KR20110099810A

KR20110099810A - 포르말린 및 ｕｖ광으로의 처리에 의한 샘플 중 병원균의 불활성화

Info

Publication number: KR20110099810A
Application number: KR1020117020020A
Authority: KR
Inventors: 만프레드 라이터; 볼프강 문트; 노엘 바레트; 오트프리드 키스트너
Original assignee: 백스터 인터내셔널 인코포레이티드; 박스터 헬쓰케어 에스.에이.
Priority date: 2004-05-27
Filing date: 2005-05-26
Publication date: 2011-09-08
Also published as: EP1753470B1; EP1753470A1; WO2005118000A1; KR101483337B1; AU2005249204A1; IL179262A0; CA2567336C; EA010428B1; JP5675690B2; JP2012143249A; CN1956739B; AU2005249204B2; ECSP067118A; JP2008500303A; NO20065912L; CA2567336A1; EA200602206A1; IL179262A; JP5502276B2; BRPI0511467A

Abstract

본 발명은 유효 농도의 포르말린으로 바이러스 함유 샘플을 처리하고, 유통 장치 중에서 유효 조사량의 UV광으로 샘플을 처리함으로써, 샘플 중의 바이러스를 불활성화시키는 방법에 관한 것이다.

Description

포르말린 및 ＵＶ광으로의 처리에 의한 샘플 중 병원균의 불활성화 {Inactivation of a Pathogen in a Sample by a Treatment with Formalin and UV Light}

본 발명은 유효 농도의 포르말린으로 바이러스 함유 샘플을 처리하고, 유통 장치(flow-through apparatus) 중에서 유효 조사량의 UV광으로 샘플을 처리함으로써, 샘플 중의 바이러스를 불활성화시키는 방법에 관한 것이다.

의약품 중 병원균의 효과적인 불활성화는, 이미 공지되지 않은 질환이 치료제의 투여를 통해 신속히 확산될 수 있음이 발견되었기 때문에 공공 건강 중대사였다. 따라서, 그 사용에 의한 제제 전달의 위험을 감소시키기 위해 의도된 더욱 엄격한 표준 하에 생물공학 제품이 도래하고 있다. 잠재적 오염물은 혈액 제품의 제조 뿐만 아니라, 안전한 백신의 제조에서도 문제이다.

병원균에 대항하는 백신, 특히 바이러스 백신의 제조 시 가장 결정적인 단계의 하나는 바이러스 불활성화이다. 바이러스 불활성화의 경우, 포르말린이 백신의 제조 시 가장 빈번히 사용된 불활성화제이다. 포르말린 불활성화 단계는 입증된 분석적 절차로 공인되어 왔다. 그러나, 매우 엄격한 품질 조절 시험, 예컨대 포유류 세포 배양 시험, 즉 베로(Vero) 안전성 시험의 도입은, 일부 경우에 잔류 감염성의 증거가 입증되었다. 이러한 잔류 감염성의 제거를 위한 노력에서, 군체 및/또는 여액의 기계적 분열이 성공적이지 못한 것으로 판명되었다.

포르말린 처리에 대한 대안으로서, UV 불활성화가 제조 공정으로 통합될 것이 고려되었다. 인간 백신에 대한 자외선 조사 불활성화의 사용은 이전에도 입증되었다. 밀쩌 등 (Milzer et al., Am. J. Pub. Health (1954) 44:26-33) 및 월프 등 (Wolf et al., JAMA (1956) 161:775-81)은 이들이 UV 불활성화된 폴리오 백신을 사용하는 경우, 인간에서의 연구로부터의 면역원성 결과에 대해 보고하였다. 폴리오바이러스는 단일 단편 중 양성 단일 스트랜드 RNA 게놈을 갖는 외피가 없는 (unenveloped) 피코나바이러스이다. 바이러스 게놈은 바이러스 표면 항원보다 UV 손상에 대해 더욱 민감하기 때문에, 폴리오바이러스 캡시드 단백질의 경우, UV 불활성화는 제품의 생화학적 특성 또는 면역원성에 대해 부정적인 효과가 거의 없는 것으로 나타났다. UV 불활성화에 대한 표적은, 포르말린에 의해 표적화된 단백질과는 대조적으로 주로 핵산이다. 포르말린 및 UV 불활성화를 조합함으로써, 과학자들은 특히 탄력있는 폴리오바이러스를 불활성화시킬 때, 각각 분리된 UV 불활성화 또는 포르말린 불활성화의 한계를 극복하기 위해 노력하였다. 예를 들어, 문헌 [McLean, et al., "Experiences in the Production of Poliovirus Vaccines," Prog. Med. Virol., vol 1, pp.122-164 (1958)] 참조.

UV 조사 기술은 식품, 제약, 화장품 및 음료 산업 및 음용수에서 광범위한 적용 범위를 갖는다. UV 소독은, 푸린 및 피리미딘 염기의 시클릭 분자의 공유 결합이 UV 파장 조사의 여기 에너지에 의해 붕괴되어, 이들이 암호화하는 핵산 및 유전 정보를 손상시키는 물리 화학적 공정이다. 유효 UVC (100 내지 280nm) 조사에 노출된 바이러스 뿐만 아니라 세균 및 효모균 등과 같은 미생물은 수 초 내에 불활성화된다. 결과적으로, 성공적인 소독은 환원 당량 조사량에 의존한다. 평균 살균성 조사량 (J/㎡)은 생물학적 방사선량계를 사용하여 조사 구역에서 측정된다. 그러나, UV 불활성화 단독은 안전하며 효과적인 백신을 생성하기에 적합하지 않다.

테일러 등 (Taylor et al., J. Immunol. (1957) 79: 265-75)은 포르말린 및 자외선 조합으로의 폴리오 바이러스의 불활성화를 기재하고 있다. 몰너 등 (Molner et al., Am. J. Pub. Health (1958) 48:590-8)은 자외선-포르말린 불활성화 폴리오 백신으로 백신화된 피검체의 혈액 중 순환하는 항체의 측정가능한 수준의 형성을 기재하고 있다. 트루펠리 등 (Truffelli et al., Appl. Microbiol. (1967) 15:516-27)은 포르말린, UV광 및 β-프로피오락톤으로 구성된 3단계 불활성화 공정에 의한 햄스터 중 아데노바이러스 (Adenovirus) 및 시미안 (Simian) 바이러스 40 발암성의 불활성화에 대해 보고하고 있다. 미야마에 (Miyamae, Microbiol. Immunol. (1986) 30:213-23)는 UV 광선 및 포르말린으로의 처리에 의한 센다이(Sendai) 바이러스의 면역원의 제조를 기재하고 있다. 산업적 규모로 안전하며 효능이 있는 백신의 제조에 대한 요구가 늘 존재하지만, 상기 기재된 어떠한 개념도 백신 제조 시 일반적인 사용을 위해 채택되지 않았다. 또한, 상기 언급된 어떠한 연구도 본 연구에 사용된 베로(Vero) 안전성 시험만큼 민감한 "불활성화된 바이러스"의 잔류 감염성 측정을 위한 안전성 시험을 사용하지 않았다.

