JP6166842B2 - 無タンパク質培地中で懸濁培養されたｍｄｃｋ由来細胞株およびそのような細胞株を使用してウイルスを増殖させる方法 - Google Patents

Description

本発明は、無タンパク質培地中で懸濁培養することができる新規のＭＤＣＫ由来細胞株、およびワクチンを生産するためにそのようなＭＤＣＫ細胞株を使用してウイルスを増殖させる方法に関する。

一般的には、インフルエンザワクチンの生産には受精卵が使用される。しかし、受精卵の使用には以下の欠点がある：生産に適しているニワトリを飼育し、管理しなければならない；インフルエンザワクチンの生産を受精卵の生産範囲に調整しなければならない；および、ワクチンを卵タンパク質に対してアレルギーがある人への接種に適さないものとする卵タンパク質を完全に取り除くことができない。

古くから、上記欠点を有する受精卵の代用として細胞培養物を使用することによって生産されたインフルエンザワクチンについて研究が行われてきた。細胞培養物の使用により、細胞培養に使用される動物細胞を無限に供給できるため、短時間での大量生産が可能になる。加えて、これには、ワクチンを卵タンパク質に対してアレルギーがある人に接種することができること、および受精卵からは単離することができないインフルエンザワクチンを細胞から単離することができるという利点がある。さらに、細胞中で増殖させたウイルスは、受精卵の中よりも少ないウイルス抗原の遺伝子突然変異を示す。

イヌの腎臓から確立されたメイディン・ダービー・イヌ腎臓（Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ）（本明細書中、以後「ＭＤＣＫ」と呼ぶ）細胞株は非常に強い表面接着を示し、動物の血清を使用して培養されており、大量生産には多くの空間が必要であり、これにより高コストが必然的に伴う。また、接着性ＭＤＣＫ細胞株は、高い腫瘍形成性を示すことが報告されている。

したがって、従来の接着性ＭＤＣＫよりも有意に低い腫瘍形成性を示す、動物由来の血清およびタンパク質を含まない培養培地を使用する懸濁培養に適合させた新規のＭＤＣＫ細胞株を開発する必要がある。

したがって、本発明の目的は、ウイルスの抗原性の変化が小さい一方で、低い腫瘍形成性を有し、したがって、ワクチンに使用されるウイルスの生産に有用であり得る、無タンパク質培地中で懸濁培養することができる新規のＭＤＣＫ由来細胞株を提供することである。

本発明の別の目的は、ワクチンを生産するためにＭＤＣＫ由来細胞株を使用してウイルスを増殖させる方法を提供することである。

本発明の目的にしたがうと、無タンパク質培地中で懸濁培養することができるメイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株（受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２９７）が提供される。

本発明の別の目的にしたがうと、以下の工程を含む、ワクチンを生産するためにウイルスを増殖させる方法が提供される：
１）ＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株（受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２９７）をウイルスに感染させる工程；
２）ウイルスに感染したＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株を培養する工程；および
３）工程２）で得た細胞培養物からウイルスを単離する工程。

本発明のＭＤＣＫ由来細胞株は、細胞増殖に異常を生じることなく無タンパク質培地中で懸濁培養することができ、様々なウイルスについて高く、均一な生産性を示し、ウイルスの抗原性の変化が小さい一方で、低い腫瘍形成性を有し、したがって、ワクチンに使用されるウイルスの生産に有用であり得る。

本発明の上記および他の目的は、添付の図面と組み合わせて読まれると、本発明の以下の説明から明らかになるであろう。

図１は、懸濁培養への適応の間の候補の細胞株Ａの細胞状態を示す。 図２は、懸濁培養への適応の間の候補の細胞株Ａの増殖曲線を示す。 図３は、懸濁培養への適応の間の候補の細胞株Ｂの細胞状態を示す。 図４は、懸濁培養への適応の間の候補の細胞株Ｂの増殖曲線を示す。 図５は、候補の細胞株Ａの継代培養の結果を示す。 図６は、候補の細胞株Ｂの継代培養の結果を示す。 図７は、候補の細胞株ＡおよびＢにおけるＨ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの生産性の分析結果を示す。 図８は、候補の細胞株ＡおよびＢにおけるＨ３Ｎ２型のインフルエンザウイルスの生産性の分析結果を示す。 図９は、候補の細胞株ＡおよびＢにおけるＢ型のインフルエンザウイルスの生産性の分析結果を示す。

本発明は、無タンパク質培地中で懸濁培養することができるＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株（受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２９７、本明細書中、以後、「候補の細胞株Ｂ」とも呼ぶ）を提供する。

動物由来の物質を含まない無タンパク質培地中で懸濁培養される本発明のＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株は細胞増殖に異常を有さず、低い腫瘍形成性を示し、そして様々なウイルスについて高く、均一な生産性を示す。

