JPH10234362A - 脂質エンベロープウイルスの不活化方法 - Google Patents

脂質エンベロープウイルスの不活化方法

Info

Publication number
JPH10234362A
JPH10234362A JP10038604A JP3860498A JPH10234362A JP H10234362 A JPH10234362 A JP H10234362A JP 10038604 A JP10038604 A JP 10038604A JP 3860498 A JP3860498 A JP 3860498A JP H10234362 A JPH10234362 A JP H10234362A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
virus
tween
inactivated
vaccine
hiv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP10038604A
Other languages
English (en)
Inventor
Berlet Noel
ノエル・バーレット
Kistner Ottofried
オットフリート・キストナー
Dorner Friedrich
フリートリッヒ・ドルナー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oesterreichisches Institut fuer Haemoderivate
Original Assignee
Immuno AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immuno AG filed Critical Immuno AG
Publication of JPH10234362A publication Critical patent/JPH10234362A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16761—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/16763—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2740/16063—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16063—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/24163—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 脂質エンベロープウイルスの不活化法および
不活化ウイルスを含有するワクチンの製造法を提供す
る。 【解決手段】 脂質エンベロープウイルスの構造的完全
性、特にエンベロープタンパク質の構造的完全性が保持
されるように、非イオン性界面活性剤を用いて該ウイル
スを不活化し、該不活化ウイルスをワクチン製造に使用
する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は非イオン性界面活性
剤による脂質エンベロープウイルスの不活化方法および
不活化ウイルスを含むワクチンの製造方法に関する。さ
らに、本発明は不活化ウイルスの構造的完全性、特にそ
のエンベロープタンパク質の構造的完全性を特徴とする
不活化ウイルス、およびワクチンを製造するための該不
活化ウイルスの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】過去数十年間、ウイルス感染病を予防す
るための効率的なワクチンの開発は医学における主要な
目的の一つになってきている。生ウイルスワクチンの製
造では、野生型ウイルスの抗原と同じ抗原を有し、病原
性または毒性が低下したウイルス突然変異体が用いられ
る。死菌ワクチンを製造するには、野生型ウイルスを、
ホルマリン、ヒドロキシルアミン、β−プロピオンラク
トンまたはＵＶ照射を用いるような物理学的または化学
的処理により不活化するが、特にウイルス抗原の免疫原
性を保持するには不活化の種類が重要である。ワクチン
の製造においてウイルスの不活化に主として用いられる
技術は、ウイルスをホルマリンで緩やかに処理すること
であるが、この方法ではウイルス活性を十分に低下させ
るために１５日間に及ぶ長いインキュベーション期間
（例えば、ＨＡＶの場合）を要する。
【０００３】全（まるごとの）ウイルスワクチンは、一
般的にウイルスのエンベロープタンパク質に対する循環
抗体の発現を誘導する。したがって、この不活化方法で
はウイルスタンパク質の免疫原性を保持することが保証
されなければならないことが繰り返し指摘されてきた。
しかしながら、同時に、安全なワクチンであることを保
証するために製剤中のすべてのウイルスが不活化されて
いることが保証されなければならない。不完全に不活化
された全ウイルスワクチン、またはワクチン製剤への細
胞成分または望ましくないウイルス粒子のコンタミネー
ションがもたらす出来事の結果として、別の不活化方法
が研究されてきた（Horaud、Develop.Biol.Standard.75
(1991),3-7; Brown、Develop. Biol.Standard.81(199
3),103-107)。
【０００４】ホルマリン不活化は常に完全というわけで
はなく、残っている感染性ウイルスが個々のワクチン製
剤中に認められるので（Smithら、Am.J.Hyg.63(1956),1
50-164)、Mussgayら(Inter-virology 1(1973,259-268)
は、Ｔｗｅｅｎ８０／エーテル、ＮＰ４０またはデオキ
シコーレートで処理し、次いでホルマリン不活化を行
う、２段階不活化法を提唱している。しかし、Mussgay
らは、界面活性剤または溶媒／界面活性剤でさらに処理
することによりホルマリン不活化ワクチンの防御性に負
の影響があることをみいだした。
【０００５】このようにして、近年、不活化全ウイルス
を含むワクチンに代わってサブユニットワクチンがます
ます開発されてきた。サブユニットワクチンの製造で
は、完全なウイルスを強力な界面活性剤で可溶化し、ウ
イルスタンパク質をウイルスから溶解させ、防御抗体を
誘導することができる選択的抗原を単離し、ワクチン製
造に用いる。同時に、ワクチンを投与する場合は望まし
くない副作用を有するかも知れない非ウイルスタンパク
質およびウイルスの膜成分を排除する。サブユニットワ
クチン用に単離された抗原は高度に精製された形および
高濃度でワクチン中に含まれていてもよい。さらに、個
々の抗原のみを免疫源として利用できるため、その免疫
原性は完全ウイルスワクチンに比べて弱くてよい。ワク
チネーションにおいて十分な免疫反応を誘導するため
に、このようにいわゆるスプリットワクチンが製造され
てきた。そこで、ウイルスを界面活性剤または界面活性
剤の混合物および溶媒で完全に可溶化し、ウイルスの完
全性を破壊し、ウイルスを溶解させて、コアタンパク
質、エンベロープタンパク質および膜成分のようなその
個々の成分とする。次に、このようにして調製されたウ
イルス成分の混合物はワクチネーションに利用される。
【０００６】ヒト血漿産物のウイルス不活化の過程で行