놀랍게도, 본 발명자들은 포르말린 및 UV 불활성화 단계의 조합이 산업적 규모로 백신 제조를 위한 불활성화된 바이러스의 제조를 위해 고용량 원료처리량 장치 중에서 벌크 바이러스 제조시 바이러스를 완전히 불활성화시키는 데 사용될 수 있음을 밝혀냈다. 또한, 이는 어떠한 잔류 바이러스 활성도 매우 민감한 베로 세포 배양 시험을 사용하여 검출되지 않는, 실시예에 사용된 것과 같은 고역가 농축된 바이러스 제제로 나타났다. 본 발명자들은 또한 놀랍게도, 이 방법이 외피가 없는 바이러스, 예컨대 폴리오 피코나바이러스에 비해 외피가 있는 (enveloped) 바이러스, 예컨대 오르토믹소바이러스에 특히 잘 작용함을 입증하였다. 이 발견은 대유행 및 전국적 유행 인플루엔자 균주와 같은 바이러스성 질환의 출현 및 신속한 변화에 대해 안전하며 매우 면역성인 백신의 신속한 제조에 대한 중요한 암시를 갖는다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 불활성화된 바이러스의 높은 항원성 및 면역원성을 유지하면서, 샘플 중 함유된 바이러스의 매우 효과적이며 안전한 불활성화를 허용하는 방법을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 방법은 백신 제조에 사용하기 위한 높은 항원 함량, 안전한 바이러스 제제를 제조하기 위한 고용량 원료처리량 장치 중 UV 불활성화 단계와 협력하여 포르말린 불활성화 단계를 이용한다.

본 발명의 하나의 양태에 따르면, 상기 목적은 (i) 유효 농도의 포르말린으로 샘플을 처리하고, (ii) 유통 장치 중에서 유효 조사량의 UV광으로 샘플을 처리하는 단계를 포함하는 (여기서, 단계 (i)은 단계 (ii) 전에 수행되거나, 또는 그 역임), 샘플 중에 함유된 바이러스를 불활성화시키는 방법을 제공함으로써 해결된다. 바람직하게는, 장치를 통한 샘플의 유속은 약 50ℓ/시간 내지 약 1000ℓ/시간이다.

불활성화 방법의 또다른 바람직한 양태에서, 불활성화될 바이러스는 각각 외피가 있는 바이러스 또는 외피가 없는 RNA 바이러스이며, 외피가 있는 바이러스 또는 외피가 없는 RNA 바이러스는 각각 전체적으로 불활성화된다.

또다른 양태에 따르면, (i) 유효 농도의 포르말린으로 샘플을 처리하고, (ii) UV 램프, 및 UV 램프의 직경에 실질적으로 수직인 장치 내의 박층 챔버를 포함하는 유통 장치 중에서 유효 조사량의 UV광으로 샘플을 처리하는 단계를 포함하며, 단계 (i)은 단계 (ii) 전에 수행되거나, 또는 그 역이며, 샘플이 단계 (ii)의 박층 챔버를 통과하는 것인, 샘플 중에 함유된 바이러스의 불활성화 방법이 제공된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 샘플은 유효 농도의 포르말린으로 처리된 후, 유통 장치 중 UV광의 유효 조사량으로 처리된다. 본 발명자들은 어떤 이론에 얽매이지는 않으나, 비리온의 표면 분자 상에서 포르말린의 가교결합 효과가 UV 불활성화 유통 장치의 고용량 유체 역학의 가혹함에 대해 바이러스를 안정화하는 것으로 생각된다.

본 발명에 따른 불활성화 방법은 실시예 2 및 4(A)에 입증된 바와 같이 효과적이며 안전하다. 또한, 불활성화 방법은 실시예 4(B)에 나타난 바와 같이 보호성 면역 반응을 이끌어내는 높은 항원성 및 면역원성을 갖는 백신의 제조를 허용한다.

본원에 사용된 용어 "샘플"은 병원균 또는 그의 일부를 함유하는 임의의 샘플, 예컨대 임의의 유체, 예를 들어 혈액 제품 또는 백신과 같은 생물학적, 의학적 또는 제약학적 생성물을 제조하기 위한 세포 배양 공정으로부터 기원하는 생물학적 유체 또는 용액을 포함한다. 생물학적 유체, 예컨대 혈액 또는 플라즈마를 포함하는 샘플일 수 있다. 또한, 세포 배양의 수확된 성분을 함유하는 유체 (예, 배양액의 배양 배지 분획 또는 세포)일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 불활성화된 바이러스 또는 그의 일부인, 치료학적 제제, 예컨대 백신의 제조시 사용된 유체이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 세포 성분은 불활성화 방법 전에, 예를 들어 여과 또는 원심분리에 의해 샘플로부터 분리된다.

본 출원의 바람직한 실시양태에서, 바이러스는 상청액 및 세포로 구성된 세포 배양의 수확물로부터 제조되어, 의약 제품, 예컨대 백신의 제조에 사용된다. 본 발명의 추가 실시양태에서, 상기 세포 배양액의 세포는 병원균으로 감염된다. 세포는 1차 세포, 또는 바이러스 제조에 적합한 임의의 배양된 세포주일 수 있다. 사용될 수 있는 세포의 예는 포유류 세포 (예, CHO, BHK, VERO, HELA 세포), 조류 세포 (예, 닭 배아 섬유모세포, 또는 조류로부터의 연속적인 세포주), 및 곤충 세포 (예, Sf9 세포)이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 바이러스성 벌크의 세포 배양액 제조로부터의 세포 파편 및 세포는 화학적 (포르말린) 불활성화 단계 및/또는 UV 조사 불활성화 단계 전에 바이러스 벌크로부터 분리된다.

본 발명에서, 불활성화될 바이러스는 단일 또는 이중 (DNA) 스트랜드 게놈을 갖는, 외피가 있거나 외피가 없는 DNA 또는 RNA 바이러스, 센스 또는 안티센스, 연속적 또는 분절이다. 바이러스는 바쿨로바이러스, 폭스파이러스, 아데노바이러스, 파포바바이러스, 파르보바이러스, 헤파드나바이러스, 코로나바이러스, 플라비바이러스, 토가바이러스, 아스트로바이러스, 피코나바이러스, 레트로바이러스, 오르토믹소바이러스, 필로바이러스, 파라믹소바이러스, 랍도바이러스, 아레나바이러스 및 분야바이러스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 바이러스는 플라비바이러스, 토가바이러스, 레트로바이러스, 코로나바이러스, 필로바이러스, 랍도바이러스, 분야바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 아레나바이러스, 헤파드나바이러스, 헤르페스바이러스 및 폭스바이러스를 포함하는 외피가 있는 바이러스의 군으로부터 선택된다. 실시예 6 및 7에 입증된 바와 같이, 본 발명의 불활성화 방법은 외피가 없는 폴리오 및 아데노바이러스에 비해, 인플루엔자 및 로스 리버 바이러스와 같은 외피가 있는 바이러스에 특히 효과적이다. 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서, 바이러스는 플라비바이러스, 토가바이러스, 레트로바이러스, 코로나바이러스, 필로바이러스, 랍도바이러스, 분야바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스 및 아레나바이러스를 포함하는 외피가 있는 RNA 바이러스의 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 바이러스는 오르토믹소바이러스, 예를 들어 인플루엔자 바이러스 균주로부터 선택되며, 인플루엔자 바이러스 균주는 헤마글루티아닌 및 뉴라미니다제 표면 단백질의 다양한 조합을 가질 수 있다. 또다른 특히 바람직한 실시예에서, 바이러스는 토가바이러스, 예를 들어 알파바이러스, 예컨대 로스 리버 바이러스 (RRV)로부터 선택된다. 벌크 바이러스성 용액으로서 사용하기에 또다른 바람직한 바이러스 군은 중증급성 호흡기 증후군 (SARS)과 관련된 바이러스를 포함하는 코로나바이러스이다. 또다른 바람직한 바이러스 군은 일본뇌염 바이러스, 진드기 매개 뇌염 (TBE), 뎅구 열병 바이러스, 황열 바이러스 및 출혈열 바이러스를 포함하는 플라비바이러스이다. 또다른 바람직한 바이러스 군은 오르토폭스바이러스 (예컨대 우두, 또는 변형 백시니아 앙카라 바이러스) 및 아비폭스바이러스를 포함하는 폭스바이러스이다.

불활성화된 바이러스성 병원균의 일부가 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 일부는 면역원 중 에피토프로서 작용할 수 있다. 이 에피토프는 병원균에 대항하여 면역 반응을 이끌어내는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 병원균의 일부는 병원균에 대항하는 백신으로서 사용된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 병원균의 상기 일부는 분할 비리온이며, 분할 전 또는 후에 불활성화될 수 있다.

