CN104498446A - 一种在疫苗生产中灭活病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种在疫苗生产中灭活病毒的方法，属于生物制品制备领域。本发明根据疫苗病毒液灭活过程中存在的影响抗原稳定性、免疫原性、抗原回收率的因素，对疫苗生产灭活过程中温度控制、搅拌速率、添加甲醛溶液的流速等条件参数加以改进，获取最优的灭活条件，减少灭活过程中抗原损失，并能够稳定抗原结构，提高免疫原性。本发明方法可保证产品质量的稳定性、均一性，降低了生产的成本；将灭活操作时间从2.5h左右降低为2h以内，减少人员的疲劳，提高了生产效率，同时也避免了疫苗生产中间产品长时间的置于室温中，间接提高了疫苗的品质质量。
Description
技术领域
本发明属于生物制品制备领域，具体地说，属于疫苗灭活方法；更具体地涉及一种在疫苗生活中使用甲醛灭活病毒的方法。
背景技术
甲醛是目前最常用的一种病毒灭活剂，通常运用于生物制品中抗原(病毒、菌液等)的灭活，其灭活作用机制是：一方面其与微生物蛋白质的胺基结合形成羟甲基衍生物，随着作用时间的延长，羟甲基衍生物可再与酰胺发生交联反应，使微生物丧失毒性和繁殖能力，但仍能保持良好的免疫性；另一方面甲醛也可以使核酸灭活，其作用是通过与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶等含有胺基的碱基结合而使核酸变性。目前，国内外灭活疫苗大多使用甲醛灭活制备而成：提纯后的病毒液(或病毒收获液)经除菌过滤(或粗过滤)后，加入一定浓度的甲醛溶液灭活，以获得蛋白结构稳定、免疫原性较高的抗原，用于制备疫苗终产品。
病毒液温度控制在灭活前、灭活过程中十分重要，尤其是甲醛溶液与病毒表面抗原蛋白混匀的过程中，温度必须控制在合格的范围内。温度的上下波动会对抗原的活性造成重要影响：温度过高时，蛋白质的空间结构改变，失去天然活性，抗原损失增加；温度过低时，在单位时间内不能为蛋白质末端基团之间形成交联键提供稳定的能量，从而不能很好地达到稳定蛋白质结构的目的。在灭活过程中温度的差异越小，对蛋白的结构稳定性越有利，抗原损失率越低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在疫苗生产中灭活病毒的方法。
本发明的方法包括如下步骤：
(1)将提纯后的病毒液静置于18-26℃下，甲醛溶液静置条件同病毒液；
(2)静置后的病毒液除菌过滤后，搅拌病毒液；
(3)甲醛溶液加入病毒液中，边加入边搅拌；
(4)将步骤(3)的病毒液静置灭活。
其中，步骤(1)中病毒液静置时间不小于5h。
本发明方法中，步骤(2)搅拌病毒液的速度为350-450rpm。
优选地，步骤(2)搅拌病毒液的速度为350rpm。
本发明方法中，步骤(3)的甲醛溶液是使用pH7.2的0.01mol/LPBS溶液与甲醛配制而成，甲醛的浓度范围为0.018～0.021g/ml。
步骤(3)中甲醛溶液加入病毒液的流速控制在60-100ml/min。
优选地，步骤(3)中甲醛溶液加入病毒液的流速为80ml/min。
其中，步骤(3)中加入甲醛溶液，使灭活液中甲醛终浓度范围为0.009～0.0125g/ml。
本发明方法中步骤(3)搅拌速度为350-450rpm。
优选地，搅拌速度为350rpm。
本发明方法中的步骤(4)静置灭活条件为36-38℃，3-12天。优选37℃，3.7天。
在抗原结构固定过程中，甲醛溶液的浓度要控制在一定的范围内，表面抗原的固定效果才能达到最佳。表面抗原的固定过程中，搅拌速度的变化影响病毒纯化液中甲醛溶液的浓度变化，对抗原的活性造成重要影响：搅拌速度过大，会使蛋白质的结构发生变化从而失去活性，抗原损失增加；搅拌速度过慢，液体混合不佳，会阻碍局部能量的传递，蛋白质末端基团不能形成稳定的交联键，进而影响蛋白结构的固定，最终导致蛋白结构不稳定，灭活效果不佳。因此，本发明针对病毒液和甲醛的平衡温度、搅拌速度、甲醛溶液流速等方面进行摸索和条件优化，获得了本发明的灭活病毒的方法。使用的磁力搅拌器搅拌速度达到350rpm时，刚好使病毒液在灭活桶中形成漩涡状，而450rpm为灭活液搅拌时可使用的最大速度，再增加速度则可导致病毒液液面上升，超出灭活桶盛装高度。对于甲醛的流速，发明人发现流速过快可导致局部甲醛溶液浓度过高，抗原发生聚集，使得检测到的抗原含量降低，而甲醛加入流速过缓，会增加灭活工艺的时限，并带来污染风险。本发明方法能够减少灭活过程中抗原损失，并能够稳定抗原结构，提高免疫原性。本发明方法可保证产品质量的稳定性、均一性，降低了生产的成本；将灭活操作时间从2.5h左右降低为2h以内，减少人员的疲劳，提高了生产效率，同时也避免了疫苗生产中间产品长时间的置于室温中，间接提高了疫苗的品质质量。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