われた実験から、ＴＮＢＰ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８
０を用いる溶媒／界面活性剤処理により、例えばＨＩ
Ｖ、ＨＣＶ、ＨＢＶまたはSindbisウイルスのような脂
質エンベロープウイルスを不活化することができること
が示された（Pietら、Transfusion 30(1990), 591-59
8）。インフルエンザウイルスサブユニットワクチンの
商業的生産には、Ｔｒｉｔｏｎ(登録商標）Ｘ−１０
０、セチルトリメチル−臭化アンモニウム、ＴＮＢＰ／
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０またはジエチルエーテル／
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０のような脂質溶媒を用いて
不活化するために種々の方法が用いられる。特に、不活
化工程でジエチルエーテルを用いる場合は、ヘマグルチ
ニン活性の顕著な低下が生じることがわかっている。Da
nihelkovaら(Acta virol. 28 (1984),26-32)は、不活化
インフルエンザウイルスのヘマグルチニンおよびノイラ
ミニダーゼ活性は、ある条件下ではＴＮＢＰ／Ｔｗｅｅ
ｎ（登録商標）８０またはジエチルエーテル／Ｔｗｅｅ
ｎ（登録商標）で処理した後に保持されることをみいだ
した。しかしながら、Danihelkovaらは、調製物から
の、溶媒、特にジエチルエーテルの除去に問題があるた
め、ＴＮＢＰ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を用いる不
活化法が好ましいと思われると述べている。
【０００７】溶媒の複雑な除去を避けるため、このよう
にインフルエンザスプリットワクチンの製造には非イオ
ン性界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１
００のみが用いられた(Grossら、J.Clin.Microbiol.14
(1981),534-538）。非イオン性界面活性剤は荷電した基
を持たず、該界面活性剤の親水性の性質はヒドロキシル
基によって生じる。イオン性界面活性剤と違って、非イ
オン性界面活性剤は膜タンパク質をはるかにより緩やか
に可溶化する。非イオン性界面活性剤は、タンパク質−
タンパク質相互作用に影響を及ぼさずに脂質−脂質およ
び脂質−タンパク質結合を破壊する。これにより、タン
パク質の天然の構造が保持される。さらに、該界面活性
剤は、通常タンパク質の疎水性部分に連結している脂質
を置換することにより、脂質様環境を作りだし、可溶化
タンパク質を安定化させる。
【０００８】ホルマリン、プソラレン、Ｔｒｉｔｏｎ
（登録商標）Ｘ−１００またはＴｗｅｅｎ（登録商標）
／エーテルで処理した後の不活化ＳＩＶワクチンの防御
性に関する研究から、ホルマリンおよびプソラレン不活
化ＳＩＶ調製物はＳＩＶ感染を防御せず、Ｔｒｉｔｏｎ
（登録商標）Ｘ−１００不活化では部分的にしか防御さ
れないことが示された。しかしながら、ＳＩＶのＴｗｅ
ｅｎ（登録商標）８０／エーテル不活化スプリットワク
チンを用いる防御効果は、強力なアジュバントの存在下
および高抗原量でのみ示された（Stahl-Heningら、Viro
logy 186(1992),588-596）。
【０００９】特に、全ウイルスワクチンの製造において
感染性のヒト病原性ウイルスを用いる場合は、ウイルス
の効果的かつ安全な不活化法が必要である。これは、特
に、通常の方法による不活化では不十分と考えられる、
例えばＨＩＶのようなウイルスに当てはまる。上記のよ
うに、ＳＩＶの場合、例えばホルマリン不活化は抗原性
の低下を生じ得る。
【００１０】このように、本発明の目的は脂質エンベロ
ープウイルスを効率的に不活化する新規ウイルス不活化
法を提供することである。
【００１１】本発明によれば、この目的は、脂質エンベ
ロープ完全ウイルスを、その構造的完全性、特にその表
面およびエンベロープタンパク質の生物活性に影響を与
えることなく、ウイルス粒子を完全に不活化するのに十
分な時間、ポリソルベート群の非イオン性界面活性剤で
インキュベーションするウイルスの不活化方法を提供す
ることによって達成される。驚くべきことに、脂質エン
ベロープウイルスをポリソルベートの群から選ばれる非
イオン性界面活性剤で処理することにより、ウイルスが
効率的に不活化され、全ウイルス、特にエンベロープタ
ンパク質の構造的完全性、ならびに免疫原性および抗原
性といったその生物活性が少なくとも大部分保持される
ことをみいだした。このことは、先行技術文献に、スプ
リットウイルスを製造する、すなわち完全ウイルス粒子
を分解するためにＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００
のような非イオン性界面活性剤を使用することが記載さ
れているので特に驚くべきことであった。オクチルグル
コシドのような他の非イオン性界面活性剤を用いる本発
明の過程で行われた比較試験は、さらに、この界面活性
剤が試験したすべてのウイルスを不活化し、さらにウイ
ルスの構造タンパク質、特にエンベロープタンパク質を
攻撃し、それを可溶化することを示した。生物活性、特
に外部エンベロープタンパク質の保持は、ウイルスワク
チンの防御的免疫反応の形成に決定的に重要であるの
で、可溶化エンベロープタンパク質を有する全ウイルス
を含むワクチンの抗原性および免疫原性は完全ウイルス
に比べて低下している。
【００１２】本発明の特別な局面では、脂質エンベロー
プウイルスは本発明の方法を実施するときに不活化され
る。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のようなレトロウイル
ス、ＴＢＥＶおよびＨＣＶのようなフラビウイルス、イ
ンフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、ムンプスウ
イルスおよび麻疹ウイルスのようなパラミクソウイル
ス、またはJuninウイルスおよびLassaウイルスのような
アレナウイルスの群から選ばれる脂質エンベロープウイ
ルスが特に好ましい。さらに、本発明の方法では、抗原
の免疫原性、および全ウイルスおよびエンベロープタン
パク質の完全性が保持されるだけでなく、例えばインフ
ルエンザウイルスまたはＴＢＥＶの血球凝集活性、また
はＨＩＶ−１のＣＤ４結合活性のようなタンパク質の生
物活性は影響を受けないことが示されている。
【００１３】本発明の方法を行うには、ポリソルベート
（ポリオキシエチレンソルビタン）の群から選ばれる非
イオン性界面活性剤が用いられる。好ましくは、Ｔｗｅ
ｅｎ（登録商標）８０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０、
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０およびＴｗｅｅｎ（登録商
標）２０、またはその組み合わせからなる群から選ばれ
るポリソルベートが用いられる。本方法を実施するため
にＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を用いるのが特に好まし
い。特に、この群の非イオン性界面活性剤は完全タンパ
ク質を攻撃せず、その活性も破壊しないことが示されて
いる。特に、溶液中に存在するすべてのウイルスを完全
に不活化するには、凝集物コンプレックス内では個々の