본 발명의 의미 내에서, 본 발명에 따른 불활성화 방법은, 방법을 사용하여 생성된 불활성화 바이러스가 포유류 세포 배양 시험, 예를 들어 실시예 2에 상세히 기재된 안전성 시험을 통과할 때, 안전하거나 전체적으로 불활성화된 것으로 간주된다. 이들 시험에서 입증된 바와 같이, 이들 시험은 이용된 다른 시험, 예컨대 달걀 시험보다 더욱 민감하다. 안전성 시험의 바람직한 양불 판정 기준은 실시예 1 및 2에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 샘플 중 바이러스의 불활성화로 인한 바이러스 역가 감소는 약 1×10⁵ 이상, 더욱 바람직한 실시양태에서 약 1×10⁷ 이상, 더욱 바람직한 실시양태에서 약 1×10¹⁰ 이상, 가장 바람직한 실시양태에서 약 1×10¹⁴ 이상이다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 샘플은 약 12 내지 약 96시간 동안 유효 농도의 포르말린으로 처리된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 샘플은 약 24시간 내지 약 48시간, 더욱 바람직하게는 약 24시간 내지 약 30시간 동안 유효 농도의 포르말린으로 처리된다.

본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 샘플은 약 24 내지 약 24.5시간 동안 유효 농도의 포르말린으로 처리된다.

추가 실시양태에서, 유효 농도의 포르말린으로 샘플을 처리하는 단계는 약 10 내지 약 40℃에서 수행된다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 유효 농도의 포르말린으로 샘플을 처리하는 단계는 약 32℃에서 수행된다.

본 발명의 바람직한 실시양태는 유효 농도의 포르말린으로 샘플을 처리하는 것을 포함하며, 여기서 포르말린의 유효 농도는 약 0.01％ 내지 약 1％ (w/w), 바람직하게는, 약 0.01％ 내지 약 0.1％, 더욱 바람직하게는 약 0.025％ 내지 약 0.1％의 범위이며, 유효 농도로 조정하기 위해 37％ 포르말린 용액을 사용시 각각 약 92㎎/ℓ 내지 약 368㎎/ℓ 포르말린에 상응한다.

본원에서, 용어 "UV광"은 100 내지 400nm의 파장을 갖는 자외선 방사선을 의미한다. UV광은 UVC (100 내지 280nm), UVB (280 내지 320nm), 및 UVA (320 내지 400nm)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. DNA로 삽입하며, UV광에 의해 불활성화되는 것과 같은 감광제, 예컨대 프소랄렌이 UV 조사의 불활성화 효과를 강화하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, UV광은 약 100 내지 약 280nm의 파장을 갖는 UVC이다. 본 발명의 더욱 바람직한 실시양태에서, UV광은 약 240 내지 약 290nm의 파장을 갖는다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 약 85％ 이상의 UV광이 약 254nm의 파장을 갖는다.

UV광 발산은 UV광 발산의 연속적인 형태, 예를 들어 수은 램프 기술 또는 펄스화 UV광, 예컨대 단일 파장 레이저 기술일 수 있다. 바람직한 UV 강도는 2개 이상의 램프를 조합함으로써 발생할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, UV광은 약 110W의 램프에 의해 연속적으로 발산된다. 실시예에 예시된 바람직한 실시양태에서, UV 램프는 실시예에 사용된 램프 (950㎜)와 같이, 약 1m의 길이를 갖는다.

본 발명의 요지는 임의의 조사량의 UV광, 예컨대 상기 기재된 바와 같이 포르말린 처리와 조합되는 경우, 주어진 바이러스를 안전하게 불활성화시키는 임의의 조사량의 UV광을 포괄한다. 유효 조사량은 당업계에 일반적으로 공지된 각종 인자, 예를 들어, UV 불활성화 챔버의 물리적 파라미터, 예컨대 램프 및 챔버의 크기 및 직경, 배지 함유 바이러스 및 UV광 공급원 간의 거리, 챔버의 물질의 광 흡수 및 반사 특성에 의존할 수 있다. 같은 이유로, UVC광의 파장 및 강도 뿐만 아니라, 바이러스가 UV광에 노출되는 접촉 시간이 또한 유효 조사량에 결정적이다. 또한, 유효 조사량은 바이러스 그 자체, 바이러스 함유 배지 및 그의 광 흡수 특성에 의해 또한 영향받는다. 바람직하게는, 유효 조사량은 샘플 중에 함유된 바이러스의 99.99％ 이상을 사멸시키며, 더욱 바람직하게는, 어떠한 활성 바이러스도 포유류 세포 배양 시험, 바람직하게는 실시예 2에 따른 시험에서 검출되지 않거나, 또는 완전히 불활성화되는 수준으로 바이러스를 불활성화한다. UVC광을 사용하는 바람직한 실시양태에서, 바이러스 함유 샘플은 약 5 내지 약 200mJ/㎠ 범위의 유효 조사량에 노출된다. 바람직한 실시양태에서, 유효 조사량은 약 20 내지 약 100mJ/㎠, 또다른 바람직한 실시양태에서, 유효 조사량은 약 40 내지 약 90mJ/㎠의 범위이다. 비교로서, 음용수 중 존재하는 병원균의 99.99％를 사멸하기 위한 유효 조사량은 약 40mJ/㎠ 이상이다. 바람직한 실시양태에서, 유효 조사량은 1×10⁵ 만큼 초기 바이러스 역가를 감소시킨다. 벌크 백신 불활성화에서, 유효 조사량은 초기 화학적 (포르말린) 불활성화 단계 후 존재할 수 있는 임의의 잔류 생 바이러스를 제거하기에 충분해야 한다. 실시예에 예시된 바와 같이, 이는 매우 민감한 포유류 세포 배양 감염 시험, 예컨대 기재된 베로 세포 배양 시험에 의해 측정될 수 있다.

본 발명의 추가 바람직한 실시양태 및 구체적인 UV광 챔버가 실시예에 제공된다.

본 발명의 추가 바람직한 실시양태에서, 샘플과 UV광의 접촉 시간은 약 1 내지 약 20초, 바람직하게는 약 1.4 내지 약 14초의 범위이다. 접촉 시간은 바람직하게는, 광원에 대한 탄젠트를 따라 대략 1㎜ 두께인 샘플, 및 약 110W의 UV 램프 와트량을 기준으로 계산된다. 당업자는, 샘플 깊이가 두껍고 에너지 (와트량) 광원이 적을수록 노출 시간이 증가하거나, 그 역임을 인지할 것이다. 본원의 더욱 바람직한 실시양태에서, 샘플과 UV광의 접촉 시간은 약 1.4 내지 약 7초, 본원의 특히 바람직한 실시양태에서, 샘플과 UV광의 접촉 시간은 약 2.8 내지 약 4.2초이다.

주어진 UV광 조사량을 사용하는 본 발명에 따른 방법의 제시된 장치가 본 발명에 따른 병원균을 효과적으로 불활성화시키는지를 시험하기 위해, 잔류 바이러스 활성에 대한 불활성화된 바이러스를 시험해야 한다. 이는 포유류 세포 배양 시험, 예를 들어 바람직하게는 실시예 1 및 2에 상세히 기재된 기준을 적용하는 베로 안전성 시험을 사용함으로써 성취될 수 있다.