1、经细胞培养2BS(人二倍体)细胞获取甲肝病毒收获液。
2、甲肝病毒收获液经过初提纯、精提纯后获得较为纯净的甲肝病毒液。
3、灭活甲肝病毒液：
1)房间清洁消毒，纯化后甲肝病毒液、甲醛溶液置于室温(18-26℃)下过夜(大于5小时)平衡。
2)甲肝病毒液除菌过滤：将甲肝病毒液接入甲肝病毒液除菌过滤系统，过滤完成后以350-450rpm转速搅拌混匀过滤后甲肝病毒液。
3)灭活：将除菌过滤后浓度范围为0.018～0.021g/ml的甲醛溶液经灭活系统加入病毒液中，使甲醛溶液在灭活液中的终浓度范围为0.009～0.0125g/ml的并保持上一步骤中350-450rpm的转速以实现灭活操作。添加甲醛溶液的流速控制在60-100ml/min范围。
4)、灭活操作结束，甲肝灭活病毒液置于37±1℃环境中灭活12天。
4、取样：灭活开始后，每天取样10ml，检验灭活效果；灭活12天各取样5ml，检测抗原含量。
5、数据及分析：
表1 甲醛溶液灭活甲肝病毒试验数据
注：室温，18-26℃；平衡温度，指病毒液与甲醛溶液在灭活前应达到的温度。
用方差方法对抗原含量及达到灭活效果天数分析：分析结果见表2。
表2 主体间效应的检验
a.R方＝.997(调整R方＝.987)
b.R方＝.973(调整R方＝.890)
用方差法对水平比较：
表3 流速
表4 搅拌速度
表5 温度
由上表2可知：在a＝0.05显著水平上，抗原含量随流速的增大差异显著(p＝0.043<0.05)，随流速搅拌速度增加差异不显著(p＝0.094>0.05)，随平衡温度的升高差异极显著(p＝0.004<0.01)。在a＝0.05显著水平上，达到灭活效果的天数随流速的增大差异不显著(p＝0.132>0.05)，随流速搅拌速度增加差异不显著(p＝0.585>0.05)，随平衡温度的升高差异显著(p＝0.034<0.05)。
灭活效果由达到病毒完全灭活所需天数及抗原回收率(由最终病毒液的抗原含量决定)决定，灭活使用天数短且最终病毒液抗原含量高为最优。故对因素水平间比较(见表3、4、5)可知：由平衡温度引起试验组数据差异显著性最大，平衡温度在灭活过程中起到关键作用，经表5中数据比对，平衡温度为室温时，获得抗原含量最高且达到灭活效果时间最短是较优条件；由流速引起试验组数据差异相对显著，经表3数据中比对，流速为80ml/min时是较优条件；由搅拌速度引起试验组数据差异性超出差异显著范围，抗原含量与达到灭活效果的天数差异不明显，为了保持搅拌效果，可选择在灭活时依据病毒液液位在350rpm-450rpm范围内调节搅拌速度。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种在疫苗生产中灭活病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将提纯后的病毒液静置于18-26℃下，甲醛溶液静置条件同病毒液；
(2)静置后的病毒液除菌过滤后，搅拌病毒液；
(3)甲醛溶液加入病毒液中，边加入边搅拌；
(4)将步骤(3)的病毒液静置灭活。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中病毒液静置时间不小于5h。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)搅拌病毒液的速度为350-450rpm。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)搅拌病毒液的速度为350rpm。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)的甲醛溶液是使用pH7.2的0.01mol/L PBS溶液配制，其浓度范围为0.018～0.021g/ml。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中甲醛溶液加入病毒液的流速控制在60-100ml/min。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中甲醛溶液加入病毒液的流速为80ml/min。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中加入甲醛溶液，使灭活液中甲醛终浓度范围为0.009～0.0125g/ml。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)搅拌速度为350-450rpm。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中的步骤(4)静置灭活条件为36-38℃，3-12天。
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