのショ糖濃度、ＨＡ活性及びたん白質濃度を測定した。ＨＡ価はニワトリ赤血球を用いて３回測定し、その幾何平均値をグラフ化した。たん白質濃度については、各フラクション５０μＬをＰＶＤＦ膜にトランスファーした後にクマジーブリリアントブルーで染色し、デンシトメトリーにより解析した（図６）。
それぞれの原液において、ショ糖濃度約４０％の画分にＨＡ活性及びたん白質のピークが認められた。Ａ法ではアプライしたＨＡ活性の８０％以上がウイルスピークに集積したが、Ｂ法では集積率は５０％以下に留まった。また、Ｂ法ではショ糖濃度約１７％の画分においてもたん白質のピークが認められたが、ＨＡ活性は認められなかった。
実験例５ ゲル濾過ＨＰＬＣ
実施例１（Ａ法）、比較例１（Ｂ法）でそれぞれ製造した原液についてゲル濾過ＨＰＬＣを実施した。原液をたん白質濃度が１００μｇ／ｍＬになるように移動相（ＰＢＳ）で希釈したものを試料とし、Ａ法、Ｂ法でそれぞれ調製した原液について、次の条件で液体クロマトグラフ法により分析を行った。
検出器 ：紫外吸光光度計（測定波長：210, 280nm）
カラム ：東ソー製のHPLC分析カラムTSKgel G3000PWXL
カラム温度 ：25℃付近の一定温度
移動相 ：0.01mol/Lリン酸ナトリウム緩衝溶液（注1） PBS（pH7.4）
流量 ：毎分約0.5mL
（注1）0.01mol/L リン酸ナトリウム緩衝溶液：リン酸二水素カリウム０．２３８ｇ、リン酸水素二ナトリウム１２水塩２．９５５ｇを水に溶かして１０００ｍＬとした。
原液のゲル濾過クロマトグラムを示す（図７ＡおよびＢ、上段：２１０ｎｍ、下段：２８０ｎｍ）。図７より、保持時間９．９分にウイルス粒子と予想されるピークが観察された。また、Ｂ法では保持時間１０．９分にもショルダーが観察された。
実施例１（Ａ法）、比較例１（Ｂ法）でそれぞれ製造した原液についてゲル濾過ＨＰＬＣを実施した。原液をたん白質濃度が１００μｇ／ｍＬになるように移動相（ＰＢＳ）で希釈したものを試料とし、Ａ法、Ｂ法でそれぞれ調製した原液について、次の条件で液体クロマトグラフ法により分析を行った。
検出器 ：紫外吸光光度計（測定波長：210, 280nm）
カラム ：東ソー製のHPLC分析カラムTSKgel G3000PWXL
カラム温度 ：25℃付近の一定温度
移動相 ：0.01mol/Lリン酸ナトリウム緩衝溶液（注1） PBS（pH7.4）
流量 ：毎分約0.5mL
（注1）0.01mol/L リン酸ナトリウム緩衝溶液：リン酸二水素カリウム０．２３８ｇ、リン酸水素二ナトリウム１２水塩２．９５５ｇを水に溶かして１０００ｍＬとした。
原液のゲル濾過クロマトグラムを示す（図７ＡおよびＢ、上段：２１０ｎｍ、下段：２８０ｎｍ）。図７より、保持時間９．９分にウイルス粒子と予想されるピークが観察された。また、Ｂ法では保持時間１０．９分にもショルダーが観察された。
実験例６ 臨床試験での免疫原性
実施例１で調製した水酸化アルミニウムゲルを添加した沈降新型インフルエンザワクチン治験薬を製造し、２０〜４０歳の健康成人男性を対象に第Ｉ相試験を実施した（図８）。このワクチンを３週間間隔で皮下あるいは筋肉内に２回接種を行った。抗原量は１回接種当たり１．７μｇ ＨＡ（低用量）、５μｇ ＨＡ（中用量）及び１５μｇ ＨＡ（高用量）の３種類で比較した。ウイルスに対する感染防御能を強く反映する中和抗体価をワクチン接種前後で比較して指標とした。高用量接種群では皮下接種群で７３％、筋肉内接種群では全例で抗体価が４倍以上上昇していた。中用量接種群でも皮下接種群で５８％、筋肉内接種群で７５％に抗体価の上昇がみられた。このことから水酸化アルミニウムゲルを添加した沈降インフルエンザワクチンはヒトに対しても多くの場合、免疫応答を惹起することが確認された。
実施例１で調製した水酸化アルミニウムゲルを添加した沈降新型インフルエンザワクチン治験薬を製造し、２０〜４０歳の健康成人男性を対象に第Ｉ相試験を実施した（図８）。このワクチンを３週間間隔で皮下あるいは筋肉内に２回接種を行った。抗原量は１回接種当たり１．７μｇ ＨＡ（低用量）、５μｇ ＨＡ（中用量）及び１５μｇ ＨＡ（高用量）の３種類で比較した。ウイルスに対する感染防御能を強く反映する中和抗体価をワクチン接種前後で比較して指標とした。高用量接種群では皮下接種群で７３％、筋肉内接種群では全例で抗体価が４倍以上上昇していた。中用量接種群でも皮下接種群で５８％、筋肉内接種群で７５％に抗体価の上昇がみられた。このことから水酸化アルミニウムゲルを添加した沈降インフルエンザワクチンはヒトに対しても多くの場合、免疫応答を惹起することが確認された。