본 발명에 따라, 유효 조사량의 UV광으로의 샘플의 처리는 유통 장치 (flow-through), 바람직하게는 표 1 및 도 1에 구체화된 유통 장치 중에서 수행된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 유통 장치는 박층 챔버를 함유한다. 챔버의 최소 두께는 전체 불활성화된 바이러스 백신에 대한 바이러스의 붕괴를 방지하고, 합리적인 재빠른 공정을 허용하기 위해 충분한 흐름의 벌크 바이러스 용액을 허용해야 한다. 이와 같이, 바람직하게는, 박층은 전체 불활성화 바이러스의 제조를 위해 약 0.1㎜ 이상의 두께이다. 또한, 벌크 바이러스 용액에 의한 UV 조사의 흡광도, 및 용액 중 모든 바이러스의 충분한 조사를 보장해야할 필요로 인해, 최대 두께는 어떠한 비리온도 충분히 조사되지 않고 장치를 통과하지 않도록 해야 한다. 따라서, 박층은 약 1㎝보다 두꺼워서는 안 된다. 박층은 UV 램프 및 불활성화될 병원균 간의 최대 거리가 약 1㎜ 미만이도록, 바람직하게는 0.5㎜ 내지 3㎜ 두께, 더욱 바람직하게는 약 1㎜이다. 대안적으로, 샘플은 샘플이 샘플 챔버의 내부 직경보다는 외부 직경으로부터 조사되도록, 램프의 길이에 평행으로 램프를 통과할 수 있다. 유사하게, 램프 (또는 램프의 원) 내의 샘플 챔버 중의 램프는 내부 및 외부 직경 모두로부터 샘플 챔버를 조사하는 구성형태로서 사용된다. 또한, 챔버는 바람직하게는, 챔버를 통한 샘플의 흐름이 엄격하게 층류는 아니며, 그보다는 탁류(turbid)이도록 디자인된다. 이는 샘플 배지를 통한 바이러스 혼합을 보조하여, UV 조사에 대한 균일한 노출을 보장한다.

본원의 또다른 바람직한 실시양태에서, 유통 장치는 UV 램프가 약 30㎜의 직경을 가지며, 샘플이 흐르는 UV 램프를 둘러싸는 챔버가 약 32㎜의 직경을 갖는 UV 불활성화 챔버를 함유한다. 본원의 바람직한 실시양태에서, 챔버는 약 92㎖의 전체 부피를 갖는다.

조사될 샘플은 장치를 통과할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 UV 조사 챔버를 통과하는 동안 냉각된다. 본 발명의 추가 바람직한 실시양태에서, UV 조사 챔버를 통과하는 샘플은 약 2 내지 약 32℃, 더욱 바람직하게는 약 2 내지 약 8℃의 온도를 갖는다.

바람직하게는, 유통 장치 중 샘플의 유속은 약 50 내지 약 1000ℓ/시간, 더욱 바람직하게는 약 230 내지 약 480ℓ/시간의 범위이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 유통 장치 중 샘플의 유속은 약 230 내지 약 250ℓ/시간, 더욱 바람직하게는 약 240ℓ/시간의 범위이다. 실시예에 예시된 이들 바람직한 유속은 벌크 바이러스 용액의 경제적인 대규모 UV 공정을 허용한다.

바람직한 실시양태에서, 접촉 시간은, 샘플이 UV 조사에 노출되는 샘플 챔버의 길이, 및 챔버를 통한 샘플의 유속에 의존한다. 따라서, 유통 장치 중에 배열된 UV 램프의 수를 증가시킴으로써 간단히 조정될 수 있는 유효 조사량은, UV 조사에 노출된 샘플 챔버의 유효 길이를 증가시킨다. 대안적으로, 보다 긴 램프 챔버의 동일한 수를 사용하는 것이 유효 조사량을 증가시킬 것이며, 짧은 램프 챔버의 더 많은 수를 사용하는 것은 동일한 유효 조사량에 상응할 것이다.

본원의 추가 바람직한 실시양태에서, 유통 장치 중에서 유효 조사량의 UV광으로 샘플을 처리하는 단계는 주기적 또는 연속적인 방법으로 반복된다. 이는 약 2 내지 약 10회 반복될 수 있다. 본원의 바람직한 실시양태에서, 유통 장치 중에서 유효 조사량의 UV광으로 샘플을 처리하는 단계는 약 2 내지 약 5회 반복되며, 더욱 바람직한 실시양태에서, 약 2 내지 약 3회 반복된다. 샘플 램프를 통해 연속적으로 또는 재순환적인 흐름으로 다중 램프 챔버를 사용하는 것에 부가된 잇점은, 샘플이 챔버 또는 주기 사이에서 더욱 완전히 혼합되어, 바이러스의 UV 조사에 대한 균일한 노출을 보장할 수 있다는 것이다.

샘플 중의 바이러스가 불활성화된 후, 불활성화된 바이러스는, 이어서 백신 및 기타 제약학적 조성물을 포함한 각종 용도에 사용하기 위해 정제될 수 있다. 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에 따라, 불활성화 방법은 추가로 샘플 중의 불활성화된 바이러스를 제약학적 순도로 정제하고, 정제된 바이러스를 백신으로서 사용하기 위한 제약학적 조성물로 제형화하는 단계를 포함한다. 정제는 여과 또는 투석여과, 크로마토그래피 (예, 크기 배제, 이온 교환, 면역친화성 등) 또는 원심분리를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌 당업계에 공지된 방법에 의해 성취될 수 있다. 대안적으로, 바이러스는 본 발명의 방법에 의한 불활성화 전에 정제될 수 있다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에 따라, 불활성화의 방법은 추가로 정제 단계를 포함하며, 즉 샘플은 샘플 중의 잔류 포르말린을 제거하기 위한 정제 단계를 거친다. 이러한 정제는 포르말린의 수준이 제약학적으로 허용가능한 수준보다 높게 잔류하는 경우에 유용하다. 임의의 정제 단계 후, 불활성화된 바이러스는 제약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 제형은 임의로 담체 (예, 생리식염수 또는 완충액), 부형제, 안정화제 (예, 알부민, 당 및/또는 아미노산), 염, 및/또는 보조제 (예, 명반)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 불활성화된 바이러스는 제약학적 용도를 위해, 예를 들어, 리포솜 중의 캡슐화에 의해 추가로 변형될 수 있다.

본 발명은 임의의 제한없이 하기 실시예에 추가로 예시될 것이다. 본 발명에 상세히 기재되었으나, 변형 및 수정이 첨부된 청구의 범위에 정의된 본 발명의 범주를 벗어나지 않고 가능함이 명백할 것이다.

도 1은 본 발명의 UV 불활성화 단계에 사용될 수 있는 UV 박층 챔버를 나타낸다.
도 2는 UV 센서가 장착된 UV 불활성화 장치를 나타낸다. UV 센서 및 유량계는 임의 특징부이다. 본원의 추가 실시양태에서, 펌프 및/또는 유량계가 배출구 튜브에 장착될 수 있다.
도 3은 유통 장치 중에서 유효 조사량의 UV광으로 샘플을 반복적으로 처리하기 위해 서로 연결된 몇몇 UV 박층 챔버 (UV 반응기)를 이용하는 UV 불활성화 장치를 나타낸다. UV 박층 챔버의 수는 약 2 내지 약 10개일 수 있다. UV 센서 및 유량계는 임의 특징부이다. 본 발명의 추가 실시양태에서, 펌프 및/또는 유량계가 배출구 튜브에 장착될 수 있다. 연속적으로 연결된 불활성화 챔버를 갖는 연속적인 UV 발생기가 대규모 제조 공정에 사용되어, 샘플의 높은 원료처리량을 허용할 수 있다.

[실시예]

실시예 1: 표준 달걀 안전성 시험의 원리

표준 달걀 안전성 시험을 사용하여, 불활성화된 인플루엔자 균주의 잔류 감염성을 시험하였다. 1가 벌크 생성물, 즉 수크로스 구배 원심분리 및 초투석여과 후 정제된 바이러스 항원을 달걀 10개에 주입하였다 (0.2㎖/달걀). 32℃에서 3일 동안 배양후, 달걀을 수확하고, 회수하여, 다시 10개에 주입하였다 (0.2㎖/달걀). 32℃에서 또다른 3일간 배양 후, 달걀을 수확하고, 회수하여, 헤마글루티닌 (HA)에 대해 시험하였다.

