ES2270501T3 - Procedimiento para la inactivacion de virus envueltos. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA LA INACTIVACION DE VIRUS CON ENVUELTA LIPIDICA CON UN DETERGENTE NO IONICO Y LA PREPARACION DE UNA INYECCION QUE CONTIENE EL VIRUS INACTIVADO. ADEMAS, LA INVENCION SE REFIERE A UN VIRUS INACTIVADO, QUE SE CARACTERIZA POR SU INTEGRIDAD ESTRUCTURAL, ESPECIALMENTE DE LA PROTEINA DE LA CUBIERTA, ASI COMO EL USO DEL VIRUS INACTIVADO PARA LA PRODUCCION DE UNA VACUNA.

Description

Procedimiento para la inactivación de virus envueltos.

La invención se refiere a un procedimiento para la inactivación de virus con envoltura lipídica con detergentes no iónicos y a la producción de una vacuna que contiene el virus inactivado. La invención se refiere además a un virus inactivado que se caracteriza por su integridad estructural, en particular de las proteínas de su envoltura, y también a la utilización del virus inactivado para la producción de una vacuna.

El desarrollo de vacunas eficaces para la profilaxis de enfermedades infecciosas virales es uno de los objetivos principales de la medicina en las últimas décadas. En la producción de vacunas con virus vivos se utilizan mutantes virales que poseen antígenos idénticos a los del virus de tipo salvaje, pero que presentan una patogenicidad o virulencia reducida.

Para la producción de vacunas muertas los virus de tipo salvaje se inactivan mediante tratamiento físico o químico, por ejemplo con formalina, hidroxilamina, \beta-propiolactona o por rayos UV, siendo importante el tipo de inactivación, en particular en cuanto a la obtención de la inmunogenicidad de los antígenos virales. La técnica más utilizada para la inactivación de virus en la producción de vacunas consiste en tratar suavemente los virus con formalina, pero para ello es necesario un largo tiempo de incubación de hasta 15 días (por ejemplo en caso de HAV) para lograr una reducción suficiente de la actividad viral.

En general, las vacunas de virus completos estimulan el desarrollo de anticuerpos circulantes contra las proteínas de la envoltura del virus. Por ello siempre se señala que durante el proceso de inactivación se ha de asegurar la conservación de la inmunogenicidad de las proteínas virales. Sin embargo, al mismo tiempo se ha de asegurar que todos los virus de la preparación estén inactivados para garantizar una vacuna segura.

Debido a diversos incidentes con vacunas de virus completos no inactivadas en su totalidad o a una contaminación de la preparación en la vacuna con componentes celulares o partículas virales no deseadas, se han buscado procedimientos de inactivación alternativos (Horaud, Develop. Biol. Standard. 75 (1991), 3-7; Brown, Develop. Biol. Standard. 81 (1993), 103-107).

Dado que la inactivación con formalina no siempre es completa y que en ciertas preparaciones de vacunas aisladas se han detectado virus infecciosos residuales (Smith y col., Am. J. Hyg. 63 (1956), 150-164), Mussgay y col. (Intervirology 1 (1973), 259-268) propusieron un proceso de inactivación en dos etapas en el que, después de la inactivación con formalina, se llevaba a cabo un tratamiento con Tween 80/éter, NP 40 o desoxicolatos. Sin embargo, comprobaron que el tratamiento adicional con el detergente o con el disolvente/detergente influía negativamente en las propiedades de protección de la vacuna inactivada con formalina.

Por ello, en los últimos años ha aumentado el desarrollo de vacunas de subunidad como alternativa a las vacunas que contienen virus completos inactivados. Para producir vacunas de subunidad, se solubiliza el virus intacto con un detergente fuerte, la proteína viral se separa del virus por disolución y los antígenos selectivos capaces de estimular anticuerpos protectores se aislan y se utilizan para producir la vacuna. Al mismo tiempo se eliminan proteínas no virales y componentes de la membrana viral que posiblemente podrían tener efectos secundarios no deseados al administrarse la vacuna. Los antígenos aislados para la vacuna de subunidad también pueden estar contenidos en dicha vacuna en forma altamente purificada y a altas concentraciones. Sin embargo, la inmunogenicidad puede ser baja en comparación con una vacuna de virus completo, ya que sólo hay disponibles antígenos como
inmunógenos.

Por ello, para inducir una respuesta inmune suficiente con la vacunación, se produjeron las llamadas vacunas de virus fraccionados (split). Para ello, el virus se solubiliza por completo con un detergente o con una mezcla de detergente y disolvente, la integridad del virus se destruye y el virus se divide en sus componentes individuales, por ejemplo proteínas de núcleo, proteínas de envoltura y componentes de membrana. La mezcla de componentes virales así preparada se utiliza después para la vacunación.