加えて、無タンパク質ＰｒｏＣＨＯ５培地中で懸濁培養される本発明のＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株は、市販されている無血清培地であるＥＸ−ＣＥＬＬ ＭＤＣＫ培地中で懸濁培養される他のＭＤＣＫ細胞株（例えば、候補の細胞株Ａ）と比較して、最大１２８倍の高いＨＡ力価、および最大１０^５倍の優れたＰＦＵ力価を示し、非常に優れたインフルエンザウイルス生産性を示している（表５〜９）。また、候補の細胞株Ａとは異なり、本発明の細胞株は、３回の継代培養の後、ウイルスＨＡ抗原のアミノ酸配列において突然変異を示さず（表１１）、比較的低い腫瘍形成性を有する（表１３）。さらに、本発明の細胞株から生産されたインフルエンザワクチンは、マウスにおいて優れた抗体形成能力を示す（表１４）。したがって、これはワクチンに使用されるウイルスの生産に有用であり得る。

本発明者らは、ＭＤＣＫ由来の候補の細胞株Ｂを「ＭＤＣＫＳ−ＭＧ」と命名し、これを、２０１３年５月１５日に受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２９７として韓国細胞株研究財団（Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）に寄託した。

本発明では、「無タンパク質培地」は、動物由来の血清を含有していない無血清培地、特に、１０ｋＤａ以上の分子量を持つタンパク質が全く添加されていない培養培地をいう。一例として、本発明の無タンパク質培地は、好ましくは、血清またはタンパク質が全く添加されていないＰｒｏＣＨＯ５培地である。

本発明のＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株は、例えば、以下の工程を含む方法にしたがって生産することができる：
（ａ）接着性ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−３４）を解凍し、続いて、それらを血清培地中で培養する工程；
（ｂ）工程ａ）で得た細胞を接着状態で継代培養する工程；および
（ｃ）工程ｂ）で得た細胞を、それぞれの継代で血清含有量を減らし、ＰｒｏＣＨＯ４培地（２％のＦＢＳ）をＰｒｏＣＨＯ５培地（無血清）で置き換え、そして５％のＣＯ_２インキュベーター中で１２０〜１３０ｒｐｍでこれらを撹拌することにより懸濁培養に適応させる工程。

本明細書中以後、以下の工程を使用して本発明のＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株を生産する方法を具体的に説明する。

工程（ａ）
最初に、親細胞として使用する接着性ＭＤＣＫ細胞についての情報は以下のとおりである：
メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ）細胞。

工程（ａ）では、ＭＤＣＫ親細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−３４）を解凍した後、これらを、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有しているＥＭＥＭ培地中で、３７℃および５％のＣＯ_２の環境下で培養する。

工程（ｂ）
工程（ｂ）では、３〜４日後に、工程（ａ）で得た細胞を、０．２５％のトリプシンＥＤＴＡを使用してフラスコの底でそれらを懸濁することによって回収することができる。細胞は、１：４〜１：５０の細胞量の比で接着状態で継代培養することができる。継代率は細胞増殖速度に応じて異なり得るが、好ましくは、１：４〜１：３０である。

工程（ｃ）
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で得た細胞を、それぞれの継代で血清含有量を減らし、ＰｒｏＣＨＯ４培地（２％のＦＢＳ）をＰｒｏＣＨＯ５培地（無血清）で置き換え、そして５％のＣＯ_２インキュベーター中で１２０〜１３０ｒｐｍでこれらを撹拌することにより懸濁培養に適応させる。

細胞を、血清含有量を減少させ、０日目〜２４日目はＰｒｏＣＨＯ４培地（２％のＦＢＳ）中で、２４日目〜３２日目はＰｒｏＣＨＯ４培地（１％のＦＢＳ）中で、３２日目〜３６日目はＰｒｏＣＨＯ４およびＰｒｏＣＨＯ５の混合培地（５０：５０、１％のＦＢＳ）中で、３６日目〜３９日目はＰｒｏＣＨＯ４およびＰｒｏＣＨＯ５の混合培地（３３：６７、０．５％のＦＢＳ）中で、３９日目〜４２日目はＰｒｏＣＨＯ４およびＰｒｏＣＨＯ５の混合培地（２０：８０）中で、そして４２日目以降はＰｒｏＣＨＯ５培地（無タンパク質）中で、例えば、５％のＣＯ_２インキュベーター中で１２０〜１３０ｒｐｍでこれらを撹拌することにより、懸濁培養に適応させる。

ＰｒｏＣＨＯ５培地は、Ｌ−グルタミン（ロンザ社（Ｌｏｎｚａ））を含有し得、Ｌ−グルタミンを含有している市販されている製品としては、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（インヴィトロジェン社（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ＧｌｕｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ（商標）（ａｔｌａｎｔａｂｉｏ社）、ＣｅｌｌＢｏｏｓｔ（商標）（ハイクローン社（ＨｙＣｌｏｎｅ））、ＲＳ−ＣＨＯ（商標）（シェフィールド社（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ））などを挙げることができる。

上記方法により生産されたＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株は、長期間継代培養した場合でもなお、それぞれの継代において等しいレベルの細胞増殖速度（図６）と、約９７％以上の高い生存率を示す。加えて、これは、グルコース、乳酸塩、グルタミンおよびグルタミン酸塩のような基質の代謝、またはウイルス生産能力において、継代間でほとんど差異を示さない。したがって、本発明のＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株はウイルスの増殖に有用であり得る。