粒子は不活化用界面活性剤の作用から保護されるかも知
れないので、ウイルス粒子の相互作用と凝集物形成を避
ける必要がある。このように本発明は、表面タンパク質
のタンパク質−タンパク質相互作用を介したウイルスの
相互作用を減らし、そしてさらに予防し、個々に存在す
るウイルス粒子を界面活性剤によって直接被い、不活化
する。
【００１４】本発明の方法を行うには、脂質エンベロー
プウイルスを不活化するために１％〜２５％の範囲のポ
リソルベート濃度を用いる。１０％〜２０％または１０
％〜１５％の範囲の濃度が好ましい。驚くべきことに、
本発明の範囲内において、試験したウイルスの完全な不
活化はポリソルベートで１０分間インキュベーションし
た後に既に生じていたが、０．０３〜０．１％ホルマリ
ンを含む対比試験製剤では例えばＨＩＶ−１の完全な不
活化は１０時間後にのみ達成されたことがわかった。こ
のように本発明では、脂質エンベロープウイルスを不活
化するための本方法は、細胞培養上清または精製ウイル
ス溶液から直接得られるウイルス懸濁液をポリソルベー
トの群から選ばれる非イオン性界面活性剤で少なくとも
１０分間インキュベーションするように実施される。ほ
とんどの脂質エンベロープウイルスにおいて、溶液中の
ウイルスの完全な不活化はこの期間後に既に達成されて
いる。全ウイルスおよびエンベロープタンパク質の構造
的完全性および生物活性を何ら損なうことなく１０時間
までのさらに長いインキュベーション期間が可能であ
る。
【００１５】ウイルスを不活化するのに十分な非イオン
性界面活性剤によるインキュベーション期間は、ウイル
ス不活化の簡単な反応速度論、および例えば実施例２
（下記）に記載のようなウイルス力価を測定することに
より決定することができよう。本発明の方法は２０℃〜
４０℃の温度で行うことが好ましい。本発明の方法を用
いてウイルスを不活化するのに最適な温度範囲の選択
は、当業者全体の知るところである。このように、本発
明の方法に最適な温度の決定は、界面活性剤／ウイルス
の各組み合わせにおいていかなる困難もなく行うことが
できよう。同様に、あらゆる当業者は、非イオン性界面
活性剤の最適濃度、タンパク質濃度およびインキュベー
ション期間のような他のパラメーターを決定できよう。
【００１６】本方法に最適なパラメーターを決定するに
は、構造の完全性、特に表面およびエンベロープタンパ
ク質の生物活性が影響を受けないように常に気をつけね
ばならない。このためには、最初に含まれている全ウイ
ルスの少なくとも５０％が保持されていれば十分と考え
られるが、本発明にしたがって処理されるウイルス粒子
の好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なく
とも９０％、特に９５％の構造的完全性が保持されるべ
きである。このように、本発明の方法の注目すべき利点
は、脂質エンベロープウイルスの急速および効率的な不
活化にあり、これにより本方法を、特に大規模な、不活
化ウイルスワクチンの製造方法に用いることができる。
例えば、インフルエンザウイルスワクチンの製造では、
ウイルス増殖、不活化およびワクチン製造に利用できる
のは短期間しかないことが知られているため、本発明は
ワクチンの産業的生産に実質的な改善をもたらす。
【００１７】ワクチン生産では、少なくともウイルスの
不活化後に、無菌濾過を行い、溶液から細胞成分または
細菌性不純物といったあらゆる考えられる夾雑物を除去
する。濾過膜に通常結合し得る、外部ウイルスエンベロ
ープの糖タンパク質は界面活性剤モノマーと結合する結
果、濾過膜との親和性が低いため、本方法によって製造
される不活化ウイルス製剤の無菌濾過がより簡単である
ことは本発明の範囲内であることがわかった。このよう
に、本発明は、無菌濾過時に通常生じる不活化ウイルス
粒子の損失を減らし、ワクチン製造用の不活化ウイルス
の収量を増加させるというさらなる利点を提供する。
【００１８】本発明の注目すべき局面では、ポリソルベ
ートの群から選ばれる非イオン性界面活性剤は不活化工
程後にウイルス含有溶液中に残っている。特に、Ｔｗｅ
ｅｎ（登録商標）８０に関しては、ヒト適応性と考えら
れ、食品材料および化粧品に用いられることが多いこと
が知られている。したがって、ヒトまたは動物に投与す
る、ほぼ少量の界面活性剤を含むワクチンでは、副作用
は予期されない。本方法によれば、２０％までの非イオ
ン性界面活性剤濃度をウイルスの不活化に使用できる
が、場合によっては最終産物中の界面活性剤濃度を減少
させるか、または所望により完全に除去するという利点
がある。これは、例えば、透析またはクロマトグラフィ
ー的手順のような知られた方法によって行うことができ
よう。特に、適切なクロマトグラフィー的手順はイオン
交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過である。しか
し、溶液から非イオン性界面活性剤を除去するための先
行技術文献に記載のすべての方法が適している。
【００１９】特に経口投与するウイルスワクチンを使用
する場合は、抗原が胃の中でタンパク質分解により破壊
され、その有効性を失うという問題があることが多い。
知られているように、ポリソルベートは「安定化界面活
性剤」とも考えられ、溶液中に存在する成分、特にタン
パク質を長期間にわたり溶液中で安定に保つことができ
る（WO93/01831）。さらに本発明の局面では、本発明に
従って製造された不活化ウイルス調製物は安定化剤を含
有する。好ましくは、該ウイルス調製物は少なくとも
０．０５％、好ましくは０．０５％〜０．５％の、特に
好ましくは０．２％の最終濃度のポリソルベートを安定
化剤として含有する。しかし、ウイルス調製物から不活
化剤として用いた界面活性剤を除去し、該調製物に、先
行技術文献で知られたあらゆる安定化剤を添加すること
も可能である。
【００２０】さらに本発明の局面は、上記方法に従った
不活化により得られた不活化ウイルスを、所望により不
活化用界面活性剤を除去した後に、生理学的に許容され
る担体および所望によりアジュバントと混合する、不活
化ウイルスワクチンの製造方法に関する。本発明の別の
局面は、全ウイルスの構造的完全性、特に、エンベロー
プタンパク質の完全性を特徴とする不活化ウイルスを含
むウイルス調製物に関する。本発明の範囲内において、
ポリソルベートの群から選ばれる非イオン性界面活性剤
による脂質エンベロープウイルス粒子の処理および不活
化は、全ウイルスの完全性に影響を及ぼさず、特に、エ
ンベロープ糖タンパク質の生物活性に影響を及ぼさない
ことがわかった。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはオク
チルグルコシドのような他の非イオン性界面活性剤は、
脂質エンベロープウイルスを不活化し、全ウイルスの構
造的完全性を破壊するため、このことは特に驚くべきこ
とであった。
【００２１】さらに本発明の態様によれば、この独創的
なウイルス調製物は、所望により、さらなる成分として
安定化剤を含む。上記によれば、安定化剤は、好ましく
は不活化に用いられたポリソルベートの群から選ばれる
非イオン性界面活性剤、特にＴｗｅｅｎ（登録商標）８
０である。しかし、先行技術文献で知られているあらゆ
る安定化剤を含有することができよう。本発明のさらな
る局面は、特に脊椎動物を免疫するための安定なワクチ
ン、すなわち、所望により生理学的に許容される担体を
含有する上記タイプのウイルス調製物を含むワクチンを