Algunos ensayos de inactivación de virus procedentes de productos plasmáticos humanos han demostrado que el tratamiento disolvente/detergente con TNBP/Tween® 80 puede inactivar los virus de envoltura lipídica, por ejemplo HIV, HCV, HBV o virus de Sindbis (Piet y col., Transfusión 30 (1990), 591-598).

En la producción comercial de vacunas de subunidad del virus de la gripe se utilizan diferentes procedimientos de inactivación con disolventes de lípidos tales como Tritón® X-100, bromuro de cetiltrimetilamonio, TNBP/Tween®80 o dietil éter/Tween®80. En particular, cuando se utiliza dietil éter en el paso de inactivación se ha comprobado que se produce una caída notable de la actividad de hemaglutinina. Danihelkova y col. (Acta Virol. 28 (1984), 26-32) han comprobado que la actividad de hemaglutinina y neuraminidasa de virus de la gripe inactivados se conserva bajo determinadas condiciones después del tratamiento con TNBP/Tween®80 o con dietil éter/Tween®. Sin embargo, apuntan que la separación del disolvente, en particular del dietil éter, de la preparación es problemática, por lo que se considera preferible un procedimiento de inactivación con TNBP/Tween®80.

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Para evitar la costosa separación del disolvente, en la producción de una vacuna de virus de la gripe fraccionada se ha utilizado únicamente Tritón X-100 como detergente no iónico (Gross y col., J. Clin. Microbiol. 14 (1981), 534-538).

Los detergentes no iónicos no poseen ningún grupo cargado. El carácter hidrófilo de estos detergentes se debe al grupo hidroxilo. A diferencia de los detergentes iónicos, solubilizan las proteínas de membrana de forma esencialmente más suave. El detergente no iónico disuelve los enlaces lípido-lípido y lípido-proteína, mientras que las interacciones proteína-proteína no resultan afectadas. De este modo se conserva la estructura nativa de las proteínas. Además, el detergente sustituye a los lípidos, que normalmente están unidos a la parte hidrófoba de las proteínas, con lo que crean un entorno de tipo lípido y pueden estabilizar proteínas solubilizadas.

En el documento US 4 314 997 se describe un procedimiento para la destrucción de endotoxinas y sustancias con actividad coagulante y también para la inactivación del virus de la hepatitis utilizando entre un 0,25% y un 10% de anfífilos no desnaturalizantes. En el documento EP 0 278 482 A2 se menciona un procedimiento para la inactivación de virus de envoltura mediante tratamiento con un detergente no iónico. El documento US 4 673 733 A se refiere a un procedimiento para la inactivación de virus y pirógenos mediante la utilización de un gen de inactivación. El documento US 4 164 565 trata de una vacuna contra hepatitis viral con antígenos de superficie de hepatitis B, incluyendo "antígenos e".

Algunas investigaciones con respecto al poder de protección de vacunas de SIV inactivadas después de tratamientos con formalina, psoraleno, Tritón®X-100 o Tween®/éter han demostrado que las preparaciones de SIV inactivadas con formalina y psoraleno no proporcionan ninguna protección contra una infección por SIV y que la inactivación con Tritón®X-100 sólo conduce a una protección parcial. Con una vacuna de SIV fraccionados inactivada con Tween®80/éter sólo se pudo observar un efecto protector a altas dosis de antígeno y en presencia de un potente adyuvante (Stahl-Hennig y col., Virology 186 (1992), 588-596).

Así, es necesario poner a disposición un procedimiento eficaz y seguro para la inactivación de virus, sobre todo si se utilizan virus infecciosos patógenos para los humanos, para la producción de una vacuna viral completa. Esto es especialmente aplicable en caso de aquellos virus, por ejemplo HIV, en los que la inactivación con métodos convencionales se considera insuficiente. Como ya se ha mencionado anteriormente, en el caso del SIV, por ejemplo, una inactivación con formalina conduce a una posible pérdida de antigenicidad.

Por consiguiente, el objetivo de la presente invención consiste en poner a disposición un nuevo procedimiento para la inactivación de virus que inactive de forma eficaz los virus de envoltura lipídica.

Este objetivo se resuelve según la invención poniendo a disposición un procedimiento para la inactivación de virus de envoltura lipídica en el que un virus envuelto intacto se incuba con un detergente no iónico del grupo de los polisorbatos durante un período suficiente para inactivar por completo las partículas virales, pero sin influir en su integridad estructural y en particular en la actividad biológica de las proteínas de superficie y de envoltura.