本発明は、上記ＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株を使用してウイルスを増殖させる方法を提供する。加えて、本発明は、上記方法により生産したウイルス、例えば、上記方法により生産したインフルエンザウイルスを提供する。本発明のＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株により生産されたウイルスは、ワクチンに、ウイルス感染の診断に、または抗体の生産もしくは抗体の生産の評価のための抗原として使用することができる。

したがって、本発明は、上記ＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株を使用してワクチンを生産するためにウイルスを増殖させる方法を提供する。

具体的には、本発明は、以下の工程を含む、ウイルスを増殖させる方法を提供する：
１）ＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株（受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２９７）をウイルスに感染させる工程；
２）ウイルスに感染したＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株を培養する工程；および
３）このようにして得た細胞培養物からウイルスを単離する工程。

したがって、本発明は上記方法により生産されたワクチンを提供する。

ウイルスは、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、おたふくかぜウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、１型単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−１、ＨＳＶ−１）、２型ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ−２、ＨＶ−２）、麻疹ウイルス、２型および３型レオウイルス、呼吸器合抱体（ＲＳ）ウイルス、狂犬病ウイルス、黄熱病ウイルス、４型アデノウイルス、ラッサ熱ウイルス、ワクシニアウイルス、パルボウイルス、Ｂ３、Ｂ４、およびＢ５型コクサッキーウイルス、ならびに水泡性口内炎ウイルスからなる群より選択され得、好ましくは、インフルエンザウイルスであり得る。

インフルエンザウイルスは、螺旋状ＲＮＡウイルスの中でもオルトミクソウイルスに属するウイルスであり得る。これはＡ型、Ｂ型、またはＣ型インフルエンザウイルス、好ましくは、Ａ型またはＢ型インフルエンザウイルスであり得る。

本発明の１つの実施形態にしたがうと、インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１型ウイルス（例えば、Ａ／ＷＳ／３３、ＩＶＲ（ワクチン研究イニシアチブ（Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））−１１６、ＩＶＲ−１４８、ＩＶＲ−１４５、またはＮＹＭＣ（ニューヨーク医科大学（ＮｅｗＹｏｒｋ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌａｇｅ））Ｘ−１８１）；Ｈ３Ｎ２型ウイルス（例えば、Ａ／香港／８／６８、ＮＹＭＣ Ｘ−１６１Ｂ、ＮＹＭＣ Ｘ−１８７、ＮＹＭＣ Ｘ−１５７、またはＩＶＲ−１４７）；またはＢ型ウイルス（例えば、Ｂ／リー／４０、Ｍ／マレーシア／２５０６／２００４、Ｂ／フロリダ／４／２００６またはＢ／ブリスベン６０／２００８）であり得る。

ＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株をウイルスに感染させる上記方法では、細胞株を適切な量（例えば、０．０１ＭＯＩ）の滅菌されたウイルス溶液と混合することにより、上記細胞株を感染させることができる。インフルエンザウイルスに感染したＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株を培養するための条件は、上記細胞株についての条件と同じである。

本発明の１つの実施形態にしたがい、ウイルスの遺伝的安定性を、ＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株中でインフルエンザウイルスを継代し、継代したウイルスの主要な表面抗原であるＨＡおよびＮＡのアミノ酸配列を決定することにより比較した。結果として、候補の細胞株Ａの中で継代されたウイルスとは異なり、ＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株中で継代したウイルスのＨＡおよびＮＡのアミノ酸配列が安定であり、３回の継代まで遺伝子突然変異を持たないことが明らかになった（実施例３）。

加えて、インフルエンザウイルスを、ＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株をインフルエンザウイルスに感染させ、この細胞株を培養することによって生産した。このようにして生産したインフルエンザウイルスを、不活化された粉砕された処方物としてインフルエンザワクチンを生じるように精製した。生産したワクチンを６週齢の雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスに投与し、血清中のＨＩ力価を分析した。結果として、ワクチンを投与したマウスにおいて抗体形成能力が生じたことが明らかになった。したがって、本発明のＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株は、ワクチン用のインフルエンザウイルスの生産に有用である（実施例５）。

本明細書中以後、本発明を具体的に説明する。以下の実施例は本発明をさらに説明するために意図され、その範囲を限定することはない。

実施例１
候補の細胞株の選択プロセス
１．１．接着性ＭＤＣＫ細胞の解凍
凍結保存された接着性ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−３４から入手）を解凍し、１５ｍＬの血清培地（１０％のＦＢＳを補充したＥＭＥＭ培地）（ロンザ社から入手）中で培養した。ＬＮ２タンクの中で保存した細胞を３７℃の水浴に入れ、解凍した。再懸濁した細胞溶液を、血清培地を含むＴ７５フラスコに添加し、その後、３７℃および５％のＣＯ_２インキュベーターの中で培養した。