製造するための、医薬としての独創的ウイルス調製物を
提供することである。
【００２２】本発明のさらなる局面では、該ワクチン
は、所望により不活化工程後に不活化用の非イオン性界
面活性剤を除去し、該不活化ウイルス溶液に生理学的に
許容される担体を混合する、独創的方法に従って不活化
されたウイルス調製物を含有する。本発明によれば、先
行技術文献で知られたすべての医薬製剤が生理学的に許
容される担体であると考えられる。本発明のワクチン製
剤は、本質的に知られた通常の方法、例えば、イオン化
水、リン酸緩衝溶液、および塩の助けにより作出されて
よく、所望により安定化の目的で、アミノ酸、またはＴ
ｗｅｅｎ（登録商標）２０やＴｗｅｅｎ（登録商標）８
０のような穏やかな非イオン性界面活性剤を含んでいて
よい。
【００２３】不活化ウイルスは最も多様な方法でワクチ
ンとして用いるために製剤化することができよう。ワク
チン中の不活化ウイルスの濃度は一般的には１０6〜１
０9pfu／mLの範囲であり、好ましくは１０7pfu／mL代で
ある。本発明のワクチンは所望により免疫応答を増す、
例えば、中和抗体の産生を誘導するように所望の濃度の
アジュバントを含有する。このように、免疫学的に許容
されるアジュバントは、鉱物油、フロインドアジュバン
ト、植物油、鉱物塩、免疫調節物質、または免疫強化物
質であってよい。該ワクチンは、最も多様な方法で、例
えば皮下、経口、経鼻、筋肉内、または腹腔内に投与す
ることができよう。一般的に、該ワクチンは知られたワ
クチネーション管理法に従って投与される。
【００２４】以下の実施例および図面において本発明を
より詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定
されるものではない。実施例１は、非イオン性界面活性
剤のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０およびオクチルグルコ
シドによる脂質エンベロープウイルスの不活化について
記載している。実施例２は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８
０で処理後のＨＩＶ−１およびＴＢＥＶのウイルス不活
化の反応速度論について記載している。実施例３は、１
％オクチルグルコシドおよび１５%Ｔｗｅｅｎ（登録商
標）８０で処理後の不活化ＨＩＶ−１のウエスタンブロ
ット分析について記載している。実施例４は、１％オク
チルグルコシドおよび１１%Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８
０で処理後の不活化ＫＰインフルエンザウイルスのウエ
スタンブロット分析について記載している。実施例５
は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０不活化ＭＡＩＤＳコン
プレックスによるマウスの免疫について記載している。
実施例６は、ホルマリンによるＨＩＶ−１のウイルス不
活化の反応速度論について記載している。実施例７は、
種々の期間インキュベーションした後のホルマリン不活
化ＨＩＶ−１のウエスタンブロット分析について記載し
ている。
【００２５】
【実施例】実施例１ ： 非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およ
びオクチルグルコシドによる脂質エンベロープウイルス
の不活化 ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、インフルエンザウイルス、お
よびＰＲＶ（Pseudorabiesウイルス）のウイルス調製物
は、ショ糖勾配遠心、次いで透析により精製された。精
製された調製物を、終量１％のオクチルグルコシドまた
は終量１１％、１５％および２０％のＴｗｅｅｎ（登録
商標）８０と混合し、２６℃で１時間インキュベーショ
ンした。次に、該調製物をＰＢＳで希釈し、400,000ｇ
で５分間ペレット化し、力価測定する前にＰＢＳに再懸
濁する。このように処理したＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、
インフルエンザウイルスまたはＰＲＶを、細胞培養液で
半対数段階に希釈した。各希釈段階８ｘ１００μＬを指
標細胞を含むマイクロタイタープレートのウェルに加え
た。感染細胞を３７℃で５〜６日間インキュベーション
し、指標細胞に対するウイルスの細胞変性効果を顕微鏡
的に測定した。指標細胞として、Vero細胞をＰＲＶおよ
びインフルエンザウイルスに用い、またＡＡ２細胞をＨ
ＩＶ−１に、Ｃ８１６６細胞をＨＩＶ−２に用いた。Re
edおよびMuuench(Am.J.Hyg.27(1938),493-497）に従っ
てＴＣＩＤ50を測定し、表１にまとめている。
【００２６】表１のデータは、試験したすべてのウイル
スが１％オクチルグルコシドにより５−７ ｌｏｇ10だ
け不活化されたことを示す。同様に、試験したすべての
ウイルスは２０％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０により不
活化されたが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＴＢＥＶ
の不活化については、完全に不活化するのにＴｗｅｅｎ
（登録商標）８０の濃度は１１％で十分であった。表 1 非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およ
びオクチルグルコシドによる脂質エンベロープウイルス
の不活化
【００２７】
【表１】
【００２８】実施例２： Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０処理後のＨＩＶ−１および
ＴＢＥＶのウイルス不活化の反応速度論 ＴＢＥＶおよびＨＩＶ−１のショ糖勾配精製ウイルス調
製物を、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０の最終濃度が１１
％までのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０溶液と混合した。
この混合物を連続的に撹拌しながら２６℃でインキュベ
ーションし、種々の時間後に、ウイルス力価測定のため
に試料を得た。試料を取り出したらすぐにＰＢＳで１：
２０の割合で希釈し、400,000ｇで５分間ペレット化
し、次いでペレットを力価測定前にＰＢＳに再懸濁させ
た。ＴＢＥＶを、ＰＳ細胞を用いるプラークアッセイに
より力価測定し、ＨＩＶ−１を、ＡＡ２細胞を用いるプ
ラークアッセイにより力価測定した。
【００２９】ＴＢＥウイルスをｌｏｇ１段階ごとに段階
希釈し、各希釈段階につき２つの部分標本５００μＬを
細胞の単層に加えた。細胞を２ｘ培地および１．８％カ
ルボキシメチルセルロースの１：１混合物で重層し、４
日間インキュベーションした。ウイルスプラークを０．
１％クリスタルバイオレット溶液で染色して可視化し、
プラークを数えることにより力価を測定した。ＡＡ２細
胞を用いるＨＩＶ−１の力価測定は、細胞培養液で段階
希釈した後に行った。各希釈段階の８ｘ１００μＬをＡ
Ａ２細胞２ｘ１０4個を含むマイクロタイタープレート
のウェルに加えた。感染細胞を３７℃で５−６日間イン
キュベーションし、指標細胞に対するウイルスの細胞変
性効果を顕微鏡的に測定した。ReedおよびMuench（Am.