Sorprendentemente se ha comprobado que los virus de envoltura lipídica se inactivan eficazmente con un detergente no iónico del grupo de los polisorbatos, manteniéndose, como mínimo en su mayor parte, la integridad estructural del virus completo y en particular de la envoltura proteica, y también su actividad biológica, por ejemplo su inmunogenicidad y antigenicidad. Esto ha resultado sorprendente sobre todo porque la utilización de detergentes no iónicos tales como Tritón®X-100 ya ha sido descrita en el estado actual de la técnica para la producción de vacunas de virus fraccionados y, por consiguiente, para la desintegración de partículas virales intac-
tas.

Además, ensayos comparativos realizados en el marco de la invención con otros detergentes no iónicos, por ejemplo con octil-glucósido, han demostrado que este detergente, si bien inactiva todos los virus ensayados, ataca y solubiliza las proteínas virales estructurales, en particular las proteínas de envoltura. Dado que la conservación de la actividad biológica, en particular de las proteínas de envoltura exteriores, tiene una importancia decisiva para el desarrollo de una respuesta inmune protectora de las vacunas virales, esto influye negativamente en la antigenicidad e inmunogenicidad de una vacuna que contiene un virus completo con proteínas de envoltura solubilizadas en comparación con un virus intacto.

De acuerdo con un aspecto especial de la invención, en la realización del procedimiento según la invención se inactivan virus con envoltura de lípidos. En este contexto son especialmente preferentes los virus con envoltura de lípidos del grupo de los retrovirus tales como HIV-1 y HIV-2, flavivirus como TBEV y HCV, virus de la gripe, herpesvirus, paramixovirus como el virus de las paperas y el sarampión, o arenavirus como el virus de Junín y el de Lassa.

Además se ha comprobado que mediante el procedimiento según la invención no sólo se conserva la inmunogenicidad de los antígenos y la integridad del virus completo y de las proteínas de envoltura, sino que dicho procedimiento no influye en la actividad biológica de las proteínas, por ejemplo en su actividad hemoaglutinante en el caso del virus de la gripe o de TBEV, o en la actividad de unión de CD4 en el caso del HIV-1.

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Para la realización del procedimiento según la invención se utilizan detergentes no iónicos del grupo de los polisorbatos (polioxietilen-sorbitanos). Preferentemente se utilizan polisorbatos del grupo formado por Tween®80, Tween®60, Tween®40 y Tween®20, o una combinación de los mismos. De forma especialmente preferente, para la realización del procedimiento se utiliza Tween®80. En particular se ha comprobado que los detergentes no iónicos de este grupo no atacan a las proteínas intactas o no destruyen su actividad.

En particular, para la inactivación completa de todos los virus de una solución es necesario evitar la interacción y formación de agregados de las partículas virales, dado que dentro de un complejo agregado puede haber partículas individuales que estén protegidas contra la acción del detergente inactivador. Por consiguiente, el presente procedimiento ofrece la ventaja de reducir o incluso evitar la interacción de virus a través de interacciones proteína-proteína de las proteínas superficiales, y que las partículas virales individuales presentes pueden ser envueltas e inactivadas directamente por el detergente.

Para realizar el procedimiento según la invención, la concentración de polisorbato utilizada para inactivar los virus de envoltura lipídica se encuentra entre el 1% y el 25%, en particular entre el 1% y el 20%. Preferentemente, dicha concentración oscila entre el 10% y el 20% o entre el 10% y el 15%.

En el marco de la invención se comprobó sorprendentemente que en sólo 10 minutos de incubación con el polisorbato ya se producía una inactivación completa de los virus ensayados, mientras que en una carga de ensayo paralela con un 0,03 a un 0,1% de formalina se necesitaron 10 horas para alcanzar una inactivación comparable, por ejemplo para el HIV-1.

Por consiguiente, el presente procedimiento para la inactivación de virus de envoltura lipídica se lleva a cabo según la invención de tal modo que una suspensión de virus que procede directamente de sobrenadantes de cultivo celular o que consiste en una solución de virus purificada se incuba durante como mínimo 10 minutos con un detergente no iónico del grupo de los polisorbatos. En la mayoría de los virus de envoltura, después de este período de tiempo ya se logra una inactivación completa de los virus de la solución. No obstante, se pueden aplicar tiempos de incubación más largos, de hasta 10 horas, sin pérdida de la actividad biológica ni de la integridad estructural del virus completo y de las proteínas de envoltura.

El período de incubación con el detergente no iónico adecuado para inactivar el virus se puede calcular mediante una cinética sencilla de la inactivación de virus y titulaciones virales, por ejemplo tal como se describe en el Ejemplo 2 (véase más abajo).