１．２．接着培養
３〜４日後、１．１により得た細胞を、１：４〜１：３０の比で継代培養した。母細胞を５５回の継代のものとした。継代培養は以下の手順によって行った。

Ｔ７５フラスコを１．１のインキュベーターから取り出し、培地を取り除き、洗浄した。細胞を、０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡでの処理により剥離し、所望する比になるように血清培地でピペッティングすることにより再懸濁した。継代培養は、１：４〜１：３０の継代培地比（ｐａｓｓａｇｅ ｒａｔｉｏ）で３日〜４日毎に行った。

接着培養は懸濁培養への適応の前に行った。

１．３．懸濁培養への適応
１．２から得た接着細胞を、ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ １．２（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））、ＵｌｔｒａＭＤＣＫ（商標）（ロンザ社）およびＶＰ−ＳＦＭ（商標）（インビトロジェン社）などのような６種の市販されている無血清培地を使用して懸濁培養に適応させた。これらのうちの２種の培地が懸濁培養に適していることが明らかになり、様々な細胞株のうちの１０種以上をこれらから得た。懸濁培養に最も適している候補のＭＤＣＫ細胞株のうちの２種（候補の細胞株ＡおよびＢ）を選択した。候補の細胞株ＡおよびＢについての具体的な懸濁培養への適応手順は以下のとおりである。

１．３．１．候補の細胞株Ａの懸濁培養への適応のためのプロセス
１．１および１．２に記載した手順にしたがい、凍結保存した接着性ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−３４）を解凍し、接着状態で３回継代培養した。次に、５％のＦＢＳを補充したＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ培地（シグマ社、６ｍＭのＬ−グルタミンを含有している）中への５ｅ＋０５細胞／ｍＬの濃度での懸濁後、細胞を、１２５ｍＬの三角フラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ ｆｌａｓｋ）に入れ、１２０ｒｐｍ〜１３０ｒｐｍのインキュベーターの中で撹拌し、オービタルシェーカー（作業容量（本明細書中以後「Ｗ．Ｖ．」）：１０ｍＬ、最初の細胞接種濃度：５ｅ＋０５細胞／ｍＬ、ｐ８０）中で懸濁培養した。

最初の細胞接種濃度を、３日〜４日毎に、５ｅ＋０５細胞／ｍＬ以上になるように調整し、ＦＢＳ濃度をそれぞれの継代の開始時に５％から下げた。候補の細胞株Ａの懸濁培養への適応のための混合物についてまとめた表を以下の表１に示す。

候補の細胞株Ａの懸濁培養への適応のための経過は以下の通りである。

１３日目に細胞増殖が起こり始め、１５日目から細胞状態が改善し９０％以上の生存率となった。２３日目には、３回連続して４倍以上の細胞数に到達し、９０％以上の生存率を有していた。３０日目には、細胞増殖が４倍以上になり、９７％の生存率を有している細胞株が得られた。この時点で、候補の細胞株Ａの懸濁培養への適応を完了した。

候補の細胞株Ａの懸濁培養への適応の６日目および４１日目の細胞状態を図１に示し、候補の細胞株Ａの増殖曲線（細胞密度および生存率）を図２に示した。

図１に示すように、６日目の細胞状態は、多くの死滅した細胞を含む膨張および凝集を明らかにし、一方、４１日目の細胞状態は、ほぼ等しい大きさの細胞形状および高い生存率を明らかにした。

１．３．２．候補の細胞株Ｂの懸濁培養への適応のプロセス
１．１および１．２に記載したプロセスにしたがって、凍結保存した接着性ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−３４から入手）を解凍し、接着状態で３回継代培養した。次に、２％のＦＢＳを補充したＰｒｏＣＨＯ４培地（ロンザ社、４ｍＭのＬ−グルタミンを含有している）中への５ｅ＋０５細胞／ｍＬの濃度での再懸濁の後、細胞を５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０ｒｐｍ〜１３０ｒｐｍでインキュベーターの中で撹拌し、そしてオービタルシェーカー中で培養した（Ｗ．Ｖ．：１３０ｍＬ、最初の細胞接種濃度：７ｅ＋０５細胞／ｍＬ、ｐ７６）。

最初の細胞接種濃度を、３日〜４日毎に、５ｅ＋０５細胞／ｍＬ以上になるように調整し、ＦＢＳ濃度をそれぞれの継代の開始時に２％から下げた。候補の細胞株Ｂの懸濁培養への適応のための混合物についてまとめた表を以下の表２に示す。

候補の細胞株Ｂの懸濁培養への適応のための経過は以下の通りである。

２１日目に細胞増殖が起こり始め、細胞状態が改善し９０％以上の生存率となった。２４日目には、２回の倍加の後、ＦＢＳ濃度を１％に下げた。３２日目には、細胞を、ＰｒｏＣＨＯ４からＰｒｏＣＨＯ５への培地の置き換えに適応させつつ、ＰｒｏＣＨＯ４（２％のＦＢＳを含有している）をＰｒｏＣＨＯ５（無血清培地、ロンザ社、カタログ番号１２−７６６Ｑ）で置き換えた。５６日目までは、細胞を、細胞増殖の低下が原因の３日〜４日毎のＷ．Ｖ．の低下を伴いながら、継代培養した。この期間内に、生存率は３０％〜４０％の範囲に低下した。５９日後、細胞増殖がゆっくりと起こり始め、生存率もまた約８０％に回復した。９５日目に、細胞増殖が安定した状態にあり、細胞が倍加していることを観察した。このことは、９０％以上の生存率を示している。９９日目に、細胞は４倍以上の細胞増殖を示し、９９％の生存率（Ｗ．Ｖ．２００ｍＬ以上）を有している細胞株が得られた。