J.Hyg.27(1938),493-497)に従ってＴＣＩＤ50を決定し
た。
【００３０】力価（pfu／mL）はポアソン分布に従って
決定した。結果を表２にまとめている。表２のデータ
は、１１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０によってＴＢＥ
Ｖ調製物は２６℃で２０分間以内に＞６．４ ｌｏｇ10
だけ不活化される。同じ条件下で、ＨＩＶ調製物は１０
分間以内に＞６．２ ｌｏｇ10だけ不活化される。表 ２ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０後のＨＩＶ−１およびＴＢ
ＥＶのウイルス不活化の反応速度論
【００３１】
【表２】
【００３２】実施例３： １％オクチルグルコシドおよび１１％Ｔｗｅｅｎ（登録
商標）８０で処理後の、不活化ＨＩＶ−１のウエスタン
ブロット分析 ＨＩＶ−１のショ糖勾配精製調製物を、実施例１に従っ
てそれぞれ１１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、１％オ
クチルグルコシドまたはＰＢＳと混合し、２６℃で１時
間インキュベーションした。次に、試料を希釈し、４℃
にて400,000ｇで１０分間ペレット化し（ここで、界面
活性剤処理（ウイルス粒子はその構造的完全性を失う）
により完全ウイルスから分離したウイルスタンパク質、
特にエンベロープタンパク質は上清中にとどまるため、
もはや次のウエスタンブロット分析では明らかではな
い）、溶解緩衝液中に再懸濁し、Laemmli(Nature 227(1
970),680-685)の記載に従ったＳＤＳ−ＰＡＧＥによっ
て分離し、濾過膜上にブロットした。
【００３３】ＨＩＶ−１特異的タンパク質を検出するた
め、濾過膜を、ＨＩＶ−１抗体陽性ヒトＩｇＧ（Immuno
AG)、ｇｐ４１特異的ヒトモノクローナル抗体、および
ｇｐ１２０特異的モノクローナルマウス抗体（DuPont)
の混合物と一夜インキュベーションした。膜を洗浄し、
次いで第二抗体としてパーオキシダーゼ結合抗ヒトおよ
び抗マウスヤギＩｇＧとインキュベーションした。ＨＩ
Ｖ−１特異的バンドの検出は、ジアミノベンチジンおよ
びＨ2Ｏ2との酵素的着色反応により行われる。ウエスタ
ンブロット分析の結果を図１に示す。
【００３４】１％オクチルグルコシドで処理した後に
は、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質、特にｇｐ１６
０およびｇｐ１２０はもはや検出できず、このことはオ
クチルグルコシド処理ウイルス粒子の構造的完全性と表
面またはエンベロープタンパク質の生物活性が失われて
いることを証明している。これとは異なり、コントロー
ル（ＰＢＳ）およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０処理試
料においてはいずれもエンベロープタンパク質はウエス
タンブロット中に明瞭に検出でき、このことは全ウイル
スの構造的完全性がＴｗｅｅｎ処理時に保持されている
ことを証明している。ｇｐ１２０特異的抗体による免疫
反応も、エンベロープタンパク質の抗原決定基がＴｗｅ
ｅｎ（登録商標）８０処理による影響を受けず、無処理
コントロールと比較していかなる変化も示さないことを
証明している。
【００３５】実施例４： １％オクチルグルコシドおよび１５％Ｔｗｅｅｎ８０で
処理した後の不活化ＫＰインフルエンザウイルスのウエ
スタンブロット分析 ＫＰインフルエンザウイルスのショ糖勾配精製調製物
を、実施例１および３に従って１％オクチルグルコシ
ド、１５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０またはＰＢＳで
処理し、ペレット化し、次いでウエスタンブロット分析
を行った。インフルエンザウイルス特異的タンパク質を
検出するために、濾過膜を、表面糖タンパク質、ヘマグ
ルチニン（ＨＡ）のＨＡ１およびＨＡ２に対するマウス
モノクローナル抗体と一夜インキュベーションした。洗
浄後、膜を第二抗体としてパーオキシダーゼ結合抗ヒト
および抗マウスヤギＩｇＧとインキュベーションした。
インフルエンザウイルスＨＡ−糖タンパク質の検出はジ
アミノベンチジンとＨ2Ｏ2を用いる酵素的着色反応によ
って行った。ウエスタンブロット分析の結果を図２に示
す。１％オクチルグルコシドで処理することにより、イ
ンフルエンザウイルスのＨＡ糖タンパク質は完全に除去
される（図１、カラム２および３）。これに対して、コ
ントロール（ＰＢＳ）およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８
０処理試料のいずれにおいてもＨＡ糖タンパク質の構造
的完全性をはっきり認めることができる（図２、カラム
４〜７）。
【００３６】実施例５： Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０不活化ＭＡＩＤＳコンプレ
ックスによるマウスの免疫 ＭＡＩＤＳコンプレックス（ＢＭ５−Ｍｉｘ ＭｕＬ
Ｖ）調製物を、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０またはＰＢ
Ｓと室温で１時間インキュベーションした。ＭＡＩＤＳ
コンプレックス感受性Ｃ５７ Ｂ１／６に対し、Ｔｗｅ
ｅｎ（登録商標）８０不活化およびＰＢＳ処理ＭＡＩＤ
Ｓコンプレックス調製物をｉ．ｐ．注射した。免疫して
５および１２週後にマウスを解剖した。ＭＡＩＤＳ症状
を判断するために、頸部リンパ節および脾臓の重量を測
定し、感染ウイルスを脾臓から単離し、ＢＭ５−Ｍｉｘ
ＭｕＬＶコンプレックスの抗原に対する抗体価を測定
した。結果を表３および４に示す。表３および４は、Ｂ
Ｍ５−Ｍｉｘ ＭｕＬＶコンプレックスのＴｗｅｅｎ
（登録商標）８０による処理が完全な不活化をもたらす
ことを示している。１２週間の観察期間にわたり、ＭＡ
ＩＤＳ症状は発現せず、脾臓細胞から感染ウイルスは単
離できなかった。さらに、不活化ウイルス調製物はＭＡ
ＩＤＳコンプレックスの抗原に対する比較的高い抗体価
を誘導した。ＰＢＳ処理ＢＭ５−Ｍｉｘ ＭｕＬＶ調製
物は、脾臓重量および頸部リンパ節の大きな増大、脾臓
における非常に高いウイルス力価を含む、そしてＭＡＩ
ＤＳコンプレックス誘導性免疫不全（あらゆる免疫応答
に対してもではない）による明らかなＭＡＩＤＳ症状を
生じた。
【００３７】
【表３】
【００３８】
【表４】
【００３９】実施例６： ホルマリンによるＨＩＶ−１のウイルス不活化の反応速
度論 １０7 ＴＣＩＤ50／ｍＬのウイルス力価を有するＨＩＶ
−１のショ糖勾配精製調製物に、最終濃度０．０１％、
０．０３％、０．０５％、０．０７５％および０．１％
のホルマリンを加えた。溶液を連続的に撹拌しながら３
７℃でインキュベーションし、ウイルス力価測定のため
に種々の間隔で試料を得た。力価測定前に、Ｎａ2Ｓ2Ｏ
5の対応する部分標本を各試料に加え、ホルマリンで中
和した。ウイルス力価測定は実施例１の記載に従って行
った。０．０３％〜０．１％のホルマリン濃度で、約１
０時間後にＨＩＶ−１の効率的な不活化が生じた。０．
０３％以下のホルマリン濃度では３０時間インキュベー
ション後も活性な感染性ウイルスが検出された。
【００４０】表 ５ ホルマリンによるＨＩＶ−１のウイルス不活化の反応速
度論
【表５】 ｎ．ｄ．＝ 測定されず
【００４１】実施例７： 種々の期間インキュベーションした後のホルマリン不活
化ＨＩＶ−１のウエスタンブロット分析 実施例６のホルマリン不活化ＨＩＶ−１ウイルス調製物
から、０、１、２、３、６、１０、２０および３０時間
後に試料を得、部分標本を用いてウエスタンブロット分
析を行った。ＨＩＶ−１特異的タンパク質を検出するた
めに、濾過膜をＨＩＶ−１−抗体陽性ヒトＩｇＧ（Immu
no AG）と一夜インキュベーションした。洗浄後、膜
を、二次抗体としてパーオキシダーゼ結合抗ヒトおよび
抗マウス−ヤギＩｇＧとインキュベーションした。 Ｈ
ＩＶ−１特異的バンドの検出は、ジアミノベンチジンと
Ｈ2Ｏ2を用いる酵素的着色反応により行った。ウエスタ
ンブロット分析の結果を図３に示す。ホルマリン処理後
において、ウイルスはペレット化することができること
からまだ全ウイルスとして完全であり、さらに０．１％