実験例７ マウスＨＩ抗体産生
実施例１で調製した水酸化アルミニウムゲル（アラム）をアジュバントとして添加した新型インフルエンザワクチンのマウスでの免疫原性をＨＩ抗体価を指標に評価した。マウス各群１０匹に０．０４〜３μｇ ＨＡ／匹の不活化ウイルス抗原を含むアラムあり製剤及びアラムなし製剤を３週間隔で下肢皮下、あるいは筋肉内に２回接種した。二次免疫１４日後のマウス血清のＨＩ抗体価を測定し、各群１０匹の平均HI抗体価を図９に示す。図９より、皮下及び筋肉内投与のいずれの群においても、アラムなし製剤と比較し、アラムあり製剤投与群のＨＩ抗体価が高かった。このことから、アラムを添加することにより、非添加群よりも高い抗体価が惹起されると考えられた。
実施例１で調製した水酸化アルミニウムゲル（アラム）をアジュバントとして添加した新型インフルエンザワクチンのマウスでの免疫原性をＨＩ抗体価を指標に評価した。マウス各群１０匹に０．０４〜３μｇ ＨＡ／匹の不活化ウイルス抗原を含むアラムあり製剤及びアラムなし製剤を３週間隔で下肢皮下、あるいは筋肉内に２回接種した。二次免疫１４日後のマウス血清のＨＩ抗体価を測定し、各群１０匹の平均HI抗体価を図９に示す。図９より、皮下及び筋肉内投与のいずれの群においても、アラムなし製剤と比較し、アラムあり製剤投与群のＨＩ抗体価が高かった。このことから、アラムを添加することにより、非添加群よりも高い抗体価が惹起されると考えられた。
実験例８ ワクチンの安全性
異常毒性否定試験
実施例１で調製した水酸化アルミニウムゲル（アラム）をアジュバントとして添加した新型インフルエンザワクチンのモルモットでの異常毒性否定試験を行った。検体は不活化ウイルス抗原３０μｇ ＨＡ／ｍＬ＋アラム０．３ｍｇ／ｍＬ、不活化ウイルス抗原３０μｇ ＨＡ／ｍＬ、アラムのみ０．３ｍｇ／ｍＬ及び生理食塩水。各検体５ｍＬを３匹ずつのモルモットに接種し、体重の変化を観察した。各群３匹の体重変化の平均を図１０に示す。接種後１日目ではアラムあり、アラムなし製剤接種群とも体重減少が見られたが、アラムあり製剤では２日目から体重が増加し、７日目には生理食塩水接種群を上回った。アラムなし製剤接種群では７日目まで生理食塩水接種群を上回ることはなかった。このことから抗原がアラムと結合することにより、その副反応が抑えられると考えられた。
異常毒性否定試験
実施例１で調製した水酸化アルミニウムゲル（アラム）をアジュバントとして添加した新型インフルエンザワクチンのモルモットでの異常毒性否定試験を行った。検体は不活化ウイルス抗原３０μｇ ＨＡ／ｍＬ＋アラム０．３ｍｇ／ｍＬ、不活化ウイルス抗原３０μｇ ＨＡ／ｍＬ、アラムのみ０．３ｍｇ／ｍＬ及び生理食塩水。各検体５ｍＬを３匹ずつのモルモットに接種し、体重の変化を観察した。各群３匹の体重変化の平均を図１０に示す。接種後１日目ではアラムあり、アラムなし製剤接種群とも体重減少が見られたが、アラムあり製剤では２日目から体重が増加し、７日目には生理食塩水接種群を上回った。アラムなし製剤接種群では７日目まで生理食塩水接種群を上回ることはなかった。このことから抗原がアラムと結合することにより、その副反応が抑えられると考えられた。
本発明によると、ヒトに対して少ない抗原量で有効な免疫応答を誘導し、かつ、副反応の少ない新型インフルエンザワクチンを提供することが可能となり、新型インフルエンザの世界的流行に的確に対処することができる。
本出願は、日本で出願された特願２００６−２７１２９５（出願日：２００６年１０月２日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含される。
本出願は、日本で出願された特願２００６−２７１２９５（出願日：２００６年１０月２日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含される。
Claims (15)
- 炭酸ナトリウム溶液と硫酸アルミニウムカリウム溶液を混合し、攪拌して調製された水酸化アルミニウムゲルならびに界面活性剤及びエーテル類の非存在下にウイルス浮遊液から精製されたインフルエンザウイルス全粒子を有効成分として含有する沈降不活化インフルエンザワクチン。
- 下記の性状を有する請求項１に記載のワクチン：
（１）水酸化アルミニウムゲルに対するインフルエンザウイルス全粒子の吸着率が９０％以上である、及び