候補の細胞株Ｂの懸濁培養への適応の２４日目および１２６日目の細胞の状態を図３に示し、候補の細胞株Ｂの増殖曲線（細胞密度および生存率）を図４に示す。図３に示すように、２４日目の細胞の状態は、いくらかの死滅した細胞を含む大きな凝集を明らかにし、一方、１２６日目の細胞の状態は、ほぼ等しい大きさの細胞の形状および高い生存率を明らかにした。

実施例２
候補の細胞株の比較分析および生産細胞株の選択
２．１．長期間の継代培養の間の細胞株の安定性の比較
２．１．１候補の細胞株Ａ
それぞれの継代で候補の細胞株Ａの細胞増殖を決定するために、細胞株Ａを、１００日間３日〜４日毎に１回、細胞数を５ｅ＋０５細胞／ｍＬに調整するために、細胞を遠心分離し、培養培地を取り除き、続いて新しい培地を投入することにより継代培養した。候補の細胞株Ａの継代培養の結果を図５に示す。

図５に示すように、３５回以上の継代を含む長期にわたる培養（ｐ８５＋３５：懸濁培養前の８５回の継代、および懸濁後の３５回の継代）においてもなお、候補の細胞株Ａはそれぞれの継代でほぼ等しいレベルの細胞増殖を示した。

２．１．２．候補の細胞株Ｂ
実施例１において懸濁培養への適応を完了したそれぞれの継代での候補の細胞株Ｂの細胞増殖を決定するために、細胞株Ｂを、２７４日間３日〜４日毎に１回、細胞数を５ｅ＋０５細胞／ｍＬに調整するために、細胞を遠心分離し、培養培地を取り除き、続いて新しい培地を投入することにより継代培養した。候補の細胞株Ｂの継代培養の結果を図６に示す。

図６に示すように、５１回以上の継代を含む長期にわたる培養（ｐ８５＋５１：懸濁培養前の８５回の継代、および懸濁後の５１回の継代）においてもなお、候補の細胞株Ｂは、４５回の継代（ｐ８９＋４５）まで、それぞれの継代でほぼ等しいレベルの細胞増殖を示した。

２．２．継代間での倍加時間および最大生存可能細胞密度の比較
候補の細胞株ＡおよびＢの細胞密度および細胞生存率を使用して、倍加時間（Ｔ_ｄ）を測定し、最大生存細胞密度を決定した。

本明細書中では、Ｔ_ｄは、毎日測定した細胞の数に基づいて対数期において以下の式にしたがって計算し、そして最大生存細胞密度（ＶＣＤ_ｍａｘ）は、４日〜７日の間にそのピークを示した毎日測定した細胞数の最大値により表した。細胞生存率を血球計数器を使用して測定した。

式中、
μは比増殖速度であり；
ｘは細胞数であり；
ｄｔは時間の変化量であり；
ｄｘ’は細胞数の変化量であり、
Ｉｎ２は細胞数が２倍になる値であり；そして
μｍａｘは比増殖速度の最大値である。

候補の細胞株Ａにおいては、ｐ８５＋７からｐ８５＋４５の継代の間で、Ｔｄおよび最大生存細胞密度は同じレベルであった。平均すると、Ｔｄは約２８時間であり、最大生存細胞密度は５．２８±０．７９ｅ＋０６細胞／ｍＬであり、細胞生存率は９７％以上であった。

候補の細胞株Ｂにおいては、ｐ８９＋２からｐ８９＋３３の継代の間で、Ｔｄおよび最大生存細胞密度は同じレベルであった。平均すると、Ｔｄは約３８時間であり、最大生存細胞密度は２．６０±０．６２ｅ＋０６細胞／ｍＬであり、細胞生存率は９７％以上であった。

２．３．候補の細胞株のインフルエンザウイルスの生産性の比較
候補の細胞株ＡおよびＢを使用して、Ｈ１Ｎ１型ウイルス（Ａ／ＷＳ／３３、ＩＶＲ−１１６、ＩＶＲ−１４８、およびＩＶＲ−１４５）；Ｈ３Ｎ２型ウイルス（Ａ／香港／８／６８、ＮＹＭＣ Ｘ−１６１Ｂ、ＮＹＭＣ Ｘ−１５７、およびＩＶＲ−１４７）；およびＢ型ウイルス（Ｂ／リー／４０、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４、およびＢ／ブリスベン６０／２００８）を増殖させた。