ホルマリン と１時間インキュベーションした後にすで
にエンベロープタンパク質は分解し、該タンパク質の天
然の構造は破壊されている。ウエスタンブロット分析
は、３時間のインキュベーション期間から始まる完全ウ
イルスの分解が生じたことを示している。実施例６にお
いて効率的なウイルスの不活化に必要な１０時間のイン
キュベーション期間では、不活化ウイルスの構造の分解
も生じる。このように、ホルマリン不活化が完全ウイル
スの構造に強く影響することが初めて示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】 １％オクチルグルコシドおよび１１%Ｔｗｅ
ｅｎ（登録商標）８０で処理後の不活化ＨＩＶ−１のウ
エスタンブロット分析の結果である。
【図２】 １％オクチルグルコシドおよび１５%Ｔｗｅ
ｅｎ（登録商標）８０で処理後の不活化ＫＰインフルエ
ンザウイルスのウエスタンブロット分析の結果である。
【図３】 種々の期間インキュベーションした後のホル
マリン不活化ＨＩＶ−１のウエスタンブロット分析の結
果である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/245 Ａ６１Ｋ 39/245 47/32 47/32 Ｊ (72)発明者 オットフリート・キストナー オーストリア、アー−1040ヴィーン、ヴェ イリンガーガッセ27／16番 (72)発明者 フリートリッヒ・ドルナー オーストリア、アー−1230ヴィーン、ペー ターリニガッセ17番

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 完全なウイルスを、該ウイルスの構造的
    完全性を破壊することなくウイルス粒子を不活化するの
    に十分な時間、ポリソルベートの群から選ばれる非イオ
    ン性界面活性剤とインキュベーションすることを特徴と
    する脂質エンベロープウイルスの不活化方法。
  2. 【請求項２】 脂質エンベロープウイルスがＨＩＶ−
    １、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−IIのよ
    うなレトロウイルス、ＴＢＥＶまたはＨＣＶのようなフ
    ラビウイルス、インフルエンザウイルスのようなオルソ
    ミクソウイルス、ヘルペスウイルス、ムンプスウイルス
    または麻疹ウイルスのようなパラミクソウイルス、Juni
    nウイルスまたはLassaウイルスのようなアレナウイルス
    からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記
    載の方法。
  3. 【請求項３】 ポリソルベートがＴｗｅｅｎ（登録商
    標）８０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ
    （登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０または
    その混合物であることを特徴とする請求項１に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】 ポリソルベートの群から選ばれる非イオ
    ン性界面活性剤が安定化界面活性剤であることを特徴と
    する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】 ポリソルベートの群から選ばれる非イオ
    ン性界面活性剤の濃度が１％〜２０％、好ましくは１０
    ％〜１５％であることを特徴とする 請求項１〜４のい
    ずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】 非イオン性界面活性剤とのインキュベー
    ションが少なくとも１０分間行われることを特徴とする
    請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】 所望により、非イオン性界面活性剤がク
    ロマトグラフィー的方法または透析により除去されるこ
    とを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれかの記載に従って
    不活化ウイルスを生理学的に許容される担体、および所
    望によりアジュバントと混合することを特徴とする不活
    化全ウイルスワクチンの製造方法。
  9. 【請求項９】 全ウイルス、特にウイルスエンベロープ
    タンパク質が完全であり、構造的完全性を有することを
    特徴とする不活化ウイルス含有ウイルス調製物。
  10. 【請求項１０】 不活化ウイルスのエンベロープタンパ
    ク質の生物活性が損なわれていないことを特徴とする請
    求項９に記載のウイルス調製物。
  11. 【請求項１１】 所望により安定化剤を含むことを特徴
    とする請求項１０に記載のウイルス調製物。
  12. 【請求項１２】 安定化剤がポリソルベートの群から選
    ばれる非イオン性界面活性剤であることを特徴とする請
    求項１１に記載のウイルス調製物。
  13. 【請求項１３】 該ポリソルベートがＴｗｅｅｎ（登録
    商標）８０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ
    （登録商標）６０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０または
    その混合物であることを特徴とする請求項１２に記載の
    ウイルス調製物。
  14. 【請求項１４】 請求項９〜１３のいずれかに記載のウ
    イルス調製物を含むワクチン。
  15. 【請求項１５】 ポリソルベート、好ましくはＴｗｅｅ
    ｎ（登録商標）８０、を０．０５％〜０．５％、好まし
    くは０．２％の濃度で含むことを特徴とする請求項１４
    に記載のワクチン。
  16. 【請求項１６】 生理学的に許容される担体を含む請求
    項１４または１５に記載のワクチン。
  17. 【請求項１７】 アジュバントを含むことを特徴とする
    請求項１４〜１６のいずれかに記載のワクチン。
  18. 【請求項１８】 全ウイルス、特にウイルスエンベロー
    プタンパク質が構造的完全性を有する不活化ウイルスお
    よび安定化剤を含む安定なワクチン組成物。
  19. 【請求項１９】 請求項９〜１３のいずれかに記載の医
    薬としてのウイルス調製物。
  20. 【請求項２０】 請求項９〜１３のいずれかに記載のウ
    イルス調製物からなる脊椎動物を免疫するための安定な
    ワクチン。
JP10038604A 1997-02-24 1998-02-20 脂質エンベロープウイルスの不活化方法 Pending JPH10234362A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT299/97 1997-02-24
AT0029997A AT405939B (de) 1997-02-24 1997-02-24 Verfahren zur inaktivierung von lipidumhüllten viren

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH10234362A true JPH10234362A (ja) 1998-09-08

Family

ID=3486870

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP10038604A Pending JPH10234362A (ja) 1997-02-24 1998-02-20 脂質エンベロープウイルスの不活化方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US6136321A (ja)
EP (2) EP1637593B1 (ja)
JP (1) JPH10234362A (ja)
AT (3) AT405939B (ja)
DE (2) DE59814464D1 (ja)
DK (2) DK1637593T3 (ja)