（２）総ヘマグルチニン活性に対するインフルエンザウイルス全粒子のヘマグルチニン活性が８０％以上である。 - アルミニウム濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ以上０．８ｍｇ／ｍＬ未満であり、インフルエンザウイルス全粒子の濃度が３．４〜１００μｇＨＡ／ｍＬである、請求項１又は２に記載のワクチン。
- 水酸化アルミニウムゲルと混合する前のウイルス原液中のインフルエンザウイルスが下記の性状を有する、請求項１ないし３の何れか一項記載のワクチン：
（i）ウイルス原液を分析的ショ糖密度勾配遠心法で分析したときに、総ヘマグルチニン活性の８０％以上がウイルス粒子画分に集積する、及び
（ii）ウイルス原液をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに供したときに、２８０ｎｍの吸光スペクトルがショルダーのない単一のピークである。 - 水酸化アルミニウムゲルと混合する前のウイルス原液中のインフルエンザウイルスが、ウイルス原液を２００００〜３００００倍の倍率の電子顕微鏡下で観察したときに、ウイルスの８０％以上が完全な粒子形態を保持している請求項１ないし４の何れか一項記載のワクチン。
- インフルエンザウイルスが、Ｈ２及びＨ４〜１６から選ばれる型とＮ１〜９から選ばれる型との組合せからなる亜型である請求項１ないし５の何れか一項記載のワクチン。
- インフルエンザウイルス全粒子を有効成分として含有する沈降不活化インフルエンザワクチンの製造方法であって、界面活性剤及びエーテル類を含有しない溶媒を用いて下記（１）〜（５）の工程を行うことを特徴とする前記製造方法：
（１）インフルエンザウイルスを培養してウイルス浮遊液を調製する工程、
（２）前記ウイルス浮遊液を濾過又は遠心分離により精製する工程、
（３）前記精製したウイルス液をホルマリンで不活化する工程、
（４）前記不活化したウイルス液を濾過してウイルス原液を調製する工程、及び
（５）前記ウイルス原液中のインフルエンザウイルスを、炭酸ナトリウム溶液と硫酸アルミニウムカリウム溶液を混合し、攪拌して調製された水酸化アルミニウムゲルに吸着させる工程。 - インフルエンザウイルスが、Ｈ２及びＨ４〜１６から選ばれる型とＮ１〜９から選ばれる型との組合せからなる亜型である請求項７記載の製造方法。
- 沈降不活化インフルエンザワクチンの製造のための、炭酸ナトリウム溶液と硫酸アルミニウムカリウム溶液を混合し、攪拌して調製された水酸化アルミニウムゲルならびに界面活性剤及びエーテル類の非存在下にウイルス浮遊液から精製されたインフルエンザウイルス全粒子の使用。
- 下記の性状を有する請求項９に記載の使用：
（１）水酸化アルミニウムゲルに対するインフルエンザウイルス全粒子の吸着率が９０％以上である、及び
（２）総ヘマグルチニン活性が８０％以上である。 - アルミニウム濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ以上０．８ｍｇ／ｍＬ未満であり、インフルエンザウイルス全粒子の濃度が３．４〜１００μｇＨＡ／ｍＬである、請求項９又は１０に記載の使用。
- 水酸化アルミニウムゲルと混合する前のウイルス原液中のインフルエンザウイルスが下記の性状を有する、請求項９ないし１１の何れか一項記載の使用：
（i）ウイルス原液を分析的ショ糖密度勾配遠心法で分析したときに、総ヘマグルチニン活性の８０％以上がウイルス粒子画分に集積する、及び
（ii）ウイルス原液をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに供した時に、２８０ｎｍの吸光スペクトルがショルダーのない単一のピークである。 - 水酸化アルミニウムゲルと混合する前のウイルス原液中のインフルエンザウイルスが、ウイルス原液を２００００〜３００００倍の倍率の電子顕微鏡下で観察したときに、ウイルスの８０％以上が完全な粒子形態を保持している請求項９ないし１２の何れか一項記載の使用。
- インフルエンザウイルスが、Ｈ２およびＨ４〜１６から選ばれる型とＮ１〜９から選ばれる型との組み合わせからなる亜型である請求項９ないし１３の何れか一項記載の使用。
- 請求項１ないし６の何れか一項に記載の沈降不活化インフルエンザワクチン、および当該ワクチンをインフルエンザの予防または軽減のために使用し得るか、または使用すべきであることを記載した書類を含む商業的パッケージ。
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