候補の細胞株ＡおよびＢをインフルエンザウイルスに感染させるために、ＥＸ−ＣＥＬＬ ＭＤＣＫ培地（シグマ社）およびＰｒｏＣＨＯ５培地（ロンザ社から入手）にそれぞれ、０．０１ＭのＭＯＩおよび１０μｇ／ｍＬのＴＰＣＫ−トリプシンを添加し、３３℃〜３７℃、５％のＣＯ_２で振盪させながら懸濁培養した。そこから７日間、１ｍＬの各試料をピペットを使用して毎日回収し、候補の細胞株ＡおよびＢの生産性をＨＡアッセイ（ヘマグルチニンアッセイ）およびＰＦＵ（プラーク形成単位）により評価した。

ＨＡ力価およびＰＦＵ力価を文献［Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ＷＨＯ］に開示されている方法にしたがって測定した。

結果として、候補の細胞株Ｂにおいて４つのタイプのＨ１Ｎ１型ウイルスおよび４つのタイプのＨ３Ｎ２型ウイルスが、候補の細胞株Ａと比較してより迅速により高い力価を示した（図７および図８）。ＩＶＲ−１４７が候補の細胞株ＡにおいてはＨＡ力価を全く示さなかったことに留意されるべきである（図８）。また、４つのタイプのＢ型ウイルスが、候補の細胞株Ｂにおいて、細胞株Ａと比較してより迅速により高い力価を示した（図９）。

それと同時に、候補の細胞株Ａにおける１１のタイプのインフルエンザウイルスのＨＡ力価に対する比として表した候補の細胞株ＢにおけるＨＡ力価（すなわち、候補の細胞株Ａにおける１１のタイプのインフルエンザウイルスのＨＡ力価を１と設定する）を、表４〜６に示す。結果として、候補の細胞株Ｂにおける生産性のレベルは、候補の細胞株Ａと比較すると同じであったかまたは高く、特に、ＩＶＲ−１４７ウイルスの生産性が１２８倍高いことが明らかになった。

また、候補の細胞株Ａにおける１１のタイプのインフルエンザウイルスのＰＦＵ力価に対する比として表した候補の細胞株ＢにおけるＰＦＵ力価（すなわち、候補の細胞株Ａにおける１１のタイプのインフルエンザウイルスのＰＦＵ力価を１と設定する）を表７〜９に示した。結果として、１１のタイプのウイルスの候補の細胞株Ｂにおける生産性のレベルは、候補の細胞株Ａと比較すると同じであったかまたは高く、特に、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８ＩＶＲ−１ウイルスの生産性が最高で１０^５倍高かったことが明らかになった。

２．４．候補の細胞株Ｂおよび接着性ＭＤＣＫにおけるインフルエンザウイルスの生産性の比較
候補の細胞株Ｂ、および血清含有培地を利用する接着性ＭＤＣＫを使用して、９つのタイプのインフルエンザウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１型ウイルス（ＩＶＲ−１１６、ＩＶＲ−１４８、およびＩＶＲ−１４５）；Ｈ３Ｎ２型ウイルス（ＮＹＭＣ Ｘ−１６１Ｂ、ＮＹＭＣ Ｘ−１５７、およびＩＶＲ−１４７）；およびＢ型ウイルス（Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４、Ｂ／フロリダ／４／２００６、およびＢ／ブリスベン６０／２００８）を増殖させた。

候補の細胞株Ｂおよび接着性ＭＤＣＫをインフルエンザウイルスに感染させるために、１０％のウシ血清を含有しているＰｒｏＣＨＯ５（商標）（ロンザ社から入手）およびＥＭＥＭ（ロンザ社）にそれぞれ、０．０１ＭＯＩのウイルスおよび１０μｇ／ｍＬのＴＰＣＫ−トリプシンを添加した。５％のＣＯ_２の存在下で懸濁培養しようとする候補の細胞株Ｂを、３３℃〜３７℃で振盪させながら懸濁培養し、一方、接着性ＭＤＣＫを、振盪させずに上記と同じ条件下で培養した。培養から２日目および３日目に、１ｍＬの各試料をピペットを使用して回収し、候補の細胞株Ｂおよび接着性ＭＤＣＫの生産性をＨＡアッセイおよびＰＦＵにより評価した。

ＨＡ力価およびＰＦＵ力価を、文献［Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ＷＨＯ］に開示されている方法にしたがって測定した。２日目から３日目の間の最高の力価を最大力価とみなし、これを比較に使用した。

結果として、候補の細胞株Ｂとともに用いた３つのタイプのＨ１Ｎ１型ウイルスが、同じまたは最大で２倍高いＨＡ力価を示した。ＰＦＵのレベルもまた、２倍高いかまたは０．３倍低いことが示されたが、差は実験誤差の範囲内であり、したがってこれらは同様のレベルであると決定した。３つのタイプのＨ３Ｎ２型ウイルスが、候補の細胞株Ｂ中で、接着性ＭＤＣＫ中よりも８倍高いＨＡ力価を示し、ＰＦＵ力価が少なくとも１００倍高いことが示された。特に、Ｂ型であるＢ／ブリスベン／６０／２００８は候補の細胞株Ｂ中で１０^７倍高いＰＦＵ力価を示した（表１０）。