ES (2) ES2350109T3 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001253833A (ja) * 2000-03-10 2001-09-18 Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai 生ワクチンの細胞性免疫活性を不活化ワクチンにも起こさせる方法、及びこれより得られる混合ワクチン
US9120849B2 (en) 2000-10-17 2015-09-01 Zeptometrix Corporation Nucleic acid amplification controls

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0863202T3 (da) 1995-11-01 2010-09-27 Dnavec Research Inc Rekombinant Sendai-virus
US20090017069A1 (en) 2000-06-29 2009-01-15 Lipid Sciences, Inc. SARS Vaccine Compositions and Methods of Making and Using Them
AU2004264842B2 (en) * 2000-06-29 2008-01-10 Eli Lilly And Company Modified viral particles with immunogenic properties and reduced lipid content useful for treating and preventing infectious diseases
US7407663B2 (en) * 2000-06-29 2008-08-05 Lipid Sciences, Inc. Modified immunodeficiency virus particles
US7407662B2 (en) * 2000-06-29 2008-08-05 Lipid Sciences, Inc. Modified viral particles with immunogenic properties and reduced lipid content
AU2008201523B2 (en) * 2000-06-29 2011-07-28 Eli Lilly And Company Modified viral particles with immunogenic properties and reduced lipid content useful for treating and preventing infectious diseases
AUPQ846900A0 (en) * 2000-06-29 2000-07-27 Aruba International Pty Ltd A vaccine
KR20030055275A (ko) * 2000-10-02 2003-07-02 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 분할 외피 바이러스 제조물
US6524586B2 (en) 2001-05-18 2003-02-25 Albany Medical College Enhancement of oligomeric viral immunogenicity
US20030127386A1 (en) * 2001-06-25 2003-07-10 Bomberger David C. Hollow fiber contactor systems for removal of lipids from fluids
AU2002322284A1 (en) * 2001-06-25 2003-01-08 Lipid Sciences, Inc. Systems and methods using multiple solvents for the removal of lipids from fluids
US6991727B2 (en) * 2001-06-25 2006-01-31 Lipid Sciences, Inc. Hollow fiber contactor systems for removal of lipids from fluids
ES2715496T3 (es) 2003-07-03 2019-06-04 Hdl Therapeutics Inc Métodos y aparatos para crear derivados de partículas de HDL con un contenido reducido de lípidos
US7393826B2 (en) 2003-07-03 2008-07-01 Lipid Sciences, Inc. Methods and apparatus for creating particle derivatives of HDL with reduced lipid content
WO2007008918A2 (en) * 2005-07-08 2007-01-18 Wayne State University Virus vaccines comprising envelope-bound immunomodulatory proteins and methods of use thereof
US11707520B2 (en) 2005-11-03 2023-07-25 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
CA2628158C (en) * 2005-11-04 2015-12-15 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Emulsions with free aqueous-phase surfactant as adjuvants for split influenza vaccines
EP3714900A1 (en) 2005-11-04 2020-09-30 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
EP2192917B1 (en) * 2007-08-28 2014-01-29 Baxter International Inc. Method for producing viral vaccines
DK2396032T3 (en) 2009-02-10 2016-12-19 Seqirus Uk Ltd Influenza vaccines with reduced amounts of squalene
US20110110975A1 (en) * 2009-11-06 2011-05-12 Streck, Inc. Inactivated virus compositions and methods of preparing such compositions
WO2012151391A2 (en) 2011-05-04 2012-11-08 Streck, Inc. Inactivated virus compositions and methods of preparing such compositions
CA2930687C (en) 2013-11-15 2024-04-23 Genentech, Inc. Methods for viral inactivation using eco-friendly detergents
CN111615397A (zh) * 2017-11-03 2020-09-01 武田疫苗股份有限公司 寨卡疫苗和免疫原性组合物及其使用方法
AU2018372198A1 (en) 2017-11-22 2020-06-11 Hdl Therapeutics, Inc. Systems and methods for priming fluid circuits of a plasma processing system
MX2020005554A (es) * 2017-11-30 2020-10-12 Takeda Vaccines Inc Vacunas y composiciones inmunogenas para zika y metodos para usarlas.