HA-시험은 인플루엔자 바이러스가 그 표면 단백질 헤마글루티닌을 사용하여 적혈구를 결합할 수 있다는 사실에 기초한다. 시험은 멸균 환경에서 행하였다. 한정된 HA 역가를 갖는 인플루엔자 바이러스의 현탁액은 양성 대조구로서 작용하며, 0.9％ NaCl 용액이 음성 대조구로서 작용한다. 시험될 샘플의 0.9％ NaCl 중 1:2 희석액 50㎕를 96웰 플레이트의 하나의 웰에 제공하였다. 각 웰에 닭 적혈구를 함유하는 용액 50㎕를 첨가하였다. 계속해서, 플레이트를 실온에서 30 내지 45분 간 배양하였다. 이어서, 헤마글루틴화를 가시적으로 측정하였으며, 여기서, 동일한 샘플을 함유하는 5개의 웰이 어떠한 헤마글루틴화도 나타내지 않는 경우, 샘플은 HA 시험을 통과한 것이다.

실시예 2: 표준 베로 안전성 시험의 원리

표준 베로 안전성 시험은 불활성화된 인플루엔자 균주의 잔류 감염성에 대한 매우 엄격한 품질 시험이다. 시험은 또한 다른 바이러스에 적용가능하다. 1가 벌크 생성물, 즉 수크로스 구배 원심분리 및 초투석여과 후 정제된 바이러스 항원을 5개의 룩스 (Roux) 플라스크에 첨가하였다 (4㎖/플라스크). 베로 배양 배지 중에서 32℃에서 7일 동안 배양 후, 세포 배양액을 수확하고, 회수하여, 다시 5개의 룩스 플라스크에 첨가하였다 (10㎖/플라스크). 32℃에서 또다른 7일간 배양 후, 세포 배양액을 수확하고, 회수하여, 실시예 1에 기재된 바와 같이 헤마글루티닌 (HA)에 대해 시험하였다.

실시예 3: 포르말린 불활성화

포르말린으로의 제1 불활성화 단계를 무세포 감염성 1가 바이러스 수확물, 즉 원심분리를 통한 정화 후 생물 반응기 수확물에 대해 수행하였다. 30 내지 34℃에서 수집 후, 1가 바이러스 수확물을 30 내지 34℃에서 4 내지 8시간 동안 약 0.9 내지 약 1.1U/㎖ 벤조나제로 처리하였다. 이어서, 32±2℃에서 24 내지 24.5시간 동안 92㎎/ℓ 이하의 포르말린으로 처리하였다.

실시예 4: 65와트 UV 램프로의 불활성화 시험

포르말린 불활성화된 바이러스로의 다수의 불활성화 실험을, 65W UV 램프 및 박층 챔버를 갖는 불활성화 챔버를 사용하여 수행하였다. 1가 바이러스 수확물의 완전한 불활성화가 3주기 동안 100ℓ/시간의 유속을 사용할 때 입증될 수 있었으나, 이 장치는 UV 시그널의 온라인 측정을 허용하지 않았다. 인플루엔자 제조를 위해 사용된 베로 세포 배양 배지는 UV 시그널의 흡수의 원인이 되는 각종 유기 화합물을 함유하였다. 따라서, 장치는 1가 바이러스 수확물 처리 동안 UV 시그널의 연속적인 모니터링을 허용하는 110W 램프가 장착되었다.

실시예 5: 110와트 UV 램프로의 불활성화 시험

포르말린 처리된 1가 인플루엔자 파나마 수확물을 불활성화 연구를 위한 모델 기질로서 사용하였다. 박층 UV 기술로의 연속적인 불활성화를 위해, 비사(VISA) 램프 (110W/4V)가 장착된 웨데코 비사 (WEDECO VISA) 장치 (독일)를 사용하였다. UV 박층 챔버는 30㎜ 직경 석영 튜브를 갖는 스테인레스 강 1.4435 장치이다 (표 1 참고). 환산된 UV 센서는 UV 시그널의 온라인 조절을 허용하였다. UV 박층 챔버는 주위 온도에서 240±10ℓ/시간의 유속으로 조작하였다. 유속 조건은 환산된 유량계 (도 2 참고)에 의해 조절되었다.

UV 불활성화 챔버의 특성

UV 램프	110W
램프의 길이	950㎜
UV 램프의 직경	30㎜
UV 램프를 둘러싸는 챔버의 직경	32㎜
박층	1㎜
전체 부피/챔버	92㎖
접촉 시간/챔버	1.4초

1가 수확물을 10 UV 주기에 노출하였다. 각 주기 후, 20ℓ의 UV 처리된 1가 수확물을 제거하고, 20mM 트리스 완충액 중 증점된 42％ 수크로스 구배를 갖는 연속적인 초원심분리 조건 및 예비 정화제가 없는 소르발 (Sorvall) CC40 원심분리기 (히타치 코키 컴퍼니 리피티드, 일본 도쿄)를 사용하는 48％ 내지 36％ 수크로스로부터의 한정된 정제된 1가 수확물 (PMVH)을 사용하여 수크로스 구배 정제에 의해 추가로 정제하였다.

포르말린 및 UV 처리된 인플루엔자 파나마의 초원심분리 작업 개요

초원심분리 작업	불활성화 조건
UZ-INF-45-03	UV 없음
UZ-INF-48-03	240ℓ/시간, 1주기
UZ-INF-52-03	240ℓ/시간, 2주기
UZ-INF-51-03	240ℓ/시간, 3주기
UZ-INF-50-03	240ℓ/시간, 4주기
UZ-INF-49-03	240ℓ/시간, 5주기
UZ-INF-58-03	240ℓ/시간, 7주기
UZ-INF-57-03	240ℓ/시간, 10주기

(A) 항원 수율 및 순도

인플루엔자 항원 수율 및 순도를 헤마글루티닌 함량 (HA), 전체 단백질 및 베로 단백질 (숙주 세포 단백질)을 기준으로 비교하였다. 정제된 바이러스는 HA/단백질 비율, 숙주 세포 단백질/HA 비율 및 바이러스 안전성을 근거로 비교하였다 (표 3 참조). 모든 UV 처리된 수확물에 대해, 어떠한 바이러스 성장도 검출될 수 없었다. 대조적으로, 표준 포르말린 불활성화 공정 (어떠한 UV 조사도 적용되지 않음)으로부터 유도된 정제된 바이러스는 베로 세포 배양액 중에서 증폭될 수 있었다. 7주기 및 10 주기 후, HA/단백질 비율에서 약간의 감소를 볼 수 있으나, 이중 불활성화된 생성물 및 포르말린의 어떠한 유의적인 차이도 HA/단백질 및 숙주 세포 단백질/HA 비율로서 측정된 항원 순도에 관해 검출되지 않았다.

포르말린 및 UV 처리 후 수크로스 구배 정제된 파나마 바이러스 (0 내지 10 UV 주기 후 HA/단백질 비율, 숙주 세포 단백질/HA 비율 및 안전성의 비교)

UV 주기의 수	접촉 시간 (초)	HA/단백질 비율	숙주 세포 단백질 /HA 비율	베로 안전성
0	0 (UV 없음)	0.85	0.04	실패
1	1.4	1.09	0.04	통과
2	2.8	0.88	0.04	통과
3	4.2	0.91	0.04	통과
5	7.0	0.83	0.04	통과
7	9.8	0.60	0.02	통과
10	14	0.58	0.03	통과

추가 연구를 행하여 헤마글루티닌 억제 (HAI) 분석에 의한 기니아 피그 및 생쥐 중 항원성 및 면역원성에 대한 UV 불활성화의 효과를 특성화하였다.

(B) 항원성

파나마 특이 항혈청에 대항하는 HAI 분석에 의해 항원성을 분석하였다. 증가된 UV 접촉 시간이 HA의 약간의 손실을 나타냈지만, HAI 역가에 대한 어떠한 부정적인 효과도 나타나지 않았다 (표 4 참조).