２．５．生産細胞株の選択
上記結果に基づき、細胞株Ｂを本発明の生産細胞株として選択し、「ＭＤＣＫＳ−ＭＧ」と命名した。これを、これを、２０１３年５月１５日に受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２９７として韓国細胞株研究財団（Ｋｏｒｅａ ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）に寄託した。

実施例３
ウイルスの遺伝的安定性の比較
インフルエンザウイルスは、遺伝子情報の変化が宿主中での増殖の間に起こった場合は、変化した遺伝子配列にしたがって増殖する。そのような変異したタンパク質は、ＨＡ抗原またはＮＡ抗原のような主要な表面抗原であり得る。結果として、変化した表面抗原により誘導された抗体は期待されるワクチン効果を示さない場合がある。

したがって、候補の細胞株ＡおよびＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株中で継代したウイルスを、主要な表面抗原ＨＡおよびＮＡのアミノ酸配列におけるあらゆる変化について試験し、抗体の形成に対する効果をあらゆる変化について試験した。

具体的には、ＮＣＢＩに登録されている基本的な遺伝子配列（「参照（Ｒｅｆ．）」）を参照して、細胞株ＡおよびＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株中で生産されたインフルエンザウイルスの遺伝子配列を、受精卵の中で生産されたインフルエンザウイルスと比較した。

最初に、受精卵由来のウイルスをＮＩＢＳＣから入手し、ＨＡおよびＮＡ抗原のアミノ酸配列を試験した。候補の細胞株ＡおよびＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株を、Ｈ１Ｎ１型ウイルス（ＩＶＲ−１１６、ＩＶＲ−１４８、ＩＶＲ−１４５、およびＮＹＭＣ Ｘ−１８１）；Ｈ３Ｎ２型ウイルス（ＮＹＭＣ Ｘ−１６１Ｂ、ＮＹＭＣ Ｘ−１５７、ＩＶＲ−１４７、およびＮＹＭＣ Ｘ−１８７）；およびＢ型ウイルス（Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４、およびＢ／ブリスベン６０／２００８）に３継代にわたり感染させた。その後、候補の細胞株ＡおよびＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株の継代１および継代３から得たインフルエンザウイルス中のＨＡおよびＮＡ抗原のアミノ酸配列におけるあらゆる変化について試験を行った。ＨＡおよびＮＡのアミノ酸配列の比較結果を、それぞれ表１１および１２に示す。

アミノ酸配列の分析はＣｏｓｍｏ ｇｅｎｅｔｅｃｈ社を参考にし、ここでは、標準的なウイルスのアミノ酸と比較して変化していたアミノ酸（ａ．ａ）とその部位（「アミノ酸（ａ．ａ）部位」）を決定した。受精卵由来のウイルスを「受精卵」の列に示した。

以下の表１１に示すように、細胞株Ａの中で３継代まで継代培養したウイルスのＨＡアミノ酸配列が、３つのタイプの株（ＩＶＲ−１１６、ＩＶＲ−１４５、およびＮＹＭＣ Ｘ−１８１）において変化していたことが明らかになった。しかし、ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株は、アミノ酸に全く変化を示さなかった。

また、表１２に示すように、ＮＡアミノ酸配列は変異したアミノ酸を全く含まず、候補の細胞株ＡおよびＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株由来のウイルスと、受精卵由来のウイルスとの間でアミノ酸配列に有意な変化はなかった。このように、ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株は、ウイルスの増殖の間、３継代までは有意な遺伝子突然変異を有さないことが明らかになった。

実施例４
腫瘍形成性の比較（マウスのインハウス（ｉｎ ｈｏｕｓｅ）腫瘍形成性）
ＭＤＣＫ細胞は、接着細胞として培養された場合には腫瘍形成性を有することが知られており、腫瘍形成性は懸濁培養されると増大する傾向がある。腫瘍形成性は、細胞自体を非常に感度が高いヌードマウスに投与することにより評価することができる。生物学的製品の生産にＭＤＣＫ細胞のような動物細胞を使用するためには、それらの安全性が十分に立証されなければならない。生産細胞として使用されるためには、細胞が低い腫瘍形成性を有するか、または腫瘍形成性を有さないことが好ましい。

細胞株ＡおよびＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株の腫瘍形成性を比較するために、以下のような実験を行った。細胞株ＡまたはＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株を１グループあたり１０匹のヌードマウスに皮下に、１０^３細胞／ｍＬ（１．００ｅ＋０３）、１０^５細胞／ｍＬ（１．００ｅ＋０５）または１０^７細胞／ｍＬ（１．００ｅ＋０７）の濃度で注射し、腫瘍の形成を１１週間観察した。腫瘍の大きさが１００ｍｍ^３以上になっていれば、腫瘍の形成を陽性と決定した。陰性対照グループにはＰＢＳを注射し、陽性対照グループにはＨｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ）を１０^７細胞／ｍＬの濃度で移植し、腫瘍の形成を観察した。腫瘍の形成を示しているマウスの数の結果を表１３に示す。