Preferentemente, el procedimiento según la invención se lleva a cabo a una temperatura entre 20ºC y 40ºC. La elección del intervalo de temperaturas óptimo para la inactivación de virus con el procedimiento según la invención forma parte de los conocimientos generales de los especialistas. Por consiguiente, el cálculo de la temperatura óptima para el procedimiento según la invención se puede llevar a cabo sin dificultad para cada combinación particular detergente/virus. Del mismo modo, cualquier especialista puede determinar otros parámetros tales como la concentración óptima del detergente no iónico, la concentración de proteínas y el tiempo de incuba-
ción.

Cuando se determinan los parámetros de procedimiento óptimos siempre se ha de tener cuidado para no influir en la integridad estructural y en particular en la actividad biológica de las proteínas de superficie y de envoltura. En este contexto, aunque una conservación de como mínimo un 50% de los virus completos originalmente incluidos se puede considerar suficiente, preferentemente como mínimo un 80%, en especial como mínimo un 90% y en particular como mínimo un 95% de las partículas virales tratadas según la invención debería conservar su integridad
estructural.

Por consiguiente, una ventaja especial del procedimiento según la invención radica en la inactivación rápida y eficaz de los virus con envoltura de lípidos, lo que posibilita principalmente la utilización del procedimiento a gran escala y en la producción de vacunas de virus inactivados. Ya que, como es sabido, para la producción por ejemplo de una vacuna del virus de la gripe sólo se dispone de un período corto para el desarrollo del virus, la inactivación y la producción de la vacuna, el presente procedimiento constituye una mejora esencial para la producción industrial de vacunas.

En la producción de vacunas, después de la inactivación del virus siempre se lleva a cabo una filtración esterilizante para eliminar eventuales contaminaciones de la solución, por ejemplo debidas a componentes celulares o a impurezas bacterianas.

En el marco de la presente invención se ha comprobado que una preparación de virus inactivados producida mediante el procedimiento según la invención es más fácil de esterilizar por filtración, dado que las glicoproteínas de la envoltura exterior de los virus, que normalmente se pueden unir a la membrana del filtro, presentan una menor afinidad por la membrana del filtro debido a su unión con los monómeros del detergente. En consecuencia, el presente procedimiento ofrece la ventaja adicional de reducir las pérdidas de partículas virales inactivadas que normalmente se producen durante la filtración esterilizante y aumentar así el rendimiento para la producción de vacunas de virus inactivados.

De acuerdo con un aspecto especial de la presente invención, el detergente no iónico del grupo de los polisorbatos permanece en la solución que contiene virus después del paso de inactivación. Es sabido que en particular el Tween®80 es tolerado por los humanos y se utiliza mucho en productos alimenticios y cosméticos. Por consiguiente, si se administra a humanos o animales una vacuna que contenga una cantidad más o menos reducida de detergente, es de esperar que no se produzca ningún efecto secundario. No obstante, dado que de acuerdo con el presente procedimiento, para la inactivación de virus se puede utilizar una concentración de hasta un 20% de detergente no iónico, en algunos casos resulta ventajoso reducir dicha concentración en el producto final o en caso dado eliminarla por completo. Esto se puede llevar a cabo a través de medidas conocidas, por ejemplo diálisis o procedimientos cromatográficos. Procedimientos cromatográficos especialmente adecuados son la cromatografía de intercambio iónico o de filtración en gel. No obstante son adecuados todos los procedimientos descritos en el estado actual de la técnica para eliminar detergentes no iónicos de una solución.

Cuando se utilizan vacunas virales de administración por vía oral principalmente, con frecuencia se plantea el problema de que los antígenos se destruyen en el estómago por degradación proteolítica y, en consecuencia, pierden su efecto. Como es sabido, los polisorbatos también sirven como "detergentes estabilizadores" permitiendo que los componentes presentes en una solución, en particular las proteínas, permanezcan estables en dicha solución durante un período de tiempo más largo (WO 93/01831). Por consiguiente, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención, la preparación viral inactivada producida según la invención contiene un agente estabilizador. Preferentemente, la preparación viral contiene como agente estabilizador un polisorbato en una concentración final de como mínimo un 0,05%, preferentemente entre un 0,05% y un 0,5%, en particular de un 0,2%. No obstante, también es posible eliminar de la preparación viral el detergente utilizado como agente de inactivación y añadir a la misma cualquier agente estabilizador conocido del estado actual de la técnica.

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la producción de una vacuna de virus inactivados, en el que los virus inactivados obtenidos después de la inactivación según el procedimiento arriba descrito se mezclan, en caso dado después de retirar el detergente inactivador, con un vehículo fisiológicamente aceptable y en caso dado con un adyuvante.