포르말린 및 UV 처리 후 수크로스 구배 정제된 파나마 바이러스 (0 내지 10 UV 주기 후 파나마 특이 항혈청으로 HA 및 HAI 역가에 근거한 항원성의 비교)

UV 주기의 수	접촉 시간 (초)	HA (㎍/㎖)	HAI 역가
0	0 (UV 없음)	211	640
1	1.4	209	640
2	2.8	200	640
3	4.2	196	640
5	7.0	191	640
7	9.8	177	640
10	14	154	640

(C) 면역원성

제1 면역화 3주 후 정제된 1가 바이러스 수확물의 상이한 분액, 이어서 상승제로 기니아 피그 및 생쥐를 면역화함으로써 면역원성을 분석하였다. 면역화된 동물의 혈청을 수집하고, 3주 및 6주 후에 회수하여, 달걀 유도 및 베로 유도된 항원에 대항하는 HAI 분석에 의해 분석하였다. 3주 및 6주 후 기니아 피그 및 생쥐에게서 시험된 면역원성은 매우 절충된 결과를 제공하였으며, 이중 불활성화된 바이러스 대 표준 포르말린 처리된 바이러스에 대해 어떠한 유의적인 차이도 볼 수 없었다 (표 5 참조).

포르말린 및 UV 처리 후 (0 내지 10주기) 수크로스 구배 정제된 파나마 바이러스 [기니아 피그 및 생쥐에서 시험된 면역원성의 비교; A) 3주 후, B) 6주 후; 달걀 및 베로 유도된 인플루엔자 항원으로의 HAI]

A)
UV 주기의 수	접촉 시간 (초)	기니아 피그 3주 후 HAI 역가		생쥐 3주 후 HAI 역가
		달걀	베로	달걀	베로
0	0 (UV 없음)	160	320	320	1280
1	1.4	160	320	320	1280
2	2.8	160	640	320	1280
3	4.2	160	320	320	1280
5	7.0	160	320	320	1280
7	9.8	160	320	320	1280
10	14	160	640	320	1280
대조구	-	40	20	80	80

B)
UV 주기의 수	접촉 시간 (초)	기니아 피그 6주 후 HAI 역가 (상승제)		생쥐 6주 후 HAI 역가 (상승제)
		달걀	베로	달걀	베로
0	0 (UV 없음)	1280	1280	1280	2560
1	1.4	1280	2560	640	1280
2	2.8	1280	1280	640	1280
3	4.2	640	1280	1280	2560
5	7.0	1280	2560	1280	2560
7	9.8	640	1280	1280	2560
10	14	1280	2560	1280	2560
대조구	-	160	80	160	40

표 4 및 표 5에 요약된 결과는 UV 처리가 생성물의 항원성 및 면역원성에 영향을 주지 않음을 입증하는 HAI 역가에서의 유의적인 차이를 생성하지 않음을 보여준다.

모든 이중 불활성화 실험에서, 전체 안전성은 UV 처리 1주기 후에조차 입증될 수 있었다. 실험실 및 최종 규모에서 상세한 조사는 포르말린 처리와 조합시, UV 조사 단계의 유효성을 입증하였다. UV 처리 후 정제된 바이러스 항원의 면역학적 특성화는 비 UV 비처리된 생성물로 수득한 것들에 필적할만한 결과를 생성하였다. 생물학적 특성에 대한 부정적인 효과 또는 바이러스 생성물의 면역원성 어느 것도 검출될 수 없었다.

실시예 6: 포르말린 및/또는 UV 불활성화로의 바이러스 역가 감소

유효 농도의 포르말린, 및 유통 장치 중에서 유효 농도의 UV광으로 샘플의 조합된 처리에 의한 바이러스 역가 감소를 상이한 바이러스로 시험하였다. 포르말린 불활성화는 0.025％ (w/v)의 최종 포르말린 농도로 32℃에서 24시간 동안 수행하였다. 유통 장치 중 UV 불활성화는 240ℓ/시간의 유속으로 3주기 동안 수행하였다. 주기 당 샘플과 UV광의 접촉 시간은 1.4초이다.

포르말린 및/또는 UV 불활성화로의 바이러스 역가 감소

바이러스	바이러스 유형	포르말린 처리 후 측정된 바이러스 역가 감소 (log 감소)	UV 처리 후 측정된 바이러스 역가 감소 (log 감소)	포르말린 및 UV 처리 후 계산된 바이러스 역가 감소 (log 감소)
인플루엔자 뉴칼레도니아	A/H1N1/20/99	≥7.4	≥7.3	≥14.7
인플루엔자 파나마	A/H3N2/2007/99	≥8.4	≥6.7	≥15.1
인플루엔자 샹동	B/7/97	≥6.7	≥7.2	≥13.9
폴리오	유형 1	3.0	4.9	7.9
아데노	유형 5	3.1	2.5	5.6

결과는 바이러스의 조합된 포르말린 및 UV 처리에 의해 각 바이러스 역가의 극한 감소가 수득됨을 보여준다.

실시예 7: 로스 리버 바이러스 (RRV) 후보 백신의 UV 불활성화

로스 리버 바이러스 (RRV)는 유행성 다발관절염 (EPA)으로서 공지된 인간의 질병을 일으키는 모기 매개 알파 바이러스이다. 증상은 종종 열, 발진 및 기타 비특이적 체질 변화를 동반하는 특히 무릎 및 손발의 작은 관절에서의 관절염을 포함한다. 관절염 증상은 통상 30 내지 40주 계속되며, 환자의 25％가 개시 1년 후 여전히 잔류 증상을 갖는다. 이는 매해 8000건 이상 호주 및 태평양 지역 전역에서 유행한다. 로스 리버 바이러스 감염의 1979/80 유행은 또한 피지, 사모아, 쿡 아일랜드 및 뉴칼레도니아에서 발생하였다. 현재 존재하는 백신이 없다.

(A) 1200ℓ 베로 세포 발효기 배양액 기재 무혈청 미소담체의 RRV 접종 및 포르말린 불활성화

무혈청 베로 세포 기재 미소담체의 1200ℓ 발효기 배양액을 로스 리버 생성 바이러스로 접종하였다. 배양액을 37℃에서 3일 동안 배양하였다. 샘플을 적정을 위해 매일 회수하였다. 3일째, 100％ 세포가 CPE (세포 변성 효과)에 의해 파괴되었을 때, 바이러스를 수확하였다. 감염성 바이러스 수확물 및 제1 여과 단계로부터의 미소담체 및 세포 잔해의 분리 후 (1.2㎛/0.2㎛), 핵산 (DNA/RNA)의 분해를 위해 벤조나제를 첨가하였다. 0.1％ (w/v) 포르말린 최종 농도로 8일 동안 포르말린 불활성화를 수행하였다. 제2 및 제3 여과 단계를 2시간 및 24시간 후 각각 수행하였다. 잔류 핵산의 제거를 위해 24시간에 벤조나제를 두번째 첨가하였다. 바이러스 적정을 위해 샘플을 회수하였다 = 표 7에 따른 베로 세포 중 조직 배양 감염성 투여량 50 (TCID₅₀/㎖), 및 C6-36 세포 및 베로 세포에 대한 안전성 시험.

RRV로 1200ℓ 발효기의 접종 1일 후, 5.8의 logTCID₅₀/㎖의 바이러스 역가가 입증될 수 있었으며, 이는 7.8 (2일), 8.1 (3일, 수확 전) 및 8.0 (바이러스 수확 후)으로 증가하였다. 분리, 제1 여과 및 벤조나제 첨가 후, 바이러스 역가는 각각 7.5, 7.2 및 7.4로 하강하였다. 포르말린 첨가 후, 역가는 바이러스 펠렛의 원심분리 및 재현탁에 의한 세포독성 포르말린 현탁액의 제거 후 측정되었다 (표 7, 열: TCID₅₀/㎖ TL100). 포르말린을 바이러스 수확물에 첨가한 15분 후, 역가는 1.6으로 급하강하였다. 포르말린 불활성화 12시간 후, 어떠한 바이러스 역가도 증명될 수 없었다.