表１３に示すように、細胞株Ａを注射したグループは、１０^５細胞／ｍＬでは２匹のマウスが、そして１０^７細胞／ｍＬでは９匹のマウスが腫瘍の形成を示し、陽性対照グループ（Ｈｅｌａ細胞）もまた９匹のマウスにおいて腫瘍の形成を示した。しかし、ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株を注射したグループは１０^７細胞／ｍＬでわずかに１匹のマウスにおいて腫瘍の形成を示したにすぎなかった。したがって、ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株の腫瘍形成性が細胞株Ａよりも有意に低いことが明らかになった。

実施例５
免疫原性の確認（マウスのインハウスでの研究）
ワクチンの最も重要な役割は、免疫を付与するための抗体形成能力である。インフルエンザウイルスに対する抗体の生産を確認するための典型的な方法は、ＨＩアッセイと呼ばれる生物学的アッセイである。したがって、ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株中で増殖させたインフルエンザウイルスの抗体形成能力を確認するために、以下の手順を行った。

実施例２に記載した方法と同じ方法で、ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株中で増殖させた本発明の３つのタイプのインフルエンザウイルス（Ａ／カリフォルニア／７／２００９（ＮＹＭＣ Ｘ−１８１）、Ａ／ビクトリア／２１０／２００９（ＮＹＭＣ Ｘ−１８７）およびＢ／ブリスベン／６０／２００８（山形系統））を超高速遠心分離を使用して遠心分離した。より純度の高いウイルスを得るために、スクロースを、２０％、２５％、および３０％の様々な濃度勾配で添加し、ウイルス層だけを単離した。透析によりスクロースを除去した後、ウイルスをＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を使用して粉状に砕き、最後に滅菌フィルターを通して濾過して、ウイルスワクチンを得た。

一方、このようにして得た６週齢の雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスを、１グループあたり８匹のマウスで各グループに割り当て、３μｇ、１μｇ、および１μｇのウイルスワクチンを筋肉内注射によりグループにそれぞれ投与した。ワクチンは２週間の間隔で２回投与した。ＨＩ分析を、最初のワクチン接種後７週のマウスの血清を使用して行った。血清は、注射器を使用して眼静脈から血液をサンプリングすることにより得、続いて６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。

ＨＩアッセイは、文献［Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ］の中で開示されている方法にしたがって実施例２と同じ様式で行った。マウスの総数に対する４０以上のＨＩ力価を有しているマウスの数の比；幾何平均抗体価（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ Ｍｅａｎ Ｔｉｔｒｅ（ＧＭＴ））；およびグループ内でのＨＩ力価の範囲を以下の表１４に示す。

表１４に示すように、１μｇ以上のウイルスワクチンを投与したグループでは、グループ内の全マウスのうち４０以上のＨＩ力価を有しているマウスの割合（％）は７０％以上であり、本発明のワクチンが抗体形成能力を有していることを述べている。

したがって、本発明のＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株中で生産された抗原は優れた抗体形成能力を有しており、ワクチン用のインフルエンザウイルスの生産に使用することができる。

本発明を上記具体的な実施形態に関して記載してきたが、当業者が様々な改変および変更を本発明に対して行うことができ、それらもまた添付の特許請求の範囲により定義されるような本発明の範囲に含まれることが理解されるものとする。

Claims (6)

1. 無タンパク質培地中で懸濁培養することができるメイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株（受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２９７）。
2. 無タンパク質培地がＰｒｏＣＨＯ（登録商標）５である、請求項１に記載のＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株。
3. ウイルスを増殖させる、請求項１に記載のＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株。
4. ウイルスが以下からなる群より選択される、請求項３に記載のＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株：
   インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、おたふくかぜウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、１型単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−１、ＨＳＶ−１）、２型ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ−２、ＨＶ−２）、麻疹ウイルス、２型および３型レオウイルス、呼吸器合抱体（ＲＳ）ウイルス、狂犬病ウイルス、黄熱病ウイルス、４型アデノウイルス、ラッサ熱ウイルス、ワクシニアウイルス、パルボウイルス、Ｂ３、Ｂ４、およびＢ５型コクサッキーウイルス、ならびに水泡性口内炎ウイルス。
5. インフルエンザウイルスが、Ａ／ＷＳ／３３、ワクチン研究イニシアチブ（Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ＩＶＲ）−１１６、ＩＶＲ−１４８、ＩＶＲ−１４５、ニューヨーク医科大学（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌａｇｅ）（ＮＹＭＣ）Ｘ−１８１、Ａ／香港／８／６８、ＮＹＭＣ Ｘ−１６１Ｂ、ＮＹＭＣ Ｘ−１８７、ＮＹＭＣ Ｘ−１５７、ＩＶＲ−１４７、Ｂ／リー／４０、Ｍ／マレーシア／２５０６／２００４、Ｂ／フロリダ／４／２００６またはＢ／ブリスベン６０／２００８である、請求項４に記載のＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株。
6. 以下の工程を含む、ワクチンを生産するためにウイルスを増殖させる方法：
   １）ＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株（受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２９７）をウイルスに感染させる工程；
   ２）ウイルスに感染したＭＤＣＫ由来ＭＤＣＫＳ−ＭＧ細胞株を培養する工程；および
   ３）工程２）で得た細胞培養物からウイルスを単離する工程。

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