WO2019133358A2 (en) 2017-12-28 2019-07-04 Hdl Therapeutics, Inc. Methods for preserving and administering pre-beta high density lipoprotein extracted from human plasma
WO2022003565A1 (en) * 2020-07-01 2022-01-06 Medimmune, Llc Detergent and method for purifying a biotherapeutic

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4164565A (en) * 1975-03-14 1979-08-14 New York Blood Center, Inc. Vaccine for active immunization containing hepatitis B surface antigen and associated antigen
DE3014189A1 (de) * 1980-04-14 1981-10-15 Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL), 6900 Heidelberg Verfahren zur herstellung eines immunogenen membranproteinaggregats von influenza-, parainfluenza- und rhabdo-viren
US4314997A (en) * 1980-10-06 1982-02-09 Edward Shanbrom Purification of plasma protein products
US4673733A (en) * 1985-04-11 1987-06-16 Sudhish Chandra Treatment of biological and pharmaceutical products adsorbed on a solid phase with virus and pyrogen inactivating agents
DE3704550A1 (de) * 1987-02-13 1988-08-25 Behringwerke Ag Verfahren zur inaktivierung huellhaltiger viren in mittels einer zelle in vitro hergestellten protein-praeparationen
US5585103A (en) * 1991-07-25 1996-12-17 Idec Pharmaceutical Corporation Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses
DE4211108A1 (de) * 1992-04-03 1993-10-07 Boehringer Mannheim Gmbh Viruslösung zum Einsatz bei Immunoassays
GB9513261D0 (en) * 1995-06-29 1995-09-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccines

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001253833A (ja) * 2000-03-10 2001-09-18 Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai 生ワクチンの細胞性免疫活性を不活化ワクチンにも起こさせる方法、及びこれより得られる混合ワクチン
US9120849B2 (en) 2000-10-17 2015-09-01 Zeptometrix Corporation Nucleic acid amplification controls
US9127048B2 (en) 2000-10-17 2015-09-08 Zeptometrix Corporation Nucleic acid amplification controls

Also Published As

Publication number Publication date
EP0864646A3 (de) 2002-05-15
US6136321A (en) 2000-10-24
ATE335810T1 (de) 2006-09-15
EP0864646B1 (de) 2006-08-09
DE59814464D1 (de) 2010-09-30
EP1637593A1 (de) 2006-03-22
AT405939B (de) 1999-12-27
ES2270501T3 (es) 2007-04-01
ATA29997A (de) 1999-05-15
DK0864646T3 (da) 2006-11-20
EP0864646A2 (de) 1998-09-16
ATE478138T1 (de) 2010-09-15
DK1637593T3 (da) 2010-11-22
EP1637593B1 (de) 2010-08-18
DE59813677D1 (de) 2006-09-21
ES2350109T3 (es) 2011-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH10234362A (ja) 脂質エンベロープウイルスの不活化方法
AU652447B2 (en) Vaccines and methods for their production
US7700116B2 (en) Method of inducing an immune response in a host by administering immunogenic compositions comprising UV-irradiated, psoralen-inactivated, desialated human immunodeficiency virus (HIV) particles devoid of CD55 and CD59 in the viral membrane
Chertova et al. Envelope glycoprotein incorporation, not shedding of surface envelope glycoprotein (gp120/SU), Is the primary determinant of SU content of purified human immunodeficiency virus type 1 and simian immunodeficiency virus
US4522809A (en) Process for obtaining lipid envelope virus sub-units, notably antigens for use as vaccines, the products obtained and their applications
KR20220144415A (ko) 백신 조성물
EP3454894B1 (en) Inactivating pathogens and producing highly immunogenic inactivated vaccines using a dual oxidation process
RU2599496C2 (ru) Улучшенная вакцинация против гриппа
RU2754398C1 (ru) Способ получения четырехвалентной вакцины для профилактики гриппа
JP6985384B2 (ja) 弱毒変異型ジカウイルスを含むワクチン組成物
Klockmann et al. Preclinical investigations of the safety, immunogenicity and efficacy of a purified, inactivated tick-borne encephalitis vaccine
CA2529965C (en) Modified viral particles with immunogenic properties and reduced lipid content useful for treating and preventing infectious diseases
JP6200805B2 (ja) 新規な方法
Berman et al. Production of Viral Glycoproteins in Genetically Engineered Mammalian Cell Lines for Use as Vaccines against Herpes Simplex Virus and the Acquired Immune Deficiency Syndrome Retrovirus
WO2023015145A1 (en) Multivalent pan-influenza vaccine
Shivanandappa et al. WE WILL OVERCOME COVID 19 TOO…
Smith et al. Specificity and in vitro transfer of the immunosuppressive effectof detergent-disrupted influenza virus vaccine