포르말린 불활성화의 개시 24시간 후, 샘플을 C6-36 세포 및 베로 세포에 대해 안전성 시험을 수행하였다. 불활성화 24h 및 26h 후, 1 양성 (CPE) 및 4 음성 샘플이 베로 세포에 대해 입증될 수 있었던 반면, 훨씬 더 민감한 C6-36 세포주에 대해서는 4 양성 및 1 음성 샘플이 수득되었다. 개시 2일로부터, 모든 샘플은 베로 세포에 대해 음성이었다. C6-36 세포주는 2일 및 3일에는 1 CPE 샘플 및 4 음성 샘플을 각각 나타냈다. 4 및 5일 째, 모든 샘플이 C6-36에 대해 음성으로 시험되었으나, 제 6일 및 7일에는 하나의 샘플이 다시 CPE를 나타냈다. 8일 후, 양성 샘플은 베로 세포 또는 C6-36 세포 어디에서도 발견될 수 없었다.

1200ℓ 발효기의 로스 리버 바이러스 수확물의 안전성 결과

샘플	TCID₅₀/㎖	TCID₅₀/㎖ TL100	안전성 C6-36	안전성 베로
감염 1일	5.8	n.d.	n.d.	n.d.
감염 2일	7.8	n.d.	n.d.	n.d.
감염 3일	8.1	n.d.	n.d.	n.d.
수확물	8.0	n.d.	n.d.	n.d.
분리기 후	7.5	n.d.	n.d.	n.d.
1 여과 후 (1.2㎛/0.2㎛)	7.2	n.d.	n.d.	n.d.
벤조나제 첨가 후	7.4	n.d.	n.d.	n.d.
포르말린 0h (15분)	n.d.	1.6	n.d.	n.d.
포르말린 1h	n.d.	1.4	n.d.	n.d.
포르말린 2h (2 여과 전)	n.d.	1.4	n.d.	n.d.
포르말린 3h (2 여과 후)	n.d.	1.7	n.d.	n.d.
포르말린 6h	n.d.	1.1	n.d.	n.d.
포르말린 12h	n.d.	<0.2	n.d.	n.d.
포르말린 18h	n.d.	<0.2	n.d.	n.d.
포르말린 24h (3 여과 전, 2 벤조나제 첨가 전)	n.d.	<0.2	4 양성 1 음성	1 양성 4 음성
포르말린 26h (3 여과 후, 2 벤조나제 첨가 후)	n.d.	<0.2	4 양성 1 음성	1 양성 4 음성
포르말린 2일	n.d.	<0.2	1 양성 4 음성	5 음성
포르말린 3일	n.d.	<0.2	1 양성 4 음성	5 음성
포르말린 4일	n.d.	<0.2	5 음성	5 음성
포르말린 5일	n.d.	<0.2	5 음성	5 음성
포르말린 6일	n.d.	<0.2	1 양성 4 음성	5 음성
포르말린 7일	n.d.	<0.2	1 양성 4 음성	5 음성
포르말린 8일	n.d.	<0.2	5 음성	5 음성

(B) RRV RNA로의 트랜스펙션 및 감염 실험

상기 언급된 안전성 시험의 결과는, 게놈 RRV RNA가 불활성화 절차 동안 방출될 것이라는 의혹을 증가시켰다. 이는 다시, 게놈 RRV RNA의 각 세포로의 도입을 일으킬 수 있었다. 벤조나제 처리가 RNA의 완전한 분해를 일으켜야 하지만, 리포솜 생성, 또는 단백질 잔해로 게놈 RRV RNA를 마스킹하는 것과 같은 기타 메카니즘이 완전한 RNA의 탈출 전략을 설명할 수 있었다.

RRV 게놈 RNA는 구배 정제된 비리온으로부터 분리하였다. RT-PCR을 통해, 입자 당량의 수를 측정할 수 있었다. 제1 실험에서 (표 8, 번호 1), 입자 당량 (게놈 RNA)을 트랜스펙션 배지 (즉, 트랜스펙션) 및 정상 배지 (즉, 감염) 모두에서 10배 단계로 희석하였다. 양 혼합물 모두로 C6-36 세포 및 베로 세포를 접종하였다. 배지 교환 후, 세포 배양액을 수 일간 배양하였다. 각 상청액의 샘플을 바이러스 역가 및 HA 측정에 사용하였다. 게놈 RNA로의 감염 실험을 수 시간 동안 실시하였다 (표 8, 번호 1 내지 5).

트랜스펙션 실험은 C6-36 세포 및 베로 세포 모두에 대한 TCID₅₀에서 양성 결과를 나타냈다. 베로 세포 상청액 또한 HA-역가를 나타냈다. 높은 수의 입자 당량 (10⁸)으로의 베로 세포의 감염은 6.8logTCID₅₀/㎖의 바이러스 역가를 나타냈으며, 128의 HA-역가를 가졌으나, C6-36 세포 감염에는 실패하였다. 게놈 RRV RNA로의 또다른 감염 실험 (번호 4)은 각각 8.4 및 6.6logTCID₅₀/㎖의 역가를 갖는 감염된 C6-36 세포 및 베로 세포를 생성하였다. 감염 시도 2, 3 및 5는 베로 세포에 대한 양성 결과를 제공하지 않았다. 감염 시도 3은 C6-36 세포에 대한 1.6log TCID₅₀/㎖의 낮은 역가를 제공하였다.

순수한 게놈 RRV RNA로 세포를 감염시키려는 모든 시도가 양성 결과를 나타내지는 않았으나, 높은 농도의 게놈 RNA는 세포를 무작위적으로 감염시킬 수 있는 것으로 보인다. 리포솜 트랜스펙션 시약을 사용하는 모든 실험이 양성 결과를 나타냈다. 따라서, RNA 또는 리포솜 형성 메카니즘의 단백질 마스킹은 표 7의 유리 DNA/RNA의 벤조나제 분해 및 포르말린 불활성화 후 양성 안전성 시험을 설명할 것이다.

(C) 감염성 RRV의 UV 불활성화

상기 언급한 고찰을 위해, 소규모 실험을 실시하여 UV 조사에 의해 RRV를 불활성화시켰다. RRV PV 상청액을 2개의 UV 강도: 2.1mW/㎠ (샘플 1-10) 및 3.3mW/㎠ (샘플 11-20)로 상이한 시간 동안 UV 조사하였다. 계속해서, 이들 샘플을 바이러스 적정을 행하고, 항원-적정 (EIA) 및 헤마글루틴화 역가를 측정하였다. 3분 넘게 조사된 샘플 (샘플 6-10 및 14-19)를 또한 C6-36 세포에 대해 안전성 시험하였다 (표 9).

양 UV 강도 모두로의 UV 조사 10분 후 바이러스 역가는 7.4logTCID₅₀/㎖ (대조구, 샘플 1)로부터 1.5logTCID₅₀/㎖로 하강하였다. 헤마글루틴화는 9의 HA 적정으로 2.1mW/㎠의 UV 강도에서 15분 동안 여전히 안정적이었으나, 3.3mW/㎠의 UV 강도에서는 8로 하강하였다. 항원-역가 (EIA) 또한 조사 15분 동안 640 및 1280 사이의 범위로 안정적이었다. 2.1mW/㎠의 UV 강도에서 3 및 5분 동안 조사된 샘플로 실시한 안전성 시험 (샘플 6 및 7)은 여전히 세포 배양액 중 CPE를 나타냈으며, 각각 8.2 및 8.6logTCID₅₀/㎖의 바이러스 역가를 제공하였다. 3.3mW/㎠의 보다 높은 UV 강도에서 2, 3 및 5분 동안 조사된 샘플 (샘플 번호 6 및 7)로 실시한 안전성 시험은 여전히 세포 배양액 중 CPE를 나타냈으며, 각각 8.2, 8.6 및 8.7logTCID₅₀/㎖의 바이러스 역가를 나타냈다. 조사 10분 후, 모든 안전성 시험은 음성이었다.