En la preparación viral que contiene virus inactivados obtenida con el procedimiento según la invención, el virus se caracteriza por la integridad estructural del virus completo y en particular por la integridad de las proteínas de envoltura. En el marco de la presente invención se ha comprobado que el tratamiento y la activación de una partícula viral de envoltura lipídica con un detergente no iónico seleccionado de entre el grupo de los polisorbatos no perjudica a la integridad del virus completo y básicamente no influye en la actividad biológica de las glicoproteínas de envoltura. Esto resultó sorprendente sobre todo porque otros detergentes no iónicos como TritónX-100 u octil-glucósido, inactivan los virus de envoltura destruyendo la integridad estructural del virus completo.

La preparación viral obtenida según la invención puede contener, en caso dado, agentes estabilizadores como componentes adicionales. De acuerdo con lo arriba indicado, el agente estabilizador consiste preferentemente en el detergente no iónico del grupo de los polisorbatos, en particular Tween®, utilizado para la inactivación. No obstante, también puede contener cualquier agente estabilizador conocido en el estado actual de la técnica.

La preparación viral obtenida según la invención se puede poner a disposición en forma de un medicamento, en particular, y de acuerdo con otro aspecto de la invención, para producir una vacuna estable para la inmunización de vertebrados; es decir, una vacuna que contiene una preparación viral del tipo arriba descrito y en caso dado un vehículo fisiológicamente aceptable.

La vacuna consiste en una preparación viral inactivada de acuerdo con el procedimiento según la invención. Después del paso de inactivación, en caso dado se retira el detergente no iónico inactivador y se añade un vehículo fisiológicamente aceptable a la solución viral inactivada. De acuerdo con la presente invención, como vehículos fisiológicamente aceptables entran en consideración todas las formulaciones farmacéuticas conocidas en el estado actual de la técnica. La formulación de la vacuna según la invención puede realizarse de la forma habitual y conocida, por ejemplo con ayuda de agua desionizada, con una solución tampón de fosfato o sales, y, en caso dado, puede contener aminoácidos o detergentes no iónicos suaves, por ejemplo Tween®20 o Tween®80, para la
estabilización.

El virus inactivado puede estar presente en los tipos de formulación más diversos para ser utilizados como vacunas. La concentración del virus inactivado en la vacuna en general oscila entre 10^{6} y 10^{9} pfu/ml, preferentemente es de 10^{7} pfu/ml. En caso dado, la vacuna según la invención contiene un adyuvante en una concentración deseada para aumentar la respuesta inmune, por ejemplo para estimular la producción de anticuerpos neutralizadores. Los adyuvantes inmunológicamente aceptables pueden consistir en aceites minerales, adyuvante de Freund, aceites vegetales, sales minerales, inmunomoduladores o inmunopotenciadores.

La vacuna se puede administrar de diferentes modos, por ejemplo vía subcutánea, oral, nasal, intramuscular o intraperitoneal. En general se administra la dosis de vacuna de acuerdo con los esquemas de vacunación cono-
cidos.

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La invención se describe más detalladamente en relación con los siguientes ejemplos y figuras, evidentemente sin estar limitada a los mismos.

El Ejemplo 1 describe la inactivación de virus de envoltura lipídica con los detergentes no iónicos Tween®80 y octil-glucósido; el Ejemplo 2 describe la cinética de la inactivación del virus HIV-1 y TBEV después del tratamiento con Tween®80; el Ejemplo 3 describe el análisis Westernblot del HIV-1 inactivado después del tratamiento con octil-glucósido 1% y Tween® 80 15%; el Ejemplo 4 describe el análisis Westernblot del virus de la gripe KP inactivado después del tratamiento con octil-glucósido 1% y Tween® 80 11%; el Ejemplo 5 describe la inmunización de ratones con complejo Tween®80-MAIDS inactivado; el Ejemplo 6 describe la cinética de inactivación del virus HIV-1 con formalina; y el Ejemplo 7 describe el análisis Westernblot del HIV-1 inactivado con formalina después de diferentes períodos de incubación.

Descripción de las figuras

Figura 1: Análisis Westernblot del HIV-1 inactivado después del tratamiento con octil-glucósido 1% y Tween® 80 11%.

Figura 2: Análisis Westernblot del virus de la gripe KP inactivado después del tratamiento con octil-glucósido 1% y Tween® 80 15%.

Figura 3: Análisis Westernblot del HIV-1 inactivado con formalina después de diferentes períodos de incuba-
ción.

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Tabla 1: Inactivación de virus de envoltura lipídica con los detergentes no iónicos Tween®80 y octil-glucósido.

Tabla 2: Cinética de inactivación de los virus HIV-1 y TBEV después del tratamiento con Tween®80.

Tabla 3: Respuesta inmune de ratones inmunizados con complejo Tween®80-MAIDS inactivado después de 5 y 12 semanas.

Tabla 4: Cinética de inactivación del virus HIV-1 con formalina.

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Ejemplo 1

Inactivación de virus de envoltura lipídica con los detergentes no iónicos Tween®80 y octil-glucósido

Se purificaron preparaciones virales de HIV-1, HIV-2, virus de la gripe y PRV (virus de la pseudorrabia) mediante centrifugación con gradiente de sacarosa y posterior diálisis. La preparación purificada se mezcló con octil-glucósido hasta una concentración final de un 1% o con Tween®80 hasta una concentración final de un 11%, 15% y 20%, y se incubó durante 1 hora a 26ºC. A continuación, la preparación se diluyó con PBS, se sometió a pelletización durante 5 minutos a 400.000 g y, antes de la titulación, se resuspendió en PBS. Los virus HIV-1, HIV-2, virus de la gripe o PRV así tratados se diluyeron en etapas semilogarítmicas en el medio de cultivo celular. En cada caso, 8 x 100 \mul de cada etapa de dilución se introdujeron en un pocillo de una placa de microtitulación que contenía células indicadoras. Las células infectadas se incubaron a 37ºC durante 5 a 6 días y el efecto citopático del virus en la célula indicadora se determinó por microscopía. Como células indicadoras para el PRV y el virus de la gripe se utilizaron células Vero, para HIV-1 células AA2 y para HIV-2 células C8166. La TCID_{50} se calculó según Reed y Muench (Am. J. Hyg. 27 (1938), 493-497) y se resume en la Tabla 1.

Los datos de la Tabla 1 muestran que con un 1% de octil-glucósido se inactivaron todos los virus ensayados en 5-7 log_{10}. También se inactivaron todos los virus con un 20% de Tween®80, mientras que para HIV-1, HIV-2 y TBEV fue suficiente una concentración de un 11% de Tween®80 para lograr una inactivación completa.

TABLA 1 Inactivación de virus de envoltura con los detergentes no iónicos Tween®80 y octil-glucósido

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Ejemplo 2

Cinética de inactivación de HIV-1 y TBEV después del tratamiento con Tween®80

Se mezcló una preparación viral de TBEV y de HIV-1 purificada con gradiente de sacarosa con una solución de Tween®80 hasta una concentración final de un 11% en Tween®80. La mezcla se incubó a 26ºC bajo agitación continua y después de determinados períodos se tomaron muestras para la titulación de los virus. Inmediatamente después de la toma, las muestras se diluyeron con PBS en una proporción 1:20, se sometieron a pelletización a 400.000 g durante 5 minutos y los pellets se resuspendieron en PBS antes de su titulación. El TBEV se tituló mediante un ensayo en placa con células PS y el HIV-2 se tituló con células AA2.

El virus TBE se diluyó por etapas en pasos de log 1 y dos partes alícuotas de 500 \mul de cada etapa de dilución se añadieron a monocapas celulares. Las células se cubrieron con una mezcla 1:1 de 2 x medio y carboximetilcelulosa 1,8% y se incubaron durante 4 días. Las placas virales se observaron mediante tinción con una solución de violeta cristal al 0,1% y el título se determinó mediante recuento de placas.

La titulación del HIV-1 en células AA2 se llevó a cabo después de una dilución por etapas en el medio de cultivo celular. En cada caso, 8 x 100 \mul de cada etapa de dilución se introdujeron en los pocillos de una placa de microtitulación que contenía 2 x 10^{4} células AA2. Las células infectadas se incubaron a 37ºC durante 5 - 6 días y el efecto citopático del virus en la célula indicadora se determinó por microscopía. La TCID_{50} se calculó según Reed y Muench (Am. J. Hyg. 27 (1938), 493-497).

El título (pfu/ml) se calculó de acuerdo con la distribución de Poisson. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

Los datos de la Tabla 2 muestran que una preparación de TBEV se inactiva en > 6,4 log_{10} con un 11% Tween®80 en un plazo de 20 minutos a 26ºC. Bajo las mismas condiciones, una preparación de HIV se inactiva en > 6,2 log_{10} en un plazo de 10 minutos.

TABLA 2 Cinética de inactivación de HIV-1 y TBEV después del tratamiento con Tween®80

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Ejemplo 3

Análisis Westernblot de HIV-1 inactivado después del tratamiento con octil-glucósido 1% y Tween®80 11%

Se mezcló una preparación de HIV-1 purificada con gradiente de sacarosa según el Ejemplo 1, en cada caso, con Tween®80 11%, octil-glucósido 1% o PBS y se incubó a 26ºC durante 1 hora. A continuación, las muestras se diluyeron, se sometieron a pelletización a 400,000 g durante 10 minutos a 4ºC (con lo que las proteínas virales, en particular las proteínas de envoltura, que se disuelven del virus completo mediante tratamiento con el detergente, perdiendo la partícula viral su integridad estructural, permanecen en el sobrenadante y en consecuencia no son registradas en el posterior análisis Westernblot), se resuspendieron en el tampón de lisis, se separaron mediante SDS-PAGE según Laemmli (Nature 227 (1970), 680-685) y se transfirieron a una membrana filtro.

Para detectar proteínas específicas de HIV-1, la membrana filtro se incubó durante la noche con una mezcla de IgG humana positiva en anticuerpos de HIV-1 (Immuno AG), un anticuerpo monoclonal humano específico gp41 y un anticuerpo monoclonal de ratón específico gp120 (DuPont). Después de lavarla, la membrana se incubó con IgG de cabra antihumana y antirratón acoplada con peroxidasa como segundo anticuerpo. La detección de bandas específicas de HIV-1 se realizó por reacción cromática enzimática con diaminobenzidina y H_{2}O_{2}. La Figura 1 muestra el resultado del análisis Westernblot.

Después del tratamiento con octil-glucósido 1%, las proteínas de envoltura del HIV-1, en particular gp160 y gp120, ya no se pueden detectar, lo que prueba que se ha perdido la integridad estructural de las partículas virales tratadas con octil-glucósido o la actividad biológica de las proteínas de superficie o de envoltura. Por el contrario, tanto en el caso del control (PBS) como en el de la muestra tratada con Tween®80, las proteínas de envoltura se pueden detectar claramente en el Westernblot, lo que demuestra que la integridad estructural del virus completo se conserva en el tratamiento con Tween. Mediante la reacción inmune con el anticuerpo específico gp120 también se demuestra que los determinantes antigénicos de las proteínas de envoltura no resultan afectados por el tratamiento con Tween®80 y no presentan ningún cambio en comparación con los controles no tratados.

Ejemplo 4

Análisis Westernblot del virus de la gripe KP inactivado después de tratamiento con octil-glucósido 1% y Tween 80 15%

Se trató una preparación del virus de la gripe KP purificada con gradiente de sacarosa según los Ejemplos 1 y 3 con octil-glucósido 1%, Tween®80 15% o PBS, se sometió a pelletización y se realizó un análisis Westernblot.

Para detectar proteínas específicas del virus de la gripe, la membrana filtro se incubó durante la noche con anticuerpos monoclonales de ratón, orientados contra HA1 y HA2 de la glicoproteína superficial, hemaglutinina (HA). Después de lavarla, la membrana se incubó con IgG de cabra antihumana y antirratón acoplada con peroxidasa como segundo anticuerpo. La detección de las glicoproteínas HA del virus de la gripe se realizó por reacción cromática enzimática con diaminobenzidina y H_{2}O_{2}.

La Figura 2 muestra los resultados del análisis Westernblot.

Mediante el tratamiento con octil-glucósido 1% se eliminan por completo las glicoproteínas HA (Figura 1; columnas 2 y 3). En cambio, tanto en el caso del control (PBS) como en el de la muestra tratada con Tween®80 se puede reconocer claramente la integridad estructural de las glicoproteínas HA (Figura 2, columnas 4 a 7).

Ejemplo 5

Inmunización de ratones con complejo MAIDS inactivado con Tween®80

Se incubó durante 1 hora un preparado de complejo MAIDS (BM5-Mix MuLV) con Tween®80 o con PBS, a temperatura ambiente. A C57 Bl/6 se les inyectó vía i.p. una preparación de complejo MAIDS inactivada con Tween®80 y otra tratada con PBS. Los ratones se diseccionaron cinco y doce semanas después de la inmunización. Para evaluar los síntomas de MAIDS se determinó el peso de los ganglios linfáticos cervicales y del bazo, se aislaron virus infecciosos del bazo y se determinó el título de anticuerpos contra los antígenos del complejo BM5-Mix MuLV. Los resultados se muestran en las Tablas 3a y 3b.

Las Tablas 3a y 3b demuestran que el tratamiento del complejo BM5-Mix MuLV con Tween®80 condujo a una inactivación completa. A lo largo del período de observación de 12 semanas no apareció ningún síntoma de MAIDS ni se pudo aislar ningún virus infeccioso de las células del bazo. Sin embargo, la preparación viral inactivada indujo títulos de anticuerpos relativamente altos contra antígenos del complejo MAIDS. La preparación de BM5-Mix MuLV tratada con PBS produjo claros síntomas de MAIDS con un gran aumento del peso del bazo y de los ganglios linfáticos cervicales, títulos de virus muy altos en el bazo y, debido a la debilidad inmunitaria inducida por el complejo MAIDS, no provocó ninguna respuesta inmune.

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TABLA 3a MAIDS/Resultados de inactivación con Tween Resultados de sección, titulación Elisa y aislamiento de MuLV ecotrópico de bazos de ratones C57 Bl/6 infectados 5 semanas después de la infección con BM5-Mix MuLV

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TABLA 3b MAIDS/Resultados de inactivación con Tween Resultados de sección, titulación Elisa y aislamiento del MuLV ecotrópico de bazos de ratones C57 Bl/6 infectados 12 semanas después de infección con BM5-Mix MuLV

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Ejemplo 6

Cinética de inactivación de HIV-1 con formalina

A una preparación de HIV-1 con un título viral de 10^{7} TCID_{50}/ml purificada con gradiente de sacarosa se le añadió formalina a una concentración final de 0,01%, 0,03%, 0,05%, 0,075% y 0,1%. La solución se incubó a 37ºC bajo agitación continua y después de diferentes períodos se tomaron muestras para la titulación viral. Antes de la titulación y para neutralizar la formalina a cada una de las muestras se añadió una parte alícuota correspondiente de Na_{2}S_{2}O_{5}. La titulación de virus se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo 1.

Con una concentración de formalina de entre el 0,03% y el 0,1% se produjo una inactivación eficaz del HIV-1 después de aproximadamente 10 horas. Con una concentración inferior al 0,03% de formalina, después de 30 horas de incubación todavía se podían detectar virus infecciosos activos.

TABLA 4 Cinética de la inactivación de HIV-1 con formalina

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Ejemplo 7

Análisis Westernblot del HIV-1 inactivado con formalina después de diferentes períodos de incubación

A partir de una preparación viral de HIV-1 inactivada con formalina según el Ejemplo 6 se tomaron muestras después de 0, 1, 2, 3, 6, 10, 20 y 30 horas y se realizó un análisis Westernblot con partes alícuotas.

Para detectar proteínas específicas de HIV-1, la membrana filtro se incubó durante la noche con IgG humana positiva en anticuerpos de HIV-1 (Immuno AG). Después de lavarla, la membrana se incubó con IgG de cabra antihumana y antirratón acoplada con peroxidasa como segundo anticuerpo. La detección de bandas específicas de HIV-1 se llevó a cabo mediante reacción cromática enzimática con diaminobenzidina y H_{2}O_{2}. La Figura 3 muestra el resultado del análisis Westernblot.

Se comprobó que, aunque después de un tratamiento con formalina los virus se pueden someter a pelletización y por consiguiente todavía están intactos como virus completos, después de sólo 1 hora de incubación con un 0,1% de formalina ya se descomponen las proteínas de la envoltura, con lo que se destruye su estructura nativa.

El análisis Westernblot muestra que a partir de 3 horas de incubación se produjo una desintegración de los virus intactos. Una incubación de 10 horas de duración, que según el Ejemplo 6 es el tiempo necesario para una inactivación eficaz, también conduce a una desintegración de la estructura de los virus inactivados.

Por consiguiente, por primera vez se ha demostrado que una inactivación con formalina tiene gran influencia en la estructura del virus intacto.

Claims (10)

1. Procedimiento para la inactivación de virus de envoltura lipídica sin destruir la integridad estructural de los virus, caracterizado porque un virus intacto se incuba con un detergente no iónico del grupo de los polisorbatos durante un período suficiente como para inactivar el virus.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el virus procede de un sobrenadante de cultivo celular.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el virus de envoltura lipídica se selecciona de entre el grupo de retrovirus como HIV-1, HIV-2, HTLV-I o HTLV-II, flavivirus como TBEV o HCV, ortomixovirus como los virus de la gripe, herpesvirus, paramixovirus como el virus de las paperas o el sarampión, o arenavirus como el virus de Junin y el virus de Lassa.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el polisorbato es Tween®80, Tween®40,
Tween®20, Tween®60 o una combinación de los mismos.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el detergente no iónico del grupo de los polisorbatos es un detergente estabilizador.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la concentración del detergente no iónico del grupo de los polisorbatos oscila entre el 1% y el 20%, preferentemente entre el 10% y el 15%.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la incubación con el detergente no iónico se realiza durante como mínimo 10 minutos.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el detergente no iónico se retira, dado el caso mediante un procedimiento cromatográfico o de diálisis.

9. Procedimiento para producir una vacuna de virus completo inactivada, caracterizado porque un virus inactivado según una de las reivindicaciones 1 a 8 se mezcla con un vehículo fisiológicamente aceptable y en caso dado con un adyuvante.

10. Utilización de una preparación viral producida según una de las reivindicaciones 1 a 9 para producir una vacuna estable para la inmunización de vertebrados.