10분 초과의 2.1mW/㎠ 및 3.3mW/㎠의 강도에서 UV 조사는 RRV 제제를 완전히 불활성화시켰다. HA- 및 EIA 시험에서 나타난 바와 같이, 항원성은 15분 동안 양 조사 강도 모두에서 손상되지 않은 상태였다. 30분 후, 항원성은 영향을 받았다.

(D) 포르말린 불활성화된 1200ℓ 발효기 수확물의 UV-불활성화

포르말린 처리된 1200ℓ 발효기 바이러스 수확물의 분액을 300ℓ/h의 유속에서 3주기, 150ℓ/h에서 3주기 및 75ℓ/h에서 3주기로 UV 조사하였다. 포르말린 처리된 1200ℓ 발효기 바이러스 수확물의 제2 분액을 이번에는 투석여과 후, 300ℓ/h의 유속에서 10주기로 UV 조사하여, 고농도의 잔류하는 단백질 소량을 제거하였다. HA-역가, 항원-EIA-역가, 바이러스 역가 및 안전성 (CPE)을 각 작업 후 측정하였다 (표 10).

제1 실험 (투석여과 없음)에서 바이러스 역가는 150ℓ/h의 유속으로 UV 조사 1주기 후, 6.13logTCID₅₀/㎖로부터 검출 한계 아래로 하강하였다. 안전성 시험 또한 CPE를 나타내지 않았다. 그러나, 150ℓ/h의 유속으로 UV 조사 3주기 후, 모든 세포 배양액에서 안전성 시험은 양성 결과를 나타냈으며, 또한 바이러스 적정에서 양성이었다 (6.7logTCID₅₀/㎖). 75ℓ/h 유속에서 UV 조사 3주기는 바이러스 적정 및 안전성 시험 모두에서 음성으로 남았다. 제2 실험에서, 안전성 실험 및 바이러스 적정은 5 이상의 조사 주기 후 음성으로 남았다. 제1 실험에서, 모든 조사량은 각각 11 및 1:320으로 HA- 및 EIA-역가에 영향을 주지 않았다. 제2 실험에서, 모든 HA- 및 EIA-역가는 각각 10 및 1:320이었으며, 예외적으로 6 조사 주기는 1:640의 EIA-역가를 생성하였다.

포르말린 및 300ℓ/h의 유속으로 5 이상의 주기의 UV 조사로 RRV의 발효기 수확물의 이중 불활성화는 항원성의 손상 없이 감염성을 완전히 파괴하기에 충분하였다.

(E) 이중 불활성화된 RRV 후보 백신 제제의 효능

면역화된 생쥐 중 유효 투여량 (ED ₅₀ ), 보호성 투여량 (PD ₅₀ ) 및 ELISA 역가

포르말린 불활성화 및 이중 불활성화 (포르말린 + UV 조사)된 RRV 후보 백신을 10㎍/투여량으로 조정한 다음, 4배 단계로 희석하였다. 각 희석액을 10마리의 생쥐 군에게 주입하였다. 3주 후, 생쥐를 상응하는 양의 백신으로 상승시켰다. 혈액 샘플을 상승제 전 3주, 상승제 후 6주 및 3주에 회수하였다. RRV 항체 ELISA에 의해 혈청을 분석하였다. 이어서, 면역화된 생쥐 50％에서 혈청전환을 유도하기에 충분한 항원 투여량인 유효 투여량 50 (ED₅₀)을 계산하였다.

상승제 전 3주에, 포르말린 불활성화된 군의 ED₅₀은 635ng였으며, 포르말린 및 UV 이중 불활성화된 군의 ED₅₀은 202ng였다. 상승제 후, ED₅₀ 값은 각각 33ng 및 10ng였다. 그러나, ELISA 역가의 분석은 이중 불활성화 군이 더 높은 항체 역가를 가짐을 입증하였다: 예를 들어 3주에, 이중 불활성화 군 중 1,000을 갖는 16마리 생쥐에 대한 1,000의 ELISA 역가를 갖는 9마리 생쥐, 및 이중 불활성화 군 중 10,000을 갖는 4마리 생쥐에 대한 포르말린 군 중 10,000을 갖는 생쥐 없음. 상승제 후, 이중 불활성화 군의 역가는 더 높았다: 100,000을 갖는 이중 불활성화 군의 11마리 생쥐에 비해 포르말린 군의 8마리 생쥐, 및 이중 불활성화 군의 백만의 ELISA 역가를 갖는 추가의 4마리 생쥐 (표 11 및 표 12).

6주, 상승제 3주 후에, 생쥐는 10⁶ TCID₅₀/㎖ (조직 배양액 감염 투여량 50)의 살아있는 로스 리버 바이러스 (균주 T48)로 정맥내 감염되었다. 1, 2, 3 및 4일에 p.i. 혈액 샘플을 취하고, 계속해서 혈청의 TCID₅₀을 측정하였다. 감염된 생쥐의 50％가 어떠한 바이러스 혈증도 나타내지 않는 항원 투여량인 보호성 투여량 50 (PD₅₀)을 계산하였다. 78ng의 PD₅₀은 이중 불활성화 (포르말린 + UV 조사)된 항원 뿐만 아니라 포르말린 불활성화된 항원의 양 항원 제제에 대해 동일하였다.

면역화된 생쥐 중 유효 투여량 (ED₅₀), 보호성 투여량 (PD₅₀) 및 ELISA 역가

ED₅₀			PD₅₀
불활성화	3주	6주 (상승제)	6주
포르말린	635ng	33ng	78ng
포르말린 + UV	202ng	10ng	78ng

ELISA 역가

주	불활성화	<10¹	10¹	10²	10³	10⁴	10⁵	10⁶	10⁷	10⁸	N
3	포르말린	35	8	8	9	0	0	0	0	0	60
	포르말린+UV	27	7	6	16	4	0	0	0	0	60
6	포르말린	14	7	5	15	11	8	0	0	0	60
	포르말린+UV	8	7	9	7	14	11	4	0	0	60

포르말린 단독 처리 후, 매우 민감한 C6-36 세포주에서 주로 발견된 잔류 감염성은 감염성 RRV RNA에 의해 대체로 야기되었다. 포르말린 처리 후 바이러스의 게놈에 영향을 주는 제2 추가 바이러스 불활성화 단계 (UV 조사)의 도입은 생쥐 모델에서 면역원성 및 유효성에는 영향을 주지 않고, 완전히 불활성화되며 안전한 RRV 후보 백신 제제를 생성하였다.

Claims

(i) 유효 농도의 포르말린으로 샘플을 처리하고,
(ii) 유통 장치(flow-through apparatus) 중에서 유효 조사량의 UV광으로 샘플을 처리하고,
(iii) a) 포유류 세포 배양액을 정제된 불활성화 바이러스로 접종하고,
b) 세포 배양액을 배양하고,
c) 세포 배양액을 수확하고, 제2 포유류 세포 배양액을 상기 수확물로 접종하고,
d) 제2 세포 배양액을 배양하고,
e) 제2 세포 배양액을 수확하고, 수확물을 헤마글루티닌 활성에 대해 시험하는 것을 포함하는 포유류 세포 안전성 시험을 이용하여 샘플 중의 불활성화 바이러스의 잔류 감염성을 측정하는 단계를 포함하며,
단계 (i)은 단계 (ii) 전에 수행되거나, 또는 그 역인
샘플 중에 함유된 바이러스의 불활성화